CN113151199A - 一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有热稳定性的γ‑谷酰胺甲胺合成酶的突变体、其编码基因、氨基酸及在生产茶氨酸中的应用，具体是通过基因工程方法获得了γ‑谷氨酰甲胺合成酶突变体；改突变体半衰期长，在提高了γ‑谷氨酰甲胺合成酶突变体的热稳定性同时，使酶的最适温度提高了10～15℃，并且该突变体不需要在缓冲盐溶液中就能发挥很好的催化效果，同时利用该突变体通过耦合多聚磷酸盐激酶的方法高效合成茶氨酸，该方法催化茶氨酸合成的同时可实现ATP再生，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径。

Description

一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码 基因、氨基酸序列及其应用

技术领域

本发明涉及一种酶突变体，特别涉及一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体、 其编码基因、氨基酸及在生产茶氨酸中的应用。

背景技术

L-茶氨酸(L-theanine)属于酰胺类化合物，是茶叶中含量最丰富的游离氨基酸，占总游离 氨基酸的50％以上。茶氨酸为是茶叶香味和口感的主要成分，其含量对茶叶的风味和品质起 到关键性的作用。茶氨酸的性质较稳定，将茶氨酸溶液煮沸5min，或将茶氨酸溶于pH 3.0的 溶液中并在25℃下储放12个月，茶氨酸含量不变。因此在通常的食品加工、杀菌过程中，茶 氨酸的性质不会发生变化，且毒性试验中未发现其有毒性。

L-茶氨酸作为一种安全、集多种生理功能于一体的功能性活性因子，被广泛应用于食品、 保健品和医药行业。日本于1964年将以茶氨酸列为食品添加剂，作为调味剂和强化剂使用， 使用过程中不作限制用量的规定。美国食品和药物管理局于1985年确认茶氨酸是一般公认为 安全的物质(GRAS)，在食品中使用没有特定用量限制。2014我国卫生部批准茶叶茶氨酸为 新食品原料，规定L-茶氨酸摄入量不得超过0.4g/d，使用范围不包括婴幼儿食品。此外，国 际食品法典委员会(CODEX)标准将L-茶氨酸批准为风味强化剂，不作限制用量的规定。

微生物酶法生产茶氨酸作为近年来较为经济和温和的方法，必将在未来产业应用中大有 前景。γ-谷氨酰甲胺合成酶(γ-glutamylmethylamide synthetase，GMAS)是一种能够催化L-谷 氨酸和甲胺合成N-甲基-L-谷氨酰胺的催化用酶，该反应需要消耗ATP。专利CN201410316269利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸，在大肠杆菌中表 达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，50mM限制底物，8h谷氨酸转化率达到69.8％；专利CN201510755912在大肠杆菌中表达γ-谷酰胺甲胺合成酶基因，可以谷氨酸和乙胺为底物生产茶氨酸，150mM限制底物，转化率低于50％，生产周 期长于30h，效率低，不适合工业生产。在CN201510973289中以γ-谷氨酰甲胺合成酶和 磷酸激酶为催化剂，在咪唑溶液中以L-谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物合成L-茶氨酸。

100mL体系中限制底物最高200mM，转化率87％，反应体系较小，且咪唑为反应环境，对 环境和成本均不友好。专利CN201880024038公开了一种使用以乙醛和丙氨酸作为底物生成 乙胺的活性、以及γ-谷氨酰甲胺合成酶活性或谷氨酰胺酶活性增强的微生物，能够在不从外 部添加乙胺且不会蓄积、残留乙胺作为副产物的情况下高效地制造茶氨酸，但乙醛并不安 全，此举并无太多益处。γ-谷氨酰甲胺合成酶虽然是更为优良的催化剂，但据已有文献报道 或专利发明文件来看，其生产茶氨酸的效率并不高。阻碍微生物酶法生产茶氨酸效率的一个 原因是γ-谷氨酰甲胺合成酶容易失活。从相关文献的报道来看，茶氨酸的生产速率随着反应 时间的延长而降低，符合酶的失活曲线，此为酶本身的性质决定。因此，如何提高γ-谷氨酰 甲胺合成酶的热稳定性以及提高其生产茶氨酸的效率，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途 径是当前亟需解决的技术问题。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明通过基因工程方法获得了一种具有热稳定性的γ-谷 氨酰甲胺合成酶突变体；并且，不仅在提高了γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体的热稳定性同时， 使酶的最适温度提高了10～15℃，并且该突变体不需要在缓冲盐溶液中就能发挥很好的催化 效果，同时利用该突变体通过耦合多聚磷酸盐激酶的方法高效合成茶氨酸，该方法催化茶氨 酸合成的同时可实现ATP再生，为酶法工业化生产茶氨酸提供有效途径。

本发明第一方面提供了一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，所述突变体的 氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

进一步地，前文所述的具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，所述突变体基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，或编码所述突变体的基因序列为编码前文所述的如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体即实施例中的gmas DBM突变体。

本发明第二方面提供了一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的构建方法，包括如下步骤；按 照随机突变试剂盒获得随机突变体，筛选其中具有优良性能的突变体。该方法中所述试剂盒 为市面上可购买到的任意QuickMutation^TM基因随机突变试剂盒。

本发明第三方面提供了一种γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体在生产茶氨酸中的应用。

进一步地，所述应用包括将γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的全细胞用于茶氨酸生产的催化 体系中进行反应。

进一步地，所述茶氨酸生产的催化体系包括300～600mM谷氨酸钠和/或谷氨酸；350～600 mM乙胺和/或乙胺盐酸盐；120～180mM含镁离子的盐,优选浓度为140～160mM；1～5mM ATP 和/或ADP，优选浓度为2mM；以及100～200mM多聚磷酸盐；

进一步地，所述茶氨酸生产的催化体系温度控制在40～55℃范围内，反应pH可在6～9范 围内波动；

进一步地，所述茶氨酸生产的催化体系中，添加40～70g/L的gmas DBM湿菌体和30～50 g/L的能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的菌体。优选的，所述能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的菌体为专利CN201910642412-一种用于生产谷胱甘肽的重组大肠杆菌的混合培养工艺及其应用中所述的菌株BL21-pET30a-ppk2。

对于上文所述的技术方案中，优选的所述含镁离子的盐包括氯化镁、硫酸镁等；

对于上文所述的技术方案中，优选的所述多聚磷酸盐包括六偏磷酸钠、三聚磷酸钠等；

对于上文所述的技术方案中，优选的谷氨酸钠和/或谷氨酸的浓度为350～450mM；

对于上文所述的技术方案中，优选的乙胺和/或乙胺盐酸盐的浓度为420～450mM；

对于上文所述的技术方案中，优选的含镁离子的盐浓度为140～160mM；

对于上文所述的技术方案中，优选的ATP和/或ADP的优选浓度为2mM；

对于上文所述的技术方案中，优选的多聚磷酸盐优选浓度为160～180mM；

对于上文所述的技术方案中，优选的添加gmas DBM湿菌体的浓度为55～65g/L；

对于上文所述的技术方案中，优选的能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的 菌体的浓度为35～45g/L；

对于上文所述的技术方案中，优选的体系温度控制在45～50℃；

对于上文所述的技术方案中，优选的反应pH可在6.5～7.5范围内。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明通过基因工程方法获得的γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体gmas DBM；其性质较野生 株有显著提高，体现在以下几方面：(1)突变体的最适温度比原始菌提高了10～15℃；(2)最 适温度下的生产强度是原始菌的2.0倍；(3)酶的热稳定性有显著提高,在35℃下，突变体的 半衰期是原始菌的6.17倍，在45℃下半衰期提高到原来的20.77倍；(4)该突变体不需要在 缓冲盐溶液中就能发挥很好的催化效果，提高了酶在水体系中反应的活性，从而降低了反应 成本，同时有利于简化后续纯化工艺，缩减生产周期，对规模化生产有重要意义；(5)耦合 多聚磷酸盐激酶，解除ATP抑制，同时实现ATP的再生，降低了工业成本。

附图说明

图1原始菌和突变体最适温度；

图2原始菌和突变体在35℃和45℃下的热稳定性；

图3原始菌和突变体最适pH；

图4氯化镁最适添加量；

图5 gmas DBM加入量；

图6 PPK加入量。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细地描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具 体实施方式的限制。

本发明中，除非另有其他明确说明，否则百分比、百分含量均以质量计。如无特殊说明， 所使用的实验方法均为常规方法，所用材料、试剂等均可从商业途径购买。

本申请的实施例中PPK湿菌体为专利CN201910642412-一种用于生产谷胱甘肽的重组大 肠杆菌的混合培养工艺及其应用中所述的菌株BL21-pET30a-ppk2。

本申请的实施例中所涉及的酶学性质、热稳定性和半衰期检测方法如下：

1.酶学性质测定

酶活定义：1U酶活定义为在35℃下，每分钟内生成1μM的茶氨酸所需要的细胞量，反 应体系包含50mM谷氨酸钠，55mM乙胺，40mM氯化镁和30mM ATP以及15g/L的gmas 细胞，于pH＝7的PBS溶液中反应60min，加入等体积的20％三氯乙酸进行终止，HPLC检 测茶氨酸产量以确定酶活力。

突变后gmas的酶学性质可能发生改变，探究最佳酶活条件，分别将未突变WT(原始菌) 和突变体gmas DBM在相同条件下的酶学性质进行分析比较。

2.热稳定性和半衰期检测

温度稳定性的测定：用PBS将酶液的浓度稀释至30g/L，在35℃和45℃下孵育，测定孵 育不同时间的残余酶活。

t_1/2值是指酶在特定温度下处理一段时间后残余酶活为50％时对应的时间。具体测定方法 如下：以未进行热处理的gmas酶的活力作为100％，分别测定并计算出酶在35℃和45℃下 处理不同时间后的残余酶活。以处理时间为横坐标，以Ln(％残余酶活)为纵坐标，绘制时间 —Ln(％残余酶活)的曲线，据图计算t_1/2＝Ln2/K_d，K_d为该图斜率。

实施例1突变体的构建

来源于亲甲基醇菌Methylovorus mays的茶氨酸合成酶基因gmas序列，密码子优化后的 序列为SEQ ID NO.1，连入质粒pET28(a)，转入E.coliBL21，得到原始菌E.coliBL21-pET28(a)- gmas命名为WT。

获得γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体gmas DBM的方法，包括如下步骤：

1.按照QuickMutation^TM基因随机突变试剂盒设计引物和随机突变，引物序列为：

random-F：GATATACATATGAAGAGCCTGGAAG；SEQ ID NO.4；

random-R：cccaagcttGTAGAATTGAACATAGCGG；SEQ ID NO.5；

2.随机突变PCR反应

随机突变PCR反应参考下表设置随机突变PCR反应体系：

表1

试剂	最终浓度	体积
			双蒸水或MilliQ水	-	12.2μL
RandomMut buffer(10×)	1×	2μL
			Mutation enhancer(10×)	1×	2uL
dNTP(2.5mM)	0.25mM	2μL
			模板DNA	0.2pg-5ng/μL	1μL
引物混合物(各10μM)	各0.2μM	0.4μL
			RandomMut DNA polymerase	-	0.4μL
总体积	-	20μL

按照如下参数设置PCR仪：

表2

3.转化感受态细胞

取10μL的PCR产物，1％的琼脂糖检测，观察到目的条带后加1μL的DpnI酶于剩余的PCR产物中，混匀孵育1h。加入2-5μL消化产物与50μL感受态细胞中，混匀后冰浴30min， 之后42℃水浴热击45s，立即放于冰上2-5min。之后加入250μLLB培养基，200rpm，37℃培 养1h，取100-200μL菌液于卡那抗性的平板上过夜培养。得到多个突变体，其中性质优良的 突变体E.coli BL21-pET28(a)-gmas-DBM命名为突变体gmas DBM，突变体gmas DBM的核 苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

野生酶和突变酶的表达：

使用LB培养基培养原始菌和突变体gmas DBM，于37℃，200rpm的条件下过夜，以5％ 接种量接种到发酵培养基中，进行扩大培养，待细胞OD₆₀₀＝0.4～1.0，添加0.1mM的IPTG， 低温诱导过夜，离心收获全细胞作为催化剂。

所述的种子培养基和发酵培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，121℃灭 菌20min，冷却后加入终浓度为10～100μg/mL的卡那霉素。

实施例2

以突变体gmas DBM湿菌体为生物催化剂，以谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物，生物转化 制备茶氨酸。催化体系为10L，催化体系包含400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，160mM氯 化镁，2mM ATP，160mM六偏磷酸钠以及60g/L的gmas DBM湿菌体和40g/LPPK湿菌 体。反应体系于45℃，pH＝7的水溶液中进行反应，反应结束后离心去除细胞，样品用0.22μm 膜过滤后进行HPLC检测茶氨酸产量。茶氨酸最高产量345mM，合60.1g/L，反应时长为16 h，生产强度为3.76g/L/h，是原始菌的2.0倍。

实施例3温度对酶性质的影响

温度即能改变酶发生催化反应速度，也能导致酶蛋白活性降低或失活。同时测定未突变 WT和突变体gmas DBM的最佳反应温度。分别置于30、35、40、45、50℃下反应60min。在pH＝7的PBS溶液中，反应体系包含50mM谷氨酸钠，55mM乙胺，40mM氯化镁和30 mM ATP以及15g/L的gmas细胞。HPLC定时测定反应液茶氨酸变化情况，将35℃下测定 WT的酶活值作为100％，计算其他温度下的相对酶活。实验结果如图1所示，WT的最适温 度为35℃，而gmasDBM的最适温度在45～50℃。

将未突变WT和突变体gmas DBM置于35和45℃下孵育，以未孵育时酶活为100％，测定孵育不同时间的残余酶活。按照图2所示的测定结果计算半衰期，结果如表3，可知在35℃下，突变体的半衰期是原始菌的6.17倍，在45℃下半衰期提高到原来的20.77倍。

表3

实施例4 pH对酶性质的影响

酶反应都有其最佳的pH值范围，pH值过高或者过低对酶发生催化反应的活性都会产生 影响，本实验将同时测定未突变WT和突变体gmas DBM的最佳反应pH。准备若干组100ml 反应液，反应体系包含50mM谷氨酸钠，55mM乙胺，40mM氯化镁和30mM ATP以及 15g/L的gmas细胞。分别调节pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，置于35℃反应60min，HPLC 定时测定反应液茶氨酸变化情况，将pH＝7下测得的未突变的酶活值作为100％，计算其他 pH值下的相对酶活。

结果如图3所示，实验结果表明未突变WT和突变体gmas DBM的最佳反应pH都是7.0。说明突变前后并未改变gmas的最适pH值。

实施例5非缓冲体系中反应

分别在PBS和纯水中溶解50mM谷氨酸钠，55mM乙胺，40mM氯化镁和30mM ATP 以及15g/L的原始菌和突变体gmas DBM的细胞，调pH＝7，在原始菌和突变体gmas DBM 各自的最适温度下进行反应，60min后HPLC测定茶氨酸产量，结果如表4。可知突变体gmas DBM在非缓冲体系中可用且酶活更高。

表4

产量/mM	PBS	水
			WT	35.4	31.2
gmas DBM	40.3	47.8

实施例6加入能量循环

ATP作为底物之一在高浓度的工业化生产中有可能产物底物抑制效应，同时增加成本。 利用PPK循环再生ATP可有效避免上述问题。按照专利110387379A中的方法获得BL21- pET30a-ppk2细胞，以ADP、AMP和六偏磷酸钠为底物可进行ATP再生。在100mL的反应体系中，以10g/L的BL21-pET30a-ppk2细胞和20mM六偏磷酸钠、2mM的ATP替代30mM 的ATP，反应体系还包含50mM谷氨酸钠，55mM乙胺，40mM氯化镁以及15g/L的gmas DBM细胞；在45℃，pH＝7的水溶液中进行反应，HPLC定时测定反应液茶氨酸变化情况。 反应60min，转化率达96.5％，是直接添加ATP的1.07倍。

实施例7提高底物浓度

提高底物浓度在工业化生产中具有更高的经济性。然而，较高的底物浓度反应如果直接 翻倍会面临底物抑制、激活剂过量或者酶的添加量不合适等问题。在100mL的反应体系中， 添加400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，2mMATP，160mM六偏磷酸钠以及120g/L的gmasDBM湿菌体和80g/L的PPK湿菌体。分别添加320mM、240mM、160mM、80mM的氯化 镁，于45℃，pH＝7下进行反应，HPLC检测茶氨酸产量。根据图4中的曲线，选择160mM 氯化镁作为反应中的激活剂。

在100mL的反应体系中，添加400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，160mM氯化镁，2 mMATP，160mM六偏磷酸钠以及80g/L的PPK湿菌体。分别添加120g/L、90g/L、60g/L 和30g/L的gmasDBM的湿菌体，于45℃，pH 7下进行反应，HPLC检测茶氨酸产量。根据 图5的曲线，认为60g/L的湿菌体足够完成反应。

在100mL的反应体系中，添加400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，160mM氯化镁，2 mMATP，160mM六偏磷酸钠以及60g/Lgmas DBM的湿菌体，分别添加80g/L、60g/L、40 g/L和20g/L的gmas DBM的湿菌体，于45℃，pH＝7下进行反应，HPLC检测茶氨酸产量。 根据图6的曲线，反应中40g/L的PPK湿菌体足以提供足够的ATP。

对比例1

原始菌转化效果

以gmas野生菌湿菌体为生物催化剂，以谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物，生物转化制备茶 氨酸。催化体系为10L，催化体系包含400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，160mM氯化镁，2mM ATP，160mM六偏磷酸钠以及60g/L的gmas野生菌湿菌体和40g/L的PPK湿菌体。 反应体系于35℃，pH＝7的水溶液中进行反应，反应结束后离心去除细胞，样品用0.22μm膜 过滤后进行HPLC检测茶氨酸产量。茶氨酸最高产量282mM，合48.9g/L，反应时长为26 h，生产强度为1.88g/L/h。

其他突变体转化效果：

以按照实施例1的方法获得的其他突变体D103CY344C、V287CP337C湿菌体为生物催 化剂，以谷氨酸钠和乙胺盐酸盐为底物，生物转化制备茶氨酸。催化体系为10L，催化体系 包含400mM谷氨酸钠，440mM乙胺，160mM氯化镁，2mM ATP，160mM六偏磷酸钠 以及60g/L的D103CY344C或V287CP337C湿菌体和40g/L的PPK湿菌体。反应体系于 35℃，pH＝7的水溶液中进行反应，反应结束后离心去除细胞，样品用0.22μm膜过滤后进行 HPLC检测茶氨酸产量。茶氨酸最高产量分别为156mM和290mM，合27.0g/L和50g/L， 反应时长为28h和21h，生产强度仅有0.96g/L/h和2.38g/L/h。与原始菌相比活性更低或相 近。

总之，通过本申请的对比例和实施例数据对比分析可知：所获得的突变体gmasDBM在 应用于茶氨酸合成过程中可显著提高其生产强度，而突变体D103CY344C、V287CP337C虽 然突变后的氨基酸也形成了半胱氨酸，却并没有达到同样正向效果。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领 域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的 保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 大连医诺生物股份有限公司

<120> 一种具有热稳定性的 γ-谷酰胺甲胺合成酶的突变体，其编码基因、氨基酸序列及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 1332

<212> DNA

<213> 密码子优化后的茶氨酸合成酶gmas基因(无)

<400> 2

atgaagagcc tggaagaagc acaaaagttt ctggaagacc accatgtcaa gtatgtcctg 60

gcacagttcg tcgatattca cggcgttgct aaagtgaaga gcgttccggc gtctcatctg 120

aatgatattc tgaccacggg tgcaggtttt gcaggcggtg ctatttgggg taccggtatc 180

gcaccgaacg gtccggatta tatggcaatt ggtgaactga gtacgctgtc cctgatcccg 240

tggcagccgg gttatgcacg tctggtctgc gacggccacg tgaatggtaa accgtatgaa 300

tttgataccc gtgtggttct gaaacagcaa attgcacgtc tggcagaaaa gggttggacc 360

ctgtatacgg gtctggaacc ggaattttca ctgctgaaaa aggatgaaca tggcgcggtg 420

cacccgttcg atgactcgga cacgctgcaa aaaccgtgtt atgattacaa gggtattacc 480

cgccatagcc cgtttctgga aaaactgacg gaatctctgg ttgaagtcgg cctggacatt 540

tatcagatcg atcacgaaga cgccaatggt caatttgaaa tcaactatac ctacgccgat 600

tgcctgaaaa gtgcagatga ctacattatg ttcaagatgg cggcctccga aatcgcgaac 660

gaactgggta ttatctgtag ttttatgccg aaaccgttct ccaatcgtcc gggcaacggt 720

atgcacatgc acatgtcaat tggcgacggt aaaaagtcgc tgtttcagga tgactcagat 780

ccgtcgggcc tgggtctgag taaactggct tatcatttcc tgggcggtat cctggcacac 840

gcaccggcac tggcagctgt ttgcgcaccg accgtcaatt cttacaaacg tctggtcgtg 900

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cgtagcacgc tggttcgcat cccgtatggc cgtctggaac tgcgcctgcc ggatggttct 1020

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<210> 3

<211> 1332

<212> DNA

<213> γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体碱基序列(无)

<400> 3

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gcacagttcg tcgatattca cggcgttgct aaagtgaaga gcgttccggc gtctcatctg 120

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gttcaattct ac 1332

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体氨基酸序列(无)

<400> 1

Met Lys Ser Leu Glu Glu Ala Gln Lys Phe Leu Glu Asp His His Val

1 5 10 15

Lys Tyr Val Leu Ala Gln Phe Val Asp Ile His Gly Val Ala Lys Val

20 25 30

Lys Ser Val Pro Ala Ser His Leu Asn Asp Ile Leu Thr Thr Gly Ala

35 40 45

Gly Phe Ala Gly Gly Ala Ile Trp Gly Thr Gly Ile Ala Pro Asn Gly

50 55 60

Pro Asp Tyr Met Cys Ile Gly Glu Leu Ser Thr Leu Ser Leu Ile Pro

65 70 75 80

Trp Gln Pro Gly Tyr Ala Arg Leu Val Cys Asp Gly His Val Asn Gly

85 90 95

Lys Pro Tyr Glu Phe Asp Thr Arg Val Val Leu Lys Gln Gln Ile Ala

100 105 110

Arg Leu Ala Glu Lys Gly Trp Thr Leu Tyr Thr Gly Leu Glu Pro Glu

115 120 125

Phe Ser Leu Leu Lys Lys Asp Glu His Gly Ala Val His Pro Phe Asp

130 135 140

Asp Ser Asp Thr Leu Gln Lys Pro Cys Tyr Asp Tyr Lys Gly Ile Thr

145 150 155 160

Arg His Ser Pro Phe Leu Glu Lys Leu Thr Glu Ser Leu Val Glu Val

165 170 175

Gly Leu Asp Ile Tyr Gln Ile Asp His Glu Asp Ala Asn Gly Gln Phe

180 185 190

Glu Ile Asn Tyr Thr Tyr Ala Asp Cys Leu Lys Ser Ala Asp Asp Tyr

195 200 205

Ile Met Phe Lys Met Ala Ala Ser Glu Ile Ala Asn Glu Leu Gly Ile

210 215 220

Ile Cys Ser Phe Met Pro Lys Pro Phe Ser Asn Arg Pro Gly Asn Gly

225 230 235 240

Met His Met His Met Ser Ile Gly Asp Gly Lys Lys Ser Leu Phe Gln

245 250 255

Asp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Leu Gly Leu Ser Lys Leu Ala Tyr His

260 265 270

Phe Leu Gly Gly Ile Leu Ala His Ala Pro Ala Leu Ala Ala Val Cys

275 280 285

Ala Pro Thr Val Asn Ser Tyr Lys Arg Leu Val Val Gly Arg Ser Leu

290 295 300

Ser Gly Ala Thr Trp Ala Pro Ala Tyr Ile Ala Tyr Gly Asn Asn Asn

305 310 315 320

Arg Ser Thr Leu Val Arg Ile Pro Tyr Gly Arg Leu Glu Leu Arg Leu

325 330 335

Cys Asp Gly Ser Cys Asn Pro Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ile Ala

340 345 350

Ala Gly Leu Asp Gly Val Ala Arg Glu Leu Asp Pro Gly Thr Gly Arg

355 360 365

Asp Asp Asn Leu Tyr Asp Tyr Ser Leu Glu Gln Leu Ala Glu Phe Gly

370 375 380

Ile Gly Ile Leu Pro Gln Asn Leu Gly Glu Ala Leu Asp Ala Leu Glu

385 390 395 400

Ala Asp Gln Val Ile Met Asp Ala Met Gly Pro Gly Leu Ser Lys Glu

405 410 415

Phe Val Glu Leu Lys Arg Met Glu Trp Val Asp Tyr Met Arg His Val

420 425 430

Ser Asp Trp Glu Ile Asn Arg Tyr Val Gln Phe Tyr

435 440

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 随机引物-F(无)

<400> 4

gatatacata tgaagagcct ggaag 25

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 随机引物-R(无)

<400> 5

cccaagcttg tagaattgaa catagcgg 28

Claims (10)

1.一种具有热稳定性的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其特征在于：编码所述突变体的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体，其特征在于：编码所述突变体的基因序列如SEQ ID NO.2所示，或编码所述突变体的基因序列为编码权利要求1所述的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体在生产茶氨酸中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用包括将权利要求1所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体细胞用于茶氨酸生产的催化体系中进行反应；所述茶氨酸生产的催化体系包括300～600mM谷氨酸钠和/或谷氨酸；350～600mM乙胺和/或乙胺盐酸盐；120～180mM含镁离子的盐,1～5mM ATP和/或ADP，100～200mM多聚磷酸盐。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述茶氨酸生产的催化体系温度40～55℃，反应pH6～9。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述茶氨酸生产的催化体系中，权利要求1所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的浓度为40～70g/L；还添加30～50g/L的能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的菌体。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的菌体为CN201910642412中所述的菌株BL21-pET30a-ppk2。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含镁离子的盐选自氯化镁和/或硫酸镁；所述多聚磷酸盐选自六偏磷酸钠和/或三聚磷酸钠。

9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述谷氨酸钠和/或谷氨酸的浓度为350～450mM；所述乙胺和/或乙胺盐酸盐的浓度为420～450mM；所述含镁离子的盐浓度为140～160mM；所述ATP和/或ADP的浓度为2mM；所述多聚磷酸盐浓度为160～180mM；所述添加权利要求1所述的γ-谷酰胺甲胺合成酶突变体的gmas DBM湿菌体的浓度为55～65g/L。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的能够以ADP和/或AMP为底物进行ATP循环再生的菌体的浓度为35～45g/L；所述体系温度45～50℃；所述的反应pH 6.5～7.5。

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