CN115044502B - 一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌yt2-1c及其应用 - Google Patents

一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌yt2-1c及其应用 Download PDF

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Abstract

一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2‑1C，保藏于中国典型培养物保藏中心，分类名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏日期为2022年5月9日，保藏号为CCTCC M 2022564。本发明中蜡样芽孢杆菌YT2‑1C具有利用色氨酸高效合成吲哚乙酸（IAA）的能力，IAA产量能达到193mg/L；具有优异的产铁载体能力，其活性载体单位为62.11%，可以合成蛋白酶46.1 U/mL，同时对蚕豆葡萄孢具有高效的抑制作用。通过上述多种作用，可以协同对蔬菜植物产生优异的促生效果，应用于育苗基质中，可以显著提高出苗量，对蔬菜植物有优异的促生作用。

Description

一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C及其应用。
背景技术
生物防治在一定程度上可补充甚至替代化学防治，达到化学物质减量的作用，是目前极具研究价值的绿色防治方法。有益的植物、微生物相互作用是决定植物健康和土壤肥力的重要因素，生防菌的有益作用在各种重要的农作物生产中已得到证实。芽孢杆菌是一类芽孢的革兰氏阳性细菌，大部分的芽孢杆菌主要有产吲哚乙酸、溶解磷酸盐、固氮、产铁载体等作用，目前使用的一些高效芽孢杆菌菌株通常具有以上描述的多个特性。吲哚乙酸(IAA)是一种植物生长素，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用。铁载体是一类年低分子量的、对Fe3+具有高亲和力的螯合物，是一种可以结合铁色素(ferric ion)并且供给给微生物细胞的低分子量物质，蛋白酶可以促进蛋白水解，分解成氨基酸供给植物根系。
为了筛选对蔬菜有促生能力的广谱促生菌株，本研究拟筛选高效、优良的植物根际促生菌，以期为微生物肥料的研制提供优质菌种资源，为微生物肥料替代分化学肥料技术在蔬菜中的推广和应用提供科学依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C，能高效合成吲哚乙酸(IAA)的同时，具有优异的产铁载体和蛋白酶的能力，同时高效抑制蚕豆葡萄孢。
本发明另一目的是提供上述蜡样芽孢杆菌YT2-1C的应用。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C，保藏于中国典型培养物保藏中心，分类名为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)，保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏日期为2022年5月9日，保藏号为CCTCC M 2022564。
蜡样芽孢杆菌YT2-1C菌落大，质地软，稍有光泽的灰白色菌落，其生理化测定结果为：革兰氏阳性菌；其能发挥高产吲哚乙酸、铁载体、蛋白酶的同时，高效抑制蚕豆葡萄孢。
进一步，上述蜡样芽孢杆菌YT2-1C在制备具有合成吲哚乙酸、铁载体、蛋白酶和抑制蚕豆葡萄孢一种或多种作用的菌剂中的应用。
进一步，上述蜡样芽孢杆菌YT2-1C具体在促进植物生长中的应用。
优选的，上述蜡样芽孢杆菌YT2-1C在蔬菜育苗基质中应用。
进一步，上述在蔬菜育苗基质中的应用具体是将蜡样芽孢杆菌YT2-1C接种至普通蔬菜育苗基质中混合均匀，形成功能型育苗基质，蜡样芽孢杆菌YT2-1C的接种量与基质干重的比值为5mL/100g，蜡样芽孢杆菌YT2-1C的浓度为108CFU/mL。
本发明具有如下技术效果：
本发明中蜡样芽孢杆菌YT2-1C具有利用色氨酸高效合成吲哚乙酸(IAA)的能力，IAA产量能达到193mg/L；具有优异的产铁载体能力，其活性载体单位为62.11％，可以合成蛋白酶46.1U/mL，同时对蚕豆葡萄孢具有高效的抑制作用。通过上述多种作用，可以协同对蔬菜植物产生优异的促生效果，应用于育苗基质中，可以显著提高出苗量，对蔬菜植物有优异的促生作用。
附图说明
图1：菌株YT2-1C在LB平板上的菌落形态。
图2：菌株YT2-1C在CAS平板上培养图(左图为正面图，右图为反面图)。
图3：YT2-1C对蚕豆葡萄孢的抑菌效果图(左为对照图，右为抑菌图)。
图4：菌株YT2-1C应用到黄瓜育苗基质中的试验效果对比。
图5：菌株YT2-1C应用到黄瓜育苗基质中田间试验的效果对比。
图6：菌株YT2-1C应用到黄瓜番茄基质中的试验效果对比。
图7：菌株YT2-1C应用到黄瓜辣椒基质中的试验效果对比
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
菌株的分离、筛选和鉴定
LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，1×105Pa灭菌20min。
1.分离：土壤样品采至重庆九龙坡区白市驿稻田，取土壤样品5g，置入装有45mL无菌水的三角瓶中，摇床180rpm振荡30min，放置到80℃的水浴锅中煮20min，以杀死其它细菌。制成土壤悬液，采用10倍稀释法配制浓度梯度为10-2、10-3、10-4的土壤悬液样品。
2.筛选：
(1)菌株的产IAA能力：将分离纯化后的菌悬液按培养基体积的1％接种于上述金氏培养基(King)中，在30℃、180r/min恒温摇床上振荡培养7d，12000r/min离心10min，取0.1mL上清液滴至检测板上，加等量S2比色液，另取S2比色液0.1mL，分别加入50、30、10mg/L标准植物生长激素IAA0.1mL作梯度对照，室温静置15min后观察颜色变化，确定菌株是否具有分泌IAA的能力。
(2)产铁载体功能检测：
配置CAS检测液：将0.079g CAS溶于50mL去离子水中，再加人10mL 1mmo1/L FeCl3溶液(用盐酸配制)，得溶液A。将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL的去离子水中，得溶液B。将A溶液沿烧杯壁缓缓加人B溶液中，搅拌混匀即得100mL CAS蓝色检测液。
菌株铁载体定性检测：将菌株YT2-1C接种到MKB液体培养基中(酪蛋白氨基酸5g、甘油15mL、K2HPO42.5g、MgSO4·7H2O 2.5g,双蒸水1L，pH＝7.2)，在30℃、180r/min下培养48h。取5mL菌液放人离心管，在10000r/min下离心10min，取上清液1mL与等量CAS检测液充分混匀，静置反应1h，然后用去离子水稀释两倍。观测经过培养的CAS检测平板，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色至黄色铁载体晕圈，如图2所示。可见，菌株YT2-1C具有一定的产铁载体能力。
(3)产蛋白酶功能检测：
配制酪素培养基：A液：称取Na2HPO4·7H2O 1.07g。干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。B液：称取KH2PO4 0.36g，加水溶解。A、B液混合后，加入酪素水解液0.3mL，加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL)将菌株接种到酪素培养基，观察是否产生透明圈。
(4)溶磷功能检测：将菌株接种于NBRIP培养液中，30℃、180r/min培养7d，培养结束后12000r/min离心10min，取上清液1mL稀释10倍，采用钥锑抗比色法测定上清中磷的含量，以不接菌的NBRIP培养液为对照，重复3次。
(5)解钾功能检测：将菌株接种到解钾培养基中，30℃、180r/min培养7d，培养结束后500r/min离心10min去除发酵液中的不溶性物质，然后12000r/min离心10min，收集上清液，采用火焰分光光度计法测定上清液中有效钾的含量。
(6)抑菌功能检测：测试所用病原菌菌株均为本实验室分离保存，即拟蚕豆葡萄孢，采用平板对峙法，将菌株YT2-1C离心，收集上清，在PDA平板距中心位置接种1块直径为8mm的菌饼，在距离中心处3cm处打孔，孔内加入50uL菌株YT2-1C上清液，每处理3次重复，置于28℃恒温箱内培养，培养7d后，另设灭菌LB液体培养基为对照。如图3所示，YT2-1C抑菌半径为1.2cm，对拟蚕豆葡萄孢有明显的抑制效果。
检测结果如表1所示：
表:1：菌株YT2-1C的促生特性
注：*ND表示未检出，+表示检出
3.鉴定：
菌株YT2-1C用平板培养出来的菌落，菌落大，质地软，稍有光泽的灰白色菌落。对菌株进行生理化鉴定，测定结果为：革兰氏阳性菌，淀粉水解、卵磷脂水解、硝酸盐还原、果糖、葡萄糖、明胶水解试验均呈阳性；柠檬酸盐试验、酪氨酸水解、木糖、甘露醇、硫化氢试验均呈阴性。
对其菌株DNA进行提取与PCR扩增，PCR产物纯化后进行测序。将所获得的16S rRNA基因序列提交到NCBI数据库中，与核酸数据库中16SrDNA基因序列进行相似性比对，得到与Bacillus cereus菌株相似度达99％，根据16SrDNA基因序列测定结果来看，该菌株可归为Bacillus cereus YT2-1C。
实施例2
蜡样芽孢杆菌YT2-1C各能力的具体测定
1.产IAA能力定量检测：配置含有L-色氨酸(100mg/L)的金氏培养基(蛋白栋20g，MgSO4·7H2O 1.5g，K2HPO4 1.15g、甘油15mL，蒸馏水1L)，将菌株接种于金氏培养液中，在30℃、180r/min恒温摇床上振荡培养7d。取5mL菌液于离心管中，12 000r/min离心10min，取上清液，加等量S2比色液(FeCl3 4.5g，10.8mol/LH2SO4 1L)，充分混合，于黑暗中静置30min后用紫外分光光度计在530nm处测定吸光度，以未接种菌株的培养液为对照调零，每组3个重复。同法以浓度为0、5、10、15、20、30mg/L的IAA标准液作标准曲线，计算培养液中IAA的浓度。经检测，YT2-1C中IAA产生量为193mg/L。测定过程中，我们尝试用其他培养基进行接种培养后检测，检测结果变化不明显，IAA产生量均维持在193±3mg/L。
(2)铁载体活性定量检测：取YT2-1C菌株菌苔转移至已灭菌的MKB液体培养基中(酪蛋白氨基酸5g、甘油15mL、K2HPO42.5g、MgSO4·7H2O 2.5g,双蒸水1L，pH＝7.2)，28℃摇床培养48h后离心，将3mL上清液，加入一定量的CAS检测液，体积比为1:1，充分混匀静置1h后，采用分光光度计测定630nm波长处的吸光度值(As)。并取双蒸水对照调零。另取3mL未接种的培养基和3mL的CAS检测液混合，以同法测定630nm波长处的吸光度值作为参比值(Ar)，As/Ar的值为0.39，通过计算铁载体活性单位SU＝[(Ar-As)/Ar]×100％，SU值表示铁载体活性单位，SU值越大，表明菌株产铁载体能力越强。可得出YT2-1C的活性载体单位为62.11％。
(3)产蛋白酶能力的定量测定：将菌株接种于LB培养基，在30℃、180r/min下恒温摇床上振荡培养24h，取1mL种子液接种于发酵培养基(牛肉膏5.0g，蛋白栋10.0g，NaCl 1g，脱脂奶10.0g，蒸馏水1L，120℃高压灭菌20min)，摇培48h后，5 000r/min离心，取上清粗酶液，利用Folin-酚法进行酶活测定。蛋白酶活力：以酪蛋白为底物，每分钟水解产生1μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位。绘制酪氨酸标准曲线，利用Folin-酚法法进行酶活测定，将测试的样品吸光值带入公式，重复实验2次，取平均值，得到最终的粗酶活性为46.1U/mL。
蜡样芽孢杆菌YT2-1C为功能菌的的应用
1.菌株培养
LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，120℃灭菌20分钟。
菌株的培养：将YT2-1C接入装有300ml LB培养基的500ml三角瓶中，30℃180rpm摇床培养48h，备用。菌株YT2-1C摇培后，8000rpm，4℃离心10min，用自来水洗涤2次，将菌株YT2-1C重悬于无菌水，调节浓度为108CFUA/mL。
2.在各基质中的应用
实施例3
以菌株YT2-1C为功能菌的生物基质对黄瓜的育苗效果
育苗试验处理如下：(1)普通育苗基质，记为CK组；(2)将重悬无菌水后的菌株YT2-1C按每100g基质干重中加入5mL的量接种至普通育苗基质中记为YT2-1C组，育苗盘25个孔，3次重复，25天后测定黄瓜苗的株高、叶绿素、茎粗、最大叶长、最大叶宽、叶面积、植株鲜重等指标如表2所示。
表2：测定菌株对黄瓜苗期生长的影响
注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。
结果：相比于普通育苗基质(CK)，添加了YT2-1C菌株的基质(YT2-1C)对黄瓜苗期的生长有显著的促进作用，显著增加黄瓜株高、叶绿素、茎粗、最大叶长、最大叶宽、叶面积、植株鲜重，具体如图4所示。
黄瓜田间试验：
对上述黄瓜苗进行田间种植，试验处理如下：(1)育苗基质(CK)；(2)育苗基质+YT2-1C菌株(YT2-1C)，每个处理种植8株，3次重复，小区面积3×4m，定植后20天测定黄瓜苗的株高、茎粗、叶绿素、叶面积等指标，具体如表3所示。
表3：黄瓜田间苗20天长势测定
处理 株高(cm) 茎粗(mm) 叶绿素 叶面积(cm2)
CK 10.05a 5.47a 78.75a 45.74a
YT2-1C 16.95b 7.13b 97.47b 97.03b
在田间试验中，添加了YT2-1C菌株基质的黄瓜幼苗仍能较好的生长，显著提高黄瓜的株高、茎粗、叶绿素、叶面积，分别提高了68.65％、30.34％、23.77％、112％，具体长势如图5所示。
实施例4
以菌株YT2-1C为功能菌的生物基质对辣椒的育苗效果
育苗试验处理如下：(1)育苗基质(CK)；(2)育苗基质+YT2-1C菌株(YT2-1C)，添加比例为1000kg基质中添加50mL菌液，菌液浓度为1.05×109，每个育苗盘25个孔，3次重复，40天后测定辣椒苗的株高、叶绿素、茎粗、地上部鲜重、根鲜重等指标如表4所示。
注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。
相比于普通育苗基质(CK)，添加了YT2-1C菌株的基质(YT2-1C)对辣椒苗期的生长有显著的促进作用，显著增加辣椒株高、叶绿素、茎粗、地上部鲜重、根鲜重，分别提高了64.5％、12％、30.1％、47.1％、87.5％,具体长势如图6所示。
实施例5
以菌株YT2-1C为功能菌的生物基质对辣椒的育苗效果
育苗试验处理如下：(1)育苗基质(CK)；(2)育苗基质+YT2-1C菌株(YT2-1C)，添加比例为1000kg基质中添加50mL菌液，菌液浓度为1.05×109，每个育苗盘25个孔，3次重复，40天后测定番茄苗的株高、茎粗、地上部鲜重、根鲜重等指标，具体如表5所示。
注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。
相比于普通育苗基质(CK)，添加了YT2-1C菌株的基质(YT2-1C)对番茄苗期的生长有显著的促进作用，显著增加番茄株高、叶绿素、茎粗、地上部鲜重、根鲜重，分别提高129.8％、83.45％、30.69％、315％、331％，具体长势如图7所示。本发明中YT2-1C应用于白菜、蚕豆、油麦菜、西蓝花等农作物的育苗中，也起到了优异的促生作用，具有广谱性。
综上所述，Bacillus cereus YT2-1C对拟蚕豆葡萄孢有明显的抑制效果，在含L-色氨酸的培养基中产生长素193mg/L，能产生蛋白酶，具有铁载体活性。在苗盘育苗试验中：相比于育苗基质(CK)，添加YT2-1C的育苗生物基质(YT2-1C)对黄瓜苗、辣椒、番茄的生长有明显的促生效果，各生长指标均有显著性差异，并且在黄瓜田间试验中依旧显著提高黄瓜的株高、茎粗、叶绿素、叶面积。

Claims (5)

1.一株抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C，其特征在于：蜡样芽孢杆菌YT2-1C保藏于中国典型培养物保藏中心，分类名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），保藏日期为2022年5月9日，保藏号为CCTCC M 2022564。
2.如权利要求1所述的抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C在制备具有合成吲哚乙酸、铁载体、蛋白酶和抑制蚕豆葡萄孢一种或多种作用的菌剂中的应用。
3.如权利要求1所述的抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1 C的应用，其特征在于：具体在促进植物生长中的应用。
4.如权利要求3所述的抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C的应用，其特征在于：具体在蔬菜育苗基质中应用。
5.如权利要求4所述的抑病促生型蜡样芽孢杆菌YT2-1C的应用，其特征在于：具体是将蜡样芽孢杆菌YT2-1C接种至普通蔬菜育苗基质中混合均匀，形成功能型育苗基质，蜡样芽孢杆菌YT2-1C的接种量与基质干重的比值为5mL/100g，蜡样芽孢杆菌YT2-1C的浓度为108CFU/mL。
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