CN106119321A - 一种用于生物蛋白质定量和示踪的n15稳定同位素标记方法 - Google Patents

一种用于生物蛋白质定量和示踪的n15稳定同位素标记方法 Download PDF

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肖传乐
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Abstract

本发明公开了一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，然后再将酵母中提取高纯度N15蛋白转化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨，用于培养多种生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记。本发明方法可应用生物种类多，操作简便，试验成本低，试验周期短，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。

Description

一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法
技术领域
本发明涉及蛋白质稳定同位素标记定量的技术领域，尤其是指一种用于生物(包括细菌、真菌、植物、藻类等)蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法。
背景技术
生物体内蛋白质定量分析已成为研究蛋白质功能和寻求疾病蛋白标记物和药物靶标的重要途径。目前蛋白质定量技术主要是同位素标记的质谱定量方法。同位素代谢标记法是同位素标记法中的一种，是目前蛋白质定量技术首选方法，它是以同位素元素或同位素标记氨基酸形式掺入到细胞培养基中，在细胞生长代谢过程中完成蛋白质同位素标记。在同位素代谢标记方法的产品中，哺乳动物细胞稳定同位素试剂盒(SILAC)被广泛应用于细胞体内蛋白质定量研究中，也有少量的N15化合物标记应用于植物蛋白质组学和酵母体内蛋白质定量研究中。
SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)是哺乳动物细胞稳定同位素代谢标记技术，其基本原理是采用含有轻、中或重型外源稳定同位素氨基酸(主要有Lys和Arg)加入培养基培养细胞，细胞在新合成的蛋白质中嵌合了同位素氨基酸，经过培养5-6代后(26)，细胞的所有蛋白质基本98％以上的蛋白质被同位素标记。通过不同条件处理，取等量不同处理条件下蛋白质混合，之后经过SDS-PAGE分离和质谱分析，通过比较一级质谱图中同位素峰型的面积大小进行相对定量，同时二级谱图鉴定蛋白质。
SILAC有明显的局限性，其情况如下：
1、应用范围小。SILAC试剂盒仅适用于哺乳动物细胞培养，是通过氨基酸Lys和Arg的C13的同位素标记而实现蛋白质定量，定量适用条件是：生物体内不能通过其它途径合成Lys和Arg氨基酸，也就是说，生物体Lys和Arg氨基酸唯一来源于外界供给。然而一些生物可以通过其它途径(或不需要外界供给Lys和Arg)合成氨基酸,如部分细菌可以通过其它途径合成氨基酸，也就是，常用氨基酸标记方法很难实现细菌蛋白质定量研究，细菌蛋白质组急需要一种元素级别的标记定量方法。因此，发展用于大多数生物的培养和蛋白质元素级别的同位素标记定量方法，即N15稳定同位素代谢培养基(或试剂盒)有很高实用价值和应用前景。
2、操作繁琐。SILAC定量流程包括：细胞培养→蛋白提取→免疫沉淀→电泳分离→酶切消化→质谱检测→定量检测，操作复杂，原代细胞培养标记效率低，不方便实施。
3、试验成本高。SILAC试剂非常昂贵。
4、试验周期长。由于SILAC需要在进行培养的过程中添加标记，所以需要比较长的时间才能比较彻底地标记。虽然整个实验的时间主要取决于细胞生长的速率和所采用的各种样品处理步骤，但一般来说，SILAC实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要20到25天。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于生物(包括细菌、真菌、植物、藻类等)蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，该方法的可应用生物种类多，操作简便，试验成本低，试验周期短，利于人们高效、低成本对大量样品进行蛋白质组分析。
为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，然后再将酵母中提取高纯度N15蛋白转化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨，用于培养多种生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记；其包括以下步骤：
1)使用只含N15(不含N14)的无机培养基对酵母菌进行培养；
2)酵母细胞的裂解；
3)N15酵母蛋白的粗提；
4)N15生物培养基的配制，即是将步骤3)中粗提后产生的N15蛋白胨作为培养基的基本原料，取代常规的N14蛋白胨用于培养，再加入不含N的无机盐物质，制成最终的N15生物培养基。
在步骤1)中，酵母将培养基中的N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，而实际操作中可以根据最终配制的生物培养基选择不同的酵母菌和只含N15(不含N14)的无机培养基配方。下面列出两个例子：
例子1:
实验材料：毕赤酵母x-33
基础盐培养基：M9母液：64g Na2HPO4,15g KH2PO4,2.5g Nacl，5g N15H4cl加入1L水灭菌。取M9母液200mL加入水700mL,加入2mL 1mol/L已灭菌的MgSO4，100uL已灭菌的1mol/LCacl2(可加可不加)，在M9基础盐培养基中添加0.5％葡萄糖和30ug/mL的链霉素。
YPD培养基:10g酵母粉，20g蛋白胨，2％的葡萄糖，添加30ug/mL的链霉素。
裂解缓冲液(pH7.4):①50mM(pH7.4)磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer,PB)②1mMMPSF。
例子2：
实验材料：产胱酵母、酿酒酵母
基础盐培养基：M9母液：64g Na2HPO4，15g KH2PO4，2.5g Nacl，5g N15H4cl加入1L水灭菌。取M9母液200mL加入水700mL，加入2mL 1mol/L已灭菌的MgSO4，100uL已灭菌的1mol/L Cacl2(可加可不加)，在M9基础盐培养基中添加0.5％葡萄糖和30ug/mL的链霉素。
YPD培养基：10g酵母粉，20g蛋白胨，2％葡萄糖，30ug/mL链霉素。
溶解10g酵母粉，20g蛋白胨于900ml水中，(如制平板加入20g琼脂粉)，高压蒸汽灭菌，加入100ml 20g葡萄糖，(葡萄糖溶液灭菌后加入)。
注意：葡萄糖，酵母粉，蛋白胨溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15min灭菌。
在步骤2)中，酵母细胞的裂解具体是采用玻璃珠破碎法或液氮研磨法。下面对这两种方法进行阐述：
采用玻璃珠破碎法时，步骤如下：
1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中，放入摇床27-33℃，190-210rpm培养1-3天。
2)按1％-3％的接种量取发酵液，6000-8000rpm，4-6min离心，取上清，0.6％-0.10％Nacl溶液洗涤俩次，接种于基础盐培养基中，27-33℃，190-210rpm，摇5-7天。
3)将发酵好的发酵液离心7000-9000rpm，9-11min，去上清，蒸馏水洗涤俩次，加入1-3mL的裂解缓冲液，然后加入等体积的灭过菌的酸化玻璃珠，漩涡震荡1-3min，冰浴1-3min，18-26次(镜检检测破碎程度)。
4)2700-3000rpm，9-11min离心，分为两个部分：上清液和沉淀物，沉淀物放入研钵，加入酸化后的石英砂或玻璃珠及液氮研磨，研磨后加入4.5-7.5mol/L的Hcl溶液，混匀，300-700rpm离心，去除石英砂及玻璃珠；上清液加入具塞试管中，加入等体积的HCl,约为4.5-7.5mol/L的HCl溶液。
采用液氮研磨法时，步骤如下：
1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中，放入摇床27-33℃，190-210rpm培养1-3天。
2)按1％-3％的接种量取发酵液，6000-8000rpm，4-6min离心，取上清，0.6％-1.0％Nacl溶液洗涤两次，接种于N15基础盐培养基中，27-33℃，150-250rpm，摇床培养4-8天。
3)3500-5000rpm，离心25-35min，用0.3％-0.7％的Na2CO3溶液对酵母菌洗涤两次脱嗅。
4)破壁(用液氮研磨)：离心收菌体，称湿重，用TGE buffer悬浮菌体，重量(g))：buffer体积(毫升)＝1：1--1：2。用注射器将菌液加入液氮中，控制加入速度，使得菌液进入液氮中后形成小颗粒，太快容易结成块。将菌体液氮颗粒转入高速打碎器，约2-3万转/分破碎1分钟，菌体颗粒应该成粉末状。倒出粉末，水浴融化后，再用注射器加入液氮中，重复上述步骤，重复3次。高速离心收上清，上清中含目标蛋白。
在步骤3)中，N15酵母蛋白的粗提即是提取步骤2)中裂解的酵母细胞中的蛋白，蛋白质中氨基酸的N元素均为N15，而N15酵母蛋白的粗提具体是采用蛋白质半水解法(酸解)或酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)。下面对这两种方法进行阐述：
采用蛋白质半水解法(酸解)时，步骤如下：
1)把5-7mol/L的Hcl溶液装入具塞玻璃管后，加入液氮，试管中的空气，密封后放入约110℃的烘箱，酸解8-10个小时；
2)酸解后取出，用氢氧化钠溶液调pH；
3)放入80-90℃的烘箱干燥，1-2h烘干，获取N15蛋白胨，其物质分子量大概在600-300Da的肽段。
采用酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)时，步骤如下：
1)自溶：加0.5％-1.5％Nacl溶液搅拌，配制成质量分数为10％-15％的酵母悬液，调节pH5.5-6.5，温度40-55℃，调节时间24-28h；
2)灭酶活，温度80-90℃，0.5-1h；
3)离心，3500-5000rpm，25-35min，去沉淀；
4)真空浓缩，真空度0.09-0.093MPa，温度50-60℃。
在步骤4)中，可以依据情况配制N15细菌培养基、N15真菌培养基、N15植物培养基、N15藻类培养基等，最终制备的培养基中N元素全部来源于步骤3)中粗提后蛋白胨的N15，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨用于培养生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记，而无机盐和培养基的具体制作条件要根据不同生物的生长特征而定。
本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
1、应用范围广。本发明是一种适用于大多数生物(包括细菌、真菌、植物、藻类等)的培养和蛋白质元素级别的同位素标记定量方法，即N15稳定同位素代谢培养基(或试剂盒)的制备方法，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，再将酵母中提取高纯度N15蛋白转化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨，可用于培养多种生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记，具有很高实用价值和应用前景。
2、操作简便。省去细胞培养、免疫沉淀、电泳分离、酶切消化等步骤，方便实施。
3、试验成本低。本发明所用试剂和材料大多是普通试剂和材料，成本低。
4、试验周期短。省去细胞培养等步骤，一般来说，实验从开始到结束，包括数据分析，大约需要8到15天。
具体实施方式
下面结合多个具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1(N15细菌培养基的制备)
本实施例所述的用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，具体是N15稳定同位素标记培养基的制备方法，包括以下步骤：
1)使用只含N15(不含N14)的无机培养基对酵母菌进行培养；
此处采用毕赤酵母x-33和基础盐培养基(M9母液)；
2)采用玻璃珠破碎法进行酵母细胞的裂解；
3)采用蛋白质半水解法(酸解)进行N15酵母蛋白的粗提；
4)N15细菌培养基的配制，即是将步骤3)中粗提后产生的N15蛋白胨作为培养基的基本原料，取代常规的N14蛋白胨用于培养，再加入不含N的无机盐物质，制成最终的N15细菌培养基。
1、培养基配方的探索：按以下配方配制1L的培养基
7号培养基：酵母粗提蛋白15-25g/L，1-3％的葡萄糖
培养基成分可以根据具体细菌品种不同而调整其成分和比例。本实施实例采用1-6号培养基蛋白胨质量分别为20g,15g,8g,3g,1g,0.1g；葡萄糖都为2％，7号培养基：酵母粗提蛋白20g/L，2％的葡萄糖。
2、培养菌种
3、分别将以上菌种接种于1-6号培养基，150-250rpm，25-35℃培养，每天测其OD值，绘制生长曲线，注意达到最大生长量的OD值及天数或者培养时间。本实施实例采用200rpm，30℃培养。
4、将以上菌种接种于7号培养基，150-250rpm，25-35℃培养，每天测其OD值，绘制生长曲线，注意达到最大生长量的OD值及天数或者培养时间。本实施实例采用200rpm，30℃培养。
5、整理数据，根据不同的菌属设计不同的培养配方，主要是替代细菌培养基中氮源。
实施例2(N15真菌培养基的制备)
与实施例1不同的是本实施例的步骤1)采用产胱酵母、酿酒酵母和基础盐培养基(M9母液)，其步骤2)采用液氮研磨的方法进行酵母细胞的裂解，其步骤3)采用酵母自溶法(利用自身酶解蛋白)进行N15酵母蛋白的粗提，最终步骤4)制得N15真菌培养基。
N15真菌培养基的配制
注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、MgSO4.7H2O配成高浓度的母液，灭菌后按量加入培养基中；
②葡萄糖配成母液，灭菌后按量加入培养基中。
无机盐种类可以根据具体真菌品种不同而调整其成分和比例。本实施实例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O浓度分别为0.05g/L、0.1g/L、2.0g/L、8.0g/L、20g/L、0.3g/L。
实施例3(N15植物培养基的制备)
与实施例1不同的是本实施例的步骤4)最终制作N15植物培养基，具体步骤如下：
1)使用只含N15(不含N14)的无机培养基对酵母菌进行培养；此处可采用毕赤酵母x-33和和基础盐培养基(M9母液)；
2)采用玻璃珠破碎法进行酵母细胞的裂解；
3)采用蛋白质半水解法(酸解)进行N15酵母蛋白的粗提；
4)N15植物培养基的配制：下面培养基的蛋白胨来自步骤3)中N15酵母蛋白的粗提。
N15植物培养基的配制：
注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、KH2PO4、Na—EDTA、MgSO4.7H2O配成高浓度的母液，灭菌后按量加入培养基中。
②葡萄糖配成母液，灭菌后按量加入培养基中。
③土壤浸出液含有铁、锰、铜、锌等藻类需要的微量元素，不含N元素。无机盐种类可以根据具体植物品种不同而调整其成分和比例。本实施实例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、Na—EDTA、KH2PO4、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O、IAA或NAA、土壤浸出液浓度分别为4.0g/L、3.5g/L、1.0g/L、7.0g/L、2.0g/L、7.0g/L、20g/L、1.2g/L、0.1g/L、8滴/L。
实施例4(N15藻类培养基的制备)
与实施例1不同的是本实施例的步骤4)最终制作N15藻类培养基，具体步骤如下：
1)使用只含N15(不含N14)的无机培养基对酵母菌进行培养；此处可采用毕赤酵母x-33和基础盐培养基(M9母液)；
2)采用玻璃珠破碎法进行酵母细胞的裂解；
3)采用蛋白质半水解法(酸解)进行N15酵母蛋白的粗提；
4)N15藻类培养基的配制：下面培养基的蛋白胨来自步骤3)中N15酵母蛋白的粗提。
N15藻类培养基的配制：
注：①FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、KH2PO4、MgSO4.7H2O配成高浓度的母液，灭菌后按量加入培养基中。
②葡萄糖配成母液，灭菌后按量加入培养基中。
③土壤浸出液含有铁、锰、铜、锌等藻类需要的微量元素，不含N元素。
④可根据具体藻类特殊需要添加培养基成分，如蓝藻需钼，硅藻需硅。
无机盐种类可以根据具体藻类品种不同而调整其成分和比例。本实施实例采用FeSO4.7H2O、Cacl2.2H2O、Na2HPO4.12H2O、KH2PO4、粗提蛋白、葡萄糖、MgSO4.7H2O、土壤浸出液浓度分别为3.0g/L、2.5g/L、2.0g/L、2.0g/L、5.0g/L、15.0g/L、0.6g/L、5滴/L。
以上所述实施例只为本发明之较佳实施例，并非以此限制本发明的实施范围，故凡依本发明之形状、原理所作的变化，均应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：首先，利用酵母将N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，然后再将酵母中提取高纯度N15蛋白转化成N15酵母蛋白胨，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨，用于培养多种生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记；其包括以下步骤：
1)使用只含N15的无机培养基对酵母菌进行培养；
2)酵母细胞的裂解；
3)N15酵母蛋白的粗提；
4)N15生物培养基的配制，即是将步骤3)中粗提后产生的N15蛋白胨作为培养基的基本原料，取代常规的N14蛋白胨用于培养，再加入不含N的无机盐物质，制成最终的N15生物培养基。
2.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤1)中，酵母将培养基中的N15无机盐转化成生物蛋白，当酵母培养代数达到6代以上，其提取蛋白98％以上都是N15的蛋白，而实际操作中根据最终配制的生物培养基选择不同的酵母菌和只含N15的无机培养基配方。
3.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤2)中，酵母细胞的裂解具体是采用玻璃珠破碎法或液氮研磨法。
4.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤3)中，N15酵母蛋白的粗提即是提取步骤2)中裂解的酵母细胞中的蛋白，蛋白质中氨基酸的N元素均为N15，而N15酵母蛋白的粗提具体是采用蛋白质半水解法或酵母自溶法。
5.根据权利要求1所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：在步骤4)中，依据情况配制N15细菌培养基、N15真菌培养基、N15植物培养基或N15藻类培养基，最终制备的培养基中N元素全部来源于步骤3)中粗提后蛋白胨的N15，利用N15蛋白胨取代常规的N14蛋白胨用于培养生物，为生物蛋白质标记定量和示踪提供特异性的N15同位素标记，而无机盐和培养基的具体制作条件要根据不同生物的生长特征而定。
6.根据权利要求3所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：
采用玻璃珠破碎法时，步骤如下：
1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中，放入摇床27-33℃，190-210rpm培养1-3天；
2)按1％-3％的接种量取发酵液，6000-8000rpm，4-6min离心，取上清，0.6％-0.10％Nacl溶液洗涤俩次，接种于基础盐培养基中，27-33℃，190-210rpm，摇5-7天；
3)将发酵好的发酵液离心7000-9000rpm，9-11min，去上清，蒸馏水洗涤俩次，加入1-3mL的裂解缓冲液，然后加入等体积的灭过菌的酸化玻璃珠，漩涡震荡1-3min，冰浴1-3min，18-26次；
4)2700-3000rpm，9-11min离心，分为两个部分：上清液和沉淀物，沉淀物放入研钵，加入酸化后的石英砂或玻璃珠及液氮研磨，研磨后加入4.5-7.5mol/L的Hcl溶液，混匀，300-700rpm离心，去除石英砂及玻璃珠；上清液加入具塞试管中，加入等体积的HCl,约为4.5-7.5mol/L的HCl溶液；
采用液氮研磨法时，步骤如下：
1)挑取酵母菌单菌落在液体YPD培养基中，放入摇床27-33℃，190-210rpm培养1-3天；
2)按1％-3％的接种量取发酵液，6000-8000rpm，4-6min离心，取上清，0.6％-1.0％Nacl溶液洗涤两次，接种于N15基础盐培养基中，27-33℃，150-250rpm，摇床培养4-8天；
3)3500-5000rpm，离心25-35min，用0.3％-0.7％的Na2CO3溶液对酵母菌洗涤两次脱嗅；
4)破壁：离心收菌体，称湿重，用TGE buffer悬浮菌体，重量(g)：buffer体积(毫升)＝1：1—1：2；用注射器将菌液加入液氮中，控制加入速度，使得菌液进入液氮中后形成小颗粒，将菌体液氮颗粒转入高速打碎器，约2-3万转/分破碎1分钟，菌体颗粒应该成粉末状；倒出粉末，水浴融化后，再用注射器加入液氮中，重复上述步骤，重复3次；高速离心收上清，上清中含目标蛋白。
7.根据权利要求4所述的一种用于生物蛋白质定量和示踪的N15稳定同位素标记方法，其特征在于：
采用蛋白质半水解法时，步骤如下：
1)把5-7mol/L的Hcl溶液装入具塞玻璃管后，加入液氮，试管中的空气，密封后放入约110℃的烘箱，酸解8-10个小时；
2)酸解后取出，用氢氧化钠溶液调pH；
3)放入80-90℃的烘箱干燥，1-2h烘干，获取N15蛋白胨，其物质分子量大概在600-300Da的肽段；
采用酵母自溶法时，步骤如下：
1)自溶：加0.5％-1.5％Nacl溶液搅拌，配制成质量分数为10％-15％的酵母悬液，调节pH5.5-6.5，温度40-55℃，调节时间24-28h；
2)灭酶活，温度80-90℃，0.5-1h；
3)离心，3500-5000rpm，25-35min，去沉淀；
4)真空浓缩，真空度0.09-0.093MPa，温度50-60℃。
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