JP2000507209A

JP2000507209A - ボレリア・ブルグドフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）抗原を投与するための組成物および方法

Info

Publication number: JP2000507209A
Application number: JP9526117A
Authority: JP
Inventors: ジーバーバー，アラン; ジェイルーク，キャサリン
Original assignee: ザユニヴァーシティーオブテキサスシステム
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2000-06-13
Also published as: NO983220D0; ZA97459B; AU1747097A; FI981624A; EP0876156A1; US7094391B1; EP0876156A4; WO1997026006A1; FI981624A0; NO983220L; AU740048B2

Abstract

(57)【要約】 OspAおよびその組成物の粘膜投与について開示している。より詳細には、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）に対する免疫応答、例えば、ライム（Lyme）病を予防する防御免疫などを誘発するためのOspAおよびその組成物の粘膜投与について開示している。従って、経口ライム（Lyme）病ワクチンもしくは免疫学的組成物ならびにそれらの使用方法を開示している。

Description

【発明の詳細な説明】ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）抗原を投与するための組成物および方法政府による援助の表明本研究は、NIH補助金RO1 AI37248号によって援助されたものであり、事前の承認がなくても、アメリカ合衆国政府は一定の権利を有することがある。関連出願 1994年10月３日に出願された第08／320,416号、1993年10月26日に出願された第08／137,175号、1994年６月20日に出願された08／262,220号、1995年１月17日に出願されたPCT／US95／07665号および08／373,455号、PCT／US92／08697号ならびにWO90／04411号をそれぞれ参照として本明細書中に取り入れる。いくつかの文献を本明細書中に引用しているが、それらは「参考文献」の項に列挙しており、各文献を参照として本明細書中に取り入れる。発明の属する分野本発明は、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）抗原を投与する方法に関する。より詳しく述べると、本発明は、ボレリア・ブルグドフェリ（ Borrelia burgdorferi）のOspA(外表面タンパク質Ａ)、特に組換えOspA(rOspA) 、および／もしくはOspD(外表面タンパク質Ｄ)、特に組換えOspD(rOspD)、またはそれらの断片を投与する方法、また、そのような方法において使用する組成物に関する。さらに詳しく述べると、本発明は、特に、ライム（Lyme）病感染に感受性のある宿主ほ乳類（例えば、ヒト、家畜、さらには、非家畜もしくは野生動物も）にrOspAなどのOspAを粘膜投与する（例えば、rOspAなどのOspAを経口投与する）方法（非家畜または野生動物も対象としているのは、本発明によれば、Os pAまたはrOspAは、摂食によって野生動物の体内に残り得るため、野生動物と接触することなく投与することができ、それによってボレリア・ブルグドフェリ（ Borrelia burgdorferi）の数を減少させ、故に、家畜やヒトに伝染したボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）およびライム（Lyme）病に対して抵抗力を発するからである)、およびそれらの組成物に関する。発明の背景ライム（Lyme）病は、イヌダニ（Ixodes ricinus）類のダニによって媒介される複雑な疾患である。スピロヘータである広義のボレリア・ブルグドフェリ（Bo rrelia burgdorferi）は、ライム（Lyme）病の病因因子であり、アメリカ合衆国においては最も一般的な節足動物媒介疾患であり、中央ヨーロッパにおいては風土病である(１)。初期段階においては抗生物質によって治療可能であるが、ライム（Lyme）病の進行を放置しておくと、心臓、神経および複合疾患が生じる。ライム(Lyme)病に対するヒト用のワクチンの開発に関する研究がなされている。そのようなワクチンにおいては、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorfe ri）の外表面リポタンパク質であるOspAが現在の主要候補である。マウスにおける感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のチャレンジに対して、組換えOspA(rOspA)は防御免疫応答を誘発することが知られている(２，３ )。現在、アメリカ合衆国においては、OspAは、皮下投与ワクチンとしてヒトにおける試験が行われている(４)。上掲の出願08／373,455号およびPCT／US92／08697号は、rOspAワクチン、とりわけ脂質化rOspA、ならびにOspAもしくはそれらの断片をコードしているDNAを発現する方法に関する。上掲の出願08／320,416号およびWO90／04411号は、OspAをコードしているDNA、OspAのアミノ酸配列、合成OspA、OspAもしくは合成OspAを含む組成物、ならびにそのような組成物を使用する方法に関する。さらに、その他の上掲の出願は、他のボレリア（Borrelia）抗原または他のOsp類をコードしているDNA、あるいはOspAもしくは他のOsp類または他のボレリア（Borrelia）抗原の有用な断片をコードしているDNA、それらのアミノ酸配列、そのような断片または他のOsp類を含む組成物、ならびにそのような組成物を使用する方法に関する。また、そのようなDNAは、08／373,455号またはPRC／US92／08697において、 OspA、他のボレリア（Borrelia）抗原もしくはOsp類、またはそれらの断片を産生する方法として用いられており、本発明において使用している。別の投与経路を提供するような新たなワクチン戦略が所望されており、それによって、注射に対して感受性を有するヒト(例えば、幼児または乳児)、または注射が困難な他の宿主（例えば、野生動物および家畜）へも投与することができる。大腸菌（Escherichia coli）内に封入して経口投与したOspAは、粘膜性免疫応答を刺激し、感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）を用いたチャレンジに対してマウスを防御した(５)。最近、デューン（Dunne）らは、O spAを発現するネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）の弱毒株を用いてマウスに経口免疫し、感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）を用いたチャレンジに対して約80％のマウスを防御したと報告している(６)。組換えBCG発現OspAを用いた鼻腔内投与による粘膜性免疫についても研究されている(７)。しかしながら、大腸菌（Escherichia coli）内のrOspA、サルモネラ（S almonella）発現OspAおよびBCG発現OspAは、ヒトや動物（家畜または野生動物）へrOspAを有効に投与するための活性産物とはいえない。なぜならば、大腸菌(Es cherichia coli)、サルモネラ（Salmonella）およびBCGは安全ではなく、ヒトまたは動物への投与が認められていない（たとえ弱毒化したとしても、復帰の可能性がある）からである。また、これまでの文献における免疫応答は、大腸菌(Esc herichia coli)、サルモネラ（Salmonella）およびBCGによるアジュバント効果または免疫刺激効果によるものではないかどうか確認されていない(注、例えば、LPSがどのようなアジュバント効果を有するかについては既知である)。故に、従来技術においては、ライム（Lyme）病に感受性のあるほ乳類宿主（家畜もしくは野生動物またはヒト）に対して、ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的断片（例えば、OspA、好ましくはrOspA、より好ましくは脂質化O spAもしくは脂質化rOspA、好ましくは、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、実質的にリポ多糖類（LPS）を含まない）を、適切な基剤（担体）または希釈剤を用い、宿主内で免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するのに十分量、好ましくはいかなる免疫増強アジュバントも用いることなく、粘膜、好ましくは経口投与すること、またはそれらの組成物について教示されたり、示唆されたりしていない。また、本明細書において示されているそのような投与による防御についても、これまで教示されたり、示唆されたりしていない。さらに、そのような経口投与の利点−例えば、単に口中に滴下するだけという、家畜ならびに幼児もしくは乳児に対する投与の容易性、OspAまたはrOspAを含む餌をまくことによる野生動物への投与の容易性など-について教示されたり、示唆されたりしていない。発明の目的および概要本発明の目的は、ライム（Lyme）病に感受性のあるほ乳類宿主に対して、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の単離および／または精製ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的断片（例えば、OspA、好ましくは rOspA、より好ましくは単離および／または精製脂質化OspAもしくは脂質化rOspA であって、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、実質的にリポ多糖類（LP S）を含まない）を、適切な基剤または希釈剤を用い、宿主内で免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘導するのに十分量、好ましくはいかなる免疫増強アジュバントを添加または用いることなく、粘膜（例えば、経口）投与する方法ならびに組成物を提供することである。さらに詳しく述べると、基剤または希釈剤を用いて経口投与されたOspAは、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）に対して防御免疫を誘導するということは、驚くべき発見である。このように、本発明は、広義には、ライム（Lyme）病またはボレリア（Borrel ia）感染症に感受性のある宿主に対して、単離および／もしくは精製ボレリア（ Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的に活性な断片を適切な基剤または希釈剤と混合して、粘膜、好ましくは経口投与することによって免疫応答を誘発する方法、ならびに抗原、基剤もしくは希釈剤を含有する組成物を提供する。該抗原または断片は、アジュバントを含んでいる必要がない、または使用を要しないような組成物および方法となるように脂質化されていることが好ましい。組成物は、固体または液体の形で使用することができる。故に、本発明は、好ましくは、免疫学的に有効な、好ましくは防御量のボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のOspAならびに適切な基剤もしくは希釈剤を含む組成物を粘膜投与して、ライム（Lyme）病に感受性のある宿主に免疫応答を誘起する方法を提供する。該OspAとしてはrOspAを用いることができ、好ましくは脂質化されており、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、LPS を実質的に含んでいない。該組成物は、いかなるアジュバントも含んでいる必要はなく、好ましくは含んでいない。粘膜投与は好ましくは経口投与である。LPS を実質的に含んでいない、および菌由来の他のタンパク質を実質的に含んでいないという概念は、上記および引用している「関連出願」に記載されているものに準じる。基剤または希釈剤は、PBSなどの液体基剤または野生動物の餌として適切なものである。ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの断片（例えば、OspA など）の含有量は、医学または獣医学の分野において既知の因子によって、または上記および引用している関連出願の記載に従って測定することができ、例えば、 0.5〜500μｇである。本発明においては、好ましくは0.5〜50μｇであり、例えば、１〜10μｇである。従って、本発明は、より好ましくは、基本的に、基剤もしくは希釈剤ならびに組換え脂質化ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）OspAを含有する組成物を経口投与することにより、ライム（Lyme）病に感受性のある宿主に免疫応答、好ましくは防御免疫応答を誘起する方法を提供する。ここで、該OspAは、単離および／または精製され、細由来の他のタンパク質を実質的に含まず、また、L PSを実質的に含んでいない。該方法において使用する組成物も本発明に包含されている。防御応答を誘起するOspAの断片も本発明の実施において用いることができる。ボレリア（Borrelia）抗原およびそれらの断片については、「関連出願」の項に引用されている出願を参照し、本明細書に参考として取り入れておく。他の目的および実施例については開示しており、または以下の詳細な説明から明らかである。図面の簡単な説明以下の「詳細な説明」においては添付の図面を参照する。図１（Ａ）は、rOspAまたはrOspDを用いて経口胃内免疫したマウス由来の血清のイムノブロットを示しており、rOspAを投与したマウスにおいて、rOspAに対する抗体が現れている。（24μｇのrOspAを調製用PAGEゲルにのせ、続いてイムノブロットを行った。血清は、0.3％のミルクを含むPBSで１：100に希釈した。正の対照（＋）は、OspAに特異的なモノクローナル抗体（MAb）H5332であり、ハイブリドーマの上清をPBS／ミルクで１：50に希釈した。負の対照（−）は、OspD に特異的なMAb HlC8であり、ハイブリドーマの上清をPBS／ミルクで１：50に希釈した。）図１（Ｂ）は、経口胃内免疫したマウス由来の血清のイムノブロットを示している。（24μｇのrOspDをイムノブロット用の調製用PAGEゲルにのせた。血清は、PBS／ミルクで１：100に希釈した。正の対照（＋）は、MAb HlC8。）図１（Ｃ）は、４μｇのrOspDを皮下免疫したマウス由来の血清のイムノブロットを示している。（24μｇのrOspDをイムノブロット用の調製用PAGEゲルにのせた。血清は、PBS／ミルクで１：200に希釈した。正の対照（＋）は、MAb HlC 8。）図１（Ｄ）は、rOspAおよびrOspDを経口胃内または皮下免疫したマウス由来の血清のイムノブロットを示しており、IgA特異的なコンジュゲートを有するIgAのサブクラス免疫グロブリンが検出されている(マウスの血清は、PBS／ミルクで１：400に希釈した。IgGの正の対照（α−OspA＋）は、PBS／ミルクで１：10に希釈したMAb H5332（IgG2a）のハイブリドーマ上清であり、細片はIgG特異的コンジュゲートとインキュベートした。IgGの負の対照（IgG-ve）は、MAb H5332のハイブリドーマ上清であり、細片はIgA特異的コンジュゲートとインキュベートした。IgA特異的コンジュゲートのバックグラウンドの対照（IgA-ve）は、細片をPBS／ミルクとインキュベートし、次にIgA特異的コンジュゲートとインキュベートした。IgAの正の対照は、マウスミエローマタンパク質TEPC15(IgAk))。発明の詳細本発明の目的は、OspA、好ましくは脂質化OspA、より好ましくは菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、実質的にリポ多糖類（LPS）を含まない脂質化Osp A、最も好ましくは菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、実質的にリポ多糖類（LPS）を含まない脂質化rOspAを、適切な基剤または希釈剤を用い、好ましくはいかなる免疫原性増強アジュバントをも必要とせず、ボレリア・ブルグドフェリ(Borrelia burgdorferi)、ひいてはライム（Lyme）病に対抗するように、ライム（Lyme）病に感受性のある宿主、例えばほ乳類宿主に粘膜、好ましくは経口投与するための方法を提供する。実際、実施例１に示しているように、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia b urgdorferi）のB31株由来の組換え外表面タンパク質Ａ（rOspA）（これは、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、また、LPSを実質的に含んでいない）を、基剤または希釈剤（PBS）中、いかなるアジュバントも添加せず、投与量4.0μ ｇおよび2.0μｇとしてマウスにそれぞれ経口投与した。感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の10⁴を用いてマウスにチャレンジし、器官を培養して防御を判定した。２回の実験において、rOspAを4.0μｇ投与したマウスにおいては、８匹中８匹ともボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdor feri）による感染に対して防御され、2.0μｇのrOspAを投与したマウスにおいては、７匹中６匹が防御され、4.0μｇのrOspDを投与したマウスにおいては、８匹中１匹も防御されなかった。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびイムノブロットアッセイにより、rOspAを経口投与したマウスにおいては、rOspAに対する特異的抗体応答が上昇しており、血清にはIgA免疫グロブリンのサブクラスの抗体が含まれていることが明らかになった。対照的に、rOspDを用いて経口胃内免疫を行つたマウス由来の血清においては、rOspDに対する抗体応答は検出されなかった。しかしながら、rOspDを用いて皮下免疫を行ったマウス由来の血清においては、イムノブロットでの検出が可能なrOspD特異的抗体を含んでいた。rOs pAを経口投与したマウス由来の血清は、インビトロ（in vitro）において、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB31株の増殖を阻害した。これまでのマウスを用いた研究（３）から、イヌおよび人に対する今回の試験によって示されるように、ボレリア・ブルグドフェリ(Borrelia burgdorferi）およびライム（Lyme）病に関して、家畜、ヒト、ならびにライム（Lyme）病およびボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）感染に対して感受性のある他の動物（例えば、シカなどの野生動物）に対して外挿するにあたっては、マウスは適した動物モデルであることは明かである。本発明を広義に捉えると、本発明はボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的に活性な断片に応用することができ、そして、本明細書中においてOspA についてなされている議論は、広義の本発明を包含するものであり、すなわち、「OspA」は例示であり、本明細書中においては「ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的断片」と読み替えることができる。本発明における粘膜投与とは、好ましくは経口投与であるが、広義には、経口、経鼻、経口的、舌下、経舌、消化管内、経肛門、経腟あるいはその他の粘膜経由の投与も含まれる。本発明において、OspA（広義には、ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的に活性な断片）は、年齢、性別、体重、種別ならびに患者に特異的な状態、および投与経路などの因子を考慮に入れ、医学または獣医学の分野の当業者において既知の投与量および手法によって投与することができる。OspA（またはボレリア（Borrelia）抗原もしくはそれらの断片）は、単独、または他の抗原と共投与もしくは順次投与することができる。さらに、OspA（またはボレリア（Bo rrelia）抗原もしくはそれらの断片）は、継続して、例えば、「ライム（Lyme）病が流行する季節」である春がはじまる頃に、毎年投与することができる。本発明において、OspA（または抗原もしくはそれらの断片）は、溶液、懸濁液、乳化剤(エマルション)、シロップ、エリキシル、カプセル(ジェルカプセル− これは、液体のOspA、抗原または断片を配合したものを包含するゼラチンカプセルである−を含む)、錠剤、ハードキャンディ様製剤などに形態にすることができる。OspA（または抗原もしくはそれらの断片）は、適切な基剤、希釈剤または賦形剤、例えば、蒸留水、生理的食塩水、PBS、グルコースなどと混合することもできる。組成物は凍結乾燥することができる。組成物には、投与経路、抗原および製剤において必要な場合には、補助的物質、例えば、湿潤または乳化剤、pH 緩衝剤、アジュバント、ゲル化または増粘剤、保存剤、香料、色素などを加えることができる(例えば、特に脂質化抗原またはそれらの断片については、アジュバントの存在は好ましくないが、非脂質化抗原またはそれらの断片については有用なこともある)。「レミントン薬剤学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE)」第17版（1985 年）などの標準的な教科書を調べることにより、不要な実験をすることなく適切な製剤を調製することができ、本明細書中に参考として引用しておく。適切な投与量は、以下の実施例および本明細書中に引用している文献に基づいて決定することもできる。「レミントン薬剤学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE)」などの標準的な教科書、ならびに市販されているドリスタン（Dristan）経鼻スプレー、ヴァンセナーゼAQ（Vancenase AQ）経鼻スプレーなどを参照すれば、Os pA（またはボレリア（Borrelia）抗原もしくはそれらの断片）を経鼻投与するにあたって、または、それらの製剤を調製するにあたって、不要な実験を要しない。また、「レミントン薬剤学(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE)」などの標準的な教科書、ならびに市販されている経肛門坐剤および経腟坐剤などを参照すれば、OspA（またはボレリア（Borrelia）抗原もしくはそれらの断片）を経肛門または経腟投与するにあたって、または、それらの製剤を調製するにあたって、不要な実験を要しない。さらに、本明細書に示しているように、本発明に従うOspA（またはボレリア（ Borrelia）抗原もしくはそれらの断片）の粘膜投与は、ヒトまたは動物において免疫応答または抗体応答を刺激する。この抗体応答とは、（防御応答をも有するものとは対照的に）単に免疫応答を刺激するためだけに、本方法を用いることができることを意味し、これは、得られた抗体が防御能を持たないにもかかわらず有用だからである。誘発された抗体から、当該分野において既知の技術により、モノクローナル抗体を調製することができる。これらのモノクローナル抗体は、既知の抗体結合アッセイ、診断キットまたは診断試験に用いることができ、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の存否を判定し、あるいはスピロヘータに対する免疫応答が単に刺激されているか否かを判断する。これらのモノクローナル抗体はまた、免疫吸着クロマトグラフィーに用いて、OspAなどのボレリア（Borrelia）抗原を回収または単離することができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞によって産生される免疫グロブリンである。モノクローナル抗体は、単一の抗原決定因子と反応し、従来の血清由来の抗体よりも高い特異性を示す。さらに、多数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、所望する特異性、結合性、およびアイソタイプを有するそれぞれの抗体を選択することが可能である。ハイブリドーマ細胞系は、化学的に同一な抗体を産生するための安定した安価な原料であり、そのような抗体の調製は容易に標準化することができる。モノクローナル抗体を産生する方法は、当業者において既知であり、例えば、1989年４月１日交付のコプロウスキ(Koprowski)，Hら、米国特許第4,196,265号などがあり、本明細書中に参考として取り入れておく。モノクローナル抗体の用途については既知である。そのような用途のひとつとして、例えば、1983年３月８日に交付されたデイヴィッド(David),Gおよびおグリーン(Greene)，H、米国特許第4,376,110号など、の診断法があり、本明細書中に参考として取り入れておく。モノクローナル抗体はまた、免疫吸着クロマトグラフィーによって物質を回収することに用いることもでき、例えば、ミルステイン(Milstein)，C、サイエンティフィック・アメリカン（Scientific American） 243：66，70(1980)などに記載されており、本明細書中に参考として取り入れておく。このように、本発明の方法およびそれによって得られた生成物には、本明細書に記載しているいくつかの用途がある。本発明の実施態様としては、他の用途も含まれる。実例を挙げている以下の実施例から、本発明およびその効果がさらに明かになるであろう。実施例実施例１−OspAおよびOspDの経口投与材料および方法ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）：ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のSh-2-82株（これは、B31株と同じOspA血清型に由来する株）を感染チャレンジに使用した(８)。Sh-2-82株は、限界希釈法によりクローン化し、SCIDマウス内で継代し、必要になるまで、10容量％のDMSOを含むBSK II培地中、−135℃で凍結保存した(メリーランド州、ロックヴィルのATCC にて)。 B311株は、クローン化され、数回継代された、非感染性のB31株（ATCC 35210 ）（OspAおよびOspBを産生する）の誘導株である(９)。HB19R1株は、多数回継代され、非感染性のHB19株（増殖過程において、OspAに対する抗体およびOspAが存在するか否かで選択したもの）の誘導株である(15)。HB19R1は、OspAあるいはOs pBは産生しないが、OspDは産生する。組換えリポタンパク質：ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB31株の組換え脂質化外表面タンパク質であるrOspAおよびrOspDは上記のようにして取得、精製され(３)、コノート・ラボラトリーズ（Connaught Laboratori es）（ペンシルバニア州、スウィフトウォーター）のR.ヒューブナー（Huebner ）博士から提供された。rOspAは、50mMのTris(pH7.5)、10mMのNaCl、２mMのEDTA 、0.3％のトライトン（Triton）X-100中に準備した。rOspD緩衝液はpHを6.5にした以外は、rOspAと同様にした。免疫：ハーラン・ラボラトリース（Harlan Laboratories）（インディアナ州、インディアナポリス）からメスのC3H/HeNマウスを入手した。10週令において、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB31株由来のrOspAまたはrOspDを用いてワクチン接種した。ワクチンの投与は経口で行い、滅菌PBS（pH 7.4）で希釈したrOspA、0.5mlを用いた。ワクチンは、20ゲージ1.5のステンレス製給餌針（ポッパー・アンド・サン（Popper&Son）社製、ニューヨーク）を通して注入した。感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）を用いたチャレンジ：10⁴（ID₅₀の100倍量）のボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi ）のSh-2-82株を尾の付け根に皮内投与した(３)。感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のSh-2-82株のチャレンジから10日後に、マウスを殺した。マウスはメトファン（Metofane）（ピットマン−ムーア（Pitman-Moo re）社、イリノイ州、ムンデライン）を用いて麻酔をかけ、心穿刺により瀉血し、頚部脱臼により殺した。心臓、膀胱および頚骨足根骨の接合部の横断部分を無菌摘出した。これらの器官および0.5mlのプラズマを、10％のウサギ血清を含むB SKII培地中、35℃で培養した。屠殺後５日目から16日目まで、位相差顕微鏡により、培養物中のスピロヘータの存在について調べた。20倍の視野中において、スピロヘータが観察されない場合には、培養物は陰性と考えられた。酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）：前記のように(９)、マウスの血清について、ホールウェットセルELISAを行った。プレートは、重炭酸被覆緩衝液（15m MのNa₂CO₃、35mMのNaHCO₃、３mMのNaN₃、pH9.6）中、１ウェルあたり10⁷のボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB31株を用いて４℃、48時間、または、アーディル（Erdile）らによって記載されているように(３)、rOspAを用いて被覆（コート）した。マウス血清の一連の希釈は、１％の無脂粉乳を含む PBS（pH7.4）中で行った。二次抗体は、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスIgG+IgA+IgM(Ｈ＋Ｌ)またはヤギ抗マウスIgA(Ｈ＋Ｌ)（ザイムド・ラボラトリーズ(Zymed Laboratories)、カリフォルニア州、サンフランシスコ）のいずれかを、PBS／１％ミルクで１：1000に希釈して用いた。ポリアクリルアミド電気泳動（PAGE）およびイムノブロット：PAGEおよびイムノブロットは、文献の記載に従って行った(10，11)。24μｇの組換えタンパク質、rOspAおよびrOspDを調製用SDA-PAGEゲルにかけ、次にこれらをニトロセルロース膜に移した。イムノブロットは乾燥し、必要になるまで４℃で保存した。IgA の正の対照は、精製マウスミエローマタンパク質TEPC15（IgAk）を用いた。H533 2およびH1C8のモノクローナル抗体ハイブリドーマ上清を１％のPBS／ミルクで１：10に希釈して用い、それぞれ、rOspAおよびOspDの負の対照とした。増殖阻害アッセイ：インビトロ（in vitro）におけるマウス血清の増殖阻害活性は、サジエン（Sadziene）らの記載（12）に従って評価した。非加熱モルモット補体（カルバイオケム−ノヴァバイオケム（Calbiochem-Novabiochem）社、カリフォルニア州、サンディエゴ）の２溶血ユニット（HU）を各セルに加え、抗体添加後の培地中の最終濃度がI0HU／mlとなるようにした。マイクロタイターウェルは、フェノールレッド指示薬の色の変化を目視でモニターし、また、ウエットマウントの位相差顕微鏡によってモニターした。増殖阻害（GI）力価は、抗血清の最低希釈度（セルの色は黄色ではなくピンクになる）として求められ、細胞数が対照（非免疫血清）ウェルの少なくとも20分の１より少ないことを意味する。トリプシン消化：脂質化組換えタンパク質rOspAおよびrOspDは、Osp希釈緩衝液を用いて濃度が250μｇ／mlとなるように希釈した。96穴のマイクロタイタープレートの各ウェルに100μｌを加えた。L-1 トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCK）処理トリプシン（シグマ・ケミカル（Sigma Chem ical）社、ミズーリ州、セントルイス）の保存溶液は、トリプシン消化緩衝液（ pH8.0）(10mMのリン酸ナトリウム(pH6.0)、50mMのNaCl、20mMのトリス（Tris）- HCl）で希釈した(13)。各ウェルに15μlの１Ｍのジチオスレイトール（DTT）を含む３倍濃度のPAGE溶解緩衝液（0.19Ｍのトリス（Tris）(pH6.8)、30容量％のグリセロール、３％のSDS、0.0015％のブロモフェノールブルー）を加え、サンプルをすぐに凍結した。電気泳動用の15％のポリアクリルアミドゲルにのせる直前に、サンプルを３分間煮沸した。結果免疫：実験１：１日目に４μｇのrOspA、２μｇのrOspA、または４μｇのrOspDを用いてマウスにワクチン接種し、初回のワクチン接種から２、４および12日目に同じ投与量を投与し、尾から採血した。21日目に同じワクチンを用いてブースターをかけ、31日目に再び尾から採血した。実験２：最初の尾からの採血を初回免疫後８日目に行った以外は、実験１と同様にマウスを免疫し、追加のブースター投与を22日目に行い、２度目の採血を25 日目に行った。感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）を用いたチャレンジ：異なる組換えOsp類を用いて行った経口免疫が感染性のチャレンジに対して防御を発揮するか否かを判定するために、初回免疫後32日目に、10⁴の感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のSh2株をマウスに皮内チャレンジした。屠殺後、マウス由来の培養物は、スピロヘータの存否について、５日後に位相差顕微鏡によって最初の観察を行い、７、８、10、12および16日目に再観察を行った。５日目までに、OspDを投与した５匹のマウスの心臓、膀胱、および接合部の培養物のすべてにおいてスピロヘータが観察されたが、他のすべての培養物においては陰性であった。16日目の培養データを表１に示す。 ELISA：免疫したマウスから採取した血清は、ELISAに供し、rOspAまたはrOspD の経口免疫に対する体液性免疫を調べた。力価は、皮下免疫したマウスの血清のそれと比較した。血清は、１：20から始めて、２倍ずつ一連に希釈を行い、１： 40,960まで希釈した。実験１および実験２の２回目の採血において得られた力価を表１に示す。実験２の血清は、マウスIgAに特異的な二次抗体を用い、非脂質化rOspAについてのELISAも行った。イムノブロット：rOspAまたはrOspDを経口免疫したマウスの抗体応答の特異性をイムノブロットにより調べた。経口免疫したマウス由来の血清が必要な場合には、実験２で得られた血清のみを使用した。経口で４μｇのrOspAを免疫したマウス由来の血清は、イムノブロットにより、１：1600の力価を有していた。２μ ｇのrOspAを免疫したマウスのうち、２匹の血清は、イムノブロット力価は１：1 600であり、他の３匹の血清の力価は１：400であった。図１Ａは、rOspAを経口免疫したマウス由来の血清中の抗体の結合を示している。rOspDを経口免疫したマウス由来の血清は、イムノブロットにおいて、rOspDに結合する抗体を含んでいなかった(図１Ｂ)。しかしながら、４μｇのrOspDを単独で皮下免疫したマウス由来の血清は、イムノブロットにおいて、rOspDに結合する抗体を含んでいた( 図１Ｃ)。経口または皮下免疫マウス由来の血清（希釈は１：400）は、マウスIg Aに特異的なコンジュゲートを用いたイムノブロットにも供し、他の投与経路によって免疫したマウス由来の血清中のこの免疫グロブリンサブクラスの量を比較した(図１Ｄ)。増殖阻害アッセイ：rOspAまたはrOspDを経口免疫したマウスおよびrOspDを皮下免疫したマウス由来の血清についてGIAを行い、血清中の抗体がインビトロ（i n vitro）において、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の増殖を阻害することができるか否かを判定した。４μｇのrOspAを経口免疫したマウス由来の血清は、１：128希釈で、インビトロ（in vitro）において、OspA産生株であるボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB311株の増殖を阻害した。しかしながら、この同じ血清は、インビトロ（in vitro）において、HB19-R1株の増殖は阻害しなかった。この株は、OspAを産生せず、親株であるH B19株（ref）と比較するとより多量のOspDを産生する。２μｇのrOspAを経口投与したマウス由来の血清は、同じ経路で４μｇのrOspAを投与したマウスの血清に比べて４分の１以下の対数GI力価しか有しておらず、HB19-R1株の増殖に対して全く影響を与えなかった。rOspDを経口投与したマウス由来の血清は、インビトロ（in vitro）において、B311株またはHBl9-R1株のいずれの増殖も阻害しなかったが、rOspDを皮下免疫したマウス由来の血清は、１：32希釈までHB19-R1株の増殖を阻害した。得られたGI力価は表２にまとめている。トリプシンに対するrOspAおよびrOspDの感受性：イムノブロット、ELISAおよびGIのデータから、皮下投与したrOspAは、OspD特異的抗体を産生したが、経口投与したrOspDは産生しなかった。経口投与した場合にrOspAは抗体産生を刺激するが、rOspDはしないのかという理由を明らかにする目的で、トリプシンに対するrOspAおよびrOspDの相対感受性を調べた。Osp緩衝液中の濃度が250μｇ／mlの rOspAは、同じ条件下の0.03125μｇ／mlのトリプシンにより消化されたようである。Osp緩衝液中の濃度が250μｇ／mlの牛血清アルブミン（BSA）を25μｇ／ml のトリプシンとインキュベートし、トリプシンがOsp緩衝液中で活性であるか否かを確認した。これらの条件下で、BSAはトリプシンによって消化された。表１：ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）のB31株のrOspAまたはrOspDを消化管内免疫したマウスにおける実験のELISA力価および防御データａ ELISA力価は２回目の採血（ブースター後３日目）からの幾何平均力価を示している。 * 陽性培養は同じマウスから得られたものである。表２：ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の組換えリポタンパク質を経口または皮下免疫したマウス由来の血清の増殖阻害力価ａ B311株はOspAを発現するが、OspDは発現しない。ｂ HB19R1株はOspDを発現するが、OspAは発現しない。結論ライム（Lyme）病に対するワクチン開発の研究は、現在、候補ワクチンとして OspAに焦点があてられている。ヒトについての試験においては、rOspAが皮下投与されている(３)。本発明は、ワクチンまたは免疫学的組成物の別の経路による投与を提供する。OspAを発現する組換えBCGベクターの鼻腔内投与によって粘膜免疫系が刺激されること示されており(７)、また、最近、デューン（Dunne）とその共同研究者らによって、OspAを発現するネズミチフス菌（Salmonella typhi murium）の弱毒株をマウスに経口投与したことが報告されている(６)。しかしながら、デューン（Dunne）およびランガーマン（Langermann）は、安全性およびその他の事項に関して、実際的な用途については何も示しておらず、単に研究上の興味のみによるものであり、OspAに由来する結果であるといういかなる確証もない（さらに、免疫の増強が、投与した製剤中に存在する他の材料に由来するものでないという確証もない）ということに加えて、デューン(Dunne)、ランガーマン（Langermann）および他の研究者らの研究においては、彼らの研究において提示されているワクチンによって、感染性チャレンジに対してすべての実験動物が防御されたわけではない。これに対して、本発明者らは、本明細書において、rOspAを単独で（免疫原性を増強するいかなるアジュバントまたは添加材料も用いず）経口投与することによって、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）による感染に対してマウスを100％防御することを報告している。 ELISAおよびイムノブロット実験から、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物のブースター投与後に、免疫した動物内にOspAに対する強力な抗体応答（IgG およびIgAの両方の免疫グロブリンサブクラスからなる）が示された。rOspDを同じ投与経路で投与したリポタンパク質対照群においては、ELISAおよびイムノブロットのどちらとも検出可能な抗体応答はみられなかった。対照的に、４μｇの rOspDを皮下免疫したマウスは、イムノブロットによって、血清の１：100希釈まで検出可能な抗体応答を示した。もちろん、脂質化しても、あるいはアジュバントと混合しても、OspDは免疫応答を誘起する。経口投与した場合におけるrOspAおよびrOspDの免疫原性の差異を明らかにする目的で、これらのリポタンパク質のトリプシンおよび低pHに対する感受性を調べた。胃内の酸度または小腸内のトリプシンがこれらのタンパク質に対して異なる作用を及ぼし、それによって、これらに対する抗体応答が影響を受けるものと考えられる。本明細書中の実験条件下において、rOspAおよびrOspDをOsp緩衝液中に再懸濁すると、トリプシンに対するそれらの感受性は４倍の差があることがわかった。rOspAは、rOspDに比べて、トリプシン消化に対する抵抗性が少し高かったが、rOspDが非常に感受性が高いようには思われなかった。デューン（Dunne）とその共同研究者らによる報告よりは、rOspAはトリプシンに対する感受性が高いようであったが、彼らの実験においては、rOspAをOsp緩衝液中に再懸濁していなかった。この緩衝液はトライトン（Triton）X-100を含んでおり、これは、rOs pAのタンパク質加水分解解裂に対する感受性を増強する。ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）による感染に対する、単一のタンパク質を含有する粘膜、好ましくは経口ワクチン、または免疫学的組成物の使用に関しては報告されたことも示唆されたこともない。ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）に対する経口免疫の研究は、バクテリア輸送系、すなわち、大腸菌（Escherichia coli）および弱毒化ネズミチフス菌（Salm onella typhimurium）を用いて行われてきた(５，６)。OspAに由来する結果の安全性、確実性ならびに調製の容易性および廉価性から、本発明は従来技術に比べて、驚くほど安全、確実、効率的および効果的であると考えることができる。また、宿主の免疫系は、従来技術の輸送系の抗原に対して応答し、故に、従来技術の組成物を繰り返し投与すると(または従来法を繰り返し行うと)、ワクチン抗原の有効性が減弱する。 rOpsAリポタンパク質の分子構造が胃腸管内での吸収および粘膜免疫系の刺激に役立っているものと考えられる。胃内の酸性度は、胃腸管内で細胞によって摂取され、輸送されるOspAの能力に影響をあたえてはいないと考えられる。胃酸に対して比較的抵抗性のあるタンパク質は、経ロワクチンの有力な候補であるという事実がある(例えば、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）の組換えウレアーゼなど(14))。rOspDが酸性状態で安定であるか否かは知られていない。、経口投与した場合に、rOspDが検出できる程度の抗体応答を誘起できなかったのは、これらのタンパク質の生化学的特性のそのような差異によるのかもしれない。本実験の防御データから、粘膜、好ましくは経口投与されたrOspAは、感染性ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）によるチャレンジに対し、マウスにおいて100％有効な防御免疫応答を誘起することが示される。本明細書中に記載しているように、本発明に従う経口投与の簡便性および有効性から、本発明によって、ヒトおよび動物（家畜または野生動物）の経口免疫またはワクチン投与が提供されることが示される。本発明は、野生動物における感染を縮小することができる。野生動物の感染は、ヒトおよび家畜への感染を引き起こす。ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）は、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）に感染したシカが保有している蚤によって伝染することはよく知られている。家畜またはヒトとの接触がある場所にシカから落とされた蚤によって、家畜またはヒト宿主に蚤がバクテリアを運び、蚤が咬み、それにより、家畜またはヒトに感染する。従って、ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的断片、例えば、Os pAなどを含む適切な餌（例えば、ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdor feri）の感染に対して感受性の高い野生動物の餌、鹿の餌など）は、野生宿主に免疫化をもたらし、その結果、そのような野生宿主間の感染を縮小し、ひいては、そのような野生宿主からヒトおよび家畜への感染の伝播をくい止める。さらに、本明細書に記載している防御結果は、いかなるアジュバントも用いず、単離、精製された組換え脂質化OspAによるものであることから、OspAの脂質化は、防御効果を提供するものと考えられるが、特に定まった理論があるわけではない。実施例２−OspAの鼻腔内および胃内（経口）投与上述のように調製された組換え脂質化OspA（３）を次のように投与した：５匹のC3H/HeNマウスを１群とする群に、25μｇの脂質化OspAを、アジュバントを用いず、基剤（PBS）に溶解し、０および２８日目の２回、鼻腔内または胃内免疫した。14日目に、両方の群において、ELISAによって非常に強力な血清IgGおよび良好な血清IgA応答が観察された。唾液中においても、特に鼻腔内免疫した群において、優れた分泌IgA応答があった。粘膜応答は、ELISPOT分析により、64日目に確認された。これは非常に有用である。なぜならば、抗体分泌細胞数を直接計数し、それによって、異なる抗体に対する応答を定量的に比較することができるからである。鼻腔内免疫したマウスにおいては、唾液腺中に、総リンパ球10⁶個あたり1,470〜5,700個（平均＝3,390個）の抗OspA IgA細胞を有していた。胃内免疫したマウスにおいては、唾液腺中に、総リンパ球10⁶個あたり350〜1,310個（平均＝660個）の抗OspA IgA細胞を有していた。比較として、20μｇのタチナタマメウレアーゼを０および28日目に投与したところ、製剤化しない場合には全く応答はなく、リポソームに封入して投与した場合には、鼻腔内で約100スポット、胃内投与で10〜50スボットであった。古典的な粘膜性免疫原であるコレラ毒素Ｂのサブユニット（投与量は１０μｇ）でさえ、鼻腔内投与ではリンパ球10⁶ 個あたりわずか500スポットであり、胃内投与においてはほとんどスポットは検出されない。このように、脂質化ボレリア（Borrelia）抗原またはそれらの免疫学的に活性な断片、特に脂質化OspAは、非常に強力な粘膜性免疫原であり、防御抗体を含む、有用な抗体を産生または誘起することができる。本発明の好ましい実施態様について詳細に記載してきたが、本発明は請求の範囲によって規定されるものであり、上述の特定の記載事項によって制限されるものではなく、それらの多くの自明な変更もまた本発明の範ちゅうに含まれる。参考文献

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】１．単離ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）OspAを基剤または希釈剤と混合して粘膜投与することにより、ライム（Lyme）病またはボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の感染に対して感受性を有するほ乳類宿主内において、免疫応答を誘導する方法。２．OspAが精製組換え脂質化OspAであり、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、LPSを実質的に含まないものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の方法。３．粘膜投与が経口投与であることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。４．基剤または希釈剤が液体であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。５．基剤または希釈剤が餌であることを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。６．基剤または希釈剤に混合しているOspAが、いかなる免疫原性増強アジュバントをも含まないことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。７．基本的に単離ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）OspAならびに基剤もしくは希釈剤を含む組成物を粘膜投与することにより、ライム（Ly me）病またはボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）の感染に対して感受性を有するほ乳類宿主内において、免疫応答を誘導する方法。８．OspAが精製組換え脂質化OspAであり、菌由来の他のタンパク質を実質的に含まず、LPSを実質的に含まないものであることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。９．粘膜投与が経口投与であることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。 10．OspAが、野生型ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）OspAの全長をコードしている遺伝子を含み、組換えボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia bur gdorferi）OspAリポタンパク質を産生するプラスミドをもちいて宿主細胞を形質転換し、さらに、非変性条件下において、宿主細胞の溶解物から、菌由来の他のタンパク質およびリポ多糖類を実質的に含まない組換えボレリア・ブルグドフェリ（Borrel ia burgdorferi）OspAリポタンパク質を精製して、脂質化されており、宿主に投与可能な形態の精製組換えボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorfe ri）リポタンパク質を得る、ことからなる方法により得られることを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。 11．基本的に単離ボレリア・ブルグドフェリ（Borrelia burgdorferi）OspAならびに適切な基剤もしくは希釈剤を含む組成物であって、該組成物が経口投与に適していることを特徴とする免疫学的組成物。 12．液体、懸濁液、乳化剤、シロップ、エリキシル、カプセル、錠剤、ハードキャンディ様の製剤または固体食材であることを特徴とする請求の範囲第11項記載の組成物。