CN103937722B - 中间苍白杆菌及微生物菌剂和它们的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种中间苍白杆菌，其保藏编号为CGMCC NO.8839。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌。本发明还提供了如上所述的中间苍白杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解烟碱类农药中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地降低土壤中烟碱类农药的残留量。
Description
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种中间苍白杆菌、一种微生物菌剂和它们的应用。
背景技术
烟碱类杀虫剂是乙酰胆碱酶受体抑制剂，作用于昆虫中枢神经系统，高效、有选择性、对哺乳动物安全，且与多数传统的农药之间不存在交互抗性。其中，具有杀虫活性的烟碱类化合物最早由壳牌公司发现，随后对该结构进行了不断的优化并得到了具有高杀虫活性的噻虫醛，其后该类化合物受到了广泛的开发和研究。目前已经商品化的烟碱类杀虫剂包括吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、氯噻啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺。
烟碱类农药的产量占到了全球农药产量的15-20％。烟碱类农药的大量使用，对土壤和地下水造成了一定的污染。因此，降解烟碱类农药是急需实施的环保措施。
应用微生物降解法来降解烟碱类农药，具有环境友好的优势，但是，目前，现有的微生物菌株降解烟碱类农药的效果仍然较差。
发明内容
本发明的发明人分离了一株中间苍白杆菌，发现其具有优异的降解烟碱类农药的效果，由此得到了本发明。为了克服烟碱类农药降解能力较低的缺陷，本发明提供了一种中间苍白杆菌，该中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)的保藏编号为CGMCC NO.8839。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌。
本发明还提供了如上所述的中间苍白杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解烟碱类农药中的应用。
通过上述技术方案，本发明可以更加高效地降解烟碱类农药，从而有助于有效地降低土壤和地下水中烟碱类农药的残留。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物材料保藏
本发明的中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)是本发明的发明人从山东烟台采集的规模化沼气工程沼液样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCC NO.8839，保藏日期为2014年2月21日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种中间苍白杆菌，该中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)的保藏编号为CGMCC NO.8839。
本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所述菌体包括保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌。
其中，所述微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌的活菌数可以为(5-200)×107CFU，优选情况下，每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌的活菌数可以为(20-120)×107CFU。
根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以将各种能够用于培养中间苍白杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作为种子培养基，用于菌种的保存；而发酵的培养基一般用于生产，这些培养基的种类也为本领域技术人员所公知。上述培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”(MicrobiologyCulture Media Manual)的记载制备得到。例如，种子培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-3g/L的牛肉膏、5-15g/L的蛋白胨、3-8g/L的氯化钠和15-20g/L的琼脂。例如发酵培养基可以含有：40-150g/L的玉米粉、40-150g/L的淀粉、40-150g/L的蔗糖、10-100g/L的豆油、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和1-10g/L的硫酸亚铁。
其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。
其中，为了方便所述微生物菌剂的贮藏和使用，所述微生物菌剂可以制成固体颗粒剂，优选地，所述微生物菌剂还含有惰性固体载体和粘结剂；所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种；所述粘结剂包括麦芽糖和/或糊精。
其中，优选地，所述微生物菌剂中，惰性固体载体的含量为30-90重量％；所述粘结剂的含量为5-20重量％。
其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌接种于发酵培养基中进行培养。优选情况下，通过培养使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌的活菌数可以为(5-200)×107CFU，更优选为(20-120)×107CFU。其中，培养的温度可以为28-35℃，培养的时间可以为10-50小时。
优选地，所述微生物菌剂的制备方法还可以包括：将在发酵培养基中进行培养后得到的物料与惰性固体载体和粘结剂混合；所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种；所述粘结剂包括麦芽糖和/或糊精。优选地，惰性固体载体和粘结剂的用量使得所述微生物菌剂中，惰性固体载体的含量为30-90重量％；所述粘结剂的含量为5-20重量％。其中，混合后的物料可以进一步干燥制粒为颗粒剂。
本发明还提供了如上所述的中间苍白杆菌和如上所述的微生物菌剂在降解烟碱类农药中的应用。
其中，所述烟碱类农药可以包括吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、氯噻啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺中的至少一种
以下通过实施例进一步详细说明本发明：
实施例1
本实施例用于说明本发明的中间苍白杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30℃和200转/分振荡下培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的蔗糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的中间苍白杆菌的活菌数为109CFU，所得的培养液即为本实施例的微生物菌剂。
实施例2
本实施例用于说明本发明的中间苍白杆菌的培养及微生物菌剂的制备。
将保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30℃和200转/分振荡下培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的蔗糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的中间苍白杆菌的活菌数为109CFU，在所得到的培养液(实测含水约65重量％)中加入硅藻土和粘结剂(糊精)，相对于每升的培养液，加入的硅藻土为500g，粘结剂为140g，然后将混合物在造粒机上过16目筛造粒，再用60℃的热空气烘干，实时测定水份含量，直至水份含量为4重量％左右，即得到本实施例的微生物菌剂，测得该微生物菌剂中，活菌数为7×108CFU/g。
实施例3
按照实施例1的方法制备微生物菌剂，不同的是，所用的发酵培养基为含有60g/L的玉米粉、100g/L的淀粉、50g/L的蔗糖、80g/L的豆油、2g/L的氯化钠、4g/L的碳酸钙、3g/L的磷酸二氢钾和3g/L的硫酸亚铁的培养基。
对比例1
将购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)的商品号为1511C0001ACCC02996的苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)中，在30℃和90转/分振荡下培养至菌密度OD600值为0.6-0.8，得到种子菌液。
将100mL上述种子菌液加入100L发酵培养基中(发酵培养基含有80g/L的玉米粉、80g/L的淀粉、80g/L的蔗糖、40g/L的豆油、3g/L的氯化钠、3g/L的碳酸钙、5g/L的磷酸二氢钾和5g/L的硫酸亚铁)，在30℃下培养，在培养过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至每克培养液中的苍白杆菌的活菌数为109CFU，所得到的培养液即为本对比例的微生物菌剂。
测试实施例1
本测试实施例中，在实验室环境测试实施例1-3和对比例1的微生物菌剂的降解烟碱类农药的效果。
分别配制添加有100mg/L烟碱类农药的LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物和10g/L的NaCl)，其中吡烟碱类农药分别为吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、氯噻啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺。然后测定实施例1-3和对比例1的微生物菌剂的溶磷圈和溶磷量。然后对100mL添加了每一种烟碱类农药的LB培养基中，将实施例1-3和对比例1的微生物菌剂各取0.05g分别加入，30℃培养2天后，高效液相色谱法测量培养基上清中的烟碱类农药的残余量，并计算降解率。结果如表1所示。
表1
根据表1的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)相对于其它苍白杆菌，具有突出的降解烟碱类农药的能力。
测试实施例2
本测试实施例通过土壤培养实验测定实施例1-3和对比例1的微生物菌剂在降解孔雀石绿中的效果。
土壤培养使用的基质土壤购自北京花卉市场的花卉土，土壤有机质含量10.24g/kg、全氮0.561g/kg、全磷1.14g/kg、全钾14.98g/kg、速效氮39.19mg/kg、速效磷16.26mg/kg、速效钾160.07mg/kg、pH6.5。并且，在基质土壤中分别添加烟碱类农药，使得烟碱类农药的含量为100mg/kg，得到实验土壤，其中吡烟碱类农药分别为吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、氯噻啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺。土壤培养盆的试验盆高21cm、上直径20cm、下直径13cm，每盆加土3.8kg，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂0.05kg。将土壤培养盆在20℃下培养，30天后用高效液相色谱法测量土壤培养盆中的烟碱类农药的残余量，并计算降解率。结果如表2所示。
表2
从表2的数据可以看出，本发明的保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium)相对于其它苍白杆菌，具有突出的降解烟碱类农药的能力。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (9)
1.一种中间苍白杆菌，其特征在于：该中间苍白杆菌(Ochrobactrumintermedium)的保藏编号为CGMCC NO.8839。
2.一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，其特征在于：所述菌体为保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于：每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC NO.8839的中间苍白杆菌的活菌数为(5-200)×107CFU。
4.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基包括牛肉膏蛋白胨培养基、肉汤培养基和LB培养基中的至少一种。
5.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述培养基含有40-150g/L的玉米粉、40-150g/L的淀粉、40-150g/L的蔗糖、10-100g/L的豆油、0.5-8g/L的氯化钠、0.5-5g/L的碳酸钙、2-10g/L的磷酸二氢钾和1-10g/L的硫酸亚铁。
6.根据权利要求2或3所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还含有惰性固体载体和粘结剂；所述惰性固体载体包括粘土、二氧化硅、硅藻土、高岭土、凹凸棒土、蒙脱土、膨润土、滑石粉、白碳黑和碳酸钙中的至少一种；所述粘结剂包括麦芽糖和/或糊精。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂中，惰性固体载体的重量百分比为30-90％；所述粘结剂的重量百分比为5-20％。
8.权利要求1所述的中间苍白杆菌或权利要求2-7中任意一项所述的微生物菌剂在降解烟碱类农药中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述烟碱类农药包括吡虫啉、啶虫脒、烯啶虫胺、氯噻啉、噻虫啉、噻虫嗪、噻虫胺和呋虫胺中的至少一种。
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