CN106119214A - 一种茶氨酸合成酶基因及其制备茶氨酸的方法 - Google Patents

一种茶氨酸合成酶基因及其制备茶氨酸的方法 Download PDF

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孙俊
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Abstract

本发明公开了一种茶氨酸合成酶基因及其制备茶氨酸的方法，所述合成酶的基因cDNA全长为2886bp，阅读框长度为2532bp，所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。该茶氨酸合成酶基因可用于合成制备茶氨酸。具体方法为(1)获得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的目的基因；(2)以pMAL‑c5x为载体，将目的基因连接到载体上，得到重组载体，并将重组载体导入大肠杆菌；(3)将导入重组载体的大肠杆菌进行诱导表达，产生诱导蛋白后加入底物谷氨酸钠与盐酸乙胺，继续培养12h，然后收集培养基中的产物，将产物离心后取上清；用0.22μm水相滤膜过滤，得合成的茶氨酸溶液。本发明合成方法因为与植物体内发生的合成反应类似，具有副反应少，产物精制步骤简单等特点。

Description

一种茶氨酸合成酶基因及其制备茶氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物学领域，具体地说是一种从茶树中分离的茶氨酸合成酶及利用其制备茶氨酸的方法。
背景技术
茶氨酸(Theanine，N-乙基-γ-L-谷氨酰胺)，是1949年日本学者Sakato首次从绿茶中分离并命名的茶树特征性的非蛋白质氨基酸。茶氨酸具有焦糖香味和类似味精的鲜爽味，能缓解苦涩味，增加茶汤的香甜味，改善滋味等作用。茶氨酸的含量与茶叶品质和等级呈正相关，相关系数高达0.787～0.876，在很大程度上影响了绿茶的滋味品质。更重要的是，大量的研究表明茶氨酸具有保健功能和药理作用，如神经保护、放松镇静、兴奋拮抗、改善睡眠、消除疲劳、抗肿瘤等诸多生理活性。
目前制备茶氨酸的方法，主要包括提取法、细胞培养法、化学合成方法以及微生物酶促反应。其中，从茶叶中提取茶氨酸的成本高昂；组织培养虽然可以适度提高茶氨酸的含量，但该法存在操作步骤繁琐、培养周期长、占用空间大、设施成本高等缺点，在生产上尚无法推广应用；利用化学方法合成茶氨酸得率较低，合成产物的分离精制工艺复杂，生产成本高，也难以得到产业化推广应用；现有利用微生物中的谷氨酰胺合成酶、谷氨酰基转肽酶等酶促合成茶氨酸在一定程度上令人满意，但由于通过添加谷氨酰胺和盐酸乙胺合成茶氨酸，产量低，在合成茶氨酸的同时发生加水分解反应，产生副产物谷氨酸，而副产物谷氨酸也使茶氨酸的精制成为问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种从茶树中分离的茶氨酸合成酶并利用其制备茶氨酸的方法。
本发明实现发明目的采用如下技术方案：
本发明提供一种从茶树中克隆的茶氨酸合成酶基因，其特点在于，所述合成酶基因cDNA全长为2886bp，阅读框长度为2532bp，所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
本发明请求保护上述茶氨酸合成酶基因在制备茶氨酸中的应用。
本发明还提供一种上述茶氨酸合成酶基因进行原核表达生产制备茶氨酸的方法，该方法包括如下步骤：
(1)获得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的目的基因；
(2)以pMAL-c5x为载体，将目的基因连接到载体上，得到重组载体，并将重组载体导入大肠杆菌；
(3)将导入重组载体的大肠杆菌进行诱导表达，产生诱导蛋白后加入底物谷氨酸钠与盐酸乙胺，继续培养12h，然后收集培养基中的产物，将产物离心后取上清；用0.22μm水相滤膜过滤，得合成的茶氨酸溶液。
进一步，所述步骤(2)的具体方法为：
1)利用SacI将pMAL-c5x单酶切，酶切时间2h；然后用Axygen公司的DNA回收纯化试剂盒纯化酶切产物并检测其浓度；
2)在0.2mLPCR管中加入：
HD酶预混合液(Enzyme Premix,Takara) 2μL
线性化载体(纯化Sac I酶切的pMAL-c5x) 3μL
PCR产物(纯化的CsGS1-1 ORF) 4.5μL
3)50℃反应15min；
4)将50μL感受态细胞(BL21)于冰上冻融，加入10μL上一步PCR反应的混合物，轻弹管壁，立即冰浴30min；
5)42℃热激50s，冰上放置3min；
6)加入600μL LB培养基，于37℃摇床培养1h(200r/min)；
7)取100μL到含相应抗性的平板上，均匀涂布；
8)37℃倒置培养过夜；
9)选取若干上述8)中的单菌落，划线培养8～10h，挑取经测序验证的阳性克隆菌落用于诱导表达。
进一步，所述步骤(3)中的诱导表达方法为：
1)挑取经测序验证的阳性克隆菌落接种至含5mL LB培养基(含Amp)的摇菌管，37℃，200r/min振荡过夜培养；
2)吸取1mL上述过夜培养的大肠杆菌至含50mL LB培养基的锥形瓶中，加入Amp(100μg/mL)，37℃，200r/min振荡培养3h，然后向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃振荡培养6h(200r/min)；
3)将培养液用离心管离心(6000r/min,10min)；离心后弃上清，加入6mL的PBS(1×)缓冲液超声破碎，后离心(12000r/min，5min)，吸取出上清标记为pMAL-CsGS1-1诱导后上清；沉淀加入1mL PBS(1×)缓冲液，标记为pMAL-CsGS1-1诱导后沉淀；
4)将标记的诱导后上清和诱导后沉淀样品放入-20℃冰箱保存备用；用于合成茶氨酸。
与已有技术相比，本发明有益效果体现在：
本发明的蛋白质，能够利用原核生物表达而得到，可利用大肠杆菌进行大规模培养表达。此外，也可以在真核生物、真核细胞中加以表达。此外，由于茶氨酸合成酶基因来自茶树，能够由谷氨酸钠和盐酸乙胺合成茶氨酸，本发明合成方法因为与植物体内发生的合成反应相似，所以与已有的方法相比较，具有副反应少，产物精制步骤简单等特点。
附图说明
图1是GS1-1ORF阅读框凝胶电泳图
图2是菌落PCR验证GS1-1
图2中，1～12为目的条带，M为Marker
图3是pMAL-GS1-1融合蛋白的SDS-PAGE分析
图3中，1.诱导前空载体；2.诱导后空载体；3.诱导前重组载体；4.诱导后重组载体；5.诱导后前上清；6.诱导后沉淀；M，标准蛋白分子量.
图4是CsGS1-1在BL21体内酶活功能的LC-MS-MS分析(MRM模式)
1.实验组(携带基因，诱导后饲喂底物)；2.对照A空载体(饲喂底物)；3.茶氨酸标品；4.对照B(携带基因，未加底物)
图5A-5B是本发明GS1-1在BL21体内酶活功能的MS-MS验证(PI模式)
图5A为标品，图5B为样品。
具体实施方式
1.1供试材料
茶树品种舒茶早鲜叶采自安徽农业大学教学科研基地，样品采集后液氮迅速冷冻处理，然后保存在－80℃冰箱中备用。
1.2总RNA的提取及cDNA合成
总RNA的提取参照史成颖等CTAB裂解的方法进行并利用天根植物RNA纯化试剂盒纯化。以提取所得茶树总RNA为模板，Oligo(dT)18为引物，按PrimeScriptII RTase(Takara)反转录酶操作说明书合成cDNA第1链。
1.3基因克隆、原核表达与酶活测定
(1)基因来源与GS1-1ORF验证
该基因序列源于安徽农业大学国家茶叶重点实验室构建幼根文库筛选出的EST，通过Clontech RACE试剂盒5’RACE、3’RACE及拼接后验证得到全长，其cDNA全长为2886bp，阅读框长度为2532bp，cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
GS1-1F:5’-ACAAGGAAGGAGGCTCAAGCGGGT-3’；
GS1-1R:5’-ATGCTGGGAGCCCCGTTCGTATCAC-3’
为了保证基因扩增的正确性，采用保真酶Prime STAR Max Premix(Takara)进行PCR反应。
1)在0.2mL PCR管中加入：
将50μL反应液混匀，均分为两管，其中一管作为平行。
2)扩增程序：
3)将所得的PCR产物，80V，45min，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
4)用Axygen公司的DNA回收纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，并检测纯化产物浓度。
按照上述步骤，得到CsGS1-1 ORF阅读框的的扩增产物。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，其结果如图1所示。从图1中可以看出，扩增产物的大小约为2600bp，与预测的2532bp相符。
经菌落PCR(图2)及测序，GS1-1 ORF序列与目标序列一致(如SEQ ID No.1所示,44～2575bp)。
(2)GS1-1的pMAL--c5x表达载体的构建及蛋白诱导表达。
A、表达载体的构建
利用Takara infusion技术，通过单酶切pMAL-c5x载体，造成缺口，然后根据一部分与酶切载体互补，一部分与目的基因互补的特点设计引物。
根据GS1-1 ORF，利用Infusion技术设计表达的上下游引物GS1-1 F和GS1-1 R，具体如下：
GS1-1F:5’-CCGCGATATCGTCGACATGGAGAAATTTGCA-3’
GS1-1R:5’-ATTCGGATCCGTCGACTCAATAGCGATGTAT-3’
1)利用Sac I将pMAL-c5x单酶切，酶切时间2h，而后纯化酶切产物并检测其浓度；
2)在0.2mL PCR管中加入：
3)50℃反应15min；
4)将50μL感受态细胞(BL21)于冰上冻融(轻弹管壁以使细胞悬浮)，加入10μL上步PCR反应的混合物，轻弹管壁，立即冰浴30min；
5)42℃热激50s，冰上放置3min；
6)加入600μL LB培养基，于37℃摇床培养1h(200r/min)；
7)取100μL到含Amp抗性的平板上，均匀涂布；
8)37℃倒置培养过夜；
9)选取若干8)中的单菌落，划线培养8～10h，然后菌落PCR挑选阳性克隆。根据菌落PCR结果，挑选阳性克隆送至英骏公司(Invitrogen)测序。
B、pMAL-CsGS1-1的诱导表达
1)挑取已测序正确的克隆及含有空载体的克隆(未携带CsGS1-1)分别接种至含5mL LB培养基(含Amp 100μg/mL)的摇菌管，37℃，200r/min振荡过夜培养。
2)各吸取1mL上述过夜培养的大肠杆菌至含50mL的LB培养基的锥形瓶中，加入Amp(终浓度100μg/mL)，37℃，200r/min振荡培养3h，此时细菌的OD600nm值大约在0.6～0.8。
3)从50mL的培养基中各吸取1mL培养液，12000r/min，离心5min，弃除上清，分别标记为空载体、pMAL-CsGS1-1诱导前总蛋白，向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃振荡培养6h(200r/min)后，培养液用离心管离心(6000r/min,10min)。
4)离心后弃上清，加入6mL的PBS(1×)缓冲液超声破碎，后离心(12000r/min，5min)，吸取出上清标记为pMAL-CsGS1-1诱导后上清；沉淀加入1mL PBS(1×)缓冲液，标记为pMAL-CsGS1-1诱导后沉淀。
5)将标记的样品放入-20℃冰箱保存备用。
C、pMAL-CsGS1-1表达蛋白的可溶性检测
(1)向诱导前的总蛋白(1mL菌液离心所得)加入80μL的ddH2O，20μL的5×SampleBuffer，向诱导后破碎的上清和沉淀中(1mL菌液离心所得)各加入40μL的ddH2O，10μL的5×Sample Buffer，100℃煮沸5min，备用。
(2)对上述各样品进行蛋白含量测定，上样量为5μg，使用10％的分离胶和5％的积层胶对样品进行SDS-PAGE检测，使用考马斯亮蓝R-250对SDS聚丙烯酰胺凝胶染色30min，染色同时振荡，脱色液脱色直到出现清晰的条带，用凝胶成像系统扫描凝胶，后对融合蛋白的可溶性进行分析。
(3)pMAL-CsGS1-1在大肠杆菌中体内酶活检测
1)样品
在诱导蛋白6h后向培养基中喂饲底物(谷氨酸钠终浓度为200μM、盐酸乙胺1.2mM)；
12h取2mL培养液，离心后取尽上清，将上清稀释10倍，标记为处理组；另将空载体(未携带CsGS1-1)作为对照组A，未加入底物的培养液为对照组B；－20℃备用。样品上样前先离心，后将上清经0.22μm的水相滤膜过滤。
2)检测条件
UPLC-QQQ-MS检测反应产物，用安捷伦的MassHunter软件收集和处理数据。
液相条件：液相柱：Phenomenex Kinetex XB-C18(粒径1.7μm,2.1×100mm)；
柱温：40℃；进样量：2μL，超高效液相色谱1200(Agilent)；
A相：0.1％乙酸；B相：100％乙腈；
流速：0.1mL/min；
质谱条件：三重四级杆串联质谱，离子源为电喷雾(ESI+)，扫描方式为母离子扫描，多反应监测(MRM)，毛细管电压：3.5kV；离子源温度：150℃。
3)蛋白表达结果
在连接酶作用下将PCR产物与酶切载体相连后转化至菌株诱导表达，测序结果和阳性菌落PCR均表明pMAL-GS1-1重组载体已构建成功。之后挑取PCR阳性克隆菌株，经过扩大培养后加入IPTG，诱导后制得蛋白样品，经SDS-PAGE检测(如图3)，IPTG诱导后含有pMAL-GS1-1重组质粒的BL21表达菌株有明显的新蛋白条带，蛋白的分子量约为136kD。而对照只含空载体质粒的表达菌株除了分子标签蛋白条带(42kD)外无新的蛋白条带出现。由此推测出GS1-1基因表达蛋白的分子大小约为94kD，这与预测的分子量93.5kD相符。这表明所表达的蛋白确为GS1-1所表达，本试验中构建的原核表达载体是成功的，而且在破碎后上清中也有目的蛋白出现，说明诱导表达的一部分是可溶的，因此可以通过提取粗酶液检测酶活。
4)GS1-1蛋白的酶活测定
实验组：将导入重组载体(pMAL-GS1-1)的大肠杆菌进行诱导表达蛋白时，产生诱导蛋白5h后加入底物谷氨酸钠200μM与盐酸乙胺1.2mM，继续培养后12h收集培养基中的产物，产物离心后取上清；用0.22μm水相滤膜过滤，进行LC-MS-MS。
对照组：将导入空载体(不含目的基因)的大肠杆菌作为对照，同时诱导并饲喂相同浓度底物，其他处理条件相同。
通过图4和图5可见，实验组添加底物后产生了茶氨酸，而对照CK则没有。利用一系列的茶氨酸标品(2.4～0.0375mg/L)制作标准曲线，将实验组的茶氨酸峰积分后算得积分面积，与标准曲线比较后可知合成的茶氨酸浓度为11.6mg/L。
图5A-5B中：A为标品，B为茶氨酸实验样品(茶氨酸分子量为174.1，m/z 175.1为茶氨酸分子离子峰，m/z 158.2为茶氨酸去掉一个－OH得到的碎片离子峰)。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.茶氨酸合成酶基因，其特征在于，所述合成酶基因cDNA全长为2886bp，阅读框长度为2532bp，所述基因cDNA序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述茶氨酸合成酶基因在制备茶氨酸中的应用。
3.利用权利要求1所述茶氨酸合成酶基因进行原核表达生产制备茶氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的目的基因；
(2)以pMAL-c5x为载体，将目的基因连接到载体上，得到重组载体，并将重组载体导入大肠杆菌；
(3)将导入重组载体的大肠杆菌进行诱导表达，产生诱导蛋白后加入底物谷氨酸钠与盐酸乙胺，继续培养12h，然后收集培养基中的产物，将产物离心后取上清；用0.22μm水相滤膜过滤，得合成的茶氨酸溶液。
4.根据权利要求3所述的方法其特征在于，所述步骤(2)的具体方法为：
1)利用Sac I将pMAL-c5x单酶切，酶切时间2h；而后利用DNA回收纯化试剂盒纯化酶切产物并检测其浓度；
2)在0.2mL PCR管中加入：
HD酶预混合液(Enzyme Premix,Takara) 2μL
线性化载体(纯化Sac I酶切的pMAL-c5x) 3μL
PCR产物(纯化的CsGS1-1ORF) 4.5μL
3)50℃反应15min；
4)将50μL感受态细胞(BL21)于冰上冻融，加入10μL上步PCR反应的混合物，轻弹管壁，立即冰浴30min；
5)42℃热激50s，冰上放置3min；
6)加入600μL LB培养基，于37℃摇床培养1h(200r/min)；
7)取100μL到含Amp(100μg/mL)的平板上，均匀涂布；
8)37℃倒置培养过夜；
9)选取若干8)中的单菌落，划线培养8～10h，挑取经测序验证的阳性克隆菌用于诱导表达。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的诱导表达方法为：
1)挑取经测序验证的阳性克隆菌接种至含5mL LB培养基(含Amp 100μg/mL)的摇菌管，37℃，200r/min振荡过夜培养；
2)吸取1mL过夜培养的大肠杆菌(上述1)至含50mL的LB培养基的锥形瓶中，加入Amp(终浓度为100μg/mL)，37℃，200r/min振荡培养3h，然后向培养基中加入终浓度为0.5mM的IPTG，30℃振荡培养6h(200r/min)；
3)将培养液用离心管离心(6000r/min，10min)；离心后弃上清，加入6mL的PBS(1×)缓冲液超声破碎，后离心(12000r/min，5min)，吸取出上清标记为pMAL-CsGS1-1诱导后上清；沉淀加入1mL PBS(1×)缓冲液，标记为pMAL-CsGS1-1诱导后沉淀；
4)将标记的诱导后上清和诱导后沉淀的蛋白样品放入-20℃冰箱保存备用；用于合成茶氨酸。
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