CN114540221B - 产中性蛋白酶芽孢杆菌和利用其生产中性蛋白酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958，产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958的亲缘关系接近于贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，于2021年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62056。还提供了产中性蛋白酶芽孢杆菌生产中性蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)菌株的初筛活化：将菌株MPEB0001958接种于筛选培养基上，35℃培养48h；(2)发酵培养：挑取有透明圈的单菌落接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液，将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清得到发酵液。通过对时间、温度和pH的调节确定芽孢杆菌所产中性蛋白酶发挥作用的最适条件。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体地，涉及产中性蛋白酶芽孢杆菌和利用其生产中性蛋白酶的方法。
背景技术
蛋白酶是能够催化水解肽键的一类酶的总称，被广泛用于饲料加工、食品、皮革等领域，且蛋白酶及其相关产品占据全球约20％酶市场份额,其广泛存在于微生物、动物内脏和植物茎叶及果实中。蛋白酶按照其反应的最适pH值，可以分为酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶。细菌中的芽孢杆菌属(Bacillus sp.)是一类重要的产蛋白酶微生物。近年来，蛋白酶被广泛用在饲料中，其对动物的生产性能、营养物质消化率、肠道健康等有积极作用。
B.velezensis菌株被发现于西班牙的一条名为贝莱斯的河流，因而命名为贝莱斯芽孢杆菌。目前，有关贝莱斯芽孢杆菌的报道主要集中于生物防治、生物农药和工业生产等方面，而生产蛋白酶的相关报道则较少。
发明内容
本发明提供了一种产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958，所述产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958的亲缘关系接近于贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，于2021年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62056。
本发明还提供了产中性蛋白酶芽孢杆菌生产中性蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)菌株的初筛活化：将菌株MPEB0001958接种于筛选培养基上，35℃培养48h；(2)发酵培养：挑取有透明圈的单菌落接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液，将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清得到发酵液。
在一些实施例中，所述筛选培养基包括：酪蛋白10g/L、牛肉膏粉3.0g/L、Na2HPO42.0g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂15g/L、溴麝香草酚蓝0.05g/L；种子培养基包括：酪蛋白水解物17.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、淀粉1.5g/L；发酵培养基包括：酪蛋白10.00g/L、KH2PO4 0.360g/L、NaH2PO4·2H2O 0.360g/L、MgSO4·7H2O 0.500g/L、CaCl·2H2O 0.480g/L、NaCl 5.00g/L，pH7.2。
本发明还通过了利用上述方法在芽孢杆菌发酵培养36h后获得的发酵液，所述发酵液中的蛋白酶的活力在50℃、pH＝7的条件下最高。
本发明提供的芽孢杆菌Bacillus sp.MPEB0001958具有良好的产中性蛋白酶能力，通过探究其最佳产酶条件，获得较佳的蛋白酶活力。
附图说明
图1为本发明所述菌株在MHA培养基上的形态。
图2为本发明所述菌株在显微镜下观察到的形态。
图3为本发明所述菌株基于16S rRNA基因序列的系统进化树。
图4为本发明所述菌株产蛋白酶能力随时间变化曲线和菌株的生长曲线。
图5为本发明所述菌株发酵液的中性蛋白酶活力随温度变化曲线。
图6为本发明所述菌株发酵液的中性蛋白酶活力随pH变化曲线。
本发明的产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958，MPEB0001958的亲缘关系接近于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，于2021年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏号为：GDMCC No：62056；保藏地址为：广东市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
本发明提供了一株产中性蛋白酶的芽孢杆菌菌株MPEB0001958和制备蛋白酶发酵液的方法，并通过改变时间、pH和温度确定中性蛋白酶发挥作用的最适条件。
所述芽孢杆菌分离自北京林地土壤样品，其16S rRNA基因序列如SEQ ID No:1所示。
芽孢杆菌菌株MPEB0001958制备蛋白酶发酵液的方法，具体包括以下步骤：
(1)菌株筛选：将菌株MPEB0001958接种于筛选培养基上，35℃培养48h，可发现菌落周围有透明圈产生。
(2)发酵培养：挑取有透明圈的单菌落接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液。将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清，得到发酵液。
所述筛选培养基为：酪蛋白10g/L、牛肉膏粉3.0g/L、Na2HPO4 2.0g/L、NaCl 5.0g/L、琼脂15g/L、溴麝香草酚蓝0.05g/L；
种子培养基为：酪蛋白水解物17.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、淀粉1.5g/L。
发酵培养基为：酪蛋白10.00g/L、KH2PO4 0.360g/L、NaH2PO4·2H2O 0.360g/L、MgSO4·7H2O 0.500g/L、CaCl·2H2O 0.480g/L、NaCl 5.00g/L，pH7.2。
本发明的芽孢杆菌Bacillus sp.MPEB0001958具有良好的产中性蛋白酶能力，若进行适当的基因工程改造或探究其最佳产酶条件，可能会获得较为客观的蛋白酶活力。
实施例1菌株筛选
菌株MPEB0001958分离自北京林地土壤样品。
样品处理：称取0.5g土壤样品，用无菌水混匀后，用接种环蘸取土壤悬液划线培养于MHA培养基(MHA，酪蛋白水解物17.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、淀粉1.5g/L、琼脂12.5g/L)上，35℃培养24h，然后挑取形态、颜色不同的菌落接种于MHB培养基(MHB，酪蛋白水解物17.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、淀粉1.5g/L)中，在35℃、150r/min条件下培养24h，然后吸取1000μL菌液加入500μL 80％甘油于冻存管中，混匀后置于-20℃保存。
初筛：取出保藏的细菌冻存液划线于MHA培养基，35℃培养24h，挑取单菌落放入MHB培养基中，32℃、160r/min振荡培养24h。将菌液10倍梯度稀释，吸取100μl涂布于筛选培养基上，35℃培养48h。产蛋白酶的菌落周围会出现透明圈。
复筛：挑取有透明圈的单菌落接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液。将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清，得到发酵液。测定发酵液蛋白酶活性，选取酶活性最高的菌株MPEB0001958进行后续操作。结果见表1。
蛋白酶活性的测定：产蛋白酶菌株的酶活力测定参考GB/T23527-2009福林酚法并做适当修改。具体如下：测定前先将粗酶液与酪蛋白溶液置于40℃水浴预热5min。实验组，取1mL粗酶液加入10g/L酪蛋白溶液1mL，40℃水浴加热，准确计时10min，之后立即加入3mL0.4mol/L三氯乙酸溶液终止反应。静置10min，然后12000r/min离心10min，吸取上清液1mL，加入5.0mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林试剂使用溶液，并放入40℃恒温水浴锅中显色20min，用紫外分光光度计在680nm处测定样品的OD680。对照组实验操作同上，只是先加三氯乙酸再加酪蛋白。
计算公式：X＝5×A×n/10。式中：X为样品酶活力(U/mL)，A为由样品测得的净OD值，查标准曲线所得相对应的酪氨酸含量，n为酶液的稀释倍数，10代表反应10min取1min计算，5代表5mL反应液取1mL测定，即5倍。
酶活力单位定义：在40℃下，每分钟内酪蛋白被水解产生1μg酪氨酸的量为1个蛋白酶活力单位(U/mL)。表1示出了复筛菌株的蛋白酶活力测定结果。
表1
实施例2：菌株MPEB0001958的鉴定
形态观察(图1)：菌株MPEB0001958在MHA培养基上生长的菌落呈不透明乳白色，圆形、边缘不光滑，表面有褶皱。
革兰氏染色：(1)涂片固定：在载玻片上滴一滴无菌水，然后用接种环挑取MHA培养基上的菌落，置于载玻片上的水中进行涂抹，尽量使菌体分散开。将载玻片在火焰上方加热1s，然后远离火焰冷却，重复操作2-3次，使载玻片上的水蒸发完全。(2)染色：在载玻片上滴加草酸铵结晶紫染液使之完全覆盖涂面区域，染色1min；然后蒸馏水冲洗；再滴加碘液覆盖涂面区域，染色1min；蒸馏水冲洗，用吸水纸吸去多余水分；滴加95％乙醇于涂面区域，轻轻晃动脱色30s；蒸馏水冲洗；滴加番红染色液覆盖涂面区域，染色1min；最后，用蒸馏水冲洗，静置待干燥后，镜检。在油镜下，细菌呈紫色为革兰氏阳性菌，同时细菌呈杆状且部分细菌内生芽孢，芽孢呈椭圆形(图2)。
基因组DNA提取：从本发明所述菌株纯培养物中提取基因组DNA，利用通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT进行扩增，对产物进行DNA测序。将测序结果在NCBI中进行Blast比对，确定其种属。基于16S rRNA基因序列的系统发育树如图3所示。菌株MPEB0001958的16S rRNA基因序列如SEQ ID No:1所示。
实施例3：产中性蛋白酶芽孢杆菌MPEB0001958的发酵培养
将菌株MPEB0001958接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液。将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，500mL锥形瓶装发酵培养基100mL，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清，得到发酵液。
实施例4：培养时间对菌株产中性蛋白酶能力的影响
将菌株MPEB0001958接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液。将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，1000mL锥形瓶装发酵培养基200mL，在37℃、180r/min条件下进行发酵培养48h，每隔4h取样，分别测定样品活菌数以及蛋白酶活力。结果如图4所示，随着培养时间增加，蛋白酶活力逐渐上升，于第36h时达到最大酶活力，然后逐渐降低，同时蛋白酶活力随时间变化的曲线与菌株MPEB0001958的生长曲线大致相符。
实施例5：酶学性质测定
将菌株MPEB0001958接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液。将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，1000mL锥形瓶装发酵培养基200mL，在37℃、180r/min条件下进行发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清，得到发酵液。
分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下进行酶促反应10min，测定温度对蛋白酶活力的影响。结果如图5所示，本发明所述菌株MPEB0001958制备的中性蛋白酶最适温度为50℃。
在40℃条件下，分别在pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11条件下进行酶促反应10min，测定pH对蛋白酶活力的影响。结果如图6所示，本发明所述菌株MPEB0001958制备的中性蛋白酶最适pH为7。
本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。
序列表
<110> 广东省科学院动物研究所
<120> 产中性蛋白酶芽孢杆菌和利用其生产中性蛋白酶的方法
<130> HP20220102LZ
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1545
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus)
<400> 1
ttatcggaga gtttgatcct ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgccta atacatgcaa 60
gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 120
tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 180
tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 240
cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcaacgatg cgtagccgac 300
ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 360
cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 420
aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 480
gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 540
tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 600
taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cgggagggtc attggaaact gggaacttga 660
gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa atgcgtagag atgtggagga 720
acaccagtgg cgaaggcgac tctctggtct gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg 780
gagcgaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgagtg ctaagtgtta 840
gggggtttcc gcccttagtc gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc 900
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa tcctagagat 1020
aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca 1140
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag 1260
cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccataa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca 1320
actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1440
gtgaggtaac ctttatggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg ggtgaagtcg 1500
taacaaggta gccgtatcgg aaggtgcggc tggatcacct ccttt 1545
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cmtggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tacggytacc ttgttacgac tt 22
Claims (4)
1.一种产中性蛋白酶芽孢杆菌(Bacillussp.)MPEB0001958，所述产中性蛋白酶芽孢杆菌Bacillussp.MPEB0001958的亲缘关系接近于贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，于2021年11月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：62056。
2.利用权利要求1所述的产中性蛋白酶芽孢杆菌生产中性蛋白酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌株的初筛活化：将菌株MPEB0001958接种于筛选培养基上，35℃培养48h；
(2)发酵培养：挑取有透明圈的单菌落接种于种子培养基中，35℃、150r/min培养24h，得到种子液，将种子液用无菌水调整至OD600为0.500，按体积比2％接种至发酵培养基中，在37℃、180r/min条件下，发酵培养24h，然后10000r/min离心10min取上清得到发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：
所述筛选培养基包括：酪蛋白10g/L、牛肉膏粉3.0g/L、Na2HPO42.0g/L、NaCl5.0g/L、琼脂15g/L、溴麝香草酚蓝0.05g/L；
种子培养基包括：酪蛋白水解物17.5g/L、牛肉浸粉5.0g/L、淀粉1.5g/L；
发酵培养基包括：酪蛋白10.00g/L、KH2PO40.360g/L、NaH2PO4·2H2O0.360g/L、MgSO4·7H2O0.500g/L、CaCl·2H2O0.480g/L、NaCl5.00g/L，pH7.2。
4.根据权利要求2所述的方法在芽孢杆菌发酵培养36h后获得的发酵液，所述发酵液中的蛋白酶的活力在50℃、pH＝7的条件下最高。
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