CN111909874B - 一株生防菌i-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株生防菌I‑5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用，属于生物技术领域。本发明以三线镰孢为目标病原菌，利用对峙培养法对苜蓿根际土中分离的生防细菌进行筛选，获得了1株目标生防菌I‑5，确定为基内苍白杆菌。生防菌I‑5无菌滤液对根腐病菌三线镰孢孢子萌发和产生以及菌丝生长发挥良好的抑制效果；抑菌活性物质表现为良好的热稳定性，对酸碱变化较为敏感，对紫外线具有较好的稳定性。生防菌I‑5对土壤蔗糖酶和土壤中性磷酸酶活性起到明显的促进作用，对土壤纤维酶和和脲酶活性有小幅度提高，对土壤过氧化氢酶活性无明显促进作用。生防菌I‑5能明显地促进紫花苜蓿的鲜重和株高，且无药害发生。

Description

一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是在世界上种植面积最大的豆科牧草，而根腐病是引起紫花苜蓿病害发生的主要病害之一，是一种土传病害，普遍发生在全球各个苜蓿种植区，引发根腐病的发病因素较多，病害可造成大面积严重发生，导致植株大面积死亡，对紫花苜蓿的品质和产量会产生较大的影响，引起经济损失。紫花苜蓿病害如果发生在根部，则会使得种群密度连续下降，植株数几年内下降到原单位面积的16％，草地的可持续利用价值将会完全丧失。近年来，紫花苜蓿的种植面积不断扩增，伴随着这种现象，根腐病的影响也日益严重。

目前，我国主要依靠农业防治和化学防治对根腐病进行控制，而不同种植区土壤环境和耕作制度不同，依靠农业防治控制该病害的程度有限，而化学防治措施虽然有效，但是由于是土传病害，发病后施用难度大、用药量大对环境与人体健康不力，且会杀死非致病性有益微生物，也会使病菌产生抗药性。因此，上述两种方法在应用上均存在明显不足，而生物防治具有优点较多，能够减少对环境的污染、控制时间久、促进苜蓿种植业的可持续性发展，成为众多学者们研究的热点对象，也是未来植物病防治必然的趋势。

因此，提供一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株生防菌I-5，其保藏编号为CGMCC No.20440，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年07月23日，分类命名为基内苍白杆菌Ochrobactrumintermedium。

进一步，所述的生防菌I-5在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

进一步，所述的生防菌I-5在促进紫花苜蓿生长中的应用。

进一步，所述的生防菌I-5无菌滤液在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

进一步，所述生防菌I-5无菌滤液的制备方法如下：

(1)用移菌环挑取生防菌I-5，将其转移至100mL NA液体培养基内，置于28℃、180rpm恒温摇床内震荡培养24h；

(2)取0.5mL已活化的浓度为1×10⁸cfu/mL的生防菌I-5接种于50mL NA液体培养基(装液量为50mL/250mL三角瓶)内，于28℃，180rpm恒温摇床震荡培养7d；

(3)将震荡培养的菌液用灭菌后的细菌滤器进行过滤，得到生防菌I-5无菌滤液。

进一步，所述的生防菌I-5无菌滤液在促进紫花苜蓿生长中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用；本发明以黑龙江省苜蓿根腐病优势致病菌三线镰孢(Fusarium tricinctum)为目标病原菌，利用对峙培养法对苜蓿根际土中分离的生防细菌进行筛选，获得了1株目标生防菌I-5；通过对生防菌株I-5的形态学、生理生化反应、分子生物学鉴定，并结合系统进化树比对分析，确定生防菌I-5为基内苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)。生防菌I-5无菌菌液对根腐病菌三线镰孢孢子萌发和产生以及菌丝生长发挥良好的抑制效果，对根腐病菌孢子萌发的抑制率为78.93％，对分生孢子产生的抑制率是76.78％，对菌丝生长的抑制率为48.51％；基内苍白杆菌I-5的抑菌活性物质表现为良好的热稳定性；对酸碱变化较为敏感，最适pH值为8；对紫外线具有较好的稳定性。生防菌I-5对土壤蔗糖酶和土壤中性磷酸酶活性起到明显的促进作用，对土壤纤维酶和和脲酶活性有小幅度提高，对土壤过氧化氢酶活性无明显促进作用。通过盆栽接种试验，10％的生防菌I-5无菌滤液和接种10％生防菌I-5菌悬液两个处理对苜蓿根腐病的防治效果相当，防效分别为73.50％和74.70％，与其他处理方式对比差异显著；且生防菌I-5能明显地促进紫花苜蓿的鲜重和株高，且无药害发生。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明生防细菌I-5对三线镰孢菌丝生长的影响；

图2附图为本发明I-5对引起苜蓿根腐病的病原真菌菌丝体生长的拮抗作用；其中，a，三线镰孢；b，腐皮镰孢；c，锐顶镰孢；d，苜蓿茎点霉；

图3附图为本发明I-5细胞扫描电子显微照片；

图4附图为本发明生防菌I-5部分生理生化特征；

其中，1，酪朊水解试验；2，淀粉水解试验；3，V-P试验；4，柠檬酸盐利用试验；5，需养性测定；6，明胶液化试验；

图5附图为本发明基于16SrDNA序列构建生防菌I-5的系统进化树；

图6附图为本发明紫花苜蓿根腐病病情指数分级标准；

图7附图为本发明生防菌I-5对三线镰孢引起紫花苜蓿根腐病的防治效果；

图8附图为本发明生防菌I-5无菌滤液对根腐病菌三线镰孢菌丝生长的影响；

图9附图为本发明温度对生防菌I-5无菌滤液抑菌活性物质的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图10附图为本发明pH值对生防菌I-5无菌滤液抑菌活性物质的影响；

其中，折线图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图11附图为本发明紫外线对生防菌I-5无菌滤液抑菌活性物质的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图12附图为本发明生防菌I-5对土壤过氧化氢酶的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图13附图为本发明生防菌I-5对土壤蔗糖酶的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图14附图为本发明生防菌I-5对土壤脲酶的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图15附图为本发明生防菌I-5对土壤中性磷酸酶的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)；

图16附图为本发明生防菌I-5对土壤纤维酶的影响；

其中，柱形图上方的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1紫花苜蓿根腐病生防菌的分离与筛选

(1)生防细菌的分离

采用稀释法自连作13年的紫花苜蓿根际土中分离，具体操作为：取10g根际土样置于装有200mL无菌水的三角瓶(500mL)中，于28℃170rpm条件下震荡20min后，取1mL上清液加入装有9mL无菌水的试管中，配置成浓度梯度为10^-1g/mL、10^-2g/mL、10^-3g/mL，在试管内取0.5mL溶液注入到无菌的培养皿中，将牛肉浸膏培养基(15mL)加入培养皿内，混匀后晾干，用封口膜密封置于26℃恒温培养箱中培养2-3d，待培养基表面长出的单菌落，用移菌钩挑出并转移到PDA试管中进行培养、备用。

牛肉浸膏培养基：牛肉浸膏3.0g、蛋白胨10g、氯化钠10g、琼脂18g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2。

(2)生防菌的初筛

以引起紫花苜蓿根腐病的优势菌株三线镰孢(F.tricinctum)为防治对象，采用平板对峙培养法对分离的细菌进行初筛，具体操作为：在NA平板(NA培养基：蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化钠10g，琼脂18g，蒸馏水1000mL)中挑取单菌的细菌，置于28℃恒温条件下进行48h活化培养，在距PDA平板中心3cm处划线接种已活化的生防细菌，三线镰孢经扩繁后将其打孔制成菌碟(直径为0.7cm)，将菌碟接种在PDA平板(PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2)中央，每个菌株均为3次重复处理，用封口膜封好放置在26℃恒温培养箱培养6d，用游标卡尺精确测量三线镰孢菌落的最长及最短半径，并计算二者比值。

从紫花苜蓿根际土壤中分离到细菌菌株315株，采用平板对峙法筛选获得的对紫花苜蓿根腐病菌三线镰孢具有抑制作用的36株，筛选结果见表1。

表1 36株细菌菌株对引起紫花苜蓿根腐病的三线镰孢拮抗作用测定

从表1可以看出，依据测量出的长度结果，计算出最长半径与最短半径比值的大小，其中5号菌株对引起紫花苜蓿根腐病的三线镰孢菌丝生长的拮抗效果最好(图1)，其最长半径与最短半径比值为3.091，将其命名为I-5。

(3)抑菌谱的测定

采用平板对峙法，选取能够引起苜蓿根腐病的8种苜蓿根腐病菌(木贼镰孢(F.equiseti)、腐皮镰孢(F.solani)、锐顶镰孢(F.acuminatum)、苜蓿茎点霉(Phomamedicaginis)、细交链孢(Alternaria alternata)、尖镰孢(F.oxysporum)、癣囊腔菌(Plectosphaerella cucumerina)、球毛壳菌(Chaetomium qlobosum))作为供试真菌，测定生防菌I-5的抑菌谱。在NA培养基上活化生防细菌，于28℃170rpm条件下震荡培养48h，在距PDA平板中心3cm处划线接种已活化的具有拮抗作用的生防细菌，8种苜蓿根腐病原菌经扩繁后将其打孔制成菌碟(直径为0.7cm)，将菌碟接种在PDA平板中央，3次重复，用封口膜封好后放置于26℃恒温培养箱中培养6d，对其观察，用游标卡尺精准测量8种苜蓿根腐病菌菌落的最长及最短半径，并计算出二者比值。通过计算出的数值大小确定生防细菌抑菌谱的范围，结果见表2和图2。

表2生防菌I-5对8种病原真菌抑菌谱的测定

注：最长半径与最短半径比值均为3次测量的平均值；比值>2的抑菌效果好。

从图2和表2可以看出，生防菌I-5对8种病原真菌都具有一定的抑制效果，其中对锐顶镰孢(F.acuminatum)、苜蓿茎点霉(Phoma medicaginis)和腐皮镰孢(F.solani)的抑制作用明显，3次重复平均值分别为2.663、2.246和2.213。

实施例2紫花苜蓿根腐病生防菌的鉴定

依据《伯杰细菌鉴定手册》，东秀珠、蔡妙英主编的《常见细菌系统鉴定手册》等鉴定标准，对该生防菌株的形态学特征及生理生化特性进行鉴定。

(1)形态学鉴定

A、形态特征：挑取少量目标生防细菌I-5，将其接种在NA液体培养基中，置于28℃170rpm条件下震荡培养24h后得到菌悬液，将其稀释10⁶倍后，取15μL菌悬液，将其均匀的涂在NA培养基平板上，在28℃培养箱中恒温培养2-3d至其出现单个菌落后，对其形态特征进行观察。

B、革兰氏染色：将蒸馏水滴在载玻片上，挑取适量菌苔涂布于其上，风干后，用结晶紫染液进行染色处理，待1min后水洗，并滴加卢戈氏碘液继续作用1min，用水冲洗、吸干。依次使用95％乙醇溶液脱色(约30s)和番红复染液染2-3min，水洗后干燥，观察染色结果。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌则为红色。经鉴定，I-5为革兰氏阳性菌。

C、电镜扫描：挑取少量已活化的生防细菌，将其接种在NA液体培养基中，置于28℃恒温条件下震荡培养48h后得到菌悬液，用12,000rpm的离心机对菌悬液进行离心处理，将所得的沉淀物装入EP管中，并向其中加入2.5％，pH值为6.8的戊二醛固定并置于4℃冰箱中固定1.5h；用0.1M pH6.8磷酸缓冲液冲洗2-3次，每次10min。再分别取浓度为50％、70％、90％的乙醇溶液对其进行脱水处理各1次，每次时间约为10-15min；100％的乙醇脱水2-3次，每次10-15min。用100％乙醇：叔丁醇＝1：1和纯叔丁醇进行置换各1次，每次15min；将其放入-20℃的冰箱中冷冻30min，再放入ES-2030(HITACHI)型冷冻干燥仪对样品进行干燥约4h；将观察面朝上放置，用导电胶带将其粘在扫描电镜(SU8010)的台上；同时，在样品表面用离子溅射镀膜仪镀上一层约为100-150埃的金属膜，样品处理好后，放置在样品盒中待检。

结果见图3，从图3可以看出，生防菌I-5为杆状细菌，无芽孢中等大小的杆状，直径为0.6-0.9μm，长为1.7-5.3μm，菌体两端呈顿圆；在固体培养基表面，菌体形成不透明的白色菌落，菌落干，边缘不整齐，有褶皱。

(2)生理生化鉴定

接触酶试验：挑取少量已活化的目标生防细菌I-5，将其接种在NA液体培养基中，于28℃170rpm条件下震荡培养培养24h后，在其中滴加10％的H₂O₂溶液，观察是否有产生气泡，若有气泡产生则为阳性，反之为阴性。

酪朊水解试验：目标生防菌I-5在培养基上活化24h后接种在牛奶平板培养基(脱脂奶粉10g，琼脂3g，蒸馏水200mL，pH7.0-7.2)上，28℃恒温条件培养3d，观察菌落周围是否有透明圈出现，若出现，则记为阳性反应；反之则记为阴性。

硝酸盐还原试验：目标生防菌I-5在NA培养基中活化24h后，接种于硝酸盐还原试验的液体培养基(葡萄糖5g，蛋白胨5g，硝酸钾1g，氯化钠0.5g，蒸馏水1000mL)中，28℃恒温培养3d，将未接种管设置为对照组。向试验组及对照组中分别各自加入少量的试剂A液与B液(格里斯氏(Griess)试剂：试剂A液(对氨基苯磺酸1g，稀醋酸(10％)300mL)；试剂B液(蒸馏水20mL，α-萘胺0.1g，10％左右的稀醋酸150mL))。若在菌液中有红、橙或棕色的变色现象发生，则记为阳性；若颜色无明显变化，向菌液中再次滴加少量的二苯胺溶液(蒸馏水40mL，浓硫酸200mL，二苯胺1g)，若菌液中有蓝色现象发生，记为阴性；若仍无明显颜色变化，反应结果按阳性处理。

需氧性测定：取12mL该试验所用的培养基(葡萄糖10g，氯化钠5g，K₂HPO₄ 2g，蛋白胨2g，琼脂6g，蒸馏水1000mL)装入试管后，进行灭菌处理，将已活化的目标生防菌I-5穿刺接种至供试培养基底部，置于30℃恒温条件下培养4d后观察菌落生长情况。若沿培养基表面生长，则该菌为好氧性菌株，为阳性；如沿穿刺线生长，则为阴性。

柠檬酸盐利用试验：取11-12mL柠檬酸盐培养基(氯化钠2.5g，柠檬酸钠1g，(NH₄)₂HPO₄ 0.5g，K₂HPO₄ 0.5g，1％溴百里酚蓝0.5mL，MgSO₄ 0.1g，琼脂1g，蒸馏水500mL)装入试管后，进行灭菌处理后，摆成斜面密封保存。将其表面水分彻底晾干后，接种已活化的目标生防菌I-5于试管中，30℃恒温条件下培养4d，观察培养基颜色变化，若呈蓝色，记为阳性；若无明显颜色变化，则记为阴性。

V-P测定：将目标生防菌在NA培养基上活化后，将其接种在该试验所用的液体培养基(40％NaOH，0.3％肌酸或原粉)中，于28℃恒温条件下培养4d，取10mL上述液体混匀至10mL40％的氢氧化钠溶液中。并向其中加入少量的肌酸溶液，待5min后(或更长时间)观察溶液颜色变化，若呈变红，则记为阳性，反之，则记为阴性。

甲基红(M.R.)试验：目标生防菌I-5经活化后，将其接种在供试的液体培养基(氯化钠5g，葡萄糖5g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，pH7.0-7.2)中，28℃恒温条件下培养4d。取上述液体，向其中滴加少量甲基红溶液，观察其颜色变化，若有红色变色现象产生，则记为阳性，反之，记为阴性。

淀粉水解试验：用移菌钩挑取少量的目标生防菌I-5置于NA平板培养基中，经24h活化处理后，再移取少量生防细菌点种于淀粉平板培养基(蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，牛肉膏5.0g，可溶性淀粉2.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL)上，置于28℃恒温条件下培养4d，将菌落周围滴加少量碘液，观察平板颜色变化，若有蓝黑色变色现象发生，同时菌落周围伴有不变色的透明圈产生，则记为阳性；反之如无透明圈产生，则记为阴性。

明胶液化试验：移菌钩挑取少量目标生防菌I-5置于NA平板培养基上，经24h活化处理后进行明胶液化培养基(明胶150g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.4)穿刺接种，将未接种管设置为对照组。将试验组与对照组同时置于20℃恒温条件下培养，分别在2d，10d和30d后观察明胶的具体形态变化。若明胶呈液态状，或试验组与对照组相比表面有凹坑出现，则记为阳性；若明胶呈固态状且表面平整，试验组与对照无明显差异，则记为阴性。

硫化氢及糖醇类发酵试验：利用新型微生物微量生化测定管(广东环凯生物科技有限公司提供)，参照使用说明进行测定。

上述实验结果见表3；酪朊水解试验、淀粉水解试验、V-P试验、柠檬酸盐利用试验、需养性测定、明胶液化试验，结果见图4。

表3生防菌I-5的生理生化特征

注：“+”阳性，“-”阴性。

由表3和图4能够得出生理生化测定结果为，生防菌I-5为革兰氏阳性菌株、厌氧菌；可利用甘露糖、5％乳糖、葡萄糖、纤维二糖、果糖、丙二酸盐和蔗糖；不可以利用木糖、阿拉伯糖、肌醇、甘露醇、鼠李糖、山梨醇、麦芽糖；可分解硫氨基酸产生硫化氢；可以分解过氧化氢；不能分解酪蛋白、淀粉；能水解明胶；硝酸盐还原试验结果为阳性；V-P试验、柠檬酸盐、M.R.试验显示为阴性。

(3)分子鉴定

采用16SrDNA扩增方法进行分子鉴定，用植物基因组提取试剂盒(康维生物科技，北京，中国)，提取供试生防细菌I-5的总DNA，利用16SrDNA的通用引物进行扩增，引物序列为：

1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；SEQ ID NO.1；

27F：5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.2。

PCR扩增体系(50μl)如下：1492R(10μM)2μL，27F(10μM)2μL，DNA 2μL，Taq Mixture25μL，ddH₂O 19μL。

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min，共设置36个循环；72℃延伸10min；最后4℃保存。

结果检测：反应结束后，移取反应产物5μL，对其进行琼脂糖凝胶电泳检测。

序列测定：电泳检测条带显示清晰，符合试验要求，送至上海生工公司对扩增产物进行进一步测序，经测序得到长度为1389的16S rDNA，其碱基序列见SEQ ID NO.3。

在BLAST软件上利用NCBI与现有数据库中的16SrDNA基因序列进行同源性的比较，将测得序列保存提交到GenBank，得到登录号MT159411，其与基内苍白杆菌Ochrobactrumintermedium strain D-2(MK249656.1)的相似程度高达95％，同时结合生防菌I-5的形态学特征与生理生化特性，与《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》进行最终比较，鉴定结果表明生防菌I-5为基内苍白杆菌(O.intermedium)。

将16SrDNA同源性作为试验基础，选取不同细菌菌属的菌株，通过使用MEGA 6.06软件构建系统进化树(图5)，结果表明生防细菌菌株I-5与基内苍白杆菌(O.intermedium)亲缘关系最近。

通过生防菌株I-5的形态学、生理生化反应和分子生物学鉴定，并结合系统进化树比对分析，确定生防菌I-5为基内苍白杆菌(O.intermedium)。

实施例3生防菌I-5对紫花苜蓿根腐病室内盆栽试验防效测定

菌悬液的配制：将具有拮抗作用的目标生防菌I-5置于NA培养基平板上，放置在28℃恒温培养箱中扩繁培养4-5d，在培养好的NA平板内倒入0.9％的无菌生理盐水，用移菌钩轻轻刮起将培养基表面的生防细菌，在分光光度计下测量OD₆₀₀值为0.1(相当于菌体浓度为1×10⁸cfu/mL)。

孢子悬浮液的配制：将苜蓿根腐病菌三线镰孢接种在PDA培养基平板上，放置在28℃温箱中扩繁培养4-5d，向培养皿中滴加无菌水15mL，用移菌钩轻刮下PDA培养基表面的病原菌菌丝，经双层纱布过滤后，放置在显微镜下进行观察，通过使用血球计数板将其配成孢子浓度为10⁶孢子/mL的孢子悬浮液，备用。

生防菌I-5无菌滤液：用移菌环挑取少量目标生防菌，将其转移至100mL NA液体培养基内(装液量为100mL/250mL三角瓶)，置于28℃、180rpm恒温摇床内震荡培养24h后。取0.5mL已活化的浓度为1×10⁸cfu/mL生防菌I-5接种于50mL NA液体培养基(装液量为50mL/250mL三角瓶)内，于28℃，180rpm恒温摇床震荡培养7d后，将震荡培养的菌液用灭菌后的细菌滤器进行过滤，最终得到目标生防菌I-5的无菌滤液，无菌滤液即为目标生防菌I-5的次生代谢产物，保存备用。

接种：挑选饱满健康的紫花苜蓿种子，用75％的酒精溶液进行5min消毒处理，再用无菌水进行冲洗、晾干，将草炭土和蛭石(3：1)混匀后，放入小钵中约3/4，再将紫花苜蓿种子放入土中，再轻覆一层土，于养苗室培养，待植株出苗后进行接种处理，每钵中紫花苜蓿植株数为4，处理试验共6组，处理1为仅接种病原菌；处理2为仅接种生防菌I-5菌悬液；处理3为接种根腐病菌及浓度为1％的生防菌I-5无菌滤液，处理4为接种根腐病菌及浓度为5％的生防菌I-5无菌滤液，处理5为接种根腐病菌及浓度为10％的生防菌I-5无菌滤液，处理6为接种根腐病菌和10％体积目标生防菌I-5菌悬液，每组处理3次重复。

生防菌接种时间为苜蓿生长至4-5叶期进行第1次接种，接种后7天进行第2次接种，每次用量为每钵5mL菌悬液或无菌滤液，第1次生防菌接种后隔1天接种病原菌，接种量为5mL/钵，对照组接种同等用量的生理盐水，待对照发病60％以上后，测量植株的发病情况、植株的株高和鲜重。结果见表4。

处理1-6苜蓿根腐病发病情况参照，紫花苜蓿根腐病分级标准(图6)：

0级：无肉眼可见症状；

I级：根部变细；

II级：根部小于1/2的面积出现病斑；

III级：根部大于1/2的面积出现病斑；

IV级：全株腐烂；

V级：种子烂死。

病情指数计算公式：

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高病级数)×100％

防治效果计算公式：

防治效果＝(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100％

表4生防菌I-5对三线镰孢引起紫花苜蓿根腐病盆栽防效的测定

注：数据为3次测量的平均值。表中的不同字母表示差异显著(P<0.05)。

生防菌I-5对三线镰孢引起紫花苜蓿根腐病的防治效果见图7。

由表4和图7可以看出，通过盆栽接种根腐病菌三线镰孢后使用10％的生防菌I-5无菌滤液和接种10％生防菌I-5菌悬液防治效果相当，防效分别为73.50％和74.70％，差异不显著，说明该菌株的菌悬液和无菌滤液都能有效控制苜蓿根腐病的发生，且未发现药害的产生。

实施例4生防菌I-5抑菌机制和活性的测定

生防菌I-5无菌滤液为实施例3制备的。

(一)目标生防菌抑菌机制的测定

(1)生防菌I-5无菌滤液对苜蓿根腐病菌三线镰孢分生孢子萌发的影响

将苜蓿根腐病菌三线镰孢接种于PDA培养基平板中，密封后将平板置于28℃温箱中培养4-5d扩繁，培养皿中加入15mL无菌水，用移菌钩轻轻地刮下PDA培养基表面的病原菌菌丝，经双层纱布过滤后，放置在显微镜下观察，通过血球计数板将其配置成孢子浓度为10⁶孢子/mL的孢子悬浮液，备用。利用24孔细胞培养板将配置好的孢子悬浮液分别加入生防菌I-5无菌滤液中，使最终浓度分别为浓度为1％、5％和10％，每孔最终体积确定为2mL，将未加入生防菌I-5无菌滤液的病原菌孢子悬浮液设置为空白对照组，每处理重复3次，待对照组萌发至60％以上时，调查各处理组的分生孢子萌发数，并计算分生孢子的萌发抑制率，结果见表5。

(2)生防菌I-5无菌滤液对根腐病菌三线镰孢菌丝生长的影响

将生防菌I-5无菌滤液加入至定量的已冷却至45℃的200mL PDA培养基中，混匀倒板，无菌滤液最终浓度分别为1％、5％和10％，将扩繁后的苜蓿根腐病菌打成直径为0.7cm的菌碟，将菌碟接种于PDA培养基平板的中心，每处理重复3次，向对照组加入无菌水，放置在26℃恒温培养箱中培养96h，结果见图8。而后测定苜蓿根腐病菌菌丝的生长直径，并计算菌丝的生长抑菌率，结果见表5。

(3)生防菌I-5无菌滤液对根腐病菌三线镰孢分生孢子产生的影响

将已扩繁5d后的苜蓿根腐病菌三线镰孢打成0.7cm的菌蝶，将菌碟接种在PDA培养基上，恒温培养至直径4cm后，切掉周围无菌的培养基，将生防菌I-5无菌滤液用无菌水稀释为1％、5％、10％的浓度梯度，向每组培养皿中分别加入不同浓度梯度的生防菌I-5无菌滤液15mL，刮掉菌丝后放置20min，倒掉培养皿中的溶液，在26℃恒温条件下培养72h后，对照组内滴加无菌水，每处理重复3次，通过血球计数板测定孢子悬浮液的浓度，而后计算分生孢子产生抑制率，结果见表5。

表5生防菌I-5无菌滤液对根腐病菌分生孢子萌发、产生及菌丝生长的影响

注：表格内每行不同字母表示差异显著(P<0.05)。

从表5和图8可以看出，生防菌I-5无菌滤液可在一定程度上抑制分生孢子的产生和萌发以及菌丝的生长过程；随着生防菌I-5无菌滤液浓度的提高，分生孢子的萌发，产生以及菌丝生长的抑制效果显著增加；生防菌I-5无菌滤液浓度达到10％时的抑菌效果最佳，抑制率明显高于1％和5％的浓度作用，对根腐病菌孢子萌发的抑制率高达78.93％，对孢子产生的抑制率为76.78％，对菌丝生长的抑制率为48.51％。

(二)生防菌I-5抑菌活性物质稳定性检测

(1)抑菌活性物质热稳定性的测定

运用菌丝生长速率法测定不同温度处理对生防菌I-5无菌滤液的抑菌效果影响，分别在20、40、60、80、100℃水浴及121℃(湿热灭菌)条件下，将生防菌I-5无菌滤液处理20min，将不同温度处理后的生防菌I-5无菌滤液加入定量的已冷却到至45℃的PDA培养基中，使溶液浓度达到10％，将已扩繁的苜蓿根腐病菌三线镰孢打成直径为0.7cm的菌碟，将菌碟接种在PDA平板的中心，加入等量无菌水为对照组，每处理重复3次，26℃恒温培养5d后测量病原菌菌落生长直径长度，并计算出菌丝生长抑菌率，结果见图9。

从图9可以看出，其中对照组生防菌I-5无菌滤液抑菌活性物质的抑菌率为56.18％，在经过20℃、40℃和60℃恒温水浴处理20min后，生防菌I-5无菌滤液的抑菌率与对照组之间无明显差异，说明当温度控制在20℃到60℃之间时，温度对生防菌I-5无菌滤液的抑菌物质活性物不会产生影响，当随温度从60℃开始逐渐升高后，抑菌率呈现为略微的下降趋势，但仍具有一定的抑菌效果，但下降幅度不大，说明生防菌I-5无菌滤液中的抑菌活性物质对温度表现相对稳定。

(2)抑菌活性物质酸碱稳定性的测定

利用菌丝生长速率法测定不同pH处理对生防菌I-5无菌滤液的抑菌效果影响，分别用0.1M的NaOH和HCl调整生防菌I-5无菌滤液的pH值，设置pH梯度为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，将未进行pH处理的样品设置为对照组，每处理重复3次，26℃恒温培养5d后测量病原菌菌落直径长度，并计算出菌丝生长抑菌率，结果见图10。

由图10可以看出，随着pH值逐渐升高，生防菌I-5无菌滤液的抑菌率呈现先升高到达峰值后降低的趋势，当pH值<5时，生防菌I-5无菌滤液抑菌活性物质的抑菌率明显降低，当pH值为8时，生防菌I-5无菌滤液的抑菌效果最好，抑菌率为55.79％，当pH值为3时，抑菌作用最低为5.33％，说明生防菌I-5无菌滤液的抑菌活性物质对酸碱变化较为敏感。

(3)抑菌活性物质抗紫外线稳定性的测定

通过菌丝生长速率法测定不同紫外照射时间对生防菌I-5无菌滤液的抑菌效果影响，在紫外灯15cm的范围附近放置生防菌I-5无菌滤液，分别对其进行10min，20min，30min和60min照射，不经处理的为对照，每处理重复3次，26℃恒温培养5d后测量菌落的直径长度，并计算抑菌率，结果见图11。

由图11可以看出，对照组根腐病菌的菌落生长直径为2.90cm，在紫外灯下对生防菌I-5无菌滤液分别进行10min、20min、30min、60min稳定照射后，测出根腐病菌的菌落生长直径分别为3.21cm、3.23cm、2.96cm和3.00cm，对照组与各实验组之间差异并不明显，说明无菌滤液中的抑菌活性物质对紫外线保持很好的稳定性。

实施例5生防菌对紫花苜蓿土壤酶活性的影响

土壤酶活性测定：土壤过氧化氢酶、土壤蔗糖酶、土壤脲酶、土壤中性磷酸酶、土壤纤维酶采用土壤酶活性试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司，中国)及其使用说明测定。

试验方法：

采用试剂盒紫外分光光度计法对土壤酶活性进行测定。选用饱满健康的紫花苜蓿种子放置在75％的酒精中处理5min后，无菌水冲洗、晾干，将蛭石和草炭土(1：3)混匀，放入小钵中约3/4，再将紫花苜蓿种子放入土中，再轻覆一层土，于养苗室培养，待植株出苗20d后接种，共4组处理：处理1(A)为空白对照，不加生防菌I-5不加病原菌；处理2(B)为只加生防菌I-5不加病原菌；处理3(C)为只加病原菌不加生防菌I-5；处理4(D)为既接种病原菌也加入生防菌I-5，每处理3次重复。

生防菌第一次接种时间为苜蓿生长至4-5叶期，接种后7天进行第2次接种，用量为每钵5mL浓度为10％的菌悬液，第1次生防菌接种后隔1天接种病原菌，接种量为5mL/钵，对照组接种同等用量的生理盐水，以第1次接种生防菌日期为起始日期，开始取土，每隔7d取1次土样，共计4次，保存烘干，静置，备用。

(1)土壤过氧化氢酶

取新鲜土样风干后研磨过40目筛网后，再次进行研磨过60目筛网，备用。预热酶标仪30min，调节波长至510nm。将试剂1内液体摇晃落入底部，分别取出20μL至3个新的EP管中，再加2mL蒸馏水充分溶解备用。在测定管和无基质管中加入干土0.1g，无土管中不加干土，再向3个EP管中加入800μL蒸馏水置于室温25℃震荡培养30min。取100μL试剂1加入至测定管和无土管内，同时向无基质管中加入蒸馏水100μL，混匀，置于室温25℃10min(每2min摇晃一次)。向三组EP管内分别加入同等量为100μL试剂2，置于12,000rpm室温下离心10min，用移液枪将上清液全部转移至新的EP管内，保存进行下一步测定。在3组EP管中依次加入上清液5μL、165μL试剂3、30μL试剂4，放置于室温25℃下静置5min后，取200μL溶液于96孔板中，并立即在510nm下读取吸光值A，△A＝A无土管-(A测定管-A无基质管)，每组重复处理3次。

利用标准曲线：

y＝0.1027x-0.0318

R²＝0.9936；x为标准摩尔质量(μmol)，y为△A。

土壤过氧化氢酶：

S-CAT(μmol/h/g干土)＝

[(△A+0.0318)÷0.1027]÷W÷T＝58.4×(△A+0.0318)÷W

其中，T为反应时间，10min＝1/6h；W为土壤样本实际取样量。

经生防菌I-5处理后的土壤，测定土壤过氧化氢酶的变化，结果如图12所示，不同处理间土壤过氧化氢酶的活性无显著差异，随着时间增长，过氧化氢酶活性始终处于比较稳定的趋势，苜蓿根腐病的发生与土壤过氧化氢酶的变化无明显关联；由此可见，生防菌I-5与病原菌对土壤过氧化氢酶活性无明显影响。

(2)土壤蔗糖酶

取新鲜土样风干后研磨过40目筛网后，再次进行研磨过60目筛网，备用。将试剂1临用前用30mL与试剂2混匀，备用。取0.1g鲜土分别加入测定管和对照管内，而后向其中加入甲苯30μL，再向测定管内滴加500μL试剂1，对照管中滴加500μL试剂2，混匀后置于恒温培养箱内孵育4h，12,000rpm，4℃离心5min，取上清液待测。预热酶标仪30min，调节波长至540nm。分别在两组EP管内依次滴加200μL上清液、200μL试剂3，摇匀后于95℃水浴下处理5min，取出后用流水降温冷却至室温。再向其中加入500μL蒸馏水，取200μL溶液于96孔板中，并于540nm读取吸光值A，则△A＝A测定管-A对照管，每组重复处理3次。

利用标准曲线方程：

T-SC活力(mg/d/g土样)＝[(△A+0.0445)÷7.2432×(V÷V1)]÷W÷T×D＝2.2×(△A+0.0445)÷W×D

y＝7.2432x-0.0445

R²＝0.9964；x为标准品质量(mg)，y为△A。

土壤蔗糖酶:

其中V为反应总体积：530μL；V1为显色反应中上清液体积：200μL；T为反应时间，10min＝1/6h；W为土壤样本实际取样量；D为稀释倍数。

经生防菌I-5处理后的土壤，测定土壤蔗糖酶的变化，结果如图13所示，随着时间的增长，土壤蔗糖酶含量呈现为升高的趋势，不同处理间存在明显差异，加入生防菌I-5可使得土壤蔗糖酶活性逐渐升高，显著高于对照组；病原菌会抑制土壤蔗糖酶活性，与对照组存在显著差异；同时加入生防菌和病原菌的根际土的土壤蔗糖酶活性明显优于只接病原菌的土壤，与对照组之间无明显差异。且随着时间的延长，生防菌I-5对土壤蔗糖酶的活性促进作用不断增加。这些数据表明生防菌I-5对土壤蔗糖酶活性具有促进作用。

(3)土壤脲酶

取新鲜土样风干后研磨过40目筛网后，再次进行研磨过60目筛网，备用。预热酶标仪30min，调节波长至578nm。向测定管和对照管中分别加入0.2g风干土样，而后向2组EP管中加入100μL甲苯，震荡混匀，使得土样全部湿润后在室温下静置15min。再向测定管中加入500μL试剂2，向对照管中加入等量500μL的蒸馏水，再同时向两组EP管中加入1000μL试剂3，充分混匀后，进行37℃恒温孵育24h后再次充分混匀，于10,000转/min常温离心10min后取上清液备用。将上清液用蒸馏水10倍稀释后，待测。向测定管和对照管中加入400μL稀释后的上清液，再依次向两组EP管中加入80μL试剂4和60μL试剂5，混匀后室温下静置20min，而后分别加入460μL蒸馏水，混匀。于波长578nm，1cm光径，蒸馏水调零，测定各管吸光度值，每组重复处理3次。

利用曲线方程：

y＝28.164x-0.1767

R²＝0.9989；x为OD值，y为标准浓度(μg/mL)。

土壤脲酶:

S-UE活力(U/g土样)＝y×V×10÷W＝y×16÷W

其中V为培养反应体系总体积：1.6mL；W为土样克重g。

结果如图14所示，单一接种病原菌会造成土壤脲酶的降低，造成土壤质量下降，但使用生防菌I-5后能够保护苜蓿根部土壤中的土壤脲酶的活性维持在正常水平。且随着时间的增加，土壤脲酶活性处于波动的状态，但整体趋势表现比较一致。

(4)土壤中性磷酸酶

取新鲜土样风干后研磨过40目筛网后，再次进行研磨过60目筛网，备用。向试剂2加入10mL试剂1充分溶解后待用。预热30min酶标仪，将波长调节至405nm。在测定管中加入0.03g干土后，在测定管和空白管中依次加入10μL甲苯、290μL试剂1、200μL试剂2，置于37℃下培养1h。而后分别加入300μL试剂3，充分混匀，12,000rpm条件下离心10min，取上清液200μL，于96孔板中，405nm下读取吸光值A测定和A空白，△A＝A测定管-A空白管，每个处理3次重复。

利用标准曲线方程：

y＝0.0315x-0.0014，

R²＝0.9994；x为PNP摩尔质量(nmol)，y为△A。

土壤中性磷酸酶:

S-NP活力(nmol/h/g土样)＝

[(△A+0.0014)÷0.0315]÷W÷T＝[(△A+0.0014)÷0.0315]÷W

其中W为土壤样品质量g；T为催化反应时间，1h；PNP相对分子质量为139.11。

结果如图15所示，苜蓿根腐病对土壤中性磷酸酶的抑制作用较大，通过施用I-5后能够有效缓解；各取样时期内不同处理土壤中性磷酸酶的变化趋势基本相同。接种生防菌后使得土壤中性磷酸酶活性提高，达到最高值，接种病原菌后土壤中性酶活性最低，接种病原菌和生防菌可抑生防菌I-5对土壤中性磷酸酶的影响。同时，单独接种生防菌I-5的处理土壤中的中性磷酸酶活性显著升高，这些说明生防菌I-5对土壤中性磷酸酶有很好的促进作用。

(5)土壤纤维酶

取新鲜土样风干后研磨过40目筛网后，再次进行研磨过60目筛网，备用。将试剂1临用前用30mL试剂2，在80℃水浴搅拌至溶解，待用。依次在测定管和对照管中加入0.1g干土、甲苯20μL，25℃恒温条件下静置15min，分别向测定管中加入500μL试剂1、向对照管中加入500μL试剂2，充分混匀，37℃恒温培养3h，12,000rpm，25℃离心10min，取上清液待测。预热酶标仪30min，调节波长至540nm。在两组EP管中依次加入上清液100μL、200μL试剂3，摇匀，95℃水浴加热5min，经冷却后，取200μL放置于96孔板中，540nm读取吸光值A，△A＝A测定管-A对照管，每组进行重复处理3次。

利用标准曲线方程：

y＝21.483x-0.038

R²＝0.9955；x为标准品质量(mg)，y为△A。

土壤纤维酶:

S-CL活力(μg/d/g干土)＝

[(△A+0.038)÷21.483×103×(V÷V1)]÷W÷T＝199.45×(△A+0.038)÷W

其中V为反应总体积：520μL；V1为显色反应中上清液体积：100μL；T为反应时间，3h＝1/8d；W为土壤样本实际取样量g。

结果如图16所示，单独接种苜蓿根腐病的处理与对照相比土壤纤维酶受到明显抑制，而通过接种生防菌I-5可明显促进土壤中土壤纤维酶的活性达到对照水平，这些表明通过施用生防菌I-5后，可有效促进苜蓿根腐病发生后对土壤中纤维酶的活性水平。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一株生防菌I-5及其在防治紫花苜蓿根腐病中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

agagttgatc ctggctcag 19

<210> 3

<211> 1389

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gcctgcctcc ttgcggttag cacagcgcct tcgggtaaaa ccaactccca tggtgtgacg 60

ggcggtgtgt acaaagcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120

cgattccaac ttcatgcact cgagttgcag aatgcaatcc gaaatgaaat ggcttttgga 180

gataaggtca tactcgcgtg ctcgctgccc cctgtcacca ccattgtgtc acgtgtgtag 240

cccagcccgt amgrggcatg gaggaacttg acagtcatcc ccacctwcct mtcaggctta 300

tgcagcyggc agtcgccytt agagtgaccc aatctgaatg ctrgcaacta aagggcgags 360

gttgcgctcg ttgcggggac ttaaacgcma acatctcacg acatcgagct gaacgacagt 420

ccatgcagca cctgtctccg atccagccga actgaaggat agtgtmtcca ctaaccgcga 480

tcggggatgt caagggctgg taaggktytg cgcgttgctt cgaaattaaa ccacatgctc 540

ccaccgcttg tgcgggcccc ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc 600

ccaggcggaa tgtttaatgc gttagctgcg ccaccgaaga gtaaactccc caacggctaa 660

cattcatcgt ktacggcgtg gactaccagg gtatstaatc ctgtttgctc cccacgcttt 720

cgcacmtcag cgtcagtaat ggtccagtga gccgccttcg ccactggtgt tcctccgaat 780

atmtacgaat ttcacctcta cactcggaat tccactcacc tctaccatac tcaagactaa 840

cagtatcaaa ggcagttccg gggtttgagc cccgggattt caccccygac ttattagccc 900

gcstacgtgc gctttacgcc cagtaaatcc gaacaacgct agcccccttc gtattaccgc 960

ggctgctggc acgaagatta gccggggctt cttctcctgg ttaccgtcat tatcttcacc 1020

ggtgaaagag cttkacawcy ctaggsccwt catcactcay gcggcatgry ggatcaggcy 1080

tgcgcccatk gtccaatrwt ccccactgct gcctccsgta ggartctggr ccgtgtctca 1140

gtcccagtgt ggctgatcat cctctcagac cagctatgga tcgtcgcctt ggtaggcctt 1200

taccccacca actagctaat ccaacgcggt catttgccga taaatctttc ccctttcggg 1260

ctcatacggt attagcacaa gtttccctga gttattccgt agcaaatggt acgttcccac 1320

gcgttactca cccgtctgcc gctccccttg cggggcgctc gactgcatgt gtaagctgcc 1380

gccatgcaa 1389

Claims (6)

1.一株生防菌I-5，其为基内苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium），其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.20440。

2.权利要求1所述的生防菌I-5在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

3.权利要求1所述的生防菌I-5在促进紫花苜蓿生长中的应用。

4.权利要求1中的生防菌I-5的无菌滤液在防治紫花苜蓿根腐病中的应用。

5.根据权利要求4所述的生防菌I-5无菌滤液在防治紫花苜蓿根腐病中的应用，其特征在于，所述生防菌I-5无菌滤液的制备方法如下：

（1）用移菌环挑取生防菌I-5，将其转移至100 mL NA液体培养基内，置于28℃、180 rpm恒温摇床内震荡培养24 h；

（2）取0.5 mL已活化的浓度为1×10⁸ cfu/mL的生防菌I-5接种于50 mL NA液体培养基内，于28℃，180 rpm恒温摇床震荡培养7 d；

（3）将震荡培养的菌液用灭菌后的细菌滤器进行过滤，得到生防菌I-5无菌滤液。

6.权利要求4中的生防菌I-5的无菌滤液在促进紫花苜蓿生长中的应用。

Images