CN113416655B - 秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用。本发明通过优化菌体的筛选工艺，解决了传统秸秆降解工序中秸秆降解难、降解效率低的技术问题。

Description

秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用。

背景技术

农作物秸秆的主要成分按降解难易程度大致可以分为两大类：一是容易被降解的成分，如粗蛋白、粗脂肪、矿物质等；二是较难降解的成分，如木质素、纤维素、半纤维素等；并且较难降解的成分在整个秸秆中干重占比达到70～80％。其中，纤维素组成了粗纤维的基本骨架，木质素和半纤维素以共价键或其他化学键结合，形成木质素-半纤维素的复合物；该复合物缠绕在纤维素分子的周围，并将纤维素束缚在其内部，如此，该复合物类似于一道屏障，阻碍了化学试剂/酶对纤维素的降解；同时，又由于构成复合物的木质素的非水溶性和结构的复杂性，使得秸秆的降解更加困难，并且降解的效率低下。

因此，一种能快速降解秸秆的菌株的出现势在必行。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明提供了一种秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用，以解决相关技术中秸秆降解难、降解效率低的技术问题。

本发明提供了一种秸秆高效速腐菌株，所述菌株为木霉属，微生物保藏编号为CCTCC NO：M 2021509。

本发明还提供一种秸秆高效速腐菌株的筛选工艺，所述筛选工艺包括以下步骤：

S1、分别选取腐烂枯木、覆盖落叶的土样、堆积木头的腐殖土样及位于树木旁的水域土样，分别稀释得到菌体稀释液，备用；

S2、分别将步骤S1中稀释后的菌体稀释液涂布于愈创木酚-PDA培养基中，多代培养、筛选，至无杂菌；检测出现氧化带的菌株的酶活大小，并筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株；

S3、分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株，得如上所述的秸秆高效速腐菌株。

可选地，在步骤S2中，所述分别将步骤S1中稀释后的土壤清液涂布于愈创木酚-PDA 培养基中，多代培养、筛选，至无杂菌的具体步骤包括：

S21、分别将步骤S1中稀释后的菌体稀释液涂布于愈创木酚质量占比为0.035～0.06％的愈创木酚-PDA培养基中培养3～5天，筛选出现氧化带的菌落，得第一备用菌落；其中，愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值；

S22、分别将第一备用菌落转接至PDA培养基中，恒温培养1～2天，然后再分别涂布于愈创木酚质量占比为0.01～0.03％的愈创木酚-PDA培养基培养，筛选出现氧化带的菌落，得第二备用菌落；其中，愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值；

S23、分别将第二备用菌落转接至PDA培养基中，恒温培养1～2天，多代培养，至无杂菌污染。

可选地，在步骤S2中，所述检测出现氧化带的菌株的酶活大小，并筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株的具体步骤包括：

S24、根据氧化带分布均匀程度、氧化带颜色鲜艳度、氧化带颜色深浅及氧化带宽度筛选出现氧化带的菌株；

S25、分别富集培养步骤S24中筛选出的菌株，然后将富集培养得到的菌液进行破碎、离心，得酶液，再后分别进行酶活性测试，筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株。

可选地，在步骤S3中，所述分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株的具体步骤包括：

分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，于28℃恒温培养3～5天，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株；其中，所述纤维素-刚果红培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值。

可选地，在步骤S1中，所述稀释，备用的具体步骤包括：

S11、分别取1g土壤，99ml无菌水进行第一次稀释，得到第一菌体稀释液；

S12、取1ml第一菌体稀释液的上清液，9ml无菌水进行第二次稀释，得到第二菌体稀释液；

S13、取1ml第二菌体稀释液，9ml无菌水进行第三次稀释，得到第三菌体稀释液；

S14、重复上述稀释步骤，得不同浓度的菌体稀释液，备用。

本发明还提供一种如上所述的秸秆高效速腐菌株在降解秸秆上的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明技术中，通过优化降解秸秆的菌株的筛选工艺，获得了秸秆高效速腐菌株；该菌株有效提高了秸秆的降解率，解决了秸秆难降解的难题。

附图说明

图1为本发明一实施例中的不同菌株处理秸秆后的失重率数据图；

图2为本发明一实施例中的SCOD标准图；

图3为本发明一实施例中的不同菌株的SCOD的结果数据图；

图4为本发明一实施例中的不同菌株对秸秆降解率的结果数据图；

图5为本发明一实施例中的不同菌株的形态图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及有益效果更加清楚明白，下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

参见图1至图5，本发明提供了一种秸秆高效速腐菌株，所述菌株为木霉属，微生物保藏编号为CCTCC NO：M 2021509，分类命名为：绿色木霉Trichoderma viride。

该菌株的保藏时间为：2021年5月11日。

该菌株的保藏中心为：中国典型培养物保藏中心，保藏单位代码为：CCTCC；保藏单位地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心。

具体详情可参见保藏副本。

本发明还提供一种秸秆高效速腐菌株的筛选工艺，所述筛选工艺包括以下步骤：

S1、分别选取腐烂枯木、覆盖落叶的土样、堆积木头的腐殖土样及位于树木旁的水域土样，分别稀释得到菌体稀释液，备用；

S2、分别将步骤S1中稀释后的菌体稀释液涂布于愈创木酚-PDA培养基中，多代培养、筛选，至无杂菌；检测出现氧化带的菌株的酶活大小，并筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株；

S3、分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株，得如上所述的秸秆高效速腐菌株。

可选地，在步骤S2中，所述分别将步骤S1中稀释后的土壤清液涂布于愈创木酚-PDA 培养基中，多代培养、筛选，至无杂菌的具体步骤包括：

S21、分别将步骤S1中稀释后的菌体稀释液涂布于愈创木酚质量占比为0.035～0.06％的愈创木酚-PDA培养基中培养3～5天，筛选出现氧化带的菌落，得第一备用菌落；其中，愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值；

S22、分别将第一备用菌落转接至PDA培养基中，恒温培养1～2天，然后再分别涂布于愈创木酚质量占比为0.01～0.03％的愈创木酚-PDA培养基培养，筛选出现氧化带的菌落，得第二备用菌落；其中，愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值；

S23、分别将第二备用菌落转接至PDA培养基中，恒温培养1～2天，多代培养，至无杂菌污染。

可选地，在步骤S2中，所述检测出现氧化带的菌株的酶活大小，并筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株的具体步骤包括：

S24、根据氧化带分布均匀程度、氧化带颜色鲜艳度、氧化带颜色深浅及氧化带宽度筛选出现氧化带的菌株；

S25、分别富集培养步骤S24中筛选出的菌株，然后将富集培养得到的菌液进行破碎、离心，得酶液，再后分别进行酶活性测试，筛选酶活力大于1.0U/ml的菌株，得木质素分解初筛菌株。

可选地，在步骤S3中，所述分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株的具体步骤包括：

分别将步骤S2中获得的木质素分解初筛菌株接种于纤维素-刚果红培养基中，于28℃恒温培养3～5天，筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株；其中，所述纤维素-刚果红培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值。

可选地，在步骤S1中，所述稀释，备用的具体步骤包括：

S11、分别取1g土壤，99ml无菌水进行第一次稀释，得到第一菌体稀释液；

S12、取1ml第一菌体稀释液的上清液，9ml无菌水进行第二次稀释，得到第二菌体稀释液；

S13、取1ml第二菌体稀释液，9ml无菌水进行第三次稀释，得到第三菌体稀释液；

S14、重复上述稀释步骤，得不同浓度的菌体稀释液，备用。

本发明还提供一种如上所述的秸秆高效速腐菌株在降解秸秆上的应用。

为进一步说明本发明提供的秸秆高效速腐菌株的筛选工艺筛选出的菌株对秸秆降解的效果，选用以下实施例进行详细阐述。应当理解，下列实施例仅用于说明本发明中筛选工艺的效果，并不限制本发明。

需要说明的是，如无特殊提及，本发明中用到的试剂为常规商用试剂，其均可在市场上购买得到，在实施例文本中不做过多补充说明。

实施例组1木质素分解初筛菌株的筛选

1、实验操作：

①分别选取腐烂枯木、覆盖落叶的土样、常年堆积木头的腐殖土样及位于高大茂密树木旁的水域土样，袋装保存；对每一土样进行初步处理后，加入无菌水稀释，得不同稀释浓度的菌体稀释液，备用；

②分别将①中稀释后的菌体稀释液涂布于愈创木酚质量占比为0.04％的愈创木酚 -PDA培养基(该愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值)中培养3～5天，筛选出现氧化带的菌落，得第一备用菌落；

③分别将第一备用菌落转接至PDA培养基(该PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值)中，28℃恒温培养1～2天，然后再分别涂布于愈创木酚质量占比为0.02％的愈创木酚-PDA培养基(该愈创木酚-PDA培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值)培养，筛选出现氧化带的菌落，得第二备用菌落；

④分别将第二备用菌落转接至PDA培养基中，28℃恒温培养1～2天，至菌丝长出后用接种铲铲取菌丝至新的PDA培养基上继续培养，至无杂菌污染。

⑤取④中培养得到的约0.5*0.5cm大小的菌丝块置于铺有灭菌玻璃纸的PDA平板中央，28℃培养5天，观察并记录每一PDA平板中氧化带直径、菌落直径，得表1所示的结果数据；其中，d代表菌株氧化带圈的直径，D代表接种的菌落的直径，R代表氧化带圈直径与菌落直径的比值；

然后将纯化后的菌丝转移至PDA培养基上进行斜面培养保藏待用；

⑥在无菌条件下，用接种针挑取⑤中待用的纯化分离斜面培养基中单菌落孢子，采用单点接种法接种于PDA培养基中，然后将菌株28℃培养3～5天，观察并记录PDA平皿的菌落特征(具体包括菌落的正背面颜色、菌落直径、菌落质地、表面和边缘透明程度、隆起度、特殊气味、干湿情况、有无分泌物等)；制备临时玻片，从菌落的边缘挑取少许菌丝和孢子置于生理盐水中，加盖玻片；显微镜下观察并记录菌种的显微形态(具体包括分生孢子头、顶囊、瓶梗、梗基、产孢结构、分生孢子等)；参照魏景超版《真菌鉴定手册》，根据菌落形态和显微形态将上述菌株进行形态鉴定，并得到如表2所示的结果数据；

⑦选取⑤中氧化带分布均匀、氧化带颜色鲜艳且较深、氧化带宽度较宽，R值大于13.5 的菌株，通过液体发酵培养基进行富集培养；然后将富集培养好的发酵液在4000r/min离心15min获得酶液，并进行酶活性测试；

具体地，以无菌水为空白对照组，DMP作为底物，2.4ml的pH3.5磷酸缓冲液和0.5ml的10mmol/L的DMP反应体系，保温5min后加入0.1ml酶液，测定其在470nm处的吸光度增加值，其中，每分钟氧化产生1umol所需的酶量定义为1个酶活力单位(U)；重复五次，取均值，得到如表3至表8所示的结果数据；

其中，酶活力(U/mL)＝△OD*V_总*N△t*V_酶*ε*10^-6；

式中，△OD----吸光度的变化值；

V_总----总反应体积，mL；

N----酶液稀释倍数；

△t----反应时间，min；

V_酶----酶液体积，mL；

ε＝49600L/(M*cm)。

表1各菌落的d、D及R值测定

编号	R＝d/D	编号	R＝d/D	编号	R＝d/D	编号	R＝d/D
								0101	13.91	0205	6.70	0237	13.21	0502	9.34
0102	9.78	0206	8.34	0238	14.81	0503	17.53
								0103	7.29	0207	5.67	0239	11.09	0504	5.25
0104	9.78	0208	9.43	0240	15.07	0505	15.72
								0105	14.68	0209	15.52	0241	10.28	0506	4.87
0106	7.27	0210	6.65	0242	18.14	0507	9.37
								0107	13.73	0211	9.22	0243	9.53	0508	14.68
0108	15.31	0212	7.43	0244	8.24	0509	8.37

表2各菌株的鉴定

表3曲霉属中菌株的酶活性测试

菌株编号	平板氧化带圈	酶活力/(U/mL)
			0102	++	1.32±0.22
0105	+++	4.52±0.17
			0107	++	1.33±0.14
0108	++	1.63±0.18
			0114	++	1.56±0.43
0117	+	0.78±0.24
			0120	+++	2.75±0.51
0125	++	1.28±0.64
			0127	+	0.93±0.15

表4木霉属中菌株的酶活性测试

表5根霉属中菌株的酶活性测试

菌株编号	平板氧化带圈	酶活力/(U/mL)
			0303	++	2.14±0.11
0308	+	0.79±0.15
			0309	++	1.95±0.13
0311	+	0.48±0.16

表6串珠霉属中菌株的酶活性测试

菌株编号	平板氧化带圈	酶活力/(U/mL)
			0402	++	1.89±0.28

表7瓶梗青霉属中菌株的酶活性测试

菌株编号	平板氧化带圈	酶活力/(U/mL)
			0503	+++	2.37±0.12
0505	+	0.46±0.24
			0508	++	1.28±0.37
0510	++	3.55±0.14
			0511	+	0.96±0.27
0514	++	1.53±0.52
			0517	++	1.82±0.61

表8毛壳霉属中菌株的酶活性测试

菌株编号	平板氧化带圈	酶活力/(U/mL)
			0602	+	0.75±0.35
0605	+	0.65±0.14
			0607	++	1.37±0.42
0613	+	0.36±0.11
			0615	++++	4.59±0.31

2、结果分析：

由表1可知，R值越大，菌株生长越旺盛。

由表2可知，初步筛选出的木质素降解菌株为木霉属、曲霉属、根霉属、串珠霉属、瓶梗青霉属或毛壳菌属。

参见表3至表8，选取其中酶活性大于1.0U/mL的菌株，即为木质素分解初筛菌株，共计28株。该菌株均具有较好的漆酶活性，可以快速降解木质素。

实施例组2秸秆高效速腐菌株的筛选

1、实验步骤：

将实施例组1中筛选获得的28株木质素分解初筛菌株分别接入配制好的纤维素-刚果红培养基(纤维素-刚果红培养基的pH值接近秸秆培养基的pH值)中，28℃恒温培养3～5 天，每隔24小时观察并记录菌落的透明光圈(即水解圈)直径的情况，并得到如表9所示的结果数据，筛选其中水解圈平均直径大于0.8cm的菌株，共16株，即为目的秸秆高效速腐菌株。

表9不同菌落的透明光圈直径的大小

2、结果分析：筛选水解圈平均直径大于0.8cm的菌株，其菌株编号分别为：0102、0108、 0105、0107、0114、0120、0201、0203、0209、0219、0226、0228、0233、0240、0503、 0615；即为目的秸秆高效速腐菌株。该菌株能高效降解纤维素。其中，编号为0201的菌株的透明光圈的直径最大，该菌株的直径可达到2.04cm。

实施例组3目的秸秆高效速腐菌株的酶活力的测定

1、实验步骤：

从实施例组2中得到的目的秸秆高效速腐菌株筛选出11株菌株，通过液体发酵培养基进行富集培养；然后将富集培养好的发酵液在4000r/min离心15min获得酶液，并进行酶活性测试；

取4支洗净烘干的20ml具塞刻度试管，编号后各加入0.5ml酶液和1.5ml 0.05mol/L的 pH为4.5的柠檬酸缓冲液。其中，1号试管中加入1.5mL DNS溶液以钝化酶活性，作为空白对照组，比色时调零用；然后将各试管分别置于50℃水浴中预热5～10min，再各自加入滤纸条50mg，50℃水浴中保温1小时后取出立即向2～12号试管中各加入1.5mL DNS溶液以终止酶反应；混匀后沸水浴5min，冷却后用蒸馏水定容至20mL,再次充分混匀。以1号试管溶液为空白对照调零点，在540nm波长下测定2-12号试管液的光密度值并记录得到如表10所示的结果。

具体地，根据3个重复光密度的平均值，在标准曲线上查出对应的葡萄糖含量，按下式计算出滤纸酶活力(U/g)。在上述条件下，每小时由底物生成1mol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。

滤纸酶活力(U/g)＝葡萄糖含量(mg)*酶液定容总体积(mL)*5.56/{反应液中酶液加入量(mL)*样品质量(g)*时间(h)}

式中:5.56为1mg葡萄糖的lmol数。

表10目的秸秆高效速腐菌株的酶活力数据

菌株编号	酶活力/(U/mL)
		0102	1.32±0.22
0108	1.63±0.18
		0105	4.52±0.17
0201	4.91±0.17
		0203	2.08±0.21
0219	1.58±0.26
		0233	2.48±0.53
0251	1.86±0.49
		0309	1.95±0.13
0503	2.37±0.12
		0615	4.59±0.31

2、结果分析：每一菌株的酶活力均大于1.0U/mL，其中，编号为0201的菌株的酶活力最高，可高达4.91±0.17U/mL。

实施例组4目的秸秆高效速腐菌株处理秸秆的实验

1、实验步骤：

①将实施例组3中筛选得到的11个菌株，直接加入粉碎好的秸秆(该秸秆的含水量约为60％)中，28℃恒温培养；10天后检测秸秆的失重率，并得到如图1所示的结果数据；

②秸秆SCOD的测定：

绘制标准曲线：称取0.8502g邻苯二甲氢钾(基准试剂)用蒸馏水溶解后，转至1000mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至标线。此贮备液COD值为1000mL/L。分别取上述贮备液 2.5mL、5mL、10mL、20mL、30mL、40mL于50ml容量瓶中，加水稀释至标线，可得到COD值分别为50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L及原液为1000mg/L标准使用液系列。准确吸取各标准液3.00mL，置于25mL比色管中，加入1mL掩蔽剂，混匀，然后再加入3.0mL消解液和5mL催化剂，旋紧密封塞，混匀。做平行试验两组，置于高压灭菌锅内进行消解(120℃，1h)。结束后，将溶液定容至15mL，摇匀。冷却后，在600nm下进行吸光度的测定，将数据绘制成SCOD-A标准曲线，如图 2所示，并求出对应方程式。

样品测定：取1g秸秆，加入100mL水浸泡，浸泡30min，布氏漏斗抽滤8次。准确吸取3.00mL水样，置于25mL比色管中，加入1mL掩蔽剂，混匀，然后再加入3.0mL 消解液和5mL催化剂，混匀。做平行试验两组，置于高压灭菌锅内进行消解(120℃，1h)，消解时注意不要将比色管的塞子塞紧。结束后，将溶液定容至15mL，摇匀。冷却后，在 600nm下进行吸光度的测定，根据吸光度，计算相应的SCOD值，并得到如图3所示的结果数据。

SCOD(O₂，mg/L)＝A.F.K

式中：A——样品的吸光度；

F——稀释倍数；

K——曲线的斜率。

2、结果分析：

由图2可知，编号为0201的菌株处理后的秸秆失重率最高，可达17.10％；编号为0105、 0219、0201、0251、0615的菌株处理后的秸秆失重率均在11％以上，说明该编号的菌株对秸秆的降解效果好。

由图3可知，编号为0201和0615的菌株的SCOD值较大，可达750以上；编号为0105、0251、0309的菌株也有较高的SCOD值，均在650以上。也即说明，这些菌株发酵水稻秸秆后，溶解性有机物含量较高，较能降解秸秆粗纤维，以将其分解成可溶性有机物。

实施例组5不同菌株对秸秆的降解率

1、实验操作：

制备固体培养基：将水稻秸秆剪短至2㎝，分别称取10g，用2％硝酸铵浸泡24h，拧干装袋，灭菌2小时。冷却后在无菌操作的条件下用打孔法，分别接种平皿中活化的9种不同的菌株，放入恒温箱，27℃培养5天，观察其生长情况，5天后停止发酵并对发酵后秸秆的粗纤维素含量进行测定，分析发酵过程中粗纤维的降解率，并得到如图4所示的结果数据。

2、结果分析：编号为0105、0201、0233、0251、0615的菌株经5天发酵后对秸秆中粗纤维的降解率能力较高，可达到8％以上；其中，降解率最高的是编号为0201的菌株，其对秸秆粗纤维的降解率可达25.08％。

实施例组6目的秸秆高效速腐菌株的鉴定和保藏

1、实验操作：

①菌株的形态学分类鉴定：无菌条件下，用接种针挑取纯化分离斜面培养基中单菌落孢子，采用单点接种法接种于PDA培养基当中，将霉菌28℃培养3-5天，观察并记录PDA平皿菌落特征和显微形态，得到如图5和表11所示的结果数据；

②菌株的分子鉴定：提取菌株的总DNA以ITS1和ITS4为上下游引物PCR扩增ITS区，PCR产物经回收后，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测序结果在genbank上进行序列比对。分子鉴定结果和形态鉴定结果完全一致。

表11不同菌株形态学观察结果

菌株编号

形状

气生菌丝颜色

孢子颜色

色素分泌

透明度

干湿情况

气味

0105

圆形

较发达，乳白色

土黄色

无

不透明

干燥

无

0201

稍圆

较发达，白色

绿色

深色

不透明

干燥

无

0615

圆形

极发达，白色

黑色

有，褐色

不透明

干燥

无

2、结果分析：

编号为0105的菌株为曲霉属，编号为0201的菌株为木霉属，编号为0615的菌株为毛壳霉属。选择其中降解秸秆效果最好的编号为0201的菌株进行保藏，保藏编号为CCTCCNO：M 2021509；保藏时间为：2021年5月11日；保藏中心为：中国典型培养物保藏中心。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (2)

1.一种秸秆高效速腐菌株，其特征在于，所述菌株为木霉属，微生物保藏编号为CCTCCNO：M 2021509。

2.一种如权利要求1所述的秸秆高效速腐菌株在降解秸秆上的应用。

Images