CN106497834A - 一种具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌及其应用 - Google Patents

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丁立功
郭悠然
臧百胜
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Abstract

本发明提供一种具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌，保藏编号为CGMCC No.13120，保存日期为2016年10月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该不动杆菌可以应用于纤维素降解尤其是秸秆堆肥中。该纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌在好氧和厌氧的条件下均有较高的纤维素降解酶活力，克服了传统好氧菌或厌氧菌对发酵环境要求严格的问题；其应用于多种环境下的纤维素降解，包括应用于规模化的秸秆堆肥生产等含氧量情况复杂环境，可避免人工保持高通氧量，降低工艺成本，保证均匀发酵，提高堆肥或其他应用环境的纤维素分解效率。

Description

一种具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种新型菌株，具体涉及一种降解纤维素的不动杆菌。
背景技术
我国是农业生产大国，每年依靠农业生产能够为国民经济提供巨大支持。但是随着农业生产活动的迅猛发展，产生的农业废弃物(如作物残体、畜禽粪便等)的数量也越来越多。
作物秸秆中含有大量的纤维素资源，纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，也是自然界中储量丰富，分布广泛的一种多糖物质。传统的焚烧或理化处理方式不但污染环境还存在着成本高，处理工艺复杂，降解率低等问题。
利用微生物处理秸秆资源，能够将秸秆中难降解的纤维素类物质分解成可以被植物利用的有机质，变废为宝，还能减轻农业废弃物对环境造成的负担。
目前针对纤维素降解菌的报导中多为好氧菌。好氧型的纤维素降解菌，较容易分离得到，其纤维素酶活力也较高，但在堆肥生产时，好氧菌在通氧量减少的情况下生长受到限制，因此在高温期后仍需保持高通氧量，增加生产成本，且由于氧含量不均匀导致无法保证均匀发酵，其应用于规模化的堆肥时受到限制。
国内外学者利用厌氧培养技术展开的厌氧纤维素降解菌的分离筛选工作也取得了一些进展。从反刍动物瘤胃中分离出的一些专性厌氧菌虽具有较强的纤维素分解能力，但由于空气中的氧气对专性厌氧菌的毒害作用，其培养应用于生产也比较困难，同样受到限制。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一株具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌Acinetobacter sdwt001，保藏编号为CGMCC No.13120，保存日期为2016年10月18日，分类名为不动杆菌(Acinetobacter sp.)保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供上述具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌的应用，所述应用为其在纤维素降解中的应用如秸秆堆肥。
本发明提供的具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌，其在好氧和厌氧的条件下均有较高的纤维素降解酶活力，克服了传统好氧菌或厌氧菌对发酵环境要求严格的问题；其应用于多种环境下的纤维素降解，包括应用于规模化的秸秆堆肥生产等含氧量情况复杂的环境中，可避免人工保持高通氧量，降低工艺成本，保证均匀发酵，提高堆肥或其他应用环境的纤维素分解效率。
附图说明
图1为16s rDNA序列PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中1泳道为菌株sdwt001,2泳道为Marker DL2000；
图2为好氧条件下不动杆菌sdwt001的酶活随培养时间的变化情况；
图3为微溶氧条件下不动杆菌sdwt001的酶活随培养时间的变化情况。
具体实施方式
实施例1
菌株的分离、纯化
堆肥样品采集自山东省青州市堆肥厂的蔬菜秸秆堆肥。
取10g腐熟期的堆肥样品，加入装有100ml无菌水(带玻璃珠)的三角瓶中，振荡20min。取5ml样品悬液接入装有100ml液体LB培养基的三角瓶中，37℃，180r/min振荡培养8h：分别取培养后的菌液1ml，加入到9ml无菌水中，用无菌水以梯度稀释法制成稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的样液，各取100μl分别涂布于以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基，每个稀释度做三个平行样。37℃条件下先后于好氧和厌氧培养箱分别恒温培养48h，挑取各平板上的单菌落在羧甲基纤维素钠培养基上反复划线纯化。挑取纯化后的单菌落接于纤维素分解菌鉴别培养基平板，先后于好氧和厌氧培养箱中分别37℃恒温培养，记录各菌株的透明圈直径D与菌落直径d变化，筛选出D/d值较大的菌株。
上述羧甲基纤维素钠培养基配方为：CMC-Na 5g,KH2PO4 1g,琼脂17g,NaN03 3g,KCl 0.5g,MgSO4 0.5g,FeSO4 0.01g,蒸馏水1000ml(调节pH在5.5-6.0)。
上述纤维素分解菌鉴别培养基配方为：(NH4)2SO4 0.2g，MgSO4 0.05g,KH2PO40.1g,NaCl0.05g,CMC-Na 2.0g,刚果红0.02g，琼脂2.0g，蒸馏水1000ml，pH自然。
实施例2
菌种鉴定
选择好氧和厌氧培养下D/d值较大的菌株分别进行基因组DNA提取。DNA使用TIANGEN细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取。取5μl点样，以λEcoT14为Marker，1％琼脂糖凝胶电泳检测,电泳图如图1所示，其余-20℃保存。
对提取到的基因组DNA进行16s rDNA PCR扩增。采用16s rDNA通用引物，以所提取到的菌株基因组DNA为模板，按照如下反应体系和扩增条件进行扩增。引物序列：上游引物P1(008F)AGAGTTTGATCMTGGCTCAG下游引物P2(1392R)CGGGCGGTGTGTRC反应体系如下表所示。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测。
表1 16s rDNA的PCR扩增反应体系和反应程序
PCR产物经电泳检测纯度后测序，将所有好氧菌和厌氧菌的测序结果进行比对，选取菌落形态相同，同源性最高的菌落，确认其为同一株菌，命名为不动杆菌(Acinetobactersp.)sdwt001。该菌株在LB固体培养基上培养12h后，其菌落特征是：乳白色，不规则形，直径约为2mm，表面湿润，中央稍突起，不透明，边缘完整。其菌体细胞特征为：短杆菌，长度约为2μm。革兰氏染色呈阴性。将获得的16s rDNA基因序列通过NCBI数据库进行比对，结果显示与Acinetobacter sp.C16的同源性最高，为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)。将该菌株命名为Acinetobacter sdwt001，于2016年10月18日，交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC NO.13120。
实施例3
好氧条件下纤维素水解酶活性的测定
用接种环挑取不动杆菌Acinetobacter sdwt001单菌落接入LB液体培养基中，于37℃、160r/min条件下培养24h。各取10ml种子液分别转接于90ml以滤纸或羧甲基纤维素钠为碳源的PCS培养基中培养，160r/min，37℃培养。分别于发酵的第3,4,5天各取10ml发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为相应酶活的待测粗酶液。
取2ml 1％的羧甲基纤维素钠(用0.1M pH＝4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)作底物，取0.5ml相应粗酶液，于具塞刻度试管中50℃保温1h，以加热灭活的粗酶液作对照，采用DNS法测定还原糖生成量。
取0.5ml相应的粗酶液，加入2ml 0.1M pH＝4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将1cm×6cm的新华滤纸条卷成小卷置于具塞刻度试管底部，50℃保温1h，以加热灭活的粗酶液作对照，采用DNS法测定还原糖生成量。
在每个具塞刻度试管中加1.5ml DNS试剂，沸水浴5min，立即用流动水冷却。以葡萄糖标准曲线的空白为对照，测定其OD540值。
酶活定义：在一定的温度及pH条件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位，以IU/ml表示。
如图2所示，好氧条件下，在培养第4天不动杆菌Acinetobacter sdwt001的滤纸酶活和羧甲基纤维素钠酶活均达到了最高，分别为2.81IU/ml和2.51IU/ml。
上述葡萄糖标准曲线的制作方法：
准确配制2mg/ml的葡萄糖溶液100ml。取7支具塞试管，编号为1、2、3、4、5、6、7，向各管中加入不同量的蒸馏水和葡萄糖溶液，制成最终浓度为0、200、400、600、800、1000、1200μg/ml的葡萄糖标准液。向每个试管中加入1.5mlDNS试剂，沸水浴5min，立即用流动水冷却。摇匀后以1号试管为空白对照，测定各管在波长为540nm处的吸光值。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
实施例4
微溶氧条件下纤维素水解酶活性的测定
用接种环挑取不动杆菌(Acinetobacter sp.)sdwt001单菌落接入LB液体培养基中，于37℃条件下培养24h。各取10ml种子液分别转接于90ml以滤纸或羧甲基纤维素钠为纤维素碳源的PCS培养基中，37℃静止培养。分别于发酵的第3,4,5天各取10ml发酵液经5000r/min离心10min，取上清液即为相应酶活的待测粗酶液。
取2ml 1％的羧甲基纤维素钠(用0.1M pH＝4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制)作底物，取0.5ml相应粗酶液，于具塞刻度试管中50℃保温1h，以加热灭活的粗酶液作对照，采用DNS法测定还原糖生成量。
取0.5ml相应的粗酶液，加入2ml 0.1M pH＝4.8的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将1cm×6cm的新华滤纸条卷成小卷置于具塞刻度试管底部，50℃保温1h，以加热灭活的粗酶液作对照，采用DNS法测定还原糖生成量。
在每个具塞刻度试管中加1.5ml DNS试剂，沸水浴5min，立即用流动水冷却。以葡萄糖标准曲线的空白为对照，测定其OD540值。
酶活定义：在一定的温度及pH条件下，1min使底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位，以IU/ml表示。
如图3所示，经测定，在微溶氧条件下FPA酶活在培养的第4天达到最高为2.98IU/ml,CMC酶在第5天时达到最高活性，为1.30IU/ml。
上述葡萄糖标准曲线的制作方法：
准确配制2mg/ml的葡萄糖溶液100ml。取7支具塞试管，编号为1、2、3、4、5、6、7，向各管中加入不同量的蒸馏水和葡萄糖溶液，制成最终浓度为0、200、400、600、800、1000、1200μg/ml的葡萄糖标准液。向每个试管中加入1.5mlDNS试剂，沸水浴5min，立即用流动水冷却。摇匀后以1号试管为空白对照，测定各管在波长为540nm处的吸光值。以葡萄糖溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。
SEQUENCE LISTING
<110>山东沃泰生物科技有限公司
<120>一种具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌及其应用
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223 > P1(008F)
<400> 1
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 20
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223 > P2(1392R)
<400> 2
CGGGCGGTGTGTRC 14

Claims (4)

1.一种具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌，其特征在于：保藏编号为CGMCCNo.13120，保存日期为2016年10月18日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.权利要求1所述的具有纤维素降解能力的兼性厌氧的不动杆菌的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为该不动杆菌在纤维素降解中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用为该不动杆菌在秸秆堆肥中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080450A (zh) * 2020-09-30 2020-12-15 内蒙古农业大学 一种秸秆降解菌及分离筛选方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888362A (zh) * 2012-09-17 2013-01-23 贾平 一种鲁氏不动杆菌及用其制备添加剂用纤维素的方法
CN103789223A (zh) * 2013-11-14 2014-05-14 西北大学 一种具有自生固氮、解磷解钾能力的醋酸钙不动杆菌及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888362A (zh) * 2012-09-17 2013-01-23 贾平 一种鲁氏不动杆菌及用其制备添加剂用纤维素的方法
CN103789223A (zh) * 2013-11-14 2014-05-14 西北大学 一种具有自生固氮、解磷解钾能力的醋酸钙不动杆菌及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JAYAKUMAR PATHMA ET AL.: "Molecular and functional characterization of bacteria isolated from straw and goat manure based vermicompost", 《APPLIED SOIL ECOLOGY》 *
孙旭东 等: "产纤维素酶菌株的筛选鉴定及发酵条件优化", 《基因组学与应用生物学》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112080450A (zh) * 2020-09-30 2020-12-15 内蒙古农业大学 一种秸秆降解菌及分离筛选方法

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