CN116855416B - 一种拮抗植物病害病原菌的菌株、菌剂及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种拮抗植物病害病原菌的菌株、菌剂及应用，所述拮抗植物病害病原菌的菌株为北里孢菌A‑qlqy‑2(Kitasatospora spp.A‑qlqy‑2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231040；保藏时间为2023年06月19日；本发明拮抗植物病害病原菌的菌株及其代谢产物能够拮抗茶树炭疽病病原C.camelliae、茶树斑点病病原D.segeticola和魔芋茎腐病镰刀菌F.solani，进而能够实现对茶树炭疽病和斑点病以及魔芋茎腐病的防治。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种拮抗植物病害病原菌的菌株、菌剂及应用。
背景技术
茶炭疽病和斑点病是茶树叶部主要病害之一，病害的发生严重时会导致茶树叶片大面积脱落甚至死亡，造成茶叶大批量减产，严重制约茶叶产量及品质提升。目前，茶叶生产上主要依赖化学药剂防治茶树叶部病害，但长期施用化学药剂所导致的病原菌产生耐药性、土壤微生态失衡、食品安全等问题已成为茶产业高质量发展的一大阻碍，因此，高效、低毒的生物防治措施在茶树种植过程中颇受重视，其中以利用或改造有益微生物在病害防控方面尤为突出。
魔芋(Amorphophallus konjac，konjac)作为食物受到很多人的喜爱，在医疗保健中也起到很好的作用，此外魔芋含有丰富的葡甘聚糖，具有多方面的生理活性和广泛的应用价值。由镰刀菌引起的魔芋茎腐病是魔芋栽培种植过程中发生的一种重要的土传病害，其大面积爆发，可对魔芋种植生产带来毁灭性的灾难，增加了芋农种植风险；虽然不断有病害防治方法的研究报道，并产生了一定的作用，但在实际魔芋种植中，魔芋茎腐病在魔芋生产中仍旧是一大难题，给魔芋产业的发展带来了巨大损失。
放线菌(Actinomycetes)是一类丝状革兰氏阳性菌，主要分布于土壤、空气、水体中，在沙漠、南极、洞穴等极端生境也能生存。放线菌产生的次级代谢物不仅具有重要的生物学活性，而且数量庞大，约占目前医药、畜牧、农用天然抗生素总量的三分之二。利用防线菌防治茶树叶部病害和魔芋茎腐病具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种拮抗植物病害病原菌的菌株、菌剂及应用，该菌株能够拮抗茶树炭疽病病原C.camelliae、茶树斑点病病原D.segeticola和魔芋茎腐病镰刀菌F.solani，进而能够实现对茶树炭疽病和斑点病以及魔芋茎腐病的防治。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种拮抗植物病害病原菌的菌株，所述拮抗植物病害病原菌的菌株为北里孢菌A-qlqy-2(Kitasatospora spp.A-qlqy-2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231040；保藏时间为2023年06月19日。
优选地，所述植物病害病原菌包括茶树炭疽病病原C.camelliae、茶树斑点病病原D.segeticola和魔芋茎腐病镰刀菌F.solani。
本发明第二方面提供了一种含有所述拮抗植物病害病原菌的菌株的菌剂。
本发明第三方面提供了一种上述拮抗植物病害病原菌的菌株在制备防治茶树炭疽病、茶树斑点病和/或魔芋茎腐病的制剂中的应用。
本发明第四方面提供了一种上述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物在制备防治茶树炭疽病、茶树斑点病和/或魔芋茎腐病的制剂中的应用。
本发明第五方面提供了一种用于防治茶树炭疽病、茶树斑点病和/或魔芋茎腐病的制剂，所述制剂包括上述拮抗植物病害病原菌的菌株和/或上述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物。
优选地，所述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物由所述拮抗植物病害病原菌的菌株经发酵培养、过滤除菌得到。
本发明第六方面提供了一种防治茶树炭疽病或斑点病的方法，所述方法包括在茶树蓬面喷施上述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物。
本发明第七方面提供了一种上述拮抗植物病害病原菌的菌株和/或上述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物在提高茶树的茶叶产量或提高茶叶中茶多酚、儿茶素没食子酸酯和咖啡碱含量中的应用。
本发明第八方面提供了一种提高茶叶产量的方法，所述方法包括在茶树蓬面喷施上述拮抗植物病害病原菌的菌株的代谢产物。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明拮抗植物病害病原菌的菌株及其代谢产物能够拮抗茶树炭疽病病原C.camelliae、茶树斑点病病原D.segeticola和魔芋茎腐病镰刀菌F.solani，进而能够实现对茶树炭疽病和斑点病以及魔芋茎腐病的防治。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例1中基于16S rDNA-gyrB基因的拼接序列构建菌株A-qlqy-2与北里孢菌属的系统发育树；
图2为本发明实施例1中菌株A-qlqy-2在ISP2培养基上的形态特征；
图3为本发明实施例2中北里孢菌A-qlqy-2对茶树炭疽病病原C.camelliae的抑制作用结果图；
图4为本发明实施例2中北里孢菌A-qlqy-2对茶树斑点病病原D.segeticola的抑制作用结果图；
图5为本发明实施例2中北里孢菌A-qlqy-2对魔芋茎腐病镰刀菌的抑制作用结果图；
图6为本发明实施例2中北里孢菌A-qlqy-2与C.camelliae对峙培养5d后的光学显微镜下观察图；
图7为本发明是实施例2中不同浓度北里孢菌A-qlqy-2发酵液对C.camelliae抑制作用结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本实施例为北里孢菌A-qlqy-2的筛选、鉴定；
一、菌株分离及保藏
采用五点法从贵州省黔西南州晴隆县碧痕镇清韵茶业有限公司(N25°74'67”，E105°15'07”)福鼎大白茶园根际采集3份土样；采用土壤稀释涂布法分离获得放线菌，命名为A-qlqy-2，并用无菌水和25％甘油分别在4℃及-20℃保存；现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M20231040，保藏日期为2023年6月19日。
二、A-qlqy-2菌株的鉴定
1、系统发育分析
参照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)方法提取放线菌DNA，参考赖宝春等(2022)的方法扩增16S rDNA和gyrB基因，在文献基础上作调整：PCR扩增体系(25μL)：Golden Star Tb Super PCR Mix(1.1x)(北京擎科生物科技有限公司)12.5μL，DNA模板2μL，10μmol/L引物各1μL，ddH2O补足25μL(所测16S rDNA和gyrB基因片段提交至GenBank，序列号分别为OQ123819、OQ186111；引物及所有PCR反应程序及条件见表1，PCR产物委托北京擎科生物科技有限公司进行测序；测序所得序列通过GenBank中的BLASTn和Ezbiocloud进行同源性检索，MAFFT进行序列比对，BioEdit软件进行序列剪切，MEGA X软件进行序列拼接；采用最大似然法以16S rDNA和gyrB基因的拼接序列构建最大似然树(Maximum-likelihood phylogenetic tree)，并使用贝叶斯法对最大似然法系统发育分析结果进行验证，综合2种分析方法最终确定菌株的分类地位；发育树节点标注为最大似然树中自展值(bootstrap value)大于等于60％及贝叶斯树中后验概率(posteriorprobability)大于等于0.95的数值(MLBS/PP)，上标“T”表示在本研究中所选用的模式菌株；
表1引物和PCR程序
同源性检索发现，与A-qlqy-2的16S rDNA基因序列(1426bp)相似性高的模式菌均属于北里孢菌属(Kitasatospora sp.)，与K.aureofaciens JCM 4434T(MT760550)相似性最高，达99.42％；A-qlqy-2的gyrB基因序列(763bp)与K.aureofaciens JCM 4434T(BMUB01000003)相似性最高，为98.56％。结合比对结果和相关文献(Takahashi,2017；Klaysubun et al.,2022)，以Streptoalloteichus tenebrarius为外群，下载GenBank中同源性较高的序列并选择已知的北里孢菌属(Kitasatospora sp.)模式菌分别构建16S rDNA和gyrB基因拼接序列的系统发育树，结果表明，菌株A-qlqy-2与已报道的北里孢菌属(Kitasatospora sp.)模式菌聚为一类，和K.aureofaciens JCM 4434T的亲缘关系较近(参见图1)。
2、形态特征
将待鉴定放线菌接种于ISP2–ISP7、PDA、高氏I号共8种培养基平板上，28℃暗培养7～14d后，参考Balagurunathan等(2020)的方法观察及描述待鉴定菌株的生长状况、气生菌丝、基内菌丝的颜色、有无可溶性色素及其颜色等特征。采用插片法在光学显微镜下观察待鉴定菌株的孢子链、孢子等形态特征并予以采集，孢子大小等测量工作利用ImageJ软件完成。
将菌株A-qlqy-2划线接种于ISP2固体培养基上，28℃暗培养7～14d，该菌株的气生菌丝起初为白色，产生黄色水溶性色素，后期气生菌丝逐渐变成深蓝灰色，水溶性色素变成棕色，基内菌丝无可鉴别颜色(图2中A所示)，有泥土气味产生；A-qlqy-2的孢子丝主要是直、柔曲型(Rectiflexibiles type)，偶有开环、勾状或宽螺旋型(Retinaculiapertutype)(图2中B、D)，孢子丝成熟后分化成附着有10-50个甚至更多孢子的孢子丝链，孢子丝链断裂后形成分生孢子(图2中C)，形状为棒状(rodshaped)，大小为(0.61～4.42)μm×(0.32～0.64)μm；未观察到孢子囊。其中，孢子链主要呈直、柔曲形态，孢子链可着生20个以上的分生孢子，无孢子囊的特征与北里孢菌属(Kitasatospora sp.)的部分典型特征相符。将菌株A-qlqy-2接种于常见的放线菌形态特征鉴定培养基上，并将其形态特征与系统发育分析中亲缘关系较近的K.aureofaciens JCM 4434T(http://doi:10.13145/bacdive15015.20221219.7.1)的进行对比，发现该菌株A-qlqy-2与K.aureofaciens JCM4434T只在气生菌丝颜色上较为相似(具体参见表2)。
表2菌株A-qlqy-2与K.aureofaciens JCM 4434T的形态特征
注:ND表示未检测；+++表示生长旺盛；++表示生长良好；+表示生长弱；-表示无颜色。
3、生理生化特性
参考关统伟等(2016)描述的方法对待鉴定菌株的唯一碳源的利用、唯一氮源的利用、适宜生长的pH、温度、NaCl浓度范围等生理生化特性进行检测。
结果表明，当其他培养条件不变时，菌株A-qlqy-2的生理生化特性分析显示，该菌株分别能在3％的盐度、10–35℃、pH为6–12的条件下正常生长；可以利用D-果糖、D-(+)-麦芽糖、甘油等9种碳源作为唯一碳源，对葡聚糖和棉子糖的利用效果弱，不能利用D-木糖、木糖醇、L-阿拉伯糖；能利用L-苏氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、KNO3作为唯一氮源，但不能利用L-赖氨酸、L-胱氨酸、NH4Cl；淀粉水解试验为阴性，脲酶为弱阳性，硫化氢、明胶液化、牛奶胨化等试验均为阳性。将菌株A-qlqy-2的生理生化特性与K.aureofaciens JCM 4434T的进行对比，结果显示，A-qlqy-2与K.aureofaciens JCM 4434T有7项差异(具体参见表3)；
表3菌株A-qlqy-2与K.aureofaciens JCM 4434T的生理生化特性
注:1表示A-qlqy-2；2表示K.aureofaciens JCM 4434T；ND表示未检测；+表示阳性；-表示阴性；w表示利用或水解程度弱。
综上，系统发育分析结果显示，菌株A-qlqy-2与K.aureofaciens JCM 4434T的亲缘关系较近，但两者的形态特征及生理生化特性差异大，所以，将A-qlqy-2初步鉴定为北里孢菌属(Kitasatospora sp.)内一种。
实施例2
本实施例为北里孢菌A-qlqy-2对茶树病害病原菌的拮抗作用：
一、对峙法初筛
参考姚锦爱等(2021)的方法，用无菌黄色移液枪枪头打取靶标菌菌饼(D＝6mm)接于PDA平板中心，在距离靶标菌25mm处的十字交叉方向分别接入放线菌菌饼(D＝6mm)，分别以单接3种靶标菌的平板为对照，每处理3个重复，于28℃暗培养7d后测量靶标菌朝向放线菌生长的菌落半径并计算抑制率。
二、菌丝生长速率法复筛
在李晓芳等(2020)的方法基础上做修改。将初筛中抑制率大于60％的菌株按照菌饼数:V培养基＝1:10mL的比例把放线菌菌饼加入到LB液体培养基中，于28℃、180r/min摇床中振荡培养7d，制备发酵液；发酵液经4层无菌擦镜纸过滤后10000r/min离心10min，取10mL上清液，通过滤膜(0.22μm)滤除孢子得到无菌发酵滤液，倒入装有90mL PDA的锥形瓶中，充分混匀后倒平板，分别取3种靶标菌菌饼接于平板中央。分别以单接3种靶标菌的平板为对照，于25℃暗培养7d后采用十字交叉法测量菌落直径并计算抑制率；每处理3个重复。
三、实验结果
北里孢菌A-qlqy-2对三种不同病原菌的抑制作用如图3～5所示；
图3为北里孢菌A-qlqy-2对茶树炭疽病病原C.camelliae的抑制作用结果图；图3中，A为对照组；B为对峙法初筛结果；C为生长速率法复筛；
图4为北里孢菌A-qlqy-2对茶树斑点病病原D.segeticola的抑制作用结果图；图4中，D为对照组；E为对峙法初筛结果；F为生长速率法复筛；
图5为北里孢菌A-qlqy-2对魔芋茎腐病镰刀菌的抑制作用结果图；图5中，G为对照组；H为对峙法初筛结果；I为生长速率法复筛；
由图3可知，在对峙培养初筛中北里孢菌A-qlqy-2对茶炭疽病病原C.camelliae的抑制率为70.00％，在生长速率法复筛中，茶炭疽病病原C.camelliae在PDA平板(含北里孢菌A-qlqy-2无菌发酵滤液10倍稀释液)上的生长均受到抑制，抑菌率为78.56％，说明该北里孢菌A-qlqy-2的活菌体和其胞外代谢产物对C.camelliae具有抑制活性。
由图4可知，在对峙培养初筛中北里孢菌A-qlqy-2对茶树斑点病病原D.segeticola的抑制率为67.87％，在生长速率法复筛中，茶树斑点病病原D.segeticola在PDA平板(含北里孢菌A-qlqy-2无菌发酵滤液10倍稀释液)上的生长均受到抑制，抑菌率为100％，说明该北里孢菌A-qlqy-2的活菌体和其胞外代谢产物对D.segeticola具有很强的抑制活性。
由图5可知，在对峙培养初筛中北里孢菌A-qlqy-2对魔芋茎腐病镰刀菌F.solani的抑制率为46.11％，在生长速率法复筛中，魔芋茎腐病镰刀菌F.solani在PDA平板(含北里孢菌A-qlqy-2无菌发酵滤液10倍稀释液)上的生长均受到抑制，抑菌率为78.51％，说明该北里孢菌A-qlqy-2的活菌体和其胞外代谢产物对F.solani具有很强的抑制活性。
四、北里孢菌A-qlqy-2对C.camelliae生长作用的研究，以及不同浓度北里孢菌A-qlqy-2发酵液对C.camelliae抑制作用的研究：
北里孢菌A-qlqy-2与C.camelliae对峙培养5d后，在光学显微镜下观察(观察结果如图6所示)，图6中，A:C.camelliae的菌丝(PDA,5d)；B:A-qlqy-2的孢子丝链(PDA,5d):C、D:A-qlqy-2孢子丝链接触、盘绕在C.camelliae菌丝表面(PDA,5d)；E:C.camelliae菌丝多处断裂，有类似菌丝内含物的物质泄出(PDA,5d)；F、G:C.camelliae菌丝被A-qlqy-2孢子丝缠绕并断裂(PDA,7d)；
由图6可知，C.camelliae菌丝大量断裂，且断裂处有类似内含物泄出的现象；此外，A-qlqy-2所产生的抑菌带周围的C.camelliae菌丝产生形变或断裂，被大量的A-qlqy-2孢子丝(一般逐渐发育为孢子丝链)接触或盘绕，然而这一现象并未在对照组发现，从而得出北里孢菌A-qlqy-2对C.camelliae的正常生长起到了破坏作用。
采用菌丝生长速率法复筛中的方法对不同浓度北里孢菌A-qlqy-2发酵液对C.camelliae进行平板培养，培养结果如图7所示，图7中，A：0％；B:1％；C:2.5％；D:5％；E:10％；统计个平板中菌落生长直径，并计算抑制率，结果如表4所示，
表4不同浓度的菌株A-qlqy-2无菌发酵滤液对C.camelliae的抑制率
注：表中数据为平均值±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
由表4可知，当PDA平板含10％无菌发酵滤液(相当于将无菌发酵液稀释10倍)时，北里孢菌A-qlqy-2对C.camelliae抑制率最高，为82.67％；将无菌发酵滤液稀释至40倍，抑制率为70.24％，当无菌发酵滤液浓度降至1％(相当于稀释100倍)时，抑制率为23.16％。北里孢菌A-qlqy-2无菌发酵液对C.camelliae的拮抗作用与无菌发酵滤液的浓度成正相关。
实施例3
本实施例为北里孢菌A-qlqy-2的田间应用试验；
田间小区试验于6月初茶树修剪后，在贵州省黔西南州晴隆县碧痕镇清韵茶业有限公司茶园(N25°74'67”,E105°15'07”)内开展，受试茶树品种为福鼎大白。配制无菌发酵液，使用6层无菌纱布滤除菌丝体后进行田间小区试验，每小区的发酵液用量为8L(4mL发酵液+4mL自来水)，小区面积约33m2，共约150株茶树，随机区组排列。采用常规喷雾法将发酵液喷施于茶树蓬面，以喷施等量清水为对照，每处理3个重复；对照小区常规管理。距离首次喷施15d再喷施第二次，共喷施2次。
喷施放线菌发酵液30d后于处理组及对照组小区分别使用样框(50cm×50cm)随机选择3个取样点采集所有一芽二叶，称重，测定茶树鲜叶产量；测完鲜重后的茶样于实验室经微波炉杀青处理(中火,90s)，80℃烘箱烘干后送贵州省茶叶研究所通过高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)进行内含物(氨基酸、茶多酚、咖啡碱、儿茶素等)测定。喷施放线菌发酵液45d后，于处理组及对照组小区分别随机选择3个取样点，每个取样点使用样框(50cm×50cm)随机选择夏梢上成叶10片，处理组和对照组分别调查100片叶片，按唐美君等(2019)描述的分级标准(表5)目测分级并计算病情指数及防效。
表5用于评定茶炭疽病菌QLLGCY1疾病指数的疾病评量表
实验结果：
1、北里孢菌A-qlqy-2发酵液对茶鲜叶产量及其品质相关成分的影响如表6所示；
表6菌株A-qlqy-2发酵液对茶树鲜叶产量及品质相关成分的影响
由表6可知，喷施北里孢菌A-qlqy-2发酵液30d后，通过高效液相色谱法检测茶树鲜叶品质成分，结果显示，处理组茶青产量为41.67±6.43g，显著高于对照组(p＜0.05)。此外，处理组的茶叶品质相关成分茶多酚的含量为15.50±0.30％、氨基酸的含量为2.20±0.00％、咖啡碱为2.36±0.13％，与对照组相比略有提升，差异达到显著水平(p＜0.05)；EGCG含量为4.18±0.35％，与对照组的差异不显著(表6)，可见，菌株A-qlqy-2对茶树的生长及生理代谢不仅没有抑制作用，还能够提高茶叶产量以及品质。
2、北里孢菌A-qlqy-2发酵液对茶炭疽病的田间防效结果如表7所示；
表7菌株A-qlqy-2发酵液对茶炭疽病的田间防效
由表7可知，喷施北里孢菌A-qlqy-2发酵液45d后，统计病情指数并计算防效，结果表明，处理组的防效为56.70％，病情指数为6.11±0.84，显著低于对照组。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
Claims (8)
1.一种拮抗植物病害病原菌的菌株，其特征在于，所述拮抗植物病害病原菌的菌株为北里孢菌A-qlqy-2(Kitasatospora spp.A-qlqy-2)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20231040；保藏时间为2023年06月19日。
2.根据权利要求1所述的拮抗植物病害病原菌的菌株，其特征在于，所述植物病害病原菌包括茶树炭疽病病原C.camelliae、茶树斑点病病原D.segeticola和魔芋茎腐病镰刀菌F.solani。
3.含有权利要求1所述的拮抗植物病害病原菌的菌株的菌剂。
4.权利要求1所述的拮抗植物病害病原菌的菌株在制备防治茶树炭疽病、茶树斑点病和/或魔芋茎腐病的制剂中的应用。
5.一种用于防治茶树炭疽病、茶树斑点病和/或魔芋茎腐病的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述拮抗植物病害病原菌的菌株。
6.一种防治茶树炭疽病或斑点病的方法，其特征在于，所述方法包括在茶树蓬面喷施权利要求1所述拮抗植物病害病原菌的菌株。
7.权利要求1所述的拮抗植物病害病原菌的菌株在提高茶树的茶叶产量或提高茶叶中茶多酚、儿茶素没食子酸酯和咖啡碱含量中的应用。
8.一种提高茶叶产量的方法，其特征在于，所述方法包括在茶树蓬面喷施权利要求1所述拮抗植物病害病原菌的菌株。
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