CN112375717A

CN112375717A - 一种玉米用溶磷菌剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112375717A
Application number: CN202011389946.3A
Authority: CN
Inventors: 曹媛媛; 李婷; 艾文峰; 黎权德; 欧康苗; 蔡柯; 郑玉欣; 胡佳丽; 邓瑞宁
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-12-02
Filing date: 2020-12-02
Publication date: 2021-02-19
Anticipated expiration: 2040-12-02
Also published as: CN112375717B; US20220167628A1

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种玉米用溶磷菌剂及其制备方法和应用。该溶磷菌剂由CR50菌株发酵而成，所述CR50菌株的分类命名为同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020721。本发明的溶磷菌剂具有溶解磷酸钙、植酸钙等难溶态无机磷和难溶态有机磷的能力，可增加土壤中速效磷含量，对玉米生长有明显的促进作用，提高玉米产量。本发明的溶磷菌株还具有产吲哚乙酸、产铁载体的能力，同时具有玉米凝集素亲和性，可与玉米凝集素发生凝集反应，CR50菌株在凝集素介导下可长期定殖在玉米根部，稳定地发挥促生效果。

Description

一种玉米用溶磷菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物促生技术领域，具体涉及一种玉米用溶磷菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

玉米是我国主要的粮食作物之一，是农业和工业生产的重要原材料。磷素是贯穿玉米整个生长周期，保证玉米优良特性的关键营养元素。磷素参与玉米的光合作用，呼吸作用等重要生命活动，促进植株的果实发育和根系生长，缺少磷元素会导致植株光合作用减弱，抗性降低，花期延迟，大大降低玉米产量。

在农业生产中，大量的磷肥被施入土壤以提高作物产量，但过量施入磷肥带来了各种问题。过量的钙镁磷肥会与锌元素作用，产生磷酸锌沉淀，无法被作物利用而使作物表现出缺锌症状；作为磷肥的原料，磷矿石中含有大量的镉、铅等重金属元素，过量施肥导致土壤和水体污染；此外，磷矿是不可再生资源，目前全世界每年大约消耗5千万吨磷肥，且需求量不断增加，未来磷肥将会消耗殆尽。

尽管土壤中磷素的总含量很高，可占土壤重量的0.1％～0.25％，但大部分是以植物难以吸收利用的难溶态化合物形式存在，可被植物直接吸收的速效磷含量只占总磷的0.5％～2％，难以满足提高作物产量的需求。土壤中存在着可溶解磷素的细菌，这些细菌将难溶态磷化合物转化为速效磷，供给植物利用，促进植物生长。目前已有研究利用溶磷细菌作为微生物菌肥施入田间，以增加土壤速效磷含量，减少磷肥施入量。但是，由于普通使用的溶磷菌无法在玉米根部稳定定殖，无法充分发挥促生效果，限制了溶磷菌剂的应用。因此，开发与玉米特异性亲和且能稳定定殖的溶磷菌剂以促进玉米磷素吸收及生长，改变传统施肥模式，降低化肥使用量，已成为农业可持续发展的必然趋势。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的之一是提供一种玉米用溶磷菌剂。

所述玉米用溶磷菌剂由CR50菌株发酵而成，所述CR50菌株的分类命名为同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市，保藏编号为CCTCC M 2020721。

优选的，所述溶磷菌剂为液态菌剂或者固态菌剂。

优选的，所述溶磷菌剂用于玉米的拌种、包衣和浇根。

优选的，所述液态菌剂每亩玉米田施用量为5～20L，所述液态菌剂中活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU·mL^-1范围内。

优选的，所述固态菌剂每亩玉米田施用量为5～20kg，所述固态菌剂中活菌数在2×10⁸-8×10⁸CFU·mL^-1范围内。

本发明的目的之二是提供一种玉米用溶磷菌剂的液态菌剂的制备方法，其步骤如下：

S61.菌种活化，将CR50菌株接入LB斜面培养基，25-30℃培养18-30h；

S62.液体培养基培养，用生理盐水5-10mL洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于80-120mL LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min^-1振荡培养24-28h至CR50菌液浓度为OD₆₈₀≥0.8，即制得所述液态菌剂。

本发明的再一目的是提供一种玉米用溶磷菌剂的固态菌剂的制备方法，其步骤如下：

S71.菌种活化，将CR50菌株接入LB斜面培养基，25-30℃培养18-30h；

S72.液体培养基培养，用生理盐水5-10mL洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于80-120mL LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min^-1振荡培养24-28h至CR50菌液浓度为OD₆₈₀≥0.8，制得液态菌剂。

S73.固态菌剂，在S72制备的液态菌剂中按照每毫升液态菌剂加入0.5-1g干燥的泥炭，混合拌匀后再发酵1-3h，至于阴凉处自然晾干至表面无水分即制得所述固态菌剂。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的溶磷菌剂对玉米生长有明显的促进作用，可显著增加玉米叶片含磷量，提高玉米产量。玉米根部可产生玉米凝集素，凝集素是非免疫来源的蛋白质或糖蛋白，可与细菌细胞壁上的多糖结合。本发明的溶磷菌株具有玉米凝集素亲和性，可与玉米凝集素发生凝集反应。CR50菌株在凝集素介导下长期定殖在玉米根部，稳定地发挥促生效果。

2、本发明使用的溶磷菌株CR50具有溶解磷酸钙、植酸钙等难溶态无机磷和难溶态有机磷的能力，可增加土壤中速效磷含量。

CR50菌株溶解无机磷的机理主要是：1、菌株在代谢过程中分泌乙酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸，降低土壤pH值，并且与Fe³⁺、Al³⁺、Ca²⁺等离子螯合，从而溶解难溶性无机磷酸盐。2、菌株呼吸作用释放的CO₂，可降低环境pH值，从而溶解难溶性无机磷酸盐。

CR50菌株降解有机磷的机理主要是：菌株分泌植酸酶、磷酸酶等酶类，将难溶态磷降解为可溶态。

3、果实是玉米植株的最具经济价值的部位，本发明的溶磷菌剂对玉米生长具有明显促进作用，对玉米籽粒有明显增重，可提高玉米产量。

4、本发明的溶磷菌株CR50还具有产吲哚乙酸(IAA)、产铁载体的能力。吲哚乙酸是一种重要的植物生长素，能够调节、促进植物芽、茎、根的生长，影响植物器官建成；铁载体具有结合Fe³⁺的能力，可螯合植物根际周围少量的Fe³⁺形成螯合体复合物，供给植物吸收利用。此外，促生菌分泌的铁载体与Fe³⁺形成的螯合体复合物不能被其他植物病原菌利用，且导致植物根部周围铁元素缺乏，从而阻止病原菌在植物根际繁殖，减少作物病害。

5、本发明的液态菌剂施用量为5-20L/亩，目前种植玉米磷肥的施用量为40-60kg/亩。相比之下，施用本发明提供的溶磷菌剂可以减少磷肥使用量，缓解土壤板结，节约能源消耗，具有广阔的应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

菌株的筛选

选取生长健壮的玉米植株，将玉米根部连土整体挖出，除去较大土块及其他无用残渣，分别取各个样品的根际土壤1g于含有制霉菌素的无菌生理盐水中，置于摇床160r·min^-1振荡0.5h，即得根际土壤菌悬液。取1mL上述菌悬液至9mL含有制霉菌素的无菌生理盐水中，梯度稀释至10^-7浓度。在含有制霉菌素的溶磷菌固体培养基上涂布上述菌悬液，每个浓度重复3次，28℃恒温培养3d以上，直至出现透明圈。溶磷菌固体培养基的配方是葡萄糖10g、K₂HPO₄ 2.0g、硫酸铵0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO₄·7H₂O 0.3g、FeSO₄·7H₂O0.03g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、Ca₃(PO₄)₂ 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。观察并测量透明圈直径H和菌落直径C，计算二者比值(H/C)，H/C值越大的菌株，其溶磷能力也越强。

挑取有透明圈的菌落至含有50mg·L^-1制霉菌素的LB培养基上，多次划线纯化，以获得纯系溶磷菌株。在LB液体培养基中接种筛选获得的具有溶磷能力的菌株，恒温振荡培养1d，至对数生长期，分装到离心管，3000r·min^-1离心10min，收集菌体，将菌体放入无菌水中用移液枪吹吸数次使其分散悬浮后，离心洗涤，重复3次，得菌悬液，观察若液体较为浑浊，可加少量无菌水稀释。在载玻片中央滴加25μL菌悬液，并与等体积玉米凝集素混匀，室温下静置0.5h，晾干，染色后在显微镜下观察反应现象。挑取出现凝集反应的菌株，获得玉米亲和性溶磷菌株，本申请使用的CR50即为用此筛选方法获得的一株玉米亲和性溶磷菌株。

所述LB培养基配方为：蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。

实施例2

CR50菌株溶磷能力的测定

采用选择性培养基和凝集素双重筛选法从玉米根际筛选出与玉米具有特异亲和性的溶磷菌，测定这些菌株溶磷能力。将菌株制成菌悬液，接种到不同的溶磷培养基中。培养基配方是葡萄糖10g、K₂HPO₄ 2.0g、硫酸铵0.5g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、MgSO₄·7H₂O0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·4H₂O 0.03g、难溶性磷10g、蒸馏水1000mL，pH 7.2，并于28℃，160r·min^-1振荡培养5d。采用钼锑抗法测定各培养液中可溶性磷含量。

比较各菌株溶磷能力，其中CR50菌株溶磷能力最佳。CR50菌株对难溶性磷的溶解能力见表1。由表1可见CR50菌株对磷酸钙(难溶性无机磷)和植酸钙(难溶性有机磷)均具有较好的溶解能力。

表1 CR50菌株对难溶性磷的溶解能力

实施例3

菌株的鉴定

结合形态学观察，生理生化试验和16SrRNA基因序列比对分析鉴定CR50菌株种属。

根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》，对CR50菌株进行生理生化特性检测。其中形态学试验包括革兰氏染色；生理生化试验包括淀粉水解试验、接触酶试验、VP试验、M-R试验、明胶液化试验、葡萄糖氧化发酵试验、产H₂S试验，结果见表2。

将CR50菌株16SrRNA基因序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对，结合生理生化试验结果，确定CR50菌株属于同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)，CR50菌株16SrRNA基因序列见附录。

表2 CR50菌株部分生理生化特性

实施例4

CR50菌株产IAA和产铁载体能力测定

将CR50菌株以2％接种量接种至有氮液体培养基中，于28℃、160r·min^-1振荡培养5d，离心去沉淀，取上清，按照1:2的比例加入相应的Sackowski’s显色液，在暗处25℃混合反应30min，以不接菌的有氮培养液作为空白对照，测定530nm处的吸光值，计算CR50菌株产IAA水平。Sackowski’s显色液：1mL0.5mol·L^-1FeCl₃溶液加入到50mL 35％HClO₄溶液中，混合均匀。有氮液体培养基配方：蔗糖10.0g、K₂HPO₄ 2.0g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.1g、酵母膏0.5g、CaCO₃ 0.5g、琼脂20g、蒸馏水400mL，pH7.0。

将CR50菌株以2％接种量接种至MKB液体培养基中，于28℃、160r·min^-1振荡培养48h，离心取上清，以1:1比例加入CAS检测液，混匀，静置1h后，以蒸馏水为对照调零，在630nm波长下测吸光值(A)。另取CAS检测液与未接菌的MKB培养基按1：1比例混合，测630nm处吸光值(Ar)，采用紫外分光光度计法测定CR50菌株产铁载体能力。MKB培养基配方：酪蛋白氨基酸5.0g、甘油15mL、K₂HPO₄ 2.5g、MgSO₄·7H₂O 2.5g、蒸馏水1000mL，pH 7.2。CAS检测液：取6mL 10mmol·L^-1十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液至100mL容量瓶中，用双蒸水稍作稀释。再将1.5mL 1mmol·L^-1FeCl₃溶液与7.5mL 2mmol·L^-1铬天青(CAS)溶液的混合液沿着玻璃棒缓慢加入至上述容量瓶中。称取4.307g无水双二甲胺(无水哌嗪)溶解于约30mL双蒸水中，加入6.25mL 12mol·L^-1HCl，此时得到pH为5.6的缓冲液。将此溶液转移至上述容量瓶中，加入双蒸水定容至100mL，备用。

表3 CR50菌株产IAA和产铁载体能力

CR50菌株产IAA和铁载体能力见表3。由表3可见CR50菌株具有较强的产IAA和铁载体能力，说明该菌株具有促进植物生长，抵抗病原菌的潜能。

实施例5

菌剂的制备以及用于玉米的大田试验

1.菌剂的制备

使用5ml生理盐水洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2％接种量将CR50菌株接种至LB液体培养基中，28℃，160r·min^-1振荡培养24h，制得CR50液态菌剂。使用时用水将菌剂稀释至OD₆₈₀＝0.8。

2.菌剂的田间试验

试验分成两组，一组为施菌剂的实验组，另一组为未施菌剂的对照组。每组设10个重复。将玉米种子播种到田间，待玉米出苗后于根部接入20mL稀释后的菌剂。玉米成熟后测定实验组和对照组的株高、穗粗、穗长、穗实粒数、穗实重、叶片含磷量以及土壤含磷量。结果见表4、5。

表4 CR50液态菌剂对玉米农艺性状和产量的影响

注：*表示处理间差异显著(p<0.05)，**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表4可见，施加CR50菌剂的实验组，其株高、穗粗、穗长、穗实粒数、穗实重分别较未施菌剂的对照组提高了22.54％、20.70％、50.24％、27.47％和35.29％，其中玉米株高、穗实粒数和穗实重提高量达显著水平，穗粗和穗长提高量达极显著水平。

表5 CR50液态菌剂对玉米叶片含磷量及土壤含磷量的影响

注：**表示处理间差异极显著(p<0.01)。

由表5可知，施加CR50菌剂的实验组，其叶片含磷量和土壤速效磷含量分别较未施菌剂的对照组提高了17.88％和19.98％，均达极显著水平。

由表4、5可知，施加CR50菌剂的实验组，其株高、穗粗、穗长、穗实粒数、穗实重、叶片含磷量、土壤速效磷含量的提高量较未施菌剂的对照组达显著水平，说明CR50液态菌剂可将土壤中的难溶态磷释放出来，提高土壤中速效磷含量，以促进玉米对磷素的吸收，提高叶片含磷量，进而促进玉米的生长，提高玉米产量。

需要强调的是，本发明提供的溶磷菌剂可以与其他菌剂或具有促生效果的产品复配使用；尽管本发明的溶磷菌剂以玉米为实验对象，但将含有CR50菌株的溶磷菌剂使用在其他植物体上的实施均应视为本发明的一种实施方式。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种玉米用溶磷菌剂，其特征在于，由CR50菌株发酵而成，所述CR50菌株的分类命名为同温层芽孢杆菌(Bacillus stratosphericus)，2020年11月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020721。

2.根据权利要求1所述的一种玉米用溶磷菌剂，其特征在于，所述溶磷菌剂为液态菌剂或者固态菌剂。

3.根据权利要求2所述的一种玉米用溶磷菌剂，其特征在于，所述溶磷菌剂用于玉米的拌种、包衣和浇根。

4.根据权利要求2所述的一种玉米用溶磷菌剂，其特征在于，所述液态菌剂每亩玉米田施用量为5-20L，所述液态菌剂中活菌数在1×10⁸-9×10⁸CFU·mL^-1范围内。

5.根据权利要求3所述的一种玉米用溶磷菌剂，其特征在于，所述固态溶磷菌剂每亩玉米田施用量为5-20kg，所述固态菌剂中活菌数在2×10⁸-8×10⁸CFU·mL^-1范围内。

6.一种权利要求2所述的玉米用溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述液态菌剂的制备方法如下：

S62.液体培养基培养，使用生理盐水洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于80-120mL LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min^-1振荡培养24-28h至CR50菌液浓度为OD₆₈₀≥0.8，即制得所述液态菌剂。

7.一种权利要求2所述的玉米用溶磷菌剂的制备方法，其特征在于，所述固态菌剂的制备方法如下：

S72.液体培养基培养，使用生理盐水洗涤LB斜面培养基上的菌种，以体积比2-5％接种量接种于装有80-120mL的LB液体培养基中，置于摇床25-30℃，120-180r·min振荡培养24-28h至CR50菌液浓度为OD₆₈₀≥0.8，制得液态菌剂。

S73.固态菌剂，在S72制备的液态菌剂中按照每毫升液态菌剂加入0.5-1g干燥的泥炭，混合拌匀后再发酵1-3h，置于阴凉处自然晾干至表面无水分，即制得所述固态菌剂。