CN106754562A - 一种高产细菌多糖的菌株及其发酵中药废弃物制备多糖的方法 - Google Patents

一种高产细菌多糖的菌株及其发酵中药废弃物制备多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物技术领域，涉及一种高产细菌多糖的菌株及其发酵中药废弃物制备多糖的方法，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2016273。中间苍白杆菌ZY03菌株在蔗糖含量为10g/L的培养基中，多糖的产量最高可达6g/L，转化率最高可达67％。

Description

一种高产细菌多糖的菌株及其发酵中药废弃物制备多糖的 方法
技术领域
本发明属于生物化工与工艺领域，涉及一种生物吸附剂吸附金属离子的方法，尤其涉及一种中间苍白杆菌胞外多糖及其应用。
背景技术
多糖是一类广泛存在于自然界的生物体产生的独特的生物大分子。它具有各种各样特殊的且在大多数情况下相当复杂的化学结构，不同的生理功能和广泛的(潜在的)应用价值。近些年来微生物多糖作为一种新型发酵产品，具有独特的物化性质，已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、悬浮剂和润滑剂等应用于石油、化工、食品、制药、环保和化妆品等多个领域。由于多糖同透明质酸、黄原胶、热凝胶、结冷胶、威兰胶一样在一定的浓度范围内表现出很好的流变学特性，非牛顿流体具有假塑流变性其保湿性和成膜性在化妆品方面也具有广泛的应用前景。目前已报道的多糖产生菌生产多糖时，培养基成分营养丰富，通常会造成产物得率不高，副产物多，产品后续分离纯化过程复杂等问题，并且多糖生产大多停留在实验室水平。因此筛选得到一株营养要求低、多糖产量高又适合工业化规模生产多糖的菌株具有十分重要的意义。
中间苍白杆菌属的成员包含在变形菌域的α-2亚群中，一般具有对腈类等含氮基团化合物的水解能力，这些细菌本身不会造成慢性感染，工艺使用安全，而且中间苍白杆菌能广泛利用碳水化合物、有机酸、氨基酸等为碳源。
另一方面，细菌及其产物对溶解态的金属离子有很强的配合能力。细菌细胞壁带有负电荷，使得细菌表面具有阴离子的性质。金属离子与细胞表面结构物质上的羟基阴离子和磷酸阴离子发生相互作用而被固定，细菌细胞外膜上的结构成分很容易与金属发生反应，使金属结合到细胞的表面。细菌多糖由至少十个以上的单糖脱水缩合而成的，线性结构的多糖可以将土壤颗粒连接起来；庞大的多糖结构中，含有大量的羟基基团，可以与土壤颗粒形成氢键；也有许多酸性基团，可以与土壤颗粒形成离子键；多糖结构中存在大量的接触点是多糖胶结作用的发挥是至关重要的。目前对细菌多糖活性的研究主要集中在医药、食品、化工领域，细菌多糖在农业土壤方面的研究还较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中间苍白杆菌胞外多糖及其应用，中间苍白杆菌胞外多糖吸附金属离子的方法，这种方法基于我们发现并鉴定一株高产多糖的中间苍白杆菌(Intermediate ochrobactrum)ZY03，并利用该菌株发酵产生细菌胞外多糖并有效吸附金属离子。
为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种中间苍白杆菌胞外多糖，通过高产细菌多糖的菌株ZY03发酵制备中间苍白杆菌胞外多糖。
为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：所述的中间苍白杆菌胞外多糖吸附金属离子的方法，包括以下步骤：
步骤(1)：获得产胞外多糖的中间苍白杆菌ZY03；
步骤(2)：获得中间苍白杆菌胞外多糖；
步骤(3)：中间苍白杆菌胞外多糖对金属离子的吸附；
步骤(4)：中间苍白杆菌胞外多糖对金属离子的解吸附。
优选的，所述步骤(1)的获得产胞外多糖的中间苍白杆菌ZY03的工艺为：从发霉中药药渣获得高效产糖菌株，16srDNA进行菌种鉴定，获得一种高产细菌多糖的菌株，保藏名称：中间苍白杆菌ZY03(Intermediate ochrobactrum ZY03)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为CCTCC M 2016273，以中间苍白杆菌ZY03为生产菌株，接种于天然培养基中，在温度30℃、180rpm转速、通风比1∶1培养基中培养18-24小时，获种子培养液；将所述种子培养液接种于多糖发酵培养基中，摇床中发酵3-5天，得到发酵液。
优选的，所述步骤(2)的获得中间苍白杆菌胞外多糖工艺为：发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，用1-3倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，烘干后得中间苍白杆菌胞外多糖。
优选的，所述步骤(3)的中间苍白杆菌胞外多糖对金属离子的吸附工艺为：获取含金属离子的溶液，调整所述溶液的pH值范围为0-7，向溶液添加中间苍白杆菌胞外多糖，中间苍白杆菌胞外多糖的添加量为每升溶液5-10克，搅拌过滤得到富集有金属离子的中间苍白杆菌胞外多糖。
优选的，所述步骤(4)的中间苍白杆菌胞外多糖对金属离子的解吸附的工艺为：将上述富集有金属离子的中间苍白杆菌胞外多糖加入到有机溶液中进行解吸附。
优选的，所述天然培养基为马铃薯培养基，所述的种子培养液接种于多糖发酵培养基中，种子培养液接种与多糖发酵培养基中的质量浓度为2％～10％。
优选的，所述的多糖发酵培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，(NH4)2SO4 0.8％，葡萄糖2％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％；pH自然。
优选的，所述的有机溶液，是重铬酸钾溶液、醋酸铅溶液、氯化镉溶液、三氯化铁溶液或硫酸铜溶液中的一种。
为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：所述中间苍白杆菌胞外多糖在保湿性和保水性方面中应用。
本发明有益效果：
1.本发明所述的中间苍白杆菌(Intermediate ochrobactrum)ZY03进行发酵的营养要求较低，可以制备得到高产、高纯度胞外多糖，在实验室条件下该菌株产中间苍白杆菌胞外多糖得率可高达67％，高于一般报道杆菌产糖比例(35％～55％)。
2.本发明所述中间苍白杆菌胞外多糖吸附金属离子能力强，对各类重金属离子吸附效率>60％，大于一般多糖的金属离子文献报道吸附率。
3.本发明所述中间苍白杆菌胞外多糖通过吸附金属离子可以达到修复土壤的功效，同时，所述中间苍白杆菌胞外多糖具有保湿与保水作用，在土壤修复、调节领域具有巨大应用价值。
附图说明
图1为中间苍白杆菌ZY03在平面培养基中产糖的照片。
图2为所述中间苍白杆菌胞外多糖的分子质量凝胶渗透色谱图。
本发明提供的中间苍白杆菌ZY03(Intermediate ochrobactrum ZY03)已经于2016年5月20日提交中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为CCTCC NO：M 2016273。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
中间苍白杆菌胞外多糖的菌株的筛选与菌种鉴定
菌种分离碳为来自已经发霉的黄芪药渣，从黄芪药渣中筛选分离获得具有腈类水解酶活力的微生物。液体培养基组成为：蛋白胨8g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，pH 7.0；平板培养基组成为：蛋白胨8g/L，酵母粉4g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L；筛选培养基组成为：甘油3g/L，氯化镁0.4g/L，硫酸镁0.5g/L，亚磷酸氢钠2g/L，亚磷酸氢钾2g/L，灭菌后加入5mL/L的β-氨基丙腈。在筛选培养基上长出菌体的培养液稀释不同梯度，进行平板涂布，选取不同单菌落接种到筛选培养基中进行培养72h，离心得到菌体，取0.5g离心得到菌体，加入10mL磷酸缓冲溶液，震荡混匀，加入0.04mLβ-氨基丙腈,室温水浴转化。上清观察荧光变化，并分别取0，12，24h的样品进行HPLC检测。反应后，经HPLC检测，获得1株具有腈类水解能力的菌株。所述菌株，在天然培养基中生长24h后，菌落大小直径为2mm～3.5mm，生长温度范围为20℃～37℃，最适生长温度为30℃，生长pH范围为7.0～9.0，最适生长pH为8.0。菌体呈短杆状具有平行边及圆端,染色均匀,有鞭毛，具运动性，专性好氧，严格呼吸代谢，革兰氏染色表明此菌株为革兰氏阴性菌。通过16SRNA同源性鉴定及系统发育分析，鉴定此菌株为中间苍白杆菌属，命名为中间苍白杆菌ZY03。
实施例2
中间苍白杆菌ZY03的发酵及静息细胞的制备
将中间苍白杆菌ZY03接种于土豆培养基中，在温度30℃、180rpm转速、通风比1∶1培养基中培养18-24小时，获种子培养液；所述种子培养液接种于多糖发酵培养基中，多糖发酵培养基pH自然，组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，(NH4)2SO4 0.8％，葡萄糖2％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％；10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得中间苍白杆菌ZY03的静息细胞。
实施例3
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体，分别置于4个同样的多糖发酵培养基中，菌体质量浓度为5％，摇床中分别发酵2、3、4、5天；发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，用2倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，烘干后得胞外粗多糖产品，苯酚-浓硫酸法测定多糖含量见表1。
表1发酵不同天数后细菌多糖的含量
实施例4
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体，分别置于4个同样的多糖发酵培养基中，菌体质量浓度为5％，摇床中发酵4天；发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，分别用1、1.5、2.0、3.0体积倍数的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，烘干后得胞外粗多糖产品，苯酚-浓硫酸法测定多糖含量见表2。
表2不同体积无水乙醇提取细菌多糖的含量
实施例5
步骤(1)种子培养：从碳源获得高效产糖菌株，16srDNA进行菌种鉴定，获得采用保藏号为CCTCC M 2016273的中间苍白杆菌(Intermediate ochrobactrum)ZY03，以中间苍白杆菌ZY03为生产菌株，接种于马铃薯培养基中，在温度30℃、180rpm转速、通风比1∶1培养基中培养18-24小时，获种子培养液；
步骤(2)摇床培养：将步骤(1)所述种子培养液接种于多糖发酵培养基中，摇床中发酵3-5天；所述步骤(2)的多糖发酵培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，(NH4)2SO4 0.8％，葡萄糖2％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％；pH自然。种子培养液接种与多糖发酵培养基中的质量浓度为2％～10％。
步骤(3)细菌粗多糖的提取：发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，用1-3倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，烘干后得胞外粗多糖产品。
实施例6
以上述所制备中间苍白杆菌胞外多糖进行吸附重金属离子效果的实验
1)铬的测定—二苯氨基脲比色法
重铬酸钾110℃加热2h干燥放冷，精确称取配成浓度为0.1g/L的铬标准溶液，临用时用水稀至1μg/L。分别移取铬标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，于瓷坩埚中加20％的碳酸钠10mL，水浴中除去水分，然后移入灰化炉中灰化完全(大约4h)，将灰分加40mL水溶解于150mL三角瓶中，加入数滴2％的高锰酸钾，加热10min，加95％乙醇2mL，然后加入5M/L的浓硫酸2mL，继续加热至棕色，调节pH值至中性，过滤，定容25mL，加入2.5mL二苯氨基脲，于540nm处比色并绘制标准曲线。
浓度为20-800μg/mL的重铬酸钾溶液25mL，加入0.2g中间苍白杆菌胞外多糖粉末，分别在恒温振荡器上震荡1-8h，加入95％乙醇醇沉至乙醇浓度达80％，静置高速离心15min，上清液减压浓缩回收乙醇后定容25mL待测。取2mL待测液，加入20％的碳酸钠10mL。水浴中加热蒸发，灰化炉中灰化完全，余下操作同标准曲线，调节pH1-7。根据标准曲线计算铬含量，结果见表3、表4和表5。
2)镉、铅的测定—原子吸收分光光度法
浓度为20-800μg/mL的硝酸铅溶液、氯化镉溶液、溶液25mL，加入0.2g中间苍白杆菌胞外多糖粉末，分别在恒温振荡器上震荡1-8h，加入95％乙醇醇沉至乙醇浓度达80％，静置高速离心15min，上清液减压浓缩回收乙醇后定容25mL待测。消化瓶中加入待测溶液10mL，加入硝酸-高氯酸(4:1)约10mL，通风橱中加热至棕色，冷却加约5mL浓硫酸继续加热至淡黄色或无色，定容25mL，用原子吸收分光光度法测定镉、铅的含量，结果见表3、表4和表5。
3)铁的测定—邻二氮杂菲吸光光度法
分别取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL的标准铁溶液(100mg/L)于6只50mL容量瓶中，加入10％盐酸羟胺溶液1mL，0.15％邻二氮杂菲溶液2mL和1mol/L的醋酸钠溶液5mL，以水稀释至刻度摇匀。于510nm处比色并绘制标准曲线。
浓度为600-4000μg/mL的三氯化铁溶液25mL，加入0.2g中间苍白杆菌胞外多糖粉末，分别在恒温振荡器上震荡1-8h，加入95％乙醇醇沉至乙醇浓度达80％，静置高速离心15min，上清液减压浓缩回收乙醇后定容25mL待测。取待测液1mL于50mL容量瓶中，余下操作同上，在标准曲线上查得铁的浓度，结果见表3、表4和表6。
表3中间苍白杆菌胞外多糖对重金属吸附百分率与吸附时间的关系
精确称取0.2g中间苍白杆菌胞外多糖加入25mL浓度为10μg/mL的重铬酸钾溶液、硝酸铅溶液、氯化镉、三氯化铁溶液，分别在恒温振荡器上震荡1、2、3、4、6、8h，计算出多糖对铬、铅、镉、铁离子的吸附百分率，结果表明中间苍白杆菌胞外多糖对铬、铅、镉离子的吸附在6h时达到最大值，对铁离子吸附在3h时达到最大值。固确定多糖对铬、铅、镉离子的最佳吸附时间为6h，对铁离子的最佳吸附时间为3h。
表4中间苍白杆菌胞外多糖对重金属吸附百分率与pH的关系
精确称取0.2g中间苍白杆菌胞外多糖加入25mL浓度为10μg/mL的不同pH重铬酸钾溶液、硝酸铅溶液、氯化镉、三氯化铁溶液，分别在恒温振荡器上震荡6h(三氯化铁振荡3h)，计算出多糖对铬、铅、镉、铁离子的吸附百分率，结果表明pH值小于4的酸性条件下，多糖对金属离子的吸附较小，弱酸牲至中性溶液中，多糖对铬、铅、镉、铁离子的吸附率增加。且同一pH下，中间苍白杆菌胞外多糖对重金属离子吸附能力由大到小为：Fe3+、Pb2+、Cd2+、Cr6+。
表5中间苍白杆菌胞外多糖对重金属吸附百分率与起始浓度的关系
精确称取0.2g中间苍白杆菌胞外多糖加入25mL浓度为20、40、50、160、240、320、640、800的重铬酸钾溶液、硝酸铅溶液、氯化镉溶液中，分别在恒温振荡器上震荡6h，计算出多糖对铬、铅、镉离子的吸附百分率，结果表明多糖对铬、铅、镉离子的吸附率随着金属离子起始浓度的增加而增加。
表6中间苍白杆菌胞外多糖对对不同浓度的氯化铁溶液中Fe离子的吸附率
精确称取0.2g中间苍白杆菌胞外多糖加入25mL浓度为600、800、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2400的三氯化铁溶液中，在恒温振荡器上震荡3h，计算出多糖对铁离子的吸附百分率，结果表明多糖对铁离子的吸附能力较强，但随着铁离子浓度增加时其吸附率稍有降低可能是铁离子吸附达到饱和时，随着振荡可能有部分Fe3+解吸。
实施例7
以上述所制备中间苍白杆菌胞外多糖进行多糖保湿性和保水性测定
(1)中间苍白杆菌胞外多糖保湿性测定
准确称5.0g质量分数为10％的多糖溶液放置直径6cm的表面皿上，分别置于干硅胶(RH 0％)和饱和Na2CO3溶液(RH 43％)的干燥器中，室温下放置5天，每天称重，甘油作为对照，计算保湿率P，公式如下：
(M为放置后样品质量；M0为初始样品质量，即5.0g)
表7中间苍白杆菌胞外多糖在饱和碳酸钠溶液和干硅胶中的保湿活性
结果表明，饱和Na2CO3和干硅胶中，在测定的时间内所有样品的含水量均逐渐的减少，中间苍白杆菌胞外多糖的保湿率明显优于甘油。
(2)胞外多糖的保水性测定
采用计算土壤水分蒸发速率的方式测定胞外多糖保水性。取3个体积1立方米的正方体容器，普通黄土105℃，4小时烘干至恒重，称量平均分为三份，份土壤质量记为M1，填入容器中压实，连同容器中质量为M2，分别给予相同质量的自来水、10-5g/L的多糖溶液，使土壤充分吸水，所用自来水和多糖溶液的质量记为M3，自来水作为对照。所有容器于30℃恒温放置3周，每周测量容器连同土壤的质量记为M4，计算出水分蒸发率K，公式如下：
土壤水分蒸发率结果见表8：
表8土壤水分蒸发率结果
结果表明，中间苍白杆菌胞外多糖对土壤有一定的保水性，且随着时间的延长，土壤水分蒸发速率降低越明显。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种高产细菌多糖的菌株，其特征在于，保藏名称：中间苍白杆菌ZY03(Intermediate ochrobactrum ZY03)，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉大学，保藏日期：2016年5月20日；保藏号为CCTCC M 2016273。
2.一种如权利要求1所述的高产细菌多糖的菌株的用途，其特征在于，所述高产细菌多糖的菌株ZY03在制备多糖中的应用。
3.一种根据权利要求l所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
步骤(1)种子培养：从碳源获得高效产糖菌株，16srDNA进行菌种鉴定，获得采用保藏号为CCTCC M 2016273的中间苍白杆菌(Intermediate ochrobactrum)ZY03，以中间苍白杆菌ZY03为生产菌株，接种于培养基中，在温度30℃、180rpm转速、通风比1∶1培养基中培养18-24小时，获种子培养液；
步骤(2)摇床培养：将步骤(1)所述种子培养液接种于多糖发酵培养基中，摇床中发酵3-5天；
步骤(3)细菌粗多糖的提取：发酵液经高速离心去除菌体，上清液真空浓缩至原液体积的1/3，用1-3倍体积的无水乙醇沉淀，离心取沉淀，沉淀物采用Sevag法去蛋白，再经乙醇沉淀，沉淀物经等量的75％乙醇洗涤2～3次，烘干后得胞外粗多糖产品。
4.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)的碳源是已经霉变的中药药渣。
5.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述的培养基，是天然培养基。
6.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(1)所述的培养基是马铃薯培养基。
7.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)的摇床培养，种子培养液接种与多糖发酵培养基中的质量浓度为2％～10％。
8.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)的多糖发酵培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：马铃薯汁20％，(NH4)2SO4 0.8％，葡萄糖2％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％；pH自然。
9.根据权利要求3所述的中间苍白杆菌ZY03发酵中药废弃物制备多糖的方法，其特征在于，所述步骤(2)的多糖发酵培养基是中药药渣培养基，培养基组分以质量百分含量计组分如下：中药药渣20-40％，(NH4)2SO4 0.8％，KH2PO4 0.5％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.01％；pH自然，其中中药药渣是五味子药渣、甘草药渣、板蓝根药渣中的一种或几种。
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