CN112080450A - 一种秸秆降解菌及分离筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种秸秆降解菌及分离筛选方法，属于生物技术领域，本发明中以木质素为靶标对多年秸秆还田土壤中的微生物进行筛选，获得木质素降解单菌，并结合纤维素降解单菌的筛选；将筛选出的秸秆降解效率高的纤维素降解菌和木质素降解菌组成菌群，获得降解效率高的菌群，将菌株混合发酵制成菌剂在田间试验筛选出降解效率高的组合。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种秸秆降解菌及分离筛选方法。
背景技术
内蒙古自治区是我国重要的玉米产区，也是重要的玉米调出地区，同时每年也生产大量的玉米秸秆。目前国家政策禁止露天焚烧秸秆，并且鼓励秸秆的综合利用。在秸秆利用的诸多方法中，秸秆还田具有改善土壤结构，提高土壤持水能力，达到保水保肥的效果。虽然秸秆还田能够培肥地力节省化肥的使用等方面的好处，但是受低温限制玉米秸秆还田之后的降解速率慢，大量未降解的秸秆在土壤中形成悬空。下茬春玉米播种时因悬空造成落干，导致出苗不齐从而降低产量。并且在播种之后随着秸秆的降解消耗氮肥，造成跟幼苗争夺氮肥的情况。
为了解决秸秆腐解慢的问题，大量研究集中在开发高效秸秆降解菌。目前市场上提供了丰富的玉米秸秆降解菌菌剂，但是绝大多数仅适用于中高温条件。菌剂主要降解秸秆中的纤维素和半纤维素，而且菌株的筛选大多以对滤纸崩解的速度为参考。这种筛选策略获得的菌株大多在冷凉地区对玉米秸秆的降解效果不理想。秸秆的主要组成成分为纤维素、半纤维素和木质素。木质素虽然占的比例不高但是对秸秆的保护作用很强，要提高对秸秆的降解速率必须重视首先解除木质素对纤维素和半纤维素的保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种秸秆降解菌及分离筛选方法，该方法以木质素为靶标对多年秸秆还田土壤中的微生物进行筛选，获得木质素降解菌，并结合纤维素降解菌的筛选。将筛选出的纤维素降解菌和木质素降解菌组成菌群，通过秸秆降解率获得降解效率高的菌群，将菌株混合发酵制成菌剂在田间试验筛选出降解效率高的组合。
为实现上述目的，特采取如下技术方案：
一种秸秆降解菌，包括假单胞菌、不动杆菌；
所述假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年08月11日，分类命名：假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.20521；
所述不动杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年08月11日，分类命名：不动杆菌Acinetobacter sp.，保藏编号为CGMCC No.20522。
一种如上所述的秸秆降解菌的分离筛选方法，包括如下步骤：
s1：秸秆降解菌样品的收集
分别制取玉米秸秆土壤稀释液、玉米秸秆菌落稀释液、玉米秸秆稀释液；
s2：利用木质素和纤维素为唯一碳源法进行筛选
利用木质素和羧甲基纤维素为唯一碳源制成平板，将上述样品的稀释液涂布平板；放置室温进行培养；
s3：将筛选出的菌落进行纯化
将上一步获得的单菌落接种到新鲜的LB培养基上进行划线培养获得单菌落，将单菌落进行发酵获得发酵液然后保存到甘油中进行低温保存菌种；
s4 低温条件下筛选秸秆降解率高的菌株
在15℃温度条件下，再将上述菌种进行接种到秸秆上，再根据秸秆表面结构变化和失重率筛选降解率最高的菌株；并在-80℃环境下保存菌株；
s5：测定高效秸秆降解菌菌株产生的木质纤维素酶酶活
在-80℃超低温冰箱中取出保存到菌株，在超净工作台无菌环境条件下取出一块接种到灭菌后的LB液体培养基试管中，在120r/min，25℃的震荡培养箱中培养24h。取4ml培养好后的LB液体培养基于5ml无菌离心管中，在4℃，4000r/min离心10min，取上清液即为制取的粗酶液；然后用３，5－二硝基水杨酸法测定粗酶液的酶活，CMC酶定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μｇ葡糖糖所需酶量定义为１个酶活力单位；
s6:确定菌株组合
根据s4和s5选取低温条件下（15℃）降解率高的菌种,并结合木质素和纤维素降解酶的产生特征选取在耐低温、高效秸秆降解和具有较高酶活的菌株作为菌群的组成菌株；
s7:菌株组合发酵液田间试验
将s6中的种菌从平板上接至LB培养基中，培养至稳定期，将该菌种的菌液和普通菌种施洒在相同条件下的玉米秸秆地中，覆盖土，浇水，插上实验标签；
s8：将混合菌制成菌剂田间检测降解效率
将s6中的菌种用LB培养基进行单菌株混合发酵，制备菌剂配方，菌剂配方为玉米秸秆粉过60目筛作为载体，麦麸作为保护剂，具体为50ml菌液＋4g秸秆粉＋4g麸皮，经过冷冻干燥之后制成菌剂，把制作好的菌剂施洒在玉米秸秆上进行田间试验，然后得出相同低温条件下秸秆的降解率：秸秆初始质量-秸秆剩余质量/秸秆初始质量。
本发明的有益效果在于：以木质素为靶标对多年秸秆还田土壤中的微生物进行筛选，获得木质素降解菌，并结合纤维素降解菌的筛选，将筛选出的纤维素降解菌和木质素降解菌组成菌群，通过秸秆降解率获得降解效率高的菌群，将菌株混合发酵制成菌剂在田间试验筛选出降解效率高的组合；经验证，该菌剂在低温条件下土壤中的秸秆降解率要高于市场上销售的秸秆降解菌的田间秸秆降解效率。
附图说明
图1为本发明的木质纤维素降解菌的鉴定结果。
图2为本发明的单菌株15℃条件下秸秆降解率测定（两周）。
图3为本发明的细菌菌群的田间为期四周的秸秆降解率，左侧为降解前右侧为降解后秸秆状态。
图4为细菌菌群田间为期四周的秸秆降解率。
图5为细菌菌群田间为期八周的秸秆降解率。
图6为菌群降解8周后秸秆硬度测定。
图7为菌群降解8周后秸秆破碎率。
图8A为各菌株在15℃和不同PH条件下的生长情况。
图8B为各菌株在4℃和不同PH条件下的生长情况。
图9A为各菌株在室温和不同氮素浓度条件下的生长情况。
图9B为各菌株在4℃和不同氮素浓度条件下的生长情况。
图9C为各菌株在15℃和不同氮素浓度条件下的生长情况。
图10A为各菌株在室温和不同盐浓度条件下的生长情况。
图10B为各菌株在4℃和不同盐浓度条件下的生长情况。
图10C为各菌株在15℃和不同盐浓度条件下的生长情况。
图11为木质素和纤维素为唯一碳源筛选平板上长出的菌落。
图12分别为葡萄糖标准曲线（左）和木糖标准曲线（右）。
图13为菌株的纤维素酶活。
图14为菌株的木质纤维素酶活。
具体实施方式
请参考附图，本申请公开了一种秸秆降解菌，包括假单胞菌、不动杆菌；
所述假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年08月11日，分类命名：假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏编号为CGMCC No.20521；
所述不动杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2020年08月11日，分类命名：不动杆菌Acinetobacter sp.，保藏编号为CGMCC No.20522。
关于秸秆降解菌分离筛选方法，具体包括如下
第一步秸秆降解菌样品的收集
初始材料为多年玉米秸秆还田的土壤样品，用水悬浮制成泥浆将土壤颗粒过滤之后采用低速离心的方法去除沉淀物，取上部悬液进行梯度稀释；采用发酵罐利用秸秆培养基中加入少许土壤样品进行分批富集发酵，选取发酵液进行梯度稀释；将收获后的玉米秸秆磨碎制成水悬液进行过滤，收集滤液进行梯度稀释。
第二步利用木质素和纤维素为唯一碳源法进行筛选
利用木质素和羧甲基纤维素为唯一碳源制成平板，将上述样品的梯度稀释悬液涂布平板。放置室温进行培养，待长出菌落后挑选典型形态、颜色的菌落进行划线培养，如图11所示。
第三步将筛选出的菌落进行纯化
将上一步获得的单菌落接种到新鲜的LB培养基上进行划线培养获得单菌落，将单菌落进行发酵获得发酵液然后保存到甘油中，进行低温保存菌种。
第四步低温条件下筛选秸秆降解率高的菌株
在15℃下，三角瓶中装入土壤浸提液经过滤膜处理过滤到浸提液中的细菌和真菌，放入秸秆块，接种200ul细菌发酵液，两周之后观察秸秆表面结构变化和失重率。根据降解效果筛选出效率高的菌株。
第五步测定高效秸秆降解菌菌株产生的木质纤维素酶酶活
在-80℃超低温冰箱中取出保存到菌株，在超净工作台无菌环境条件下取出一块接种到灭菌后的LB液体培养基试管中，在120r/min，25℃的震荡培养箱中培养24h。取4ml培养好后的LB液体培养基于5ml无菌离心管中，在4℃，4000r/min离心10min，取上清液即为制取的粗酶液。
纤维素酶活力的测定
纤维素可以被纤维素酶降解为葡萄糖，在测定纤维素酶活时用的方法都是以３，5－二硝基水杨酸（DNS）法。CMC酶定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μｇ葡糖糖所需酶量定义为１个酶活力单位。
葡萄糖标准曲线绘制
配置1 mg/mL 葡萄糖标准溶液。共8个处理。每个处理做3个平行1个对照，在沸水中水浴10min后用冷水冷却，在就加蒸馏水定容至10ml，震荡混匀，在540nm下测定光密度（OD值）。用3个葡萄糖浓度的平均值作图，绘制葡萄糖标准曲线。用空白管溶液调零点, 记录吸光度值, 以葡萄糖浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线（如图12左所示）。
具体操作步骤
测量所采用的底物为羧甲基纤维素钠。取 4 支 20 mL 具塞刻度试管，洗净烘干，编号后各加入 1 mL 1％CMC-Na溶液。将4支试管同时在 50℃水浴锅中预热 5 min，分别向 2、3、4 号试管中各加入粗酶液 200 μL，在50℃水浴锅中保温 10 min后，立即向 4 支试管中加入 2 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，充分摇匀，同时向 1号试管中加入 500 μL 酶液，作为空白对照，比色时调零用，之后立即将 4 支试管进行沸水浴5min，沸水浴后立即冷却并用蒸馏水定容至 20 mL，充分混匀。用1号试管对照调零点，在 540 nm 波长下测定2、3、4 号试管液的 OD 值，根据绘制的标准曲线的线性方程计算酶活。
CMC酶酶活计算公式酶活=（吸光值×线性回归常数×稀释倍数×2×1000）/（Mr×反应时间）Mr—葡萄糖的分子量180.16；反应时间—10min。
半纤维素酶活力的测定
木聚糖酶可以将半纤维素降解为阿拉伯糖和低木聚糖。测量木聚糖酶活所使用的方法也是采用３，5－二硝基水杨酸（ＤＮＳ）法。木聚糖酶活定义为在PH4.8，50 ℃条件下，每分钟水解木聚糖产生1μｇ木糖所需酶量定义为１个酶活力单位。
木糖标准曲线绘制
配置1 mg/mL木糖标准溶液。共8个处理。每个处理做3个平行1个对照，在沸水中水浴10min后用冷水冷却，在就加蒸馏水定容至10ml，震荡混匀，在540nm下测定OD值。用3个木糖浓度的平均值作图，绘制木糖标准曲线。用空白管溶液调零点, 记录吸光度值, 以木糖浓度为横坐标, 吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
具体操作步骤
测量所采用的底物为燕麦木聚糖。取 4 支 20 mL 具塞刻度试管，洗净烘干，编号后各加入 1.8 mL 1％燕麦木聚糖柠檬酸缓冲液。将4支试管同时在 50℃水浴锅中预热 5 min，分别向 2、3、4 号试管中各加入粗酶液 200 μL，在50℃水浴锅中保温 10 min后，立即向 4支试管中加入 2 mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）溶液，充分摇匀，同时向 1号试管中加入 500μL 酶液，作为空白对照，比色时调零用，之后立即将 4 支试管进行沸水浴5min，沸水浴后立即冷却并用蒸馏水定容至 20 mL，充分混匀。用1号试管对照调零点，在 540 nm 波长下测定2、3、4 号试管液的 OD 值，根据绘制的标准曲线的线性方程计算酶活（如图12右所示）。
酶活=（吸光值×线性回归常数×稀释倍数×2×1000）/（Mr ×反应时间）
Mr—木糖的分子量150.13；反应时间—10min。
木质素酶活测定
降解木质素的酶主要是：木质素过氧化物酶（Lip）、锰过氧化物酶（Mnp）、漆酶（Lac）。木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶都是含Fe+2血红素的糖蛋白。木质素过氧化物酶分子量大约是40kD，而锰过氧化物酶分子量大约是38~62.5kD。漆酶是一种以O2为电子受体，含有4个Cu离子的氧化酶，分子量大约是60~80Kd。木质素过氧化物酶(Lip)酶活测定木质素过氧化物酶酶活定义为１min内氧化１μｍol藜芦醇的酶量为１个酶活力单位。准确移取 200 mM 酒石酸缓冲液 0.5 mL于容积为 1.4 mL 的比色皿中，加入 40 mM 黎芦醇 0.1 mL。准确加入待测酶50μL、蒸馏水350μL 。在30 ℃条件下水浴10min，加入浓度为 20 mM H2O2溶液 0.01mL启动反应，使用分光光度计迅速测定 310 nm 处的吸光度，1 min 后再测定 1 次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD310 变化）。
酶活计算公式：
木质素过氧化物酶酶活=OD310变化/9.3*1.01*106/X（U/L）
X─待测酶液体积：50μL；木素过氧化物酶催化黎芦醇后形成产物在310 nm
下的摩尔吸光系数为9 300 mol-1·L·cm-1。
锰过氧化物酶（Mnp）酶活测定
锰过氧化物酶酶活定义为１min内氧化１μmol Ｍn２＋的酶量为１个酶活力单位。准确移取 100 mM 丙二酸-丙二酸钠缓冲液 0.5 mL 于容积为 1.4 mL 的比色皿中，加入 10 mMMnSO4 溶液 0.1 mL。准确加入待测酶液 50μL，加入蒸馏水350μL。在30 ℃条件下水浴10min，加入浓度为 10 mM H2O2 溶液 0.01 mL 启动反应，使用分光光度计迅速测定 270nm 处的吸光度，1 min 后再测定 1 次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD270变化）。酶活计算公式：锰过氧化物酶酶活=OD270变化/11.590*1.01*106/X(U/L) X─待测酶液体积：50μL；锰过氧化物酶氧化后的复合物在270nm 下的摩尔吸光系数为11 590 mol-1·L·cm-1漆酶（Lac）酶活测定漆酶酶活定义为：１min内氧化１μmol ABTS的酶量为１个酶活力单位。准确移取 100 mM 丙二酸-丙二酸钠缓冲液、0.6 mM ABTS 溶液各 10 mL，混合，摇匀，在30 ℃条件下水浴10min。取上述混合试剂 1 mL 于容积为 1.4 mL 的比色皿中，在420 nm 处调零。准确加入待测酶液 50μL，立即记录吸光值，每隔30s 记录 1 次，共 3 次，取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（OD420变化）。
酶活计算公式漆酶酶活=OD420/36*（1+X/1000）*106/X（U/L）
X─待测酶液体积：50μL；漆酶催化ABTS 形成的产物摩尔吸光系数为36 000 mol-1·L·cm-1。
第六步确定菌株组合
根据第五步和第四步选取低温条件下降解率高的菌种，并结合木质素和纤维素降解酶的产生特征选取在耐低温、高效秸秆降解和具有较高酶活的菌株作为菌群的组成菌株。最终确定菌株8株。
第七步菌株组合发酵液田间试验
将8种菌从平板上接至LB培养基中，培养至稳定期；将8种菌的菌液混合进无菌的烧杯中，共计800ml; 用剪刀将玉米秸秆处理3-4cm四段，放置烘箱中80摄氏度烘3小时；将烘干的秸秆装入尼龙网袋中，每份尼龙网袋中秸秆称至40.0g；取内农大职业技术学院玉米中心实验地块，挖三条深15cm深沟，沟间距50cm; 每条沟中放置9份秸秆，沟中秸秆间距为20cm;取8g (NH4)2SO4和4克尿素混合，如此三份，将每份均匀撒至沟中；三条沟秸秆样品的处理分别每份秸秆浇菌液70ml，对照为浇70ml空培养基空白对照为浇70ml水；覆盖土，浇水，插上实验标签。
第八步将混合菌制成菌剂田间检测降解效率
将8株菌株利用LB培养基进行单菌株混合发酵，发酵条件为搅拌300转/分钟，通气量为1L/分钟，发酵温度为28℃。菌剂配方为玉米秸秆粉过60目筛作为载体，麦麸作为保护剂。具体配方为50ml菌液＋4g秸秆粉＋4g麸皮，经过冷冻干燥之后制成菌剂。把制作好的菌剂进行田间试验，阳性对照为中农绿康秸秆降解菌剂产品，阴性对照为水、水加秸秆粉和麸皮。具体准确量取烘干洗净的长度约5㎝的秸秆块，每30g分装于5㎜孔径的纱网袋中，埋于地下20cm。每一菌剂设5次重复，共95袋。每包秸秆配施0.6g磷酸铵，0.3g尿素。埋地时间：2019年10月5日——2019年11月15日。结果显示本试验制作的菌剂在低温条件下土壤中的秸秆降解率要高于市场上销售的秸秆降解菌的田间秸秆降解效率；
其中：XF 为8株细菌混合发酵后麸皮作为保护剂制作的菌剂；LF 为市场上销售的中农绿康秸秆降解菌以麸皮为保护剂作为对照；SY为水处理空白对照；SF为水加麸皮处理阴性对照。
综上，利用木质素和纤维素为唯一碳源法从土壤、秸秆样品进行细菌菌株筛选，获得单菌株，选取代表性的43个菌株进行16s rRNA鉴定发现它们分别属于9个不同的属（图1）。通过室内低温（15℃）单菌株秸秆降解率测定，从筛选出的具有高效秸秆降解能力的单菌株进行鉴定，分别为假单胞杆菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、柠檬酸杆菌属和金黄杆菌属等（图2.）。根据分离来源将各菌株分为木质素降解菌和纤维素降解菌（表1）。
表1
将这些菌株进行单独发酵后等比例混合进行室外土壤条件下秸秆降解率实验。采用40克秸秆埋深10cm，设置菌液处理，LB液体培养基处理和空白清水对照处理，一个月后从土里挖出洗净烘干后称重，计算秸秆的失重率（图3）。由木质纤维素降解菌组合成的菌群在田间进行试验结果显示，菌群的降解效果比不添加菌群的处理降解效率在一个月内高出10%左右（图4.）。并且菌群在两个月的时间内保持最高的秸秆降解效率（图5）。对降解后的秸秆选取完整部分进行穿刺实验，菌群处理后能够非常显著降低秸秆的硬度（图6）通过统计发现菌群处理后2个月的样品破碎程度明显提高（图7）。
各菌株在不同条件下的适应性有较大差异，其中45号菌有最宽的PH适应范围和温度适应范围，在低温条件下生长速率最快。另外18号菌在PH=7.0条件下也表现了很好地低温适应能力（图8）。各菌株在不同氮素浓度下在室温、15℃和4℃条件下培养测定细菌浓度，发现45号菌具有较高的耐受氮素缺乏的能力。并且提高氮素浓度可以显著提高各菌株对低温的适应能力（图9）。对各菌株在不同盐浓度下和不同温度下的生长情况进行试验发现各菌株对盐浓度有不同的耐受性，其中45号菌具有较强的耐盐能力（图10）。通过适应性试验综合各方面指标选取45号和18号菌进行发酵制作菌剂后进行田间试验。具体的发酵数据和田间降解效果由张赛楠提供。
综上所述，通过筛选获得低温条件下秸秆降解效率高的单菌，将单菌株组配成菌群在土壤中进行降解率发现：在为期两个月的试验中，前期（一个月）菌群显著提高秸秆的失重率，后期（第二个月）显著降低秸秆硬度并促进秸秆破碎。菌株45号和18号在耐低温、PH、耐盐和耐氮素贫瘠中表现良好，所以优先选择这两株菌进行发酵，后期田间降解的效果正在进行中。
Claims (4)
1.一种秸秆降解菌，其特征在于，包括假单胞菌、不动杆菌；
所述假单胞菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号为CGMCC No.20521；
所述不动杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏编号为CGMCC No.20522。
2.一种如权利要求1所述的秸秆降解菌的分离筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
s1：秸秆降解菌样品的收集
分别制取玉米秸秆土壤稀释液、玉米秸秆菌落稀释液、玉米秸秆稀释液；
s2：利用木质素和纤维素为唯一碳源法进行筛选
利用木质素和羧甲基纤维素为唯一碳源制成平板，将上述样品的稀释液涂布平板；放置室温进行培养；
s3： 将筛选出的菌落进行纯化
将上一步获得的单菌落接种到新鲜的LB培养基上进行划线培养获得单菌落，将单菌落进行发酵获得发酵液然后保存到甘油中，保存温度为-80℃；
s4： 低温条件下筛选秸秆降解率高的菌株
在15℃温度条件下，将上述菌种进行接种到秸秆上，根据秸秆表面结构变化和失重率筛选出效率最高的菌株；
s5：测定高效秸秆降解菌菌株产生的木质纤维素酶酶活
在-80℃的超低温冰箱中取出保存到菌株，在超净工作台无菌环境条件下取出一块接种到灭菌后的LB液体培养基试管中，在120r/min，25℃的震荡培养箱中培养24h；取4ml培养好后的LB液体培养基于5ml无菌离心管中，在4℃，4000r/min离心10min，取上清液即为制取的粗酶液；然后用３，5－二硝基水杨酸法测定粗酶液的酶活，CMC酶定义为每分钟水解羧甲基纤维素钠产生1μｇ葡糖糖所需酶量定义为1个酶活力单位；
s6:确定菌株组合
根据s4和s5选取低温条件下降解率高的菌种,并结合木质素和纤维素降解酶的产生特征选取在耐低温、高效秸秆降解和具有较高酶活的菌株作为菌群的组成菌株；
s7:菌株组合发酵液田间试验
将s6中的种菌从平板上接至LB培养基中，培养至稳定期，将该菌种的菌液和普通菌种施洒在相同条件下的玉米秸秆地中，覆盖土，浇水，插上实验标签；
s8：将混合菌制成菌剂田间检测降解效率
将s6中的菌种用LB培养基进行单菌株混合发酵，制备菌剂配方，菌剂配方为玉米秸秆粉过60目筛作为载体，麦麸作为保护剂，把制作好的菌剂施洒在玉米秸秆上进行田间试验，然后得出相同低温条件下秸秆的降解率：秸秆初始质量-秸秆剩余质量/秸秆初始质量。
3.根据权利要求2所述的秸秆降解菌的分离筛选方法，其特征在于：s6中所述低温条件为15℃及以下。
4.根据权利要求2所述的秸秆降解菌的分离筛选方法，其特征在于：s8中所述菌剂配方的具体内容为50ml菌液＋4g秸秆粉＋4g麸皮，经过冷冻干燥之后制成菌剂。
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