CN112625943A - 一种玉米用溶钾菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种玉米用溶钾菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种玉米用溶钾菌剂及其制备方法和应用。该溶钾菌剂由YK4菌株发酵而成，所述YK4菌株的分类命名为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020720。本发明的溶钾菌剂具有显著的溶钾效果，可以大幅度提高土壤中速效性钾的含量，对玉米生长有明显的促进作用，提高玉米产量。本发明的溶钾菌株还具有产吲哚乙酸、产铁载体的能力，同时具有玉米凝集素亲和性，可与玉米凝集素发生凝集反应，YK4菌株在凝集素介导下可长期定殖在玉米根部，稳定地发挥促生效果。

Description

一种玉米用溶钾菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种玉米用溶钾菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
玉米是我国重要的粮食作物之一，工业和农业的许多产品如淀粉、饲料、工业乙醇等，都以玉米为原料，国内对玉米的需求量长期居高不下。钾是维持玉米正常生长发育、保证玉米优质高产的不可缺少的元素之一。钾素可激活细胞内多种酶活性，促进植物光合作用，提高CO2同化率，从而促进植物生长。钾素参与维持植物细胞渗透压平衡，增强植物抗寒、抗盐、抗倒伏等抗逆能力。钾素不足时，植株叶片发黄，光合作用受到影响，植株根系扎根能力和吸收营养元素能力减弱，导致植株抗逆性下降，影响作物产量和品质。
在现代化农业中，化学肥料的使用已成为提高农产品产量和质量的重要因素，每年都有大量的钾肥被施入农田以提高作物产量，但过量施入钾肥也带来了各种问题。钾肥过剩影响植株对钙、镁等阳离子的吸收，造成营养缺乏症。此外，钾肥生产过程中，来自矿物原料中的重金属如铅、镉等会被连同带入钾肥中施入农田，造成土壤、水体污染以及农田品质恶化。
农田土壤中的钾主要来自于化学钾肥，然而，作为化肥施用到土壤中的可溶性无机钾的很大一部分被迅速固定，不能被植物利用。微生物参与了土壤钾转化的一系列过程，是土壤钾循环的重要参与者。土壤中存在可溶解难溶态钾素的细菌，这些细菌通过溶解和矿化作用有效地将可溶性钾从土壤中释放出来，从而增加土壤速效钾含量，减少钾肥施入量。近年来，溶钾微生物引起了人们的关注。目前已有研究将溶钾细菌作为微生物菌肥施入田间，以增加土壤速效钾含量，减少钾肥施入量，但是，由于普通使用的溶钾菌无法在玉米根部稳定定殖，无法充分发挥促生效果，限制了溶钾菌剂的应用。因此，开发出与玉米特异性亲和且能稳定定殖的溶钾菌剂以促进玉米钾素吸收及生长，改变传统施肥模式，释放土壤钾资源，降低化肥使用量，已成为农业可持续发展的必然趋势。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种玉米用溶钾菌剂。
所述玉米用溶钾菌剂由YK4菌株发酵而成，所述YK4菌株的分类命名为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC M 2020720。
优选的，所述溶钾菌剂为液态菌剂。
优选的，所述溶钾菌剂用于玉米的拌种、包衣和浇根。
优选的，所述液态菌剂每亩玉米田施用量为5～20L，所述液态菌剂中活菌数在1×108-9×108CFU·mL-1范围内。
本发明的目的之二是提供上述玉米用溶钾菌剂的液态菌剂的制备方法，其步骤如下：
S1.菌种活化，将YK4菌株接入LB斜面培养基，25-30℃培养18-30h；
S2.液体培养基培养，使用生理盐水5-10mL洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于80-120mL LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min-1振荡培养24-28h至YK4菌液浓度为OD680≥0.8，即制得所述液态菌剂。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的溶钾菌剂对玉米生长有明显的促进作用，可显著增加玉米叶片含钾量，提高玉米产量。玉米根部可产生玉米凝集素，凝集素是非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，可与细菌细胞壁上的多糖结合。本发明的溶钾菌株具有玉米凝集素亲和性，可与玉米凝集素发生凝集反应。YK4菌株在凝集素介导下长期定殖在玉米根部，稳定地发挥促生效果。
2、本发明的溶钾菌YK4具有显著的溶钾效果，利用自身的代谢能力将难溶态的钾素释放出来，大幅度提高土壤中速效性钾的含量，供玉米吸收利用。
3、YK4菌株的溶钾机理主要有酸解、酶解、配合螯合、溶蚀等作用。YK4菌株溶钾主要是通过：1、分泌有机酸如草酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸，溶解难溶态钾。2、YK4菌株与矿物接触产生特殊的酶，这些酶破坏了土壤中矿石结晶结构，并发生离子交换反应，使其中的钾释放出来。3、YK4菌株分泌的胞外多糖能紧紧地包绕矿物，使菌体与矿石能紧密接触，并且提高矿物表面有机酸的浓度。在有机酸酸溶作用和络合作用的共同作用下，矿物中的钾被释放出来。4、细菌通过分泌的胞外多糖与钾长石形成细菌矿物复合体，细菌对矿物颗粒表面较脆弱的部位产生溶蚀作用，以及细菌产生的代谢产物对矿物进行化学降解作用，导致钾离子等的释放，从而将难溶性钾转换为可溶性的速效钾供玉米吸收。
4、本发明的溶钾菌株YK4还具有产吲哚乙酸(IAA)、产铁载体的能力。吲哚乙酸是一种重要的植物生长素，能够调节、促进植物芽、茎、根的生长，影响植物器官建成；铁载体具有结合Fe3+的能力，可螯合植物根际周围少量的Fe3+形成螯合体复合物，供给植物吸收利用。此外，促生菌分泌的铁载体与Fe3+形成的螯合体复合物不能被其他植物病原菌利用，且导致植物根部周围铁元素缺乏，从而阻止病原菌在植物根际繁殖，减少作物病害。
5、本发明的液态菌剂施入土壤中用量为5-20L/亩。目前种植玉米钾肥的施用量为40-60kg/亩。相比之下，施用促生菌剂可以减少钾肥使用量，缓解土壤板结，节约能源消耗，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
菌株的筛选
选取生长健壮的玉米植株，将玉米根部连土整体挖出，除去较大土块及其他无用残渣，分别取各个样品的根际土壤1g于含有制霉菌素的无菌生理盐水中，置于摇床160r·min-1振荡0.5h，即得根际土壤菌悬液。取1mL上述菌悬液至9mL含有制霉菌素的无菌生理盐水中，梯度稀释至10-7浓度。在含有制霉菌素的溶钾菌固体培养基上涂布上述菌悬液，每个梯度重复3次，28℃恒温培养3d以上，直至出现透明圈。溶钾菌固体培养基配方是Na2HPO42.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1g、钾矿物质1.0g、蔗糖5.0g、琼脂粉15g、蒸馏水1000mL，pH7.0。观察并测量透明圈直径H和菌落直径C，计算二者比值(H/C)，H/C值越大的菌株，其溶钾能力也越强。
挑取有透明圈的菌落至含有50mg·L-1制霉菌素的培养基上，多次划线纯化，以获得纯系溶钾菌株。在LB液体培养基中接种筛选获得的具有溶钾能力的菌株，恒温振荡培养1d，至对数生长期，分装到离心管，3000r·min-1离心10min，得菌体，将菌体放入无菌水中用移液枪吹吸数次使其分散悬浮后，离心洗涤，重复3次，得菌悬液，观察若液体较为浑浊，可加少量无菌水稀释。在载玻片中央滴加25μL菌悬液，并与等体积玉米凝集素混匀，室温下静置0.5h，晾干，染色后在显微镜下观察反应现象。挑取出现凝集反应的菌株，获得玉米亲和性溶钾菌株，本申请使用的YK4即为用此筛选方法获得的一株玉米亲和性溶钾菌株。
所述LB培养基配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
实施例2
YK4菌株溶钾能力的测定
采用选择性培养基和凝集素双重筛选法从玉米根际筛选出与玉米具有特异亲和性的玉米根际溶钾菌，测定这些菌株的溶钾能力。制备各菌株菌悬液，接种到溶钾培养基中。溶钾培养基配方是Na2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeCl3 0.005g、CaCO3 0.1g、钾长石1.0g、蔗糖5.0g、蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，并于28℃，160r·min-1振荡培养5d。每瓶菌液接入4mL H2O2，于121℃消解30min后6000r·min-1离心5min，取上清液定容至100mL，采用火焰光度计法测定上清液中速效钾含量。
比较各菌株溶钾能力，其中YK4菌株溶钾能力最佳。YK4菌株对难溶性钾的溶解能力见表1，由表1可见YK4菌株对难溶性钾具有较好的溶解能力。
表1 YK4菌株对难溶性钾的溶解能力
Figure BDA0002813582080000051
实施例3
菌株的鉴定
结合形态学观察，生理生化试验和16SrRNA基因序列比对分析鉴定YK4菌株种属。
根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对YK4菌株进行生理生化特性检测。其中形态学试验包括革兰氏染色；生理生化试验包括淀粉水解试验、接触酶试验、VP试验、M-R试验、明胶液化试验、葡萄糖氧化发酵试验、产H2S试验，结果见表2。
将YK4菌株16SrRNA基因序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对，结合生理生化试验结果，确定YK4菌株属于中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)，YK4菌株16SrRNA基因序列见附表。
表2 YK4菌株部分生理生化特性
Figure BDA0002813582080000052
实施例4
YK4菌株产IAA和产铁载体能力测定
将YK4菌株以2％接种量接种至有氮液体培养基中，于28℃、160r·min-1振荡培养5d，离心去沉淀，取上清，按照1:2的比例加入相应的Sackowski’s混合液，在暗处25℃混合反应30min，以不接菌的有氮培养液作为空白对照，测定530nm处的吸光值，计算YK4菌株产IAA水平。Sackowski’s显色液：1mL 0.5mol·L-1FeCl3溶液加入到50mL 35％HClO4溶液中，混合均匀。有氮液体培养基配方：蔗糖10.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.1g、酵母膏0.5g、CaCO3 0.5g、琼脂20g、蒸馏水400mL，pH7.0。
将YK4菌株以2％接种量接种至MKB液体培养基中，于28℃、160r·min-1振荡培养48h，离心取上清，以1:1比例加入CAS检测液，混匀，静置1h后，以蒸馏水为对照调零，在630nm波长下测吸光值(A)。另取CAS检测液与未接菌的MKB培养基按1：1比例混合，测630nm处吸光值(Ar)，采用紫外分光光度计法测定YK4菌株产铁载体能力。MKB培养基配方：酪蛋白氨基酸5.0g、甘油15mL、K2HPO4 2.5g、MgSO4·7H2O 2.5g、蒸馏水1000mL，pH 7.2。CAS检测液：取6mL 10mmol·L-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液至100mL容量瓶中，用双蒸水稍作稀释，再将1.5mL 1mmol·L-1FeCl3溶液与7.5mL 2mmol·L-1铬天青(CAS)溶液的混合液沿着玻璃棒缓慢加入至上述容量瓶中。称取4.307g无水双二甲胺(无水哌嗪)溶解于约30mL双蒸水中，加入6.25mL 12mol·L-1HCl，此时得到pH为5.6的缓冲液。将此溶液转移至上述容量瓶中，加入双蒸水定容至100mL，备用。
YK4菌株产IAA和铁载体能力见表3。由表3可见YK4菌株具有较强的产IAA和铁载体能力，说明该菌株具有促进植物生长，抵抗病原菌的潜能。
表3 YK4菌株产IAA和产铁载体能力
Figure BDA0002813582080000061
实施例5
菌剂的制备以及用于玉米的大田试验1.菌剂的制备
使用5mL生理盐水洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2％接种量将YK4菌株接种至LB液体培养基中，28℃，160r·min-1振荡培养24h，制得YK4液态菌剂。使用时用水将菌剂稀释至OD680＝0.8。
2.菌剂的田间试验
试验分成两组，一组为施菌剂的实验组，另一组为未施菌剂的对照组。每组设10个重复。将玉米种子播种到田间，待玉米出苗后于根部接入20mL稀释后的菌剂。玉米成熟后测定实验组和对照组的株高、穗粗、穗长、穗实粒数、穗实重、叶片含钾量以及土壤含钾量。结果见表4、5。
表4 YK4菌剂对玉米农艺性状和产量的影响
Figure BDA0002813582080000071
注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。
由表4可见，施加YK4菌剂的实验组，其株高、穗粗、穗长、穗实粒数、穗实重分别较未施菌剂的对照组提高了12.64％，15.50％、44.35％、21.61％、22.81％，其中株高、穗长、穗实粒数的提高量达显著水平，穗粗、穗实重的提高量达极显著水平。结果表明，施加YK4菌剂能促进玉米植株生长，提高玉米产量。
表5 YK4菌剂对玉米叶片含钾量及土壤含钾量的影响
Figure BDA0002813582080000072
注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。
由表5可见，施加YK4菌剂的实验组，其叶片含钾量和土壤速效钾含量分别较未施菌剂的对照组提高了10.51％和28.02％，其中叶片含钾量的提高量达显著水平，土壤速效钾的提高量达到极显著水平。
由表4、5可知，施加YK4菌剂的实验组，其株高、穗长、穗实粒数、叶片含钾量提高量较未施菌剂的对照组达显著水平；穗粗、穗实重、土壤速效钾含量提高量较未施菌剂的对照组达极显著水平，说明YK4菌剂可将土壤中的难溶态钾释放出来，提高土壤中速效钾含量，以促进玉米对钾素的吸收，提高叶片含钾量，进而促进玉米植株的生长，提高玉米产量。
需要强调的是，本发明提供的溶钾菌剂可以与其他菌剂或具有促生效果的产品复配使用；尽管本发明的溶钾菌剂以玉米为实验对象，但将含有YK4菌株的溶钾菌剂使用在其他植物体上的实施均应视为本发明的一种实施方式。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002813582080000091
Figure BDA0002813582080000101

Claims (5)

1.一种玉米用溶钾菌剂，其特征在于，由YK4菌株发酵而成，所述YK4菌株的分类命名为中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020720。
2.根据权利要求1所述的一种玉米用溶钾菌剂，其特征在于，所述溶钾菌剂为液态菌剂。
3.根据权利要求1或2所述的一种玉米用溶钾菌剂，其特征在于，所述溶钾菌剂用于玉米的拌种、包衣和浇根。
4.根据权利要求2所述的一种玉米用溶钾菌剂，其特征在于，所述液态菌剂每亩玉米田施用量为5～20L，所述液态菌剂中活菌数在1×108-9×108CFU·mL-1范围内。
5.一种权利要求2所述的玉米用溶钾菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态菌剂的制备方法如下：
S1.菌种活化，将YK4菌株接入LB斜面培养基，25-30℃培养18-30h；
S2.液体培养基培养，使用生理盐水洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于80-120mL LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min-1振荡培养24-28h至YK4菌液浓度为OD680≥0.8，即制得所述液态菌剂。
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