JP5730862B2 - オクロバクトラム・インターメディウムのリポ多糖類および哺乳動物の免疫刺激剤としてのそれらの使用 - Google Patents
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Description
オクロバクトラム属の細菌は、プロテオバクテリア門のアルファ2下位分類に含まれる。それらは、重症もしくは免疫不全患者または留置カテーテルを有する患者でのみ病原性となることが知られている主に土壌に生息する細菌である。オクロバクトラムが、髄膜炎、骨髄炎、菌血症、および敗血症を引き起こし得るような状況において、これらの細菌は、それら自体の慢性感染を確立することはできず、カテーテル除去後に正常な宿主から除去される(Cieslak, T. J., C. J. Drabick, and M. L. Robb. 1996. Pyogenic infections due to Ochrobactrum anthropi. Clin. Infect. Dis. 22:845−847.)
今日、オクロバクトラム・インターメディウム株 LMG 3306のリポ多糖類(IM)が、敗血症の処置および/または予防に有用であり、ならびに免疫抑制された動物およびリーシュマニア症患者におけるワクチン用アジュバントとして有用であることを実証した。
−マクロファージにおいてIL−12産生を誘導すること、
−本発明のLPSによって誘導されたTNFのレベルは、腸のLPSよりはるかに低く、病理学的効果を有さないこと、
−本発明のLPSはTヘルパー1(TH1)活性化およびγ−IFN産生を誘導すること、
を含む、免疫刺激剤として広範な活性を有することが証明された。
−本発明の化合物と合わせて特定のワクチン接種後のIBRウイルスに対する中和抗体の増加の影響
−マクロファージ分化の誘導
−マクロファージにおけるTNFの誘導
−マクロファージにおけるIL−12の誘導
−脾臓リンパ球によるIFN−γ産生の誘導
−TLR4およびTLR2受容体による免疫刺激作用
−T細胞の刺激に対する用量依存的な影響。
用語“免疫刺激組成物”は、本明細書で広義に定義され、該製品を接種された哺乳動物における免疫応答を刺激し得る投与可能な形態の任意の生物学的物質を意味する。
a)オクロバクトラム・インターメディウム LMG3306の不活化培養物を遠心し;
b)得られた沈殿物を再懸濁して生理懸濁液とし;
c)精製水およびポリエチレングリコールを用いて透析し;
d)4倍量のメタノールおよび1%の酢酸ナトリウム入り飽和メタノールで沈殿させ;
e)凍結乾燥させて、粗LPSを得る。
1. 粗LPSを、要すれば超音波を用いて、緩衝液(10mM Tris−HCl pH7,5)に溶解し;
2. プロテイナーゼKを添加し、室温でインキュベートし;
3. 精製したLPSを超遠心分離により集め;
4. サンプルを凍結乾燥させる。
i)ワーキングシード細菌(LMG3306株)の解凍
接種前準備:
1. Triptycase Soy Broth(TSB)を1L準備する
2. 60mlのTSBを含むチューブを準備する
3. ワーキングシード凍結バイアルから種菌(pearl)を取り出し、60mlのTSBを含むチューブにそれを加える
4. 37±0.1℃で24時間、振とうしながらインキュベートする
5. 前接種源の制御:同定および純度制御:コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
接種物製造
1. スクロース 2‰を添加した培養培地TSBを準備する
2. スクロース 2‰を添加した5LのTSB(pH6.75±0.15)を含む接種ボトルを準備する
3. 培養培地を含む接種ボトル中で前接種源を接種する
4. 37±0.1℃で24時間、振とうしながらインキュベートする
5. 接種源の制御:同定および純度制御:コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
1. 発酵装置を浄化および滅菌する
2. スクロース 2‰を添加した400LのTSBを準備する
3. スクロース 2‰を添加し、pH6.75±0.15に合わせた400LのTSBを発酵装置に入れる
4. 培養培地を含む発酵装置に接種源を入れる
5. 37±0.1℃で24時間、最大50rpmで振とうしながらインキュベートする
6. 培養物の制御:同定および純度制御:コロニーの形態および培養物の顕微鏡的形態の確認。
1. 滅菌導管により不活性化タンクに培養物を移送する
2. ホルムアルデヒド溶液を、終濃度0.4%まで添加し、37℃で10rpmで振とうしながら3日間インキュベートする。
1. 発酵槽を連続遠心分離機に接続し、発酵槽の内容物を遠心する
2. 10リットル容量のプラスチックボトルに不活化培養物を入れ、使用まで4℃で貯蔵する。
1−オクロバクトラム・インターメディウム LMG3306の不活化培養物を遠心する。上清を除去する。
2−得られた沈殿物を再懸濁し生理懸濁液とする:200g/l 15mM NaCl。
3−65℃で、水溶液に90%でフェノールを添加する。
4−65℃で20分間振とうする。混合物を10℃まで冷却する。
5−9000xgで20分間遠心する。4℃で24時間維持する。
6−初めに純水で、次いでポリエチレングリコールで透析する。
7−4倍量のメタノールおよび1%の酢酸ナトリウム含有飽和メタノールで沈殿させる。
8−9000xgで20分間遠心する。上清を除去する。抽出物を純水で再懸濁し、振とうする。
9−工程7を繰り返す。
10−サンプルを凍結乾燥して、粗LPSを得る。
1. 超音波を用いて、100mgの粗LPSを20(5mg/ml)の緩衝液(10mM Tris−HCl pH7,5)に溶解する。5−10mgのLPSを対照として使用する。
2. 0.5mlのプロテイナーゼK(1mgのLPS当たり、50μg/mlまたは5μgのプロテイナーゼ)を添加する。室温で12時間、撹拌および軽く振とうしながらインキュベートする。
3. 純粋なLPSを超遠心(100.000×g、6時間)により集める。沈殿物を純水に再懸濁する。
4. サンプルを凍結乾燥させる。
材料および反応材
1. 1,25 N H2SO4:H2O DD中、6,66mlの市販の反応材で100mlとする。
2. 0,042N 過ヨウ素酸:100mlの0,125N H2SO4中、0,48gの過ヨウ素酸(パラ過ヨウ素酸、H15IO6)
3. 0,5N HCl中、2% 亜ヒ酸ナトリウム(200ml H2Oに8,3ml HCl濃縮物)
4. チオバルビツール酸(Sigma):0,3% pH2(H2O DD中に溶解、50℃)。15日以内に使用する。
5. ジメチルスルホキシド
6. 標準:
Kdo(分子量=255,1)(Sigma、−20℃で貯蔵)
デオキシリボース(分子量=136)(Sigma、−20℃で貯蔵)
7. 上記のバッチから定量したLPS
8. ビー玉(marble)が合致するガラス管(第二クロム混合物または等量物で浄化)。
9. 分光光度計。
1. Kdo標準(0.05μg)、デオキシリボース標準(0.025μg)、上記のバッチから定量したLPS(0.2μg)およびブランク反応材(200μl H2O)を含むチューブを準備し、
a)サンプルが抽出したLPSであるとき、凍結乾燥させ、0.2μgを計量し、1つのチューブに準備する。
b)サンプルが最終生成物のとき、200μlを含むチューブを準備する。
チューブにH2Oを加えて200μlとする。
2. サンプルを含むチューブを氷上に置き、20μlの1.25 N H2SO4を各チューブに加え、それらをビー玉で栓をして正確に20分間沸騰させる。氷上で冷却する。この工程は、標準サンプルには行わない。
3. 0.25mlの過ヨウ素酸をサンプルおよび標準サンプルに迅速に加え、振とうし、それらを室温で20分間インキュベートする(最初のチューブから計る)。過ヨウ素酸を加えるため、チューブをH2SO4が添加されたときと同じ順にしておく。測定されたKdoの量は、Kdoの可溶化によって、また加水分解条件中のその分解によっても変わるため、加水分解時間を最適化しなければならない(20分は、オクロバクトラム・インターメディウム LMG3306 LPSにとって十分である)。
4. 3と同じ順のチューブを、0.5mlの亜ヒ酸ナトリウムを添加し、ボルテックスして振とうし、最初のチューブへの添加から2分間待つ(試薬の添加により現れる黄色が、この時消失する)。
5. 各チューブに前と同じ順で2mlのチオバルビツール酸を迅速に添加する。それらをビー玉で栓をして20分間沸騰させる。
6. 各チューブに正確に1mlのDMSO(混濁の出現を避ける)を添加し、その後、それらを、水道水を入れたトレー中で冷却する。
7. 室温で30分間インキュベートする。ランプを安定化させるために、初めの30分間、分光光度計を点けておく。
8.各チューブを552nmおよび536nm(Kdoおよびデオキシリボースそれぞれの最大吸収)で読み出す。プラスチックトレーを用い得る。
定量化プロセスのこの均質性確認法は、製品製造中、EMEA/CVMP/598/99“プロセスバリデーションのガイダンスノート”に従って2回用いられる:
−オクロバクトラム・インターメディウム LMG3306不活性化培養物からのLPS抽出の終わりに、その濃度を知るために用いる。
−最終生成物中のLPSの量を調べるために用いる。
−標準Kdoを含む標準直線:直線性を試験する。
−標準デオキシリボースを含む標準直線:直線性を試験する。
−上記の通り定量したLPSを含む直線。方法をチェックする。直線性を試験する。
−標準Kdo、上記の通り定量したLPSおよび試験サンプルについて552nmでの吸光度、ならびに標準デオキシリボースについて536nmでの吸光度を分母として、各サンプルについて得られた吸光度値の商を計算する。
好ましくは、投与スケジュールは以下の通りである:
・皮下経路により0.1μg/Kg体重(b.w.)の第一投与。
・15日後の同じ投与量での第二投与。
さらなる投与:6ヶ月−1年の適用がより推奨される(0.1μg/Kg b.w.皮下経路)。
これに関して、本発明者らは、Balb/cマウスの急性モデルにおいて大腸菌由来のLPSを用いる。
第一に、本発明者らは、6日間で100%死亡率をもたらす大腸菌LPSの用量を決定する(致死量100)。
大腸菌株O111:B4のLPSを、SIGMA社(St. Louis, MO, USA)から購入した。全ての実験において、LPSの希釈剤としてリン酸塩緩衝液を用いる。全ての場合において、用いるビークルはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)であった。生存実験用のLPSの適当用量は、LPSの増大用量をメスBALB/cに腹腔内(IP)投与したときの用量応答曲線により決定した。
内毒素血症を有するメスBALB/cマウスを、LPS(大腸菌 O111:B4)暴露の前に24時間、2つの異なる用量のIM、0.6μg/Kg(用量60)または3μg/Kg(用量300)でIP処理するか、または処理しなかった。LPSは、マウス1匹当たり1.75mgをIP投与した。
敗血症の場合に等しい急速輸液を供するために、全ての注入は、同量であった。
敗血症の主な問題は、通常、その過程が始まるときに、その予防ではなく、むしろ処置である。この試験のために、5匹のマウスを、LPS IM 0.6μg/Kg(用量60)または3μg/Kg(用量300)IPで処置の24時間後、動物1匹当たり2mgのLPS(大腸菌 O111:B4)でIP(腹腔内)感染させた。IMは、LPS誘導性死亡に保護効果を有する。故に、プラセボ処置後72時間で、全ての動物が死亡する。しかしながら、IM処置は、20%の動物の生存をもたらし、それらの死を顕著に遅延させたこのことは、IMが、内毒素ショックを有するマウスを部分的に処置し得ることを示す(図2).
オクロバクトラム・インターメディウム LMG 3306のリポ多糖類を、敗血症の他のモデルである大腸菌誘導性腹膜炎誘導性敗血症で試験した。
この実験に関して、メスC57BL/6マウスを、動物を、LPS IM、0.6μg/Kg(用量60)または3μg/Kg(用量300)、または単一のIP投与を用いるプラセボで処置した24または4時間後に、107または108の生存O26:B6 大腸菌コロニー形成単位(CFU)を接種した。
大腸菌注入の24時間後、107 CFUを最初接種した何匹かのマウスが死に(それらの20%)、かつ敗血症の病的症状を示す(0から5段階で平均3)。
IMでの処置は、用量応答的に動物の死を防ぎ、敗血症の病的症状を完全に回復させた(図3)。
足蹠感染におけるアジュバント効果:
この抗原は、Th1保護応答を活性化し得ない(図5)ため、SLA(可溶性リーシュマニア抗原)抗原抽出物が、主なリーシュマニア原虫での実験的感染に対する保護効果をもたらさないことは、よく知られている。しかし、SLAが、CpGとしてアジュバントと結合するとき(米国特許第7521063号)(TLR9による免疫応答を刺激し、Th1応答を増大させるためのワクチン用アジュバント)(Heeg, Int. J. Microbiol, 298, 33, 2008)、TLR9(トール様受容体)を介して保護的Th1(IFN−γ)の活性化をもたらし得る(米国特許第6890542号)。
図6で、本発明者らは、この目的のためのプロトコールを示す。
屠殺した動物の脾臓細胞を集め、SLAで“インビトロ”で刺激し、Th1(IFN−γ)および/またはTh2(IL−4)応答を評価した。
図12において、リーシュマニア症を有する進行性実験的完成におけるIMの治療効果を評価するためのプロトコールを示す。
1)IMF−1、2および3群は、0.6μg/Kg(18ng/マウス)を受容した。
2)IMF−4、5および6は、1.2μg/Kg(36ng/マウス)用量を受容した。
結果は、IMが、リーシュマニア属による主な感染症から、CpGで得られた効力と同様の効力で保護し得ることを示す(図13A)。
IMは、抗原としてSLAを用いて、リーシュマニア原虫感染に対してワクチンアジュバント作用を有することが既報である。
免疫刺激性LPSを、オクロバクトラム・インターメディウム株 LMG3306から上記の製造法に従って得た。
1. 上記の工程(ii)(製造方法)の発酵バルク抗原を得るための方法
2. 上記の工程(iii)(製造方法)のLPS抽出方法
3. 上記の工程(iv)および(v)(製造方法)の、LPSの精製およびLPS量の測定。
本実験の主な目的は、上記のKdoの比色法によって、LPS1ml当たりのナノモル数の測定値の再現性を確認することである。
試験すべきパラメーターは、
1−アッセイ内の正確性
2−アッセイ間の正確性
3−バッチ間の正確性
である。
このアッセイにおいて、本発明の生成物の1つのバッチ(A003A)を用い、3つのサンプルを、サンプル1つ当たり10回同様の操作を繰り返して、抗体力価を測定した。次いで、各サンプルの3つの希釈物(1/2、1/4および1/8)を、希釈物1つ当たり10回同様の操作を繰り返して、該アッセイの再現性を確認した。
主に実験者の操作による変動を調べるため、本発明の製品の同じバッチを、3日の異なる日に滴定した。各日、全ての必要な溶液を新鮮に調製し、生成物サンプルを実験の最初から最終日まで4℃で貯蔵した。
このアッセイにおいて、本発明の生成物の1つのバッチ(A003A)を、異なる3日に滴定し、3つの異なるサンプルをサンプル毎に10個の複製物を用いて行った。
バッチ製造の変動を調べる:
このアッセイにおいて、本発明の製造物の3つのバッチ(A001A、A002AおよびA003A)を、滴定した。各バッチの3つのサンプルをサンプル毎に10個の複製物を用いて行った。
野外試験
この野外試験を、血清−陰性のウシにおける、常套的に不活性化したワクチン接種による免疫化によりもたらされる、血清、ウシヘルペスウイルス1(BHV−1)または感染性ウシ鼻気管炎ウイルス(IBR)に対する抗体全体および中和抗体に対する免疫応答(inmunitary answer)への免疫刺激剤の効力を評価するために行った。
1.ウシ群の選択
試験群の選択のために、乳牛の他の5つの群からの120頭の動物を予め試験した。これらの5つの群中に血清−陽性の動物がいたため、サンプルを6つの群に分けた;試験した動物は、血清−陰性であって、この群を選択した。
2.1.処理およびワクチン接種
試験を、IBRウイルスに感染していない22頭の血清−陰性の若い雌牛で行った。新しい動物を試験中に群に加えなかった。
−群1.−13頭の若い雌牛を、試験0日目および7日目に5mlの免疫刺激化合物(6μg/mL)で処理し、7日目および28日目に、不活性化IBRウイルスを含む5mlの承認された市販のワクチンをワクチン接種した。両製品を、首の筋肉内深部に注射した。
−群2.−6頭の若い雌牛を、7日目および28日目に、同様のワクチンおよび同様の方法でワクチン接種して免疫化した。
−群3.−3頭の若い雌牛を対照群とした;それらは、ウイルスが感染しなかった個とを確認するために、処理または免疫化しなかった。
各動物の血液サンプルを、試験0日目、7日目、28日目および58日目に得た。
I.ウシヘルペスウイルス1中和抗体力価を、標準ウイルス中和試験により決定した;100 DI50CT/25μlのウシ腎臓由来のよく確立された細胞株である“Georgia bovine kidney”(GBK)のColorado株(Prof. Marcelino Alvarez, Dpto. Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Leon, Espanaにより提供される)を用いて行われ、各血清を4回試験した。
I.試験中に血清転換した動物はいなかった。
II.7日目および28日目での血清転換率は、処理群および非処理群のそれぞれで92.3%および83.3%であり、28日目および58日目では、処理群および非処理群のそれぞれで69.2%および16.7%であった。
1.得られた結果により示される通り、免疫刺激化合物の投与は、ワクチン接種した動物における中和抗体および保護レベルとしての体液性応答を顕著に増大させた;故に、それは、ワクチン接種によって誘導される免疫応答の実現に重要な役割を果たした。
2.その適用は、
−その低廉な価格のために、ウシに適用される免疫化パターンとして推奨され、
−基本的に、動物が、ウシを太らせる場所のようなストレス下の状況にあるとき、これらの結果が子牛に乳を飲ませて草を食べさせる状況下で行われた他の野外試験で見出された他の臨床的および生産的結果を裏付けるために、
推奨される。
多くの細菌種由来のLPSを含む、トール様受容体(TLR)リガンドのような免疫調節分子の特徴の1つは、増殖活性の減少に関係するマクロファージ細胞系の形態変化を誘導するそれらの能力である。
TLR リガンドの活性を実験するための最も高感度のアッセイの1つは、マクロファージまたはマクロファージ細胞株により産生されるTNFサイトカインを研究することである。この試験のために、J774(クローンJ774A168)および生264.7(ATCC TIB−71から購入)マウスマクロファージ細胞株を、2mM L−グルタミン(Sigma)、抗生物質、ゲンタマイシンおよび5% FCSを添加したRPMI1640培地(GIBCO, Gran Island, NY)中で培養した。実験のために、細胞を、0.5%FCSおよび異なる用量の本発明の免疫刺激化合物または大腸菌由来のLPSを添加したRPMI中で培養した。培養物を、37℃、5% CO2下で24時間インキュベートし、上清を集めた。TNFを、2部位サンドイッチELISA(Endogen, Woburn, MA)により検出した。
IL−12は、TCR リガンドを含む多くの刺激に応答してマクロファージにより主に分泌されるサイトカインである。IL−12は、IL−12がTh1表現型へのTヘルパー(Th)分化を制御するため、最も重要なサイトカインの1つである。IL−12は、p35/p40タンパク質鎖からなる70kDのヘテロ二量体である。
脾臓細胞(SC)懸濁液を、マウスから製造した。SCを、蒸留水を含む低張の溶解液により赤血球を除き、5%FCS、2mM L−グルタミン、ペニシリン(100U/ml)およびストレプトマイシン(100ng/ml)(GIBCO Laboratories, Grand Island, NY)を含むRPMI−1640完全培地中に懸濁した。
本発明の免疫刺激物質により用いられると推定される受容体を明らかにするため、TLR2またはTLR4受容体の何れかを欠失するマウス腹膜マクロファージまたは脾臓細胞を、上記のアッセイに用いた。
本発明者らは、ある特定の実験を行い、LPSの免疫刺激能を実験する。
B6 C57マウスを、2x105 pfuのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)で感染させ、7日後に、ウイルスによって誘導されたT細胞応答を起こしたマウスを選択し、マウスを屠殺し、それらの脾臓細胞を単離し、その後、異なる刺激剤で数時間エクスビボ刺激した。
オクロバクトラム・インターメディウムのLPSは、より古典的な使用によいアジュバントとなるだけでなく、DNAワクチンによって誘導される免疫応答を増加させるため、多くの特性を達成する。
2.LPSは、インビトロで添加したとき、用量依存的にウイルス特異的CD8およびCD4 T−細胞の両方を活性化し得る。
3.PMA/イオノマイシン(常用される)は、脾臓細胞にアポトーシスを誘導するが、100μg/mlで添加したときでさえ、全ての濃度で毒性ではない。
Claims (20)
- 敗血症の処置および/または予防において使用するための、哺乳動物において免疫応答を刺激し得るオクロバクトラム・インターメディウム LMG3306由来のリポ多糖類。
- オクロバクトラム・インターメディウム株 LMG3306細菌を、トリプチケースソイ培地を用いて培養し、
a)オクロバクトラム・インターメディウム株LMG3306の不活化培養物を遠心し;
b)得られた沈殿物を生理懸濁液に再懸濁し;
c)精製水およびポリエチレングリコールを用いて透析し;
d)4倍量のメタノールおよび1%の酢酸ナトリウム含有飽和メタノールを用いて沈殿させ;
e)凍結乾燥させて、粗LPSを得る工程でリポ多糖類を抽出することを含む、
請求項1記載のリポ多糖類を製造する方法。 - 粗LPSの精製工程:
a)所望により超音波を用いて、粗LPSを緩衝液(10mM Tris−HCl pH7.5)に溶解し;
b)プロテイナーゼKを添加して、室温でインキュベートし;
c)精製したLPSを超遠心分離により集め;
d)サンプルを凍結乾燥する工程
をさらに含む、請求項2記載の方法。 - 請求項1記載のオクロバクトラム・インターメディウム LMG3306由来のリポ多糖類および所望により1個またはそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む、免疫応答を刺激するための組成物。
- オクロバクトラム・インターメディウム LMG3306の化学的に純粋なLPSを含むことを特徴とする、請求項4記載の組成物。
- オクロバクトラム・インターメディウム株 LMG3306由来のLPSを0.5〜120μg/ml含むことを特徴とする、請求項4または5記載の組成物。
- リポ多糖類が、ミセル相が4℃で1年以上安定である均質な懸濁液形態で存在する、請求項4〜6のいずれか一項記載の組成物。
- 組成物のpHが2〜12である、請求項4〜7のいずれか一項記載の組成物。
- 哺乳動物における免疫応答の調節のための、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 調節が、哺乳動物における免疫能力を増強することを含む、請求項9記載の組成物。
- 免疫応答の調節が、マクロファージの分化誘導、TNF産生、IL−12産生、脾臓リンパ球によるIFN−γ産生、および/またはウイルス特異的CD8およびCD4 T細胞の活性化からなる、請求項10記載の組成物。
- 調節が、対象における炎症性サイトカインの産生を阻害することを含む、請求項10記載の組成物。
- 炎症性サイトカインがIL−12である、請求項12記載の組成物。
- ワクチンに含まれる特定のウイルスおよび/または細菌に対して免疫を強化するためのワクチン用アジュバントとしての、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 敗血症の処置および/または予防のための、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 内毒素血症の処置および/または予防のための、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 感染症の処置および/または予防のための、請求項4〜8のいずれか一項記載の組成物。
- 免疫抑制動物における感染症の処置および/または予防のための、請求項17記載の組成物。
- リーシュマニア原虫感染に対するワクチンにおけるアジュバントとしての、請求項17または18記載の組成物。
- リーシュマニア原虫の皮膚感染に対するワクチンにおけるアジュバントとしての、請求項19記載の組成物。
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