CN102802639A

CN102802639A - 中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途

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Publication number: CN102802639A
Application number: CN2009801603018A
Authority: CN
Inventors: 胡安·伊格纳西奥·奥韦赫罗吉萨索拉; 曼努埃尔·弗雷斯诺埃斯库德罗
Original assignee: LABORATORIOS OVEJERO SA
Current assignee: LABORATORIOS OVEJERO SA
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2009-12-31
Publication date: 2012-11-28
Also published as: US20120107352A1; CL2011003033A1; EA025766B1; CU24041B1; ES2352780A1; WO2010139352A1; EA201190309A1; CA2763266A1; NZ596599A; CU20110223A7; IL216560A0; KR20120061045A; AU2009347459A1; PL2437754T3; US9241954B2; CO6470857A2; ES2352780B2; JP2012528805A; ES2653202T3; BRPI0924393A2

Abstract

本发明涉及从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分离、纯化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途、制备用于治疗和/预防败血症的药物化合物的方法和用于免疫抑制动物和对抗利士曼原虫(Leishmania)的疫苗的佐剂。

Description

中间苍白杆菌的脂多糖及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途

本发明涉及从中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)菌株LMG3306中分离、纯化和表征脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，以及其作为哺乳动物免疫刺激剂的用途、制备用于治疗和/预防败血症的药物化合物的方法和用于免疫抑制动物中和对抗利士曼原虫(Leishmania)的疫苗佐剂。

背景技术

苍白杆菌(Ochrobactrum)属的成员包括在变形菌(Proteobacteria)域(domain)的α-2亚群中。它们主要存在于土壤中，已知其仅在病情危重或免疫力低下的患者中或在留置导管的患者中具有致病性。虽然在这些情况下苍白杆菌可引发脑膜炎、骨髓炎、菌血症和败血症，但这些细菌本身不能造成慢性感染，并且在导管去除之后从正常宿主中被清除(Cieslak，T.J.，C.J.Drabick和M.L.Robb.1996.Pyogenic infections due to Ochrobactrumanthropi.Clin.Infect.Dis.22：845-847.)。

因为所有脂多糖(革兰氏阴性细菌外膜的主要成分)的组成遵循一般原则，即其包含通过特异性糖(称为2-酮基-3-脱氧辛酮糖酸(KDO，2-keto-3-deoxyoctulosonic acid))连接至脂质组分(称为脂质A)的多糖(Rietschel，E.T.，Schade，U.，Jensen，M.，Wollenweber，H.W.，Luderitz，O.和Greisman，S.G.1982.Bacterial endotoxins：chemical structure，biologicalactivity and role in septicaemia.Scand.J.Infect.Dis.Suppl.3：8)，因此已假定所有LPS分子都具有相同的生物学效应。

然而，这一观念已经被研究所改变，所述研究显示，几种LPS产生细胞因子合成的能力存在很大差异，该作用与其脂质A部分的结构特征相关(Netea，M.G.，van Deuren，M.，Kullberg，B.J.，Cavaillon，J.M.和van derMeer，J.W.M.2002.Does the shape of lipid A determine the interaction ofLPS with Toll-like receptors？Trends Immunol.23：135.)。

嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)是革兰氏阴性的兼性细胞内细菌，就低细胞内毒性和其LPS的化学结构而言，其也类似于布鲁氏菌(Brucella)，并且显著低于肠杆菌的LPS所引起的毒性(Zahhnger，U.，Knirel，Y.A.，Lindner，B.，Helbig，J.H.，Sonesson，A.，Mane，R.和Rietschel，E.T.1995.Thelipopolysaccharide of Legionella pneumophila serogroup 1(strainPhiladelphia 1)：chemical structure and biological significance.Prog.Clin.Biol.Res.392：113.26)。

人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)已知与布鲁氏菌亲缘关系最近(Velasco et al.International Journal of Systematic Bacteriology 48(1998)759-768)。尽管其种系进化关联性接近，B.abortus与苍白杆菌在OM特征上显著不同，并且这些广泛的差异至少部分是由LPS中的微小变化所引起的(Velasco等Infection and Immunity 68(2000)3210-3218)。

测定了来自中间苍白杆菌LMG 3301的LPS的完整核心脂质A主链(backbone)和来自人苍白杆菌LMG 3331的LPS的O链(Velasco et al.Carbohydrates Research 306(1996)123-126；Velasco et al.CarbohydratesResearch 306(1998)283-290；Velasco et al.Infection and Immunity 68(2000)3210-3218)。

Velasco等描述了中间苍白杆菌的菌株LMG3306(International Journalof Systematic Bacteriology 48(1998)759-768)，然而，以前尚无对来自中间苍白杆菌LMG 3306的LPS的描述。

另一方面，仅在美国每年就有大约900,000例败血症病例，引起大约210,000例死亡，并花费几乎170亿美元。败血症是一种发生率在上升的常见疾病，死亡率为27～48％。败血症性休克(septic shock)是败血症的后果，其经常是致命的。败血症中伴随感染而发生的严重炎症是多种治疗性干预的靶标。然而，对败血症的炎症方面，使用一般抗炎剂超过20年的临床试验已经证明，该方法并不成功。

导致败血症的病理机制是复杂的，且远未被理解。败血症涉及全身性的炎性应答，继之以补偿性抗炎应答。它们之间的平衡对于宿主的存活是关键的。此外，败血症的动物模型不容易模拟人类患者中败血症的复杂性。

据认为，败血症性休克的多数结果与循环内毒素(LPS)的大量释放有关，因此，最近已经进行了一些通过Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)拮抗剂来治疗该作用的尝试。因此，正处于II期的作为TLR4拮抗剂而发挥作用的Eritoran(LPS的脂质A部分的结构类似物)在严重败血症患者中显示出对死亡率的降低。此外，TAK-242是TLR4信号转导抑制剂，其降低促炎细胞因子的水平，并且还在高IL-6水平的严重败血症患者的亚组中降低死亡率。

目前，很多感染性疾病尚无疫苗。这些情况中的一些是因为缺乏正确的佐剂来诱导正确和适宜的免疫应答。对于一些感染剂，例如细胞内细菌、病毒和多数原生动物，保护性免疫应答为以产生IFN-γ为特征的T辅助细胞1型(TH1)。相反，对抗多数寄生虫的保护性应答是以产生IL-4为特征的类型2(TH2)(Fresno，M.，M.Kopf和L.Rivas.1997.Cytokines and infectiousdiseases.Immunol Today 18：56-58)。可用于人类疫苗制剂的佐剂很少，因为它们中的很多由于加剧的Th1诱导是有毒性的。其实并非佐剂的明矾(alum)用在多数人类疫苗制剂中。最近，Toll样受体(TLR)的激动剂已经引起了很大关注(Hoffman，Nature Reviews Drug Discovery 4，879，2005)(Kwissa；Expert Vaccine Rev.，6，G73，2007)。当前正在分析几种抗原和各种TLR的几种激动剂。

最终，任何疫苗制剂(包括已经被许可的那些疫苗)的主要问题之一是其在免疫抑制的对象中基本没有作用。此外，其中的一些在这些患者中具有继发作用(Kwissa，等2007)。

Velasco等Carbohydrates Research 306(1998)283-290描述了来自中间苍白杆菌LMG 3301的野生型的深-粗糙(deep-rough)LPS(不存在O链并且外核心部分缺乏一些单糖的LPS)的完整核心脂质A主链；确定了来自人苍白杆菌LMG 3331 LPS野生型的光滑(smooth)LPS的O链(Velasco等Carbohydrates Research 306(1996)123-126)；并且Velasco等Infection andImmunity 68(2000)3210-3218发表了脂质A和完整LPS的分子量。

Velasco等描述了中间苍白杆菌LMG 3306的菌株(International Journalof Systematic Bacteriology 48(1998)759-768)，然而，以前尚无对中间苍白杆菌LMG 3306的野生型光滑LPS的描述。

发明内容

目前，已经证明中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)可有效用于治疗和/或预防败血症，以及在用于免疫抑制动物和在对抗利什曼病的疫苗中用作佐剂。

因此，根据本发明的第一个方面，其涉及中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制备用于治疗和/或预防败血症的药物，以及用于免疫抑制动物中和对抗利什曼病的佐剂疫苗中的用途。

根据本发明的一个实施方案，其提供了中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)在制备用于治疗和/或预防败血症性休克和内毒素性休克的药物中的用途。

根据本发明的另一个实施方案，其提供了中间苍白杆菌菌株LMG 3306的LPS(IM)作为用于人类和动物的感染性疾病之疫苗佐剂的用途。

根据本发明的一个具体实施方案，其提供了IM在制备用于治疗和/或预防免疫抑制动物(包括人)之感染的药物的用途。

根据本发明，中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖中的所述用途适用于人类和动物。因此，在整个本发明中，所提及的在动物中的应用也包括在人中的应用。

总而言之，在免疫抑制的动物中，治愈和预防败血症和内毒素血症的哺乳动物免疫刺激剂具有疫苗佐剂的特性，并且，在足垫利什曼病的实验性小鼠模型中具有疫苗佐剂的特性以及保护性和治疗性作用。

已经证明，IM(来自中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖)作为免疫刺激剂，具有广泛的活性，包括：

-诱导巨噬细胞中产生IL-12。

-本发明的LPS所诱导的TNF水平远低于肠LPS，不引起病理作用。

-本发明的LPS诱导T辅助细胞1(TH1)刺激和γ-IFN的产生。

该化合物与哺乳动物中激发免疫应答的能力相关联。因此，本发明提供免疫刺激剂组合物，其包含中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖，和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选地，免疫应答的调节在于增强人的免疫功能。

本发明涉及IM(哺乳动物的免疫刺激剂)的用途，其用作预防和治愈败血症和内毒素血症的化合物。本发明特别涉及其作为佐剂改善在正常的和实验性免疫抑制的动物中接种的用途。在这方面，作为其佐剂特征的一个例子，本发明特别涉及IM作为疫苗佐剂用于实验性利什曼病感染和使用硕大利什曼原虫(Leishmania major)足垫利什曼病的实验性小鼠模型对皮肤利什曼病的治疗性和保护性作用。

本发明涉及由中间苍白杆菌菌株LMG3306制备LPS的方法，所述LPS作为化合物用于医药领域，用作哺乳动物的免疫刺激剂。

本发明提供了作为免疫刺激剂在牛、猪、奶牛和小鼠中的实验领域的试验开发中的特异性活性：

-联合本发明进行特异性接种之后，在增加针对IBR病毒的中和抗体中的影响

-诱导巨噬细胞分化

-在巨噬细胞中诱导TNF

-在巨噬细胞中诱导IL-12

-诱导脾淋巴细胞产生IFN-γ

-通过TLR4和TLR2受体的免疫刺激作用

-以剂量依赖的方式影响T细胞的刺激

因此，本发明涉及中间苍白杆菌菌株LMG3306脂多糖(LPS)能够在哺乳动物中激发免疫应答的能力。因此，本发明提供免疫刺激剂组合物，所述组合物包含中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。优选地，免疫应答的调节在于增强哺乳动物的免疫活性(immunocompetence)。

本发明还涉及在哺乳动物中调节免疫应答的方法，包括给哺乳动物施用中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS或含有所述LPS的药物组合物。因此，本发明还涉及免疫刺激剂组合物在制备用于在哺乳动物中诱导一般细胞免疫的药物中的用途。本发明还涉及本发明的免疫刺激剂组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱导巨噬细胞分化、产生TNF、产生IL-12、脾淋巴细胞产生IFN-γ和刺激病毒特异性CD8和CD4 T细胞，其包括给哺乳动物施用中间苍白杆菌LMG3306的LPS。

根据另一个实施方案，本发明的免疫刺激剂组合物用作疫苗的佐剂，用于改进针对所述疫苗中含有的特异性病毒或细菌的免疫。

与以低的亚致死剂量或其他较低毒性的LPS预防内毒素性休克相关的多数工作已证明，需要事先接种(Hatao，F.，等，The induction of super-resistance using synthetic lipopolysaccharide receptor agonist rescues fatalendotoxemia in rats without excessive immunosuppression.Shock2005；23(4)：365-70.)。发明人惊奇地发现，中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖不需要在前的脱敏期，而仅连同LPS一起接种中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖即避免了该毒性作用。

此外，大多数已发表的数据发现了体外或细胞系中TNF抑制与体内的脱敏作用之间存在相关性(参见例如，Lehner，MD，等，Lipopolysaccharideand Highly Purified Lipoteichoic Acid Via Different Toll-Like ReceptorsIndependent of Paracrine Mediators.2，001.J.Immunol.166：5161-5167)。然而，发明人现已证明中间苍白杆菌菌株LMG3306的脂多糖虽然在体内保护LPS的作用，但并不降低巨噬细胞系和腹腔巨噬细胞或脾脏细胞中TNF或IL-12的分泌。体内的初步结果还提示中间苍白杆菌菌株LMG 3306的脂多糖(IM)能够以某种方式显著降低LPS所诱导的TNF水平。不论如何，TNF水平和保护作用之间没有直接的相关性。这些结果是出人意料的。

另一些假说给出了IL-10或TGF-β产量增加产生脱敏作用的原因(Randow，F.等，Mechanism of endotoxin desensitization：involvement of 35interleukin 10 and transforming growth factor beta.J.Exp.Med 1995.181，1887-1892)。然而，情况似乎并不是这样，因为实际上IM在体外几乎不诱导IL-10，事实上，似乎有某物抑制了外周巨噬细胞或脾脏细胞中IL-10的产生(尽管其不显著)，并且，除了在C57BL/6小鼠的脾脏细胞中的情况之外，LPS诱导的IL-10水平并未通过IM而显著增加。

另外一个有趣的方面是IM调节病原体之间免疫应答的能力。因此，使用硕大利什曼原虫感染的系统，显现出IM促进免疫原性利士曼原虫抗原提取物的作用，其方式与CpG不类似。已知CpG为免疫调节剂，其通过与TLR9联合而增强Th1应答(其对于诸如利士曼原虫和许多其他病原体而言是保护性的)，并且已经作为免疫调节剂和疫苗佐剂而获得专利。然而，体内IM不像CpG那样明显地改变Th1/Th2的比例。这可表明，在体液(Th2)和细胞(Th1)具有重要保护作用的感染中，IM可比CpG佐剂更好。或许更重要的是证明了IM不仅可以诱导保护性应答，而且可直接诱导保护作用，即对利士曼原虫感染具有治疗性作用。

在整个说明和权利要求书中，词语“包含”及该词的变化形式并不意在排除其他技术特征、添加物、成分或步骤。对于本领域技术人员来说，经过查看本说明书，本发明的其他目的、优点和特征会变得显而易见，或可通过实施本发明而得知。以下实施例和附图通过举例说明来提供，且其并不意在限制本发明。此外，本发明涵盖了本文中描述的具体实施方案和优选实施方案的所有可能的组合。

附图简述

图1显示因使用IM而对大肠杆菌(E.Coli)LPS所引起的毒性作用的预防。用LPS(1.75mg)或IM(中间苍白杆菌的LPS)，以0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300)单独或联合处理每组5只小鼠的组，并评价存活率。

图2显示对LPS内毒素性休克的治疗。以LPS(2mg/动物)处理5只动物的组。24小时后，给他们注射IM(中间苍白杆菌的LPS)0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300)，并评价存活率。

图3显示对大肠杆菌性腹膜炎的预防。以大肠杆菌(1×10⁷菌落形成单位，CFU)感染每组5只小鼠的组；在此24小时之前，用IM(中间苍白杆菌的LPS)0.6μg/Kg(剂量60)或6μg/Kg(剂量600)接种动物，并评价存活率(上图)和临床症状(下图)。

图4显示对大肠杆菌性腹膜炎的治愈。以大肠杆菌(1×10⁸菌落形成单位，CFU)感染每组5只小鼠的组；4小时之后，用IM(中间苍白杆菌的LPS)6μg/Kg(剂量600)接种动物，并评价存活率(上图)和临床症状(下图)。

图5显示针对利什曼病的保护性免疫和作用过程中免疫模式的一般特征。如该图所示，寄生虫与巨噬细胞的相互作用产生免疫应答，所述免疫应答如果主要基于Th1淋巴细胞的刺激，那么所述应答对寄生虫是有效和成功的，但如果Th2的应答是典型的，则会表现出感染。

图6显示用于评价利什曼病疫苗之潜在佐剂IM 25(中间苍白杆菌LMG3306的脂多糖)的免疫接种方案。在第0、15和30天，以单独的SLA抗原或与CpG或IM一起接种每组5只小鼠的组。在第60天，给每只动物在每个足垫中接种1000个前鞭毛体(promastigote)，并评价损伤的发展和免疫参数。

图7显示以SLA和SLA-CpG(上图)或以SLA-IM为佐剂接种的动物中损伤的发展。其对沿着感染的足垫肿胀进行定量。

图8显示相对于对照(PBS)而言，以SLA和SLA-CpG、SLA-IM接种的动物的足垫中损伤的宏观状态。图中包括感染6周内对照组动物、以SLA接种的一只、以SLA-CpG接种的一只和以SLA-IM接种的6只动物的照片。

图9显示对脾和淋巴结(DLN)中寄生虫数目的定量，其中，与对照组相比，用SLA免疫接种对所述器官中计数的寄生虫数目不产生任何降低，而SLA-CpG可使该计数降低大约2个对数(log)的量级，并且其中SLA-IM组获得了类似的降低效果。

图10显示对来自被处死动物之脾的细胞中，以及这些分离的细胞和以SLA体外刺激的细胞中Th1应答(IFN-γ)和/或Th2(IL-4)应答之评价的图示结果。

图11显示在特异性抗体同种型IgG2a(Th1)和IgG1(Th2)方面，基于对利士曼原虫水平的分析而对Th1/Th2应答的评价。

图12显示评价IM对利士曼原虫实验性感染的治疗效果的实验方案。

图13(A)显示以IM接种的动物中损伤的发展。其对沿着感染的足垫肿胀进行量化。(B)显示与对照组(PBS)相比，以IM接种的动物之足垫损伤的宏观状态。其中包括感染6周内属于对照组的一只动物、以CpG接种的一只动物和以SLA-IM接种的全部6只动物。(C)显示7周之后，脾和淋巴结(DLN)中对寄生虫数目的定量。

图14显示PBS对照样品、CpG和IM之间的IgG1和IgG2a(包括它们之间的比值)的对比表格。

图15显示用于在免疫抑制动物中分析佐剂RT之作用的实验方案的概要。以地塞米松免疫抑制每组5只动物的组，并用SLA、SLA-CpG或SLA-IM接种。24小时后，感染所述动物，并随后在第8天再次感染。在第60天处死后，评价损伤的发展和免疫参数。

图16显示以SLA接种之后，IM在小鼠脾细胞中的佐剂作用。用或不用抗原SLA(10g/ml)培养所述脾细胞72小时，并通过在72小时的时间内将trimidina整合进DNA来评价增殖。结果显示三次重复的两个实验的平均值，每个实验中使用6只动物。

图17显示对接种动物的脾细胞产生IL-4的影响。所述脾细胞分离自多种动物，且用SLA(10g/ml)刺激，并用ELISA分析IL-4的分泌。

图18显示对接种的和用地塞米松(DEX，dexamethasone)处理的小鼠脾细胞的IL-4和IFN-γ的作用。

图19显示被接种的动物中对SLA的细胞应答。其显示在体外添加SLA之后17天，对抗IFN-γ的特异性应答和对SLA的应答。其显示IFN-γ分泌(Th1)/IL-4(Th2)的比例。

图20显示与Raw巨噬细胞中的大肠杆菌LPS相比添加免疫刺激化合物之后J774细胞的分化。本发明的免疫刺激化合物诱导对J774巨噬细胞之分化的剂量依赖性抑制。该作用比在J774或Raw巨噬细胞中基于重量/体积使用大肠杆菌LPS所观察到的作用(未显示)低约500。

图21显示未受刺激的巨噬细胞不合成可通过ELISA检测的TNF。在J774巨噬细胞(图21a)和在raw细胞中(未显示)，本发明的免疫刺激剂组合物在剂量为0.1～10μg/ml时，以剂量应答的方式诱导显著的TNF产生，反应性水平高达4000pg/ml。本发明的免疫刺激剂的作用虽然高度地显著，但比大肠杆菌的LPS弱约500倍(图21b)。

图22显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自Balb/c和C57B16品系小鼠的巨噬细胞中诱导TNF的产生，但是在同等浓度下比大肠杆菌LPS的效能低(图3)。

图23显示本发明的免疫刺激剂在剂量为10m μg/ml时，在来自C57Bl/6和Balb/c的腹腔巨噬细胞中诱导大量的IL-12(图4)。

图24显示A刺激诱导来自两个品系小鼠的脾细胞大量分泌IFN-γ，提示激发了以IFN-γ产生为特征的Th1应答。本发明的免疫刺激剂组合物在剂量为1～10m□g/ml时，诱导来自C57Bl/6和Balb/c脾淋巴细胞的大量IFN-γ。

图25显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自C57Bl/6的腹腔巨噬细胞中诱导TNF，而TLR-2缺陷仅部分地阻止该活性，并且巨噬细胞中缺乏TLR4强烈地降低了所述诱导。

图26显示本发明的免疫刺激剂组合物在来自C57Bl/6的腹腔巨噬细胞中诱导IL-12，而TLR-2缺陷仅部分地阻止该活性，并且巨噬细胞中缺乏TLR4强烈地降低了所述诱导。

图27显示A刺激诱导IFN-γ的分泌，其在来自C57Bl/6 tlr2-/-的脾细胞中被显著地抑制，并且当使用10mg免疫刺激化合物用于C57Bl/6 tlr4-/-细胞时，所述分泌几乎完全消失。

图28显示在来自B6 C57小鼠的脾细胞中，用淋巴丛脑膜炎(Lymphochoremeningitis)病毒感染并添加不同的刺激物之后诱导的CD4(图28a)或CD8(图28b)T细胞应答；从左至右：无肽；LCMV NP 396肽(肽NP 396)；单独的培养基；PMA加离子霉素(ionomycing)；和不同浓度的免疫刺激化合物。

具体实施方案

术语“免疫刺激剂组合物”在本文中广义地定义为能够在接种了该制品的哺乳动物中激发免疫应答的可施用形式的任何类型的生物剂。

本文中使用的术语“纯化的”，当其涉及LPS时，表示所述LPS已经过分级或纯化过程(例如但不限于上文中公开的那些过程)，以除去各种其他成分，并且所述组合物基本保持其所表现的生物活性。在使用术语“基本纯化的”时，该术语是指这样的组合物，其中LPS形成所述组合物的主要非溶剂组分。例如，“基本纯化的LPS”表示溶液或组合物中超过约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％的非溶剂组分是本发明的LPS。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述免疫刺激剂组合物包含基本纯化形式的中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS，其中非溶剂组分未被超过0.2％的其他化合物(DNA、RNA、蛋白质、葡聚糖、脂质……)所污染。

“免疫学有效量”是指在哺乳动物中免疫原性足以诱导可检测的细胞或体液免疫应答的量。

本文中使用的“保护性免疫应答”是指阻止或延缓特异性病原体所引起的感染或疾病的细胞或体液免疫应答。

可使用基于赋形剂、pH和浓度的常规制备技术来制备本发明的化合物。

根据本发明的一个实施方案，按照以下步骤从中间苍白杆菌LMG3306中提取脂多糖：

a)将中间苍白杆菌LMG3306的灭活培养物离心；

b)将所获得的沉淀物重悬在盐水悬浮液中；

c)用纯水和聚乙二醇透析；

d)用四体积的甲醇和1％的醋酸钠饱和甲醇沉淀；

e)冷冻干燥以获得粗制LPS。

根据一个优选的实施方案，一旦所述粗制LPS已被冰冻干燥，就按照以下步骤对其进行纯化：

1.在缓冲液(10mM Tris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任选地以超声辅助；

2.添加蛋白酶K并在室温下孵育；

3.通过超速离心收集纯化的LPS

4.冷冻干燥该样品。

如下的流程图中显示了对本发明的免疫刺激化合物之生产方法的优选实施方案的更详细描述：

中间苍白杆菌LMG 3306 LP提取方法的流程图：

该制造方法包括如下步骤：

i)解冻工作种菌(Working Seed Bacteria)(菌株LMG3306)

预接种物(preinoculum)的制备：

1.制备1升胰酪胨大豆肉汤(Triptycase Soy Broth，TSB)

2.准备装有60ml TSB的管

3.从工作种菌的冷冻小瓶中取出一小粒(pearl)并放入装有60ml TSB的管中。

4.在37℃±0.1下震荡孵育24小时。

5.预接种物的控制：鉴定和纯度控制：验证菌落的形态学和培养物的显微形态学。

ii)在控制发酵罐(controls fermentor)中生长：

接种物的制备

1.制备补充有2‰蔗糖的培养基TSB

2.准备装有5升调和的pH为6.75±0.15的补充有2‰蔗糖的TSB的接种瓶。

3.将所述预接种物接种进装有所述培养基的接种瓶中。

4.在37℃±0.1下震荡孵育24小时。

5.接种物的控制：鉴定和纯度控制：验证菌落的形态学和培养物的显微形态学。

培养

1.清洗并消毒发酵罐

2.制备400l补充有2‰蔗糖的TSB

3.将400l补充有2‰蔗糖的TSB装入发酵罐，调节pH为6.75±0.15。

4.将接种物注射进所述装有培养基的发酵罐中。

5.在37℃±0.1下，以50rpm的最大震荡孵育24小时

6.培养物的控制：鉴定和纯度控制：验证菌落的形态学和培养物的显微形态学。

灭活

1.通过无菌操作将培养物转移至灭活罐(inactivation tank)。

2.添加甲醛溶液直到终浓度为0.4％，并且在37℃下以10rpm孵育3天

离心

1.将发酵罐与连续离心机相连，并离心所述发酵罐的内容物。

2.将灭活的培养物装入容积为10升的塑料瓶中。4℃下保存待用。

iii)按照以下描述的方法提取LPS：

1-离心中间苍白杆菌LMG 3306灭活的培养物。除去上清液。

2-在盐水悬浮液(200g/l 15mM NaCl)中重悬所获得的沉淀物。

3-在90％和65℃下，向水溶液中添加苯酚。

4-在65℃下震荡20’。将混合物冷却至10℃。

5-以9000×g离心20’。在4℃保持24小时。

6-透析。首先用纯水，随后用聚乙二醇

7-用四体积的甲醇和1％的醋酸钠饱和的甲醇沉淀。

8-以9000×g离心20’。除去上清液。用纯水重悬提取物并震荡。

9-重复步骤7。

10-冷冻干燥样品以获得粗制LPS。

iv)根据以下方法纯化LPS：

1.通过超声辅助，将100mg粗制LPS溶解于20(5mg/ml)的缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5)中。使用5～10mg LPS作为对照。

2.添加0.5ml蛋白酶K(50μg/ml或5μg蛋白酶/mg LPS)。在搅拌和轻微震荡下室温孵育12小时。

3.通过超速离心(100.000×g，6小时)收集纯化的LPS。在纯水中重悬沉淀物。

4.冷冻干燥样品。

v)按照以下描述计算LPS的浓度以制备大体积溶液(bulk solution)：

材料和试剂

1.1.25N H₂SO₄：将6.66ml商品试剂溶于H₂O DD中至100ml。

2.0.042N高碘酸：0.48g高碘酸(periodic acid)(仲高碘酸(paraperiodic acid)，H₁₅IO₆)溶于100ml 0.125N H₂SO₄中。

3.溶于0.5N HCl(8.3ml浓HCl至200ml H₂O中)的2％亚砷酸钠。

4.硫代巴比妥酸(Sigma)：0.3％pH 2(在50℃下溶于H₂O DD中)。15日之内使用。

5.二甲基亚砜

6.标准品：

Kdo(分子量＝255.1)(Sigma，保存在-20℃)

脱氧核糖(Deoxyxiribose)(分子量＝136)(Sigma，保存在-20℃)

7.以前批次中定量的LPS

8.玻璃管(以铬酸混合液(chromic mixture)或等同物清洗)，其中配有弹球(marble)。

9.分光光度计

方法

1.准备装有标准品Kdo(0.05μg)、脱氧核糖(0.025μg)、以前批次中定量的LPS(0.2μg)和空白试剂(200μl H₂O)的管。

a)如果样品是重量为0.2μg的提取的和冷冻干燥的LPS，则准备一个管

b)如果样品是终产物，则准备200μl的管。

在管中加H₂O至200μl。

2.将装有样品的管置于冰中，向每个管中添加20μl的1.25N H₂SO₄，并用弹球覆盖，精确地煮20分钟。在冰中冷却。标准品不进行该步骤。

3.迅速向样品和标准品中添加0.25ml高碘酸，震荡并在室温下孵育20分钟(从第一管开始计时)。添加高碘酸的顺序必须与添加H₂SO₄的顺序相同。须优化水解时间，因为测得的Kdo量不仅取决于Kdo的溶解，而且取决于其在水解条件(对于中间苍白杆菌LMG3306的LPS而言，20分钟足够)下的降解。

4.按照与3中相同的管顺序，添加0.5ml亚砷酸钠，涡旋震荡并等待2分钟(自添加第一管起)(此时，添加试剂时出现的黄色已经消失)。

5.按照与以前相同的顺序向每个管中迅速添加2ml硫代巴比妥酸。使与弹球一起将其煮20分钟。

6.在托盘中用自来水将其冷却之前，向每个管中精确地添加1mlDMSO(避免出现浑浊)。

7.室温下孵育30分钟。在所述30分钟开始时打开分光光度计，以使灯稳定。

8.在552nm和536nm(分别为Kdo和脱氧核糖的最大吸收)下读取每个管。可使用塑料托盘。

计算

Mk552＝Abs552/μmolk；以相同的方式计算Mk536、Md552y Md536。

μmol  KDO = \frac{Md 536 Abs 552 - Md 552 Abs 536}{Mk 552 Md 536 - Mk 536 Md 552}

k：KDO；d：脱氧核糖；Abs：吸光度

vi)按照以下描述，最后步骤时该批次的均匀性

在产品的制造过程中和根据EMEA/CVMP/598/99“工艺验证指南(Notefor guidance on process validation)”，进行两次该定量方法的均匀性验证：

-在从中间苍白杆菌LMG 3306的灭活培养物中提取LPS结束时，得知其丰度(richness)。

-在最终产品中核对LPS的量。

该经验证的工艺是在提取阶段结束时应用的。在分析方法中所使用的量远高于在最终产品中定量时所用的量。使用该方法意在得知所提取的LPS的浓度。

LPS的定量通过其成分之一(Kdo)的定量来进行。Kdo是LPS分子的一部分，并且，对于特定的LPS，其量总是恒定的，但在不同的细菌LPS中，其量不同。在中间苍白杆菌LMG 3306中，每个LPS分子有2分子的Kdo。

通过分光光度法来进行定量。

当样品为提取的LPS时，Kdo的定量方法不是特异性的，由于Kdo在最大吸收波长(552nm)处有吸收，在LPS的提取和纯化过程结束时留下的任何残留的脱氧核糖(DNA的组分)均可干扰该检测。

使用Kdo标准品进行的Kdo定量验证将会证明Kdo的定量是线性的、精确的和准确的。当LPS样品被脱氧核糖残留所污染时，该方法缺乏特异性，通过应用校正公式来解决。在样品中存在这种干扰时，该公式将所获得的理论Kdo值调整至消除了脱氧核糖干扰的真实值。

脱氧核糖定量的线性将表明该组分不仅单独时表现出线性，而且当其作为LPS的污染物时也表现出线性。

每次使用该方法时，将会使用具有不同浓度Kdo标准品的样品、具有不同浓度脱氧核糖的样品、具有不同浓度的以前定量的LPS的样品和具有不同浓度的受试样品的样品，并且其都在脱氧核糖的最大吸收波长(552nm)下进行测量。

采用所获得的结果，进行以下步骤：

-使用Kdo标准品的标准直线：测试线性。

-使用脱氧核糖标准品的标准直线：测试线性。

-使用以前定量的LPS的直线。检验方法。测试线性。

-计算每个样品所获得的吸光度值的商(quotient)，对于Kdo标准品、以前定量的LPS和受试样品，分子(numerator)为在552nm的吸收值，对于脱氧核糖标准品，分子为在536nm的吸收值。

为了应用该公式，按如下方式选取受试样品的浓度值，使得其商值与Kdo标准品和脱氧核糖标准品的浓度所获得的商值最接近，只要所选的值在标准直线之内即可。如果值不在直线之内，则选取最接近的值。

应用该公式确定Kdo在受试样品中的微摩尔数

本发明还提供药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合的本文中所提供的LPS免疫刺激化合物。合适的载体将取决于要治疗的病症和施用途径。要理解的是，本发明的药物组合物可用作佐剂来增加对抗原的免疫应答或增强免疫系统细胞的某些活性，或者在某些情况下作为预防或治疗性组合物用于在对象中预防或治疗特定的病症。

因此，在一个实施方案中，本发明提供含有本发明的LPS和药学上可接受的载体的药物组合物，其中所述LPS以有效调节免疫应答的量存在，其为在激发所需的免疫应答、治疗或抑制疾病或病症方面达到所期望效果之所需量的化合物。当与抗原共同施用时，所述药物组合物还可作为佐剂发挥作用。

当以广泛范围的剂量和广泛范围的比例施用时，本发明的免疫刺激剂组合物表现出强免疫刺激作用。根据一个优选的实施方案，所述免疫刺激剂组合物包含0.5至120μg/ml的LPS。更优选地，所述组合物包含0.5至10μg/ml的LPS。

根据一个优选的实施方案，所述脂多糖在均匀的悬浮液中，其中的胶束相在4℃下稳定超过1年。

优选地，本发明的免疫刺激剂组合物的pH在2～12之间。

与疫苗共同施用的免疫刺激剂的量通常选择为与疫苗一起诱导免疫保护性应答但却没有典型疫苗中的显著不良副作用的量。所述量也会依据所使用的特定免疫原及其呈递方式而改变。一般来说，预期每个剂量会包含约1～1000μg抗原和0.1～200μg免疫刺激剂，最通常为约2～100μg抗原和0.5～150μg免疫刺激剂，并且优选约5～50μg抗原制剂和1～75μg免疫刺激剂。当然，所施用的剂量可取决于年龄、体重、并行治疗的种类(如果有的话)，以及要施用的抗原和免疫刺激剂的性质。

本发明的免疫刺激剂组合物的施用方式可为递送一般免疫刺激的任何合适途径。然而，所述免疫刺激剂组合物优选通过肌内或皮下途径胃肠外施用。更优选地，皮下施用免疫刺激剂组合物。如果需要的话，也可采用其他施用方式，因此，本发明的组合物的例子包括用于腔孔(例如，口腔、鼻、肛门、阴道等)施用的液体制剂，例如，混悬剂、糖浆剂或酏剂；以及用于胃肠外、皮下、皮内、肌内或静脉施用(例如，注射施用)的制剂，例如，无菌混悬剂或乳剂。在这样的组合物中，本发明的免疫刺激剂组合物可与合适的载体、稀释剂或赋形剂(例如，无菌水、生理盐水、葡萄糖等)混合。

本领域中的技术人员可容易地确定合适的免疫保护作用和非毒性的剂量，即包含于本发明的产品中的本发明的菌株的合适的免疫保护和非毒性量可在LPS有效量的范围内。没有最小推荐应用年龄，一些研究的确显示其应用于1天的年龄。

当然，如果需要的话，可以以合适的间隔重复施用。优选的应用方案如下：

·通过皮下途径，第一次应用0.1μg/Kg体重(body weight，b.w.)。

·15天之后，以相同的剂量第二次应用

更多应用：推荐6个月～1年的应用(0.1μg/Kg b.w.皮下途径)。

实施例1.内毒素血症的治疗和预防

为此，我们在Balb/c小鼠急性模型中使用大肠杆菌的LPS。

首先，我们确定在6天时间内诱导100％死亡率的大肠杆菌LPS的剂量(致死剂量100)。

大肠杆菌菌株O111:B4的LPS购自商号SIGMA(St.Louis，MO，USA)。在所有研究中，使用磷酸盐缓冲液作为LPS的稀释剂。在所有情况下，所使用的载体是磷酸盐缓冲盐水(PBS，phosphate buffered saline)。通过剂量应答曲线来确定存活研究中LPS的适宜剂量，在所述剂量应答中，给雌性BALB/c腹腔内(IP，intraperitonealy)施用增加剂量的LPS。

内毒素血症致死作用的预防

在LPS(大肠杆菌O111:B4)激发之前24小时，将发生内毒素血症的雌性BALB/c小鼠用2个不同IM剂量(0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300))IP处理，或者不进行处理。将所述LPS以1.75mg/小鼠进行注射。

为了在败血症的情况下提供同等的液体复苏(fluid resuscitation)，所有的注射均为相同体积。

两个剂量的IM均完全阻止了大肠杆菌LPS的内毒素休克所引起的LPS相关的动物死亡。此外，IM处理的动物未表现出与感染性休克相关的任何迹象(图1)。所使用的LPS剂量远高于IM的剂量。因此，IM(中间苍白杆菌3306的LPS)不大可能将LPS竞争出去。

内毒素致死性休克的治愈

败血症的主要问题通常不是对其进行预防，而是当该过程开始时将其治愈。为了测试这一点，用2mg/动物的LPS(大肠杆菌O111:B4)IP(腹腔)感染5只小鼠，并在24小时之后用LPS IM 0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300)IP处理。IM对LPS诱导的死亡具有保护作用。因此，在用安慰剂处理72h之后，所有动物都死亡。然而，IM处理产生了20％的动物存活率，并且显著延迟其死亡。这表明，IM能够部分治愈发生内毒素休克的小鼠(图2)。

出人意料的是，与安慰剂组中的动物相比，IM处理的动物表现出更低水平的血液凝固。该事实非常重要，因为过度凝固的问题与败血症的症候相关，并且，事实上，最近被批准的用于该病症的唯一化合物具有凝血阻断作用。

细菌性腹膜炎：

在另一个败血症模型(大肠杆菌诱导的腹膜炎所导致的败血症)中测试中间苍白杆菌LMG 3306的脂多糖。

大肠杆菌致死性腹膜炎的治疗

对于本研究，用10⁷或10⁸活的O26:B6大肠杆菌菌落形成单位(CFU，colony forming unit)接种雌性C57BL/6小鼠，并且分别在24和4小时之后，以LPS IM(0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300))或用单次IP注射安慰剂进行处理。

此后，评价存活和病理症状(厌食、死亡、脱毛、choquexia、身体活动等)。

大肠杆菌注射24小时之后，以10⁷CFU接种的一些小鼠开始死亡(其中的20％)，并且表现出败血症的病理征象(按0至5级分级，平均为3级)。

IM的处理阻止了动物的死亡，并且以剂量应答的方式完全逆转了败血症的病理征象(图3)。

当使用10⁸CFU剂量的大肠杆菌时，所有动物在24小时时死亡。因此，接种大肠杆菌后4小时将其用IM处理。这时，没有小鼠死亡，但病理症状的平均评分非常高(4，总分为5)。14小时时，所有大肠杆菌感染的小鼠均死亡。然而，IM 3μg/Kg(剂量300)阻止了多数动物的死亡(80％存活率)，并且逐渐降低了临床症状的严重程度(图4)。

在利什曼原虫实验性感染中的佐剂作用

足垫感染中的佐剂作用：

众所周知，SLA(利什曼原虫的可溶性抗原，Soluble Antigen Leishmania)抗原提取物不诱导对抗硕大利什曼原虫实验性感染的保护性作用，因为该抗原不能刺激Th1保护性应答(图5)。但是，当SLA与佐剂(如CpG(美国专利7521063))组合或作为用于通过TLR9激发免疫应答和增加Th1应答的疫苗佐剂(Heeg，Int.J.Microbiol，298，33，2008)时，能够通过TLR9(Toll样受体)来诱导保护性Th1(IFN-γ)刺激(美国专利6890542)。

因此，与沿用已久的使用CPG为佐剂用于对抗实验性利什曼病的接种相比，该模型在测试IM方面非常有用。

在图6中，我们显示了用于该目的的实验方案。

基本上，在第0、15和30天，将SLA抗原单独或者与CPG或IM一起接种。

在第60天，将1,000前鞭毛体接种进每个小鼠足垫中，并监测损伤和免疫参数。可宏观地跟踪感染的发展，并与寄生虫的数目相关联。如图7所示，接种之后，对照组中的感染是明显的。SLA抗原不产生任何保护作用，而SLA+CPG和SLA+IM组显著降低损伤。

此外，图8中显示感染后6周的宏观结果，并且证实了，与单独用SLA处理的动物足垫相比，用SLA-CpG或SLA-IM处理的动物中的损伤显著降低。

此外，还对足垫和脾中寄生虫的数目进行了定量。在感染后第7周处死动物，测定脾和引流淋巴结(DLN，draining lymph node)中存在的寄生虫。与IM和CpG相比，SLA的免疫接种不引起寄生虫数目的任何降低。CpG以接近2log的量级减少该数目，并且，在总共6只动物中的至少4个中，IM显示类似的结果(图9)。

简单地说，SLA不单独保护，而是与CpG或IM联合才具有对抗感染的保护性作用。

收集所处死动物的脾细胞，并用SLA“体外”刺激，并评价Th1(IFN-γ)和/或Th2(IL-4)应答。

很好地描述了易感的Balb/c模型中的硕大利什曼原虫感染相对地增加IL-4的水平(与IFN-γ的水平相比)。尽管SLA接种不改变该模式，但其与CpG的联合增加Th1应答，所述Th1应答通过IFN-γ的产生和后续降低的IL-4相对表达而定量。因此，IFN-γ(应答Th1)/IL-4(应答Th2)的比例显著增加(图10)。

出人意料的是，尽管IM与CpG有类似的和保护的作用，但其免疫学机制不同。该保护作用并不与IFN-γ(应答Th1)/IL-4(应答Th2)的比例严格地相关，因为两个参数同时增加(图10)。

测定应答Th1/Th2的第二种方式是分析利什曼原虫特异性的同种型抗体IgG2a(Th1)和IgG1(Th2)的水平。

尽管不清楚其机制，但IgG2a的水平与对抗利什曼原虫的保护作用相关。在未处理或仅以SLA处理的动物中，没有检测水平的IgG2a。然而，在用CpG或IM处理的动物中，检测到了IgG2a的水平。因此，与SLA-CpG和SLA-IM组相比，在未处理或仅以SLA处理的动物中，IgG2a/IgG1的比例很低(图11)。

在足垫实验性小鼠模型中，IM的保护性和治疗性作用：

图12中显示正在进行的用利什曼原虫实验性感染评价IM的治疗作用的实验方案。

为此，使用两个不同剂量与利什曼原虫同时接种IM：

1)组IMF-1、2和3，接受0.6μg/Kg(18ng/小鼠)

2)组IMF-4、5和6，接受1.2μg/Kg(36ng/小鼠)的剂量。

该结果表明，IM能够防御硕大利什曼原虫感染，其效能与用CpG所获得的效能类似(图13A)。

用IM处理的动物未出现任何显著损伤(图13B)。感染后7周，处死动物并定量脾和淋巴结(LN，lymph node)中的寄生虫数目。在组CpG和IM中获得了类似的结果，淋巴结中的寄生虫显著降低(10.000倍)，并且脾中未发现寄生虫(图13C)。

最终，并且与以前的实验相一致，CpG组诱导抗体水平的比值IgG2a/IgG1显著改变。此外，IM未显示该比值的显著改变，这也与以前所获得的结果一致(图14)。

作为结论，我们发现，IM具有与CpG类似的特征，但在免疫机制上与后者不同，因为未改变Th1/Th2或IgG2a/IgG1的特征和比值。在这种情况下，IM可因刺激这两种应答(不仅是CpG中所证实的Th1)而成为更好的佐剂。

IM(中间苍白杆菌的LPS)在免疫抑制的动物中具有疫苗佐剂特性：

以前已经表明，使用SLA作为抗原时，IM对利什曼原虫感染具有疫苗佐剂作用。

该抗原的免疫原性差，并且更重要的是，其主要诱导Th2应答(以占主导地位的IgG1抗体和IL-4的产生为特征)，而非Th1应答(以IgG2a应答和IFN-γ的产生为特征)，所述Th1应答是保护性应答。

为测试对免疫抑制小鼠的佐剂作用，用皮质类固醇地塞米松(Dex)以20μg IP/动物处理雌性Balb/c，并且24小时之后，用SLA单独(10μg/动物)或者与IM(0.6μg/Kg(剂量60)或3μg/Kg(剂量300))或CpG联合接种所述动物，所述CpG是以前报道的诱导Th1应答的化合物(所用的实验方案见图15)。一周之后，用SLA单独加强，并且在第17天，处死所述动物并收集脾细胞，并评价血清中的抗SLA效价。

如图16所示，在所有用SLA注射的动物(除了单独使用Dex的对照外)中检测特异性的抗SLA抗体，但多数抗体为IgG1同种型。据报道，CpG佐剂增加IgG2a/IgG1比值，且更重要的是，IM比CPG更好地诱导该转换，所述转换以Th2向Th1的体内转换为代表。这表明IM在免疫抑制的动物中具有佐剂活性，并且更重要的是，其甚至在免疫抑制的动物中保持偏好Th1应答。

此外，获取了来自不同动物的脾细胞，并用SLA体外刺激，并测量了增殖和IFN-γ(一种防御利什曼原虫所需的Th1细胞因子)。如图7所示，在Dex处理的动物中，SLA诱导增殖性应答。CpG处理的动物具有改善的增殖性应答。有趣的是，以IM处理的动物还具有以剂量应答方式的针对SLA更好的增殖性应答(图17)。在全部动物中，均未观察到对有丝分裂原应答的差异(未显示)。

SLA“体外”处理脾细胞之后，我们检测了在脾细胞的上清液中释放的IFN-γ(Th1细胞因子)和IL-4(Th2细胞因子)。如图18所示，体外SLA激发时，未接种的Dex对照动物没有可检测的IL-4或IFN-γ产生。在SLA接种的动物中，SLA的“体外”激发导致IL-4的产生，但仅产生非常少的IFN-γ，这与相同动物血清的IgG1/IgG2a数据相一致。

CpG的处理诱导IL-4和IFN-γ二者的增加，但对其比值改变不大(图19)。有趣的是，IM的LPS也增加两种细胞因子，但对IFN-γ增加的比例远高于IL-4。这在用3μg/Kg(剂量300)处理的动物中尤其明显，IFN-γ/IL-4的比值增加10倍(图19)。

实施例2.制造方法。

按照上文中描述的制造方法，从中间苍白杆菌菌株LMG 3306获取免疫刺激剂LPS。

1.根据上文中描述的(制造方法)部分(ii)的获得发酵大批量抗原的方法

2.根据上文中描述的(制造方法)部分(iii)的提取LPS的方法

3.根据上文中描述的(制造方法)部分(iv)和(v)纯化和计算LPS的量。

产品存储于预先灭菌的并配有连续搅拌系统的不锈钢罐(tank)中，以保持该批次在4℃下长达24小时的均匀性。使用无菌气体管道系统将所述产品从所述罐中转移至装瓶区域。

在100A级别的无菌环境下进行装瓶(背景的级别为100B)。在相同的区域内应用橡胶塞和包封(capsule)。

将装有最终产品的小瓶存储于4℃，直到贴标签和包装。在另外的区域进行贴标签和包装，并且每次仅一个批次的最终产品及其调节材料(conditioning material)可进入该区域。最后存储在5±3℃，直到上市。

实施例3.组合物：

实施例4.Kdo测试：

本研究的主要目的是检验按照上文中描述的Kdo比色法测定纳摩尔/ml的LPS的重现性。

要检验的参数是：

1-测定内部的精确度

2-测定之间的精确度

3-批次之间的精确度

1-测定内部的精确度结果

在该测定中，使用本发明的一批产品(A003A)，在同一天滴定3个样品，每个样品10个重复。随后，测试每个样品的三个稀释度(1/2、1/4和1/8)(每个稀释度有10个重复)以检验该测定的重复性。

结果：

样品	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											1	0.25	0.25	0.25	0.26	0.25	0.25	0.24	0.25	0.25	0.25
2	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
											3	0.25	0.26	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25

平均	SD	VC
			0.25	0.003	1.2％

该结果表明，该测试是可重现的；VC低于10％。

1/2稀释度：

平均	SD	VC
			0.121	0.003051	2.52％

1/4稀释度：

平均	SD	VC
			0.061333	0.003457	5.63％

1/8稀释度：

平均	SD	VC
			0.031	0.003051	9.84％

我们研究了每个稀释的VC。所获得的结果表明了该测试的重复性；每个VC均低于10％。

2-测定之间的精确度

为了检验主要由技术人员操作所引起的变异性，在不同的三天中滴定相同批次的本发明的产品。每天，所有必需的溶液均是新鲜制备的，并且在该实验的第一天和最后一天之间，将该产品存储在4℃。

在该测定中，在不同的三天中，滴定本发明同一批次(A003A)的产品，3个不同的样品，每个样品10个重复。

结果：

平均	SD	VC
			0.25	0.003352	1.34％

所获得的结果表明了该测定的重现性；VC低于10％。

3-批次之间的精确度

验证该批次成产的变异性：

在本测定中，滴定本发明三个批次(A001A、A002A和A003A)的产品。每个批次三个样品，每个样品10个重复。

平均	SD	VC
			0.25	0.004475	1.78％

在使用本发明的产品样品的测定内部、测定之间和随时间测定中，未观察到Kdo活性的显著差异。

实施例5.作为病毒灭活疫苗之佐剂的免疫原性测试

现场测试(Field Test)

进行该现场测试以在血清阴性的小牛中评价免疫刺激剂对以常规灭活免疫接种所诱导的针对牛疱疹病毒1(BHV-1，Bovine Herpesvirus 1)或感染性牛鼻气管炎(IBR，Rhinotracheitis)的血清抗体、总抗体和中和抗体的免疫应答效率的影响。

材料和方法

1.畜群选择

为了选择受试畜群，预先测试了来自其他5个奶牛畜群的120只动物。因为这5个畜群是血清阳性动物，所以样品取自第六个畜群；受试动物是血清阴性的，并且选择该畜群。

用检测针对IBR病毒总抗体的ELISA商业化测试来进行血清学。

2.操作方案：处理、接种和样品收集

2.1.处理和接种

在来自没有IBR病毒的奶牛群中的22只血清阴性的小母牛中进行测试。在测试的过程中，不允许新动物进入该畜群。

小母牛被分成以下的组：

-组1.-在测试第0和7天用5ml免疫刺激化合物(6μg/mL)处理13只小母牛，并在第7和28天用5ml含有灭活IBR病毒的已注册的商业化疫苗接种。通过颈部深肌内注射来注射这两种产品。

-组2.-在第7和28天，用相同的接种剂量和方式免疫接种6只小母牛。

-组3.-3只小母牛为对照组；其未被处理或被免疫接种，以验证病毒不传播。

2.2.样品收集

在测试期的第0、7、28和58天，取每只动物的血样。

测试的进展方案

3.检测牛疱疹病毒(BHV-1)的中和血清抗体。

I.通过标准病毒中和测试来测定牛疱疹病毒1中和抗体效价；其利用100DI₅₀CT/25μl“Georgia牛肾”(GBK，Georgia bovine kidney)上的Colorado株，其为来自牛肾的完善的细胞系(由Marcelino Alvarez教授，Dpto.Sanidad Animal，Facultad de Veterinaria，Universidad de Leon，Espana提供)，每种血清测试4次。

从纯血清滴定血清。将血清与病毒(25μl稀释的血清和25μl病毒悬液)混合并稀释，以Spearman-Karber法(TRIMMED SPEARMAN-KARBER(TSK)PROGRAM VERSION 1.5，ECOLOGICAL MONITORINGRESEARCH DIVISION ENVIRONMENTAL MONITORING SYSTEMSLABORATORY，U.S.ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCYCINCINNATI，OHIO 45268)来确定其效价。其表示为50％保护的血清最高稀释的倒数。

II.在两个研究组中，确定平均对数效价并将其表示为其反对数(anti-logarithm)的倒数。血清逆转定义为每两次血清收集之间抗体的4倍增加。

III.为了验证处理的和非处理的动物组在不同的测试日获得的平均对数效价之间统计学上相关差异的存在，我们用Windows环境下的Epilnfo软件进行统计了学分析(Kinskall-Wallis非参数检验)。

结果和讨论

I.测试期间，对照动物没有血清转换。

II.对于第7和28天，处理的和非处理的动物组中的血清转换率分别为92.3％和83.3％，而对于第28和58天，在处理的和非处理的动物组中分别为69.2％和16.7％。

在这两种情况下，在处理的动物组中的血清转换比非处理的动物组中的更高；但那些组之间血清转换的差异仅在第28至58天之间是统计学上显著的。

III.在第28天，经处理的动物组中IBR中和抗体的平均对数效价为3.50，其显著高于非处理组动物中获得的2.37的效价。

在第58天，在经处理的动物组中，IBR中和抗体的平均对数效价为12，其显著高于非处理组动物中获得的4.8的效价。

在第28和58天，在经处理的动物中获得的IBR病毒血清抗体效价分别为1.5和2.5，高于非处理的动物中的效价。

结论

1.如所获得的结果显示的那样，免疫刺激化合物的施用显著增加体液应答(如被免疫的动物中的中和抗体和保护水平)；因此，其在接种诱导的免疫应答的实施中发挥重要作用。

2.推荐应用：

-因其低成本，与任何应用于牛的免疫接种形式联用。

-基本上，当动物处于应激情况下(例如，发生在育肥领域)，因为这些结果的确证实在哺食(food suckling)和放牧小牛中进行的其他领域测试中的其他临床的和生产的结果。

实施例6.诱导巨噬细胞分化

免疫调节分子(包括很多细菌种类的LPS)的一个特征是其在巨噬细胞系中诱导形态学改变并伴随增殖活性降低的能力(例如Toll样受体(TLR)的配体)。

为了对此进行研究，在补充有2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、抗生素、庆大霉素和5％FCS的RPMI 1640培养基(GIBCO，Gran Island，NY)中培养J774(克隆J774A168)和Raw 264.7小鼠巨噬细胞系。对于这些实验，在补加有0.5％FCS和不同剂量的本发明的免疫刺激化合物或大肠杆菌LPS的RPMI中培养细胞。在37℃下，孵育该培养物72小时，并通过在培养的最后16小时期间将(3H)胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)整合进DNA来评价细胞增殖。用1μCi的(3H)胸苷对所述细胞进行脉冲处理，并使用自动细胞收获器(automatic cell harvester)在玻璃纤维滤器中收获所述细胞。在液体闪烁谱仪(liquid scintillation spectrometer)中测量放射性整合。该检测在三次重复的培养物中进行。

如图1所示，在Raw巨噬细胞中，与用大肠杆菌LPS相比，本发明的免疫刺激剂组合物诱导J774细胞分化。巨噬细胞的分化通常伴有细胞增殖的降低。本发明的免疫刺激剂组合物诱导对J774巨噬细胞分化的剂量依赖性抑制。在J774或Raw巨噬细胞中，该作用比在基于重量/体积使用大肠杆菌LPS中观察到的作用弱约500倍。

实施例7.在巨噬细胞中诱导TNF：

研究TLR配体活性最敏感的检测之一是通过巨噬细胞或巨噬细胞系研究TNF细胞因子的产生。为进行该测试，在补加了2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、抗生素、庆大霉素和5％FCS的RPMI 1640培养基(GIBCO，GranIsland，NY)中培养J774(克隆J774A168)和Raw 264.7(来自ATCC TIB-71)。对于这些实验，在补加了0.5％FCS和不同剂量的本发明的免疫刺激剂组合物或大肠杆菌的LPS的RPMI中培养细胞。在37℃、5％CO₂下孵育培养物24小时，并收获上清液。通过双位夹心ELISA(two-site sandwich ELISA)(Endogen，Woburn，MA)检测TNF。

未刺激的巨噬细胞不合成用ELISA可检测的TNF。剂量为0.1～10μg/ml的本发明的免疫刺激剂组合物在J774巨噬细胞(图2a)和在raw细胞中以剂量应答方式诱导高达4000pg/ml的TNF生成反应性。尽管本发明的免疫刺激剂的作用是高度显著性的，但比大肠杆菌LPS的作用弱约500倍(图2b)。

此外，单次腹腔注射10％巯基乙酸盐溶液(1ml；Difco Laboratories)4天之后，通过腹腔灌洗从BALB/c或C57Bl/6的12周龄的小鼠中分离腹腔巨噬细胞。用本发明的免疫刺激剂组合物处理来自C57Bl/6(其被认为是易发Th1应答的小鼠品系)和来自Balb/c(相反，其被认为倾向于Th2应答)的巨噬细胞。在平底的12孔板中，使细胞(1.5×10⁶/孔)黏附1h，并在指定量的LPS(026.B6大肠杆菌血清型，Sigma)或本发明的免疫刺激剂存在或不存在下，用新鲜的RPMI/0.5％FCS覆盖。将培养物在37℃、5％CO₂下孵育24小时，并收获上清液。通过双位夹心ELISA(Endogen，Woburn，MA)检测TNF。

在来自Balb/c和C57Bl6品系的两种小鼠的巨噬细胞中，本发明的免疫刺激剂组合物诱导TNF产生，尽管在同等浓度下其效能弱于大肠杆菌的LPS(图3)。可得出结论：基于同等浓度，本发明的免疫刺激剂诱导TNF的效能比大肠杆菌的LPS弱500倍。因此，本发明的免疫刺激剂组合物能够诱导免疫调节剂量的而非过量剂量的TNF，所述过量剂量可以是有毒性的并且引起大肠杆菌LPS所诱导的内毒素性休克。

实施例8.在巨噬细胞中诱导IL-12：

IL-12是主要由巨噬细胞分泌的、对很多刺激(包括TCR配体)作出应答的细胞因子。IL-12是最重要的细胞因子之一，因为IL-12控制T辅助细胞(Th，T helper)向Th1表型分化。IL-12是由p35/p40蛋白链构成的70kD的异二聚体。

为进行该测试，单次腹腔注射10％巯基乙酸盐溶液(1ml；DifcoLaboratories)4天之后，通过腹腔灌洗从BALB/c或C57Bl/6的12周龄的小鼠中分离腹腔巨噬细胞。在平底的12孔板中，使细胞(1.5×10⁶/孔)黏附1小时，并在指定量的LPS(026.B6大肠杆菌血清型，Sigma)或本发明的免疫刺激剂组合物存在或不存在下，用新鲜的RPMI/0.5％FCS覆盖。将培养物在37℃、5％CO₂下孵育24小时，并收获上清液。通过ELISA检测Il-12。在来自C57Bl/6和Balb/c的腹腔巨噬细胞中，剂量为10mμg/ml的本发明的免疫刺激剂诱导大量的IL-12(图4)。

实施例9.通过脾淋巴细胞诱导IFN-γ的产生：

制备来自小鼠的脾细胞(SC，Spleen cell)悬液。通过用蒸馏水低渗裂解耗竭SC中的红细胞，并重悬于含有5％FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100ng/ml)的RPMI-1640完全培养基(GIBCOLaboratories，Grand Island，NY)中。

37℃下，在5％CO₂大气中，在96孔平底培养板(Costar；Cambridge，MA)中，在250μl培养基(RPMI 1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10^-5M 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、0.1μg/ml链霉素)中培养脾细胞(0.4×10⁶细胞/孔)。在指定量的免疫刺激化合物存在或不存在下，用伴刀豆球蛋白A(ConA，Concanavalin A)(10ng/ml)刺激细胞。

在ConA存在或不存在下，在获自脾细胞培养物24h的上清液中测量小鼠IFN-γ。根据制造商的说明，通过特异性的夹心ELISA小鼠MiniKit(Endogen)对其进行测定。如图5所示，ConA的刺激诱导来自两种小鼠品系的脾细胞分泌大量的IFN-γ，这提示其激发了以产生IFNγ为特征的Th1应答。

实施例10.免疫刺激剂通过TLR4和TLR2受体发挥作用：

为了解决本发明的免疫刺激剂所使用的推定的受体，在上述检测中使用小鼠腹腔巨噬细胞或者TLR2或TLR4受体缺陷的脾细胞。

腹腔注射10％的巯基乙酸盐溶液(1ml；Difco Laboratories)之后4天，通过腹腔灌洗分离来自12周龄的C57Bl/6或C57Bl/6 tlr4-/-或C57Bl/6 tlr2-/-(Sarna JR，Dyck RH，Whishaw IQ.2000.The Dalila effect：C57BL6 micebarber whiskers by plucking.Behavioral Brain Research，108(1 )：39-45.PubMedlD：10680755)小鼠的腹腔巨噬细胞。在平底的12孔板中，使细胞(1.5×10⁶/孔)黏附1h，并在指定量的LPS(026.B6大肠杆菌血清型，Sigma)或本发明的免疫刺激剂存在或不存在下，用新鲜的RPMI/0.5％FCS覆盖。将培养物在37℃、5％CO2下孵育24小时，并收获上清液。通过双位夹心ELISA检测TNF和IL-12。在巨噬细胞中缺乏TLR4强烈降低本发明的免疫刺激剂诱导TNF(图6)和IL-12(图7)的能力，而TLR-2缺陷仅部分地阻止该活性。

从小鼠中制备脾细胞(SC)悬液。用蒸馏水低渗裂解耗竭SC中的红细胞，并重悬于含有5％FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)和链霉素(100ng/ml)的RPMI-1640完全培养基(GIBCO Laboratories，GrandIsland，NY)中。

37℃下，在5％CO₂大气中，在96孔平底培养板(Costar，Cambridge，MA)中，在250μl培养基(RPMI 1640、10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、5×10^-5M 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素、0.1μg/ml链霉素)中培养脾细胞(0.4×10⁶细胞/孔)。用伴刀豆球蛋白A(10ng/ml)活化细胞。

在ConA加本发明的免疫刺激剂组合物存在或不存在下，在获自脾细胞培养物24h的上清液中测量小鼠IFN-γ。根据制造商的说明，通过特异性的夹心ELISA小鼠MiniKit(Endogen)测定所述IFN-γ。如图8所示，ConA的刺激诱导大量的IFN-γ分泌，在来自C57Bl/6 tlr2-/-的脾细胞中，所述分泌被严重地抑制，并且当使用C57Bl/6 tlr4-/-细胞时，其几乎完全消失。

因此，本发明的免疫刺激剂主要通过使TLR4受体参与(且部分通过TLR2的参与)而发挥作用。

实施例11.以剂量依赖性方式，用中间苍白杆菌LMG 3306的LPS刺激

T细胞

我们通过进行特异性的实验研究了LPS的免疫刺激能力。

用2×10⁵pfu的淋巴丛脑膜炎病毒(LCMV，Lymphochoremeningitisvirus)感染B6 C57小鼠，并且7天之后，在挑选病毒诱导的T细胞应答时处死小鼠，分离其脾细胞，然后将其用不同的刺激离体刺激几个小时。

为了研究肽特异性的刺激，在布雷菲德菌素A(Brefeldin A)存在下，用单独的培养基或用LCMV NP396肽孵育6小时(以避免IFNγ分泌)，所述肽是来自LCMV的优势H2b限制的CTL表位(Denis Hudrisier，JoelleRiond和Jean Edouard Gairin，Molecular and Functional Dissection of theH-2D^b-Restricted Subdominant Cytotoxic T-CeII Response to LymphocyticChoriomeningitis Virus，J Virol.2001 March；75(5)：2468-2471)。

为了在该时间点时(独立于肽的特异性)在小鼠中检测所有活化的T细胞，在最优浓度下，在没有或有豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA，phorbolmyristate acetate)加离子霉素的情况下孵育脾细胞。

最终，为了研究中间苍白杆菌LPS的刺激能力，以下述不同浓度添加化合物：0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和100μg/ml。

如图9所示，在0.1和1μg/ml时，刺激是次优的。在浓度高于10□g/ml时，达到最大刺激水平。在这些浓度时，至少与“最优的”T细胞刺激实验方案相比，大多数刺激的CD8和CD4 T细胞的IFN□表达的评分为阳性。

来自布鲁氏菌属(Brucella spp.)和人苍白杆菌的含有脂质A部分的LPS结构特征与肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的LPS仅在高浓度(10μg/ml)时通过TLR-4引起生化信号有所不同。注意，虽然PMA/离子霉素引起CD8和CD4 T细胞的毒性，但LPS甚至没有以最大浓度使用。通过添加PMA/离子霉素，很大百分比的这些细胞进入凋亡，导致更低数目的T细胞。

中间苍白杆菌的LPS实现了这些特性中的多个，使得其不仅变成用于更多经典用途的良好佐剂，而且增加DNA疫苗所诱导的免疫应答。

1.我们实验室中用最优剂量的LPS获得的结果改善了由DNA质粒所诱导的免疫应答，至少增加在小鼠中诱导的抗体应答。

2.当体外以剂量依赖性方式添加LPS时，还能够刺激病毒特异性的CD8和CD4 T细胞。

3.甚至当以100μg/ml添加时，其根本不引起毒性，而PMA/离子霉素(通常所使用的)则诱导脾细胞凋亡。

其是由易于转化的非致病细菌所产生的。

Claims

1.一种来自中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)LMG3306的脂多糖，其能在哺乳动物中激发免疫应答，用于治疗和/或预防败血症。

2.用于制备权利要求1的脂多糖的方法，其包括用胰酪胨大豆肉汤培养来自中间苍白杆菌菌株LMG 3306的细菌

3.根据权利要求2的方法，还包括按以下步骤提取所述脂多糖：

a)将中间苍白杆菌LMG3306的灭活培养物离心；

b)将所获得的沉淀物重悬在盐水悬浮液中；

c)用纯水和聚乙二醇透析；

d)用四体积的甲醇和1％的醋酸钠饱和甲醇沉淀；和

e)冷冻干燥以获得粗制LPS。

4.根据权利要求2的方法，还包括按以下步骤纯化粗制LPS：

a)在缓冲液(10mM Tris-HCI pH 7.5)中溶解粗制LPS，任选地以超声辅助；

b)添加蛋白酶K并在室温下孵育；

c)通过超速离心收集纯化的LPS；和

d)冷冻干燥该样品。

5.一种免疫刺激剂组合物，其包含权利要求1的来自中间苍白杆菌LMG3306的脂多糖和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂。

6.根据权利要求5的组合物，其特征在于，其包含化学纯的中间苍白杆菌LMG 3306的LPS，其中非溶剂组分未被超过0.2％的其他化合物所污染。

7.根据权利要求5～6中任一项的组合物，其特征在于，其包含0.5～120μg/ml的来自中间苍白杆菌菌株LMG3306的LPS。

8.根据权利要求5～7中任一项的组合物，其中所述脂多糖处于均匀的悬浮液中，其中胶束相在4℃下稳定超过1年。

9.根据权利要求5～8中任一项的组合物，其中所述组合物的pH在2～12之间。

10.根据权利要求5～9中任一项的组合物在制备用于调节哺乳动物免疫应答的药物中的用途。

11.根据权利要求10的用途，其中所述调节包括在所述哺乳动物中增强免疫活性。

12.根据权利要求11的用途，其中所述免疫应答调节在于诱导巨噬细胞分化、产生TNF、产生IL-12、脾淋巴细胞产生IFN-γ和/或刺激病毒特异性的CD8和CD4T细胞。

13.根据权利要求11的用途，其中所述调节包括在所述对象中抑制促炎细胞因子的产生。

14.权利要求13的用途，其中所述促炎细胞因子为IL-12。

15.根据权利要求5～9中任一项的组合物作为疫苗佐剂用于改进对抗所述疫苗中所含有的特异性病毒和/或细菌之免疫的用途。

16.根据权利要求5～9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防败血症的药物中的用途。

17.根据权利要求5～9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防内毒素血症的药物中的用途。

18.根据权利要求5～9中任一项的组合物在制备用于治疗和/或预防感染性疾病的药物中的用途。

19.根据权利要求18的组合物在制备用于在免疫抑制的动物中治疗和/或预防感染的药物中的用途。

20.根据权利要求18～19中任一项的组合物作为用于对抗利什曼原虫感染之疫苗佐剂的用途。

21.根据权利要求20的组合物作为用于对抗利什曼原虫皮肤感染之疫苗佐剂的用途。