CN103540534A - 高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物藻类的培养方法，是一种高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，该方法按下述步骤进行：第一步，分离出沙漠绿藻培养物；第二步，将单个沙漠绿藻落接种在固体平板上重复培养直至接种8代至10代，得藻体；第三步，将藻体接种到液体培养基中，工业化密闭培养3天至15天。本发明先对沙漠绿藻进行培养，提高沙漠土壤培养液中细胞浓度，获得目的藻种生物量高的目的藻种沙漠土壤培养液后再进行分离目的藻种，然后进行纯化获得高产的目的藻种后，最后进行大规模的工业化培养，这样能保证成功分离目的藻株，并且本发明采用的培养方法为全无菌培养，不会受到污染源及有害菌的污染，在保证沙漠绿藻产量的情况下，能够大规模培养沙漠绿藻。
Description
技术领域
本发明涉及微生物藻类的培养方法，是一种高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法。
背景技术
藻类（Algae）是植物界中有光合作用色素的一类自养原植体植物，既没有叶子，种子或根，也没有花。有些藻类极小，只有几微米，但有些是很大的，很复杂的组织，像宽大的飘带，例如海带。藻类用孢子进行繁殖，形态各异，大小不一，大多是距今20亿年以上的原始植物。大部分的藻类从远古时期就存在，至今仍存在。藻类的适应性很强，即便在极端恶劣的气候条件下（如在咸盐或冰海地区），它们也能存活。
众所周知，蛋白质饲料是指自然含水率低于45%，干物质中粗纤维又低于18%，而干物质中粗蛋白质含量达到或超过20%的豆类、饼粕类、鱼粉等均划归蛋白质饲料。在饲料中的所含氮化合物叫做“粗蛋白质”，并不是完全意义上的蛋白质，还含有其他复杂的蛋白质、多肽、氨基酸、酰胺、硝酸盐等等，饲料工业上所有的蛋白质饲料几乎都是成熟了的籽实以及籽实的加工产物，它们的含氮化合物主要是蛋白质。蛋白质饲料的另一个制约条件是粗纤维含量在18%以下，就意味着蛋白质饲料含有相当高的可利用能量。
按照主要来源不同，蛋白质饲料可分为植物性蛋白饲料、动物性蛋白饲料、单细胞蛋白饲料和非蛋白氮饲料四大类。单细胞生物蛋白质饲料主要包括一些微生物或单细胞藻类。
塔克拉玛干沙漠绿藻作为极端环境微藻，所分离得到的绿藻作为极端环境微藻，在几十万年的进化中必然会积累出其它绿藻所没有的独特的生理生化及药理特性。塔克拉玛干沙漠绿藻细胞蛋白质含量平均为59.23%，具有作为蛋白质饲料开发的潜力，但是目前没有一套成熟完善的进行分离培养沙漠绿藻的工艺方法，传统的10倍稀释法的分离原理是分离后进行培养，但是此方法中，目的藻种在沙漠土样中的生物量很低，不能保证成功分离目的藻种以及保证目的藻种的生长，同时，在现有的沙漠绿藻培养方法中，现有的培养方法为开放式培养，很容易受到污染源及有害菌的污染。
发明内容
本发明提供了一种高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有的沙漠绿藻培养方法分离培养方法不稳定以及培养沙漠绿藻产量低的问题。
本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，按下述步骤进行：第一步，分离，称取沙漠土壤样品，按每50g至100g沙漠土壤样品中加入200ml至400ml的TAP液体培养基计，向沙漠土壤样品中加入TAP液体培养基，在转速为100rpm至120rpm条件下用摇床摇5 min 至15min，使样品与培养基充分混合，将混合物在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天，等培养物上清液变绿后，按每200μL至300μL上清液涂布在25ml至30ml TAP固体培养基上计，在无菌条件下吸取上清液，涂布在含有TAP固体培养基的培养皿中，并在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到沙漠绿藻培养物；
第二步，纯化，按每单个沙漠绿藻落接种在25ml至30mlTAP固体培养基上计，用已灭过菌的接种环在沙漠绿藻培养物中挑取单个沙漠绿藻落，划线法接种在含有TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到一代沙漠绿藻藻体，再用已灭过菌的接种环在一代沙漠绿藻藻体中挑取单个沙漠绿藻落接种在含有新的TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到二代沙漠绿藻藻体，重复直至接种8代至10代，最后得到纯沙漠绿藻藻体；
第三步，工业化培养，按每个单藻落接种到100ml至500ml TAP液体培养基上计，在纯沙漠绿藻藻体中挑取单藻落，接种到TAP液体培养基中，在温度为25℃至31℃、光照为2000 Lux至4000 Lux条件下进行密闭培养3天至15天制备得到生物量达到10
11
个细胞/ml至10
12
个细胞/ml的沙漠绿藻母种子悬浮液，按每50L至500L TAP液体培养基中接入1%至3%体积的沙漠绿藻母种子悬浮液计，向新的TAP液体培养基中接入沙漠绿藻母种子悬浮液，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至4000Lux条件下进行工业化密闭培养3天至15天。
下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
上述TAP液体培养基为0.4gNH
4
Cl、0.156gMgSO
4
、0.05gCaCl
2
·H
2
O、0.142gK
2
HPO·3H
2
O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH
3
COONa·3H
2
O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液得到TAP液体培养基，该TAP液体培养基的PH范围为6.8至7.0。
上述TAP固体培养基按下述方法得到：将0.4gNH
4
Cl、0.156gMgSO
4
、0.05gCaCl
2
·H
2
O、0.142gK
2
HPO·3H
2
O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH
3
COONa·3H
2
O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液，向该溶液中加入溶液总体积1.8%至2%的琼脂粉，并将该溶液的PH范围调节到6.8至7.0，将该溶液在温度为121℃、压力为0.11MPa进行高压湿热灭菌20min后，在40℃下冷却并凝固，使其成为固体状态即得到TAP固体培养基。
上述沙漠土壤样品为塔克拉玛干沙漠中采集过来的沙漠土壤样品。
本发明先对沙漠绿藻进行培养，提高沙漠土壤培养液中细胞浓度，获得目的藻种生物量高的目的藻种沙漠土壤培养液后再进行分离目的藻种，然后进行纯化获得高产的目的藻种后，最后进行大规模的工业化培养，这样能保证成功分离目的藻株，并且本发明采用的培养方法为全无菌培养，不会受到污染源及有害菌的污染，在保证沙漠绿藻产量的情况下，能够大规模培养沙漠绿藻。
附图说明
附图1为本发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10的光学显微镜图。
附图2为本发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10的扫描电镜图。
附图3为本发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10在GENEBANK上注册号为FJ888523.1基因序列。
具体实施方式
本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。本发明中所提到的水，除特别指明外，均为去离子水。
下面结合实施例对本发明作进一步描述：
实施例1，该高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法按下述步骤进行：第一步，分离，称取沙漠土壤样品，按每50g至100g沙漠土壤样品中加入200ml至400ml的TAP液体培养基计，向沙漠土壤样品中加入TAP液体培养基，在转速为100rpm至120rpm条件下用摇床摇5 min 至15min，使样品与培养基充分混合，将混合物在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天，等培养物上清液变绿后，按每200μL至300μL上清液涂布在25ml至30ml TAP固体培养基上计，在无菌条件下吸取上清液，涂布在含有TAP固体培养基的培养皿中，并在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到沙漠绿藻培养物；
第二步，纯化，按每单个沙漠绿藻落接种在25ml至30mlTAP固体培养基上计，用已灭过菌的接种环在沙漠绿藻培养物中挑取单个沙漠绿藻落，划线法接种在含有TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到一代沙漠绿藻藻体，再用已灭过菌的接种环在一代沙漠绿藻藻体中挑取单个沙漠绿藻落接种在含有新的TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到二代沙漠绿藻藻体，重复直至接种8代至10代，最后得到纯沙漠绿藻藻体；
第三步，工业化培养，按每个单藻落接种到100ml至500ml TAP液体培养基上计，在纯沙漠绿藻藻体中挑取单藻落，接种到TAP液体培养基中，在温度为25℃至31℃、光照为2000 Lux至4000 Lux条件下进行密闭培养3天至15天制备得到生物量达到10
11
个细胞/ml至10
12
个细胞/ml的沙漠绿藻母种子悬浮液，按每50L至500L TAP液体培养基中接入1%至3%体积的沙漠绿藻母种子悬浮液计，向新的TAP液体培养基中接入沙漠绿藻母种子悬浮液，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至4000Lux条件下进行工业化密闭培养3天至15天。
实施例2，该高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法按下述步骤进行：第一步，分离，称取沙漠土壤样品，按每50g或100g沙漠土壤样品中加入200ml或400ml的TAP液体培养基计，向沙漠土壤样品中加入TAP液体培养基，在转速为100rpm或120rpm条件下用摇床摇5 min 或15min，使样品与培养基充分混合，将混合物在温度为25℃或31℃、光照为2000Lux或3000Lux条件下培养3天或15天，等培养物上清液变绿后，按每200μL或300μL上清液涂布在25ml或30ml TAP固体培养基上计，在无菌条件下吸取上清液，涂布在含有TAP固体培养基的培养皿中，并在温度为25℃或31℃、光照为2000Lux或3000Lux条件下培养3天或15天得到沙漠绿藻培养物；
第二步，纯化，按每单个沙漠绿藻落接种在25ml或30mlTAP固体培养基上计，用已灭过菌的接种环在沙漠绿藻培养物中挑取单个沙漠绿藻落，划线法接种在含有TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃或31℃、光照为2000Lux或3000Lux条件下培养3天或15天得到一代沙漠绿藻藻体，再用已灭过菌的接种环在一代沙漠绿藻藻体中挑取单个沙漠绿藻落接种在含有新的TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃或31℃、光照为2000Lux或3000Lux条件下培养3天或15天得到二代沙漠绿藻藻体，重复直至接种8代或10代，最后得到纯沙漠绿藻藻体；
第三步，工业化培养，按每个单藻落接种到100ml或500ml TAP液体培养基上计，在纯沙漠绿藻藻体中挑取单藻落，接种到TAP液体培养基中，在温度为25℃或31℃、光照为2000 Lux或4000 Lux条件下进行密闭培养3天或15天制备得到生物量达到10
11
个细胞/ml或10
12
个细胞/ml的沙漠绿藻母种子悬浮液，按每50L或500L TAP液体培养基中接入1%或3%体积的沙漠绿藻母种子悬浮液计，向新的TAP液体培养基中接入沙漠绿藻母种子悬浮液，在温度为25℃或31℃、光照为2000Lux或4000Lux条件下进行工业化密闭培养3天或15天。
实施例3，作为上述实施例的优选，TAP液体培养基为0.4gNH
4
Cl、0.156gMgSO
4
、0.05gCaCl
2
·H
2
O、0.142gK
2
HPO·3H
2
O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH
3
COONa·3H
2
O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液得到TAP液体培养基，该TAP液体培养基的PH范围为6.8至7.0。
实施例4，作为上述实施例的优选，TAP固体培养基按下述方法得到：将0.4gNH
4
Cl、0.156gMgSO
4
、0.05gCaCl
2
·H
2
O、0.142gK
2
HPO·3H
2
O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH
3
COONa·3H
2
O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液，向该溶液中加入溶液总体积1.8%至2%的琼脂粉，并将该溶液的PH范围调节到6.8至7.0，将该溶液在温度为121℃、压力为0.11MPa进行高压湿热灭菌20min后，在40℃下冷却并凝固，使其成为固体状态即得到TAP固体培养基。
实施例5，作为上述实施例的优选，上述沙漠土壤样品为塔克拉玛干沙漠中采集过来的沙漠土壤样品。
本发明先对沙漠绿藻进行培养，提高沙漠土壤培养液中细胞浓度，获得目的藻种生物量为10
11
个细胞/ml至10
12
个细胞/ml的目的藻种沙漠土壤培养液后再进行分离目的藻种，然后进行纯化获得高产的目的藻种后，最后进行大规模的工业化培养，这样能保证成功分离目的藻株，并且本发明采用的培养方法为全无菌培养，不会受到污染源及有害菌的污染，在保证沙漠绿藻产量的情况下，能够大规模培养沙漠绿藻。
在本发明上述实施例中提到的沙漠绿藻属于衣藻（Chlamydomonas）属的潜在新种，该沙漠绿藻命名为Chlamydomonas sp. HTL-10，并已进行分子鉴定，发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10的光学显微镜图如附图1所示，本发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10的扫描电镜图如附图2所示，Chlamydomonas sp. HTL-10的ITS-DNA序列（如附图3所示）被注册在美国国际核酸数据库中（GENBANK）注册号FJ888523.1，便于永久保存；采用硫氨酸硫酸铵沉淀（盐析）法提取该沙漠绿藻的总蛋白质，通过Bradford法蛋白定量试剂盒法所测定出本发明中沙漠绿藻Chlamydomonas sp. HTL-10的细胞蛋白含量平均为59.23%。
以上技术特征构成了本发明的最佳实施例，其具有较强的适应性和最佳实施效果，可根据实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
Claims (5)
1.一种高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，其特征在于按下述步骤进行：第一步，分离，称取沙漠土壤样品，按每50g至100g沙漠土壤样品中加入200ml至400ml的TAP液体培养基计，向沙漠土壤样品中加入TAP液体培养基，在转速为100rpm至120rpm条件下用摇床摇5 min 至15min，使样品与培养基充分混合，将混合物在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天，等培养物上清液变绿后，按每200μL至300μL上清液涂布在25ml至30ml TAP固体培养基上计，在无菌条件下吸取上清液，涂布在含有TAP固体培养基的培养皿中，并在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到沙漠绿藻培养物；
第二步，纯化，按每单个沙漠绿藻落接种在25ml至30mlTAP固体培养基上计，用已灭过菌的接种环在沙漠绿藻培养物中挑取单个沙漠绿藻落，划线法接种在含有TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到一代沙漠绿藻藻体，再用已灭过菌的接种环在一代沙漠绿藻藻体中挑取单个沙漠绿藻落接种在含有新的TAP固体培养基的固体平板上，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至3000Lux条件下培养3天至15天得到二代沙漠绿藻藻体，重复直至接种8代至10代，最后得到纯沙漠绿藻藻体；
第三步，工业化培养，按每个单藻落接种到100ml至500ml TAP液体培养基上计，在纯沙漠绿藻藻体中挑取单藻落，接种到TAP液体培养基中，在温度为25℃至31℃、光照为2000 Lux至4000 Lux条件下进行密闭培养3天至15天制备得到生物量达到1011个细胞/ml至1012个细胞/ml的沙漠绿藻母种子悬浮液，按每50L至500L TAP液体培养基中接入1%至3%体积的沙漠绿藻母种子悬浮液计，向新的TAP液体培养基中接入沙漠绿藻母种子悬浮液，在温度为25℃至31℃、光照为2000Lux至4000Lux条件下进行工业化密闭培养3天至15天。
2.根据权利要求1所述的高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，其特征在于TAP液体培养基为0.4gNH4Cl、0.156gMgSO4、0.05gCaCl2·H2O、0.142gK2HPO·3H2O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH3COONa·3H2O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液得到TAP液体培养基，该TAP液体培养基的PH范围为6.8至7.0。
3.根据权利要求1或2所述的高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，其特征在于TAP固体培养基按下述方法得到：将0.4gNH4Cl、0.156gMgSO4、0.05gCaCl2·H2O、0.142gK2HPO·3H2O、2.42gTris Base、1.5mlHCl、1.0ml冰乙酸、2g CH3COONa·3H2O和1ml微量元素溶于水配制成1L的溶液，向该溶液中加入溶液总体积1.8%至2%的琼脂粉，并将该溶液的PH范围调节到6.8至7.0，将该溶液在温度为121℃、压力为0.11MPa进行高压湿热灭菌20min后，在40℃下冷却并凝固，使其成为固体状态即得到TAP固体培养基。
4.根据权利要求1或2所述的高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，其特征在于沙漠土壤样品为塔克拉玛干沙漠中采集过来的沙漠土壤样品。
5.根据权利要求3所述的高蛋白沙漠绿藻的工业化培养方法，其特征在于沙漠土壤样品为塔克拉玛干沙漠中采集过来的沙漠土壤样品。
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Effective date of registration: 20200210 Address after: 830000 floor 1, building 1, No.202, Taishan street, Urumqi Economic and Technological Development Zone (Toutunhe District), Xinjiang Uygur Autonomous Region Patentee after: Xinjiang tuobida Technology Development Co., Ltd Address before: Room 509, room five, Xinjiang, Urumqi, Xinjiang economic and Technological Development Zone, No. 531 export processing zone Patentee before: Xinjiang Longbo ecological environmental protection Co., Ashley leaves |
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