CN104651284B - 鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法 - Google Patents

鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法 Download PDF

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Abstract

鞘氨醇单胞菌T‑3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。所述鞘氨醇单胞菌株(Sphingomonas sp.)T‑3，保藏号为CGMCC No.10150。该发明方法包括：首先将菌株T‑3活化培养，并接种至种子培养基中，然后将种子液接种至发酵培养基中培养，发酵结束后经蒸馏水稀释，加热，膜分离上清液和菌体沉淀。上清液用盐酸调节pH至3.0左右，得到沉淀用NaOH调至pH中性，烘干得生物多糖。菌体沉淀经烘干后用氯仿抽提，上清经烘干得到聚β羟基丁酸。本发明所用的菌株T‑3在发酵时，胞内大量积累聚β羟基丁酸，同时向培养基中分泌大量生物多糖，所得两种产物可广泛应用于工业，食品，医疗等领域。

Description

鞘氨醇单胞菌T-3及其共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的 方法
技术领域
本发明属于生物技术和生物材料领域，具体涉及利用微生物发酵的方法同时合成生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。
背景技术
鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp)是根据16s rRNA序列，呼吸醌种类和细胞极性脂模式等特征提出的一个新属。区别于其它革兰氏阴性菌的重要特征是其细胞膜中含有鞘糖脂，而无脂多糖。鞘氨醇单胞菌属广泛分布于水体，土壤和空气中。目前，对于鞘氨醇单胞菌属的研究主要集中在该菌属具有降解难降解有机污染物的能力，比如二苯呋喃可被Sphingomonas sp.RW1作为唯一的碳源物质利用；具有合成β胡萝卜素的能力；具有合成一类酸性的荚膜多糖的能力，这些荚膜多糖的结构相似但不尽相同，其统称为鞘氨醇胶。
目前，已经大量生产并广泛应用的鞘氨醇胶主要包括：Sphingomonas elodeaATCC3161合成的结冷胶，Sphingomonas sp.ATCC31555合成的韦兰胶，Sphingomonassp.ATCC53159合成的迪特胶，Sphingomonas sp.ATCC31961合成的鼠李胶等。此类鞘氨醇胶具有相对保守的主链结构，而侧链基团的种类、位置则具有极大的多样性，这使鞘氨醇的结构和功能更加丰富，从而赋予了每一种鞘氨醇胶独特的物理性质。比如没有糖基侧链的结冷胶能形成凝胶，从而在食品、日化和医学上得到了广泛的应用；具有鼠李糖或甘露糖侧链的韦兰胶，能形成耐酸、耐碱、耐高温的高粘度的溶液，具有一个或两个鼠李糖侧链的迪特胶在低浓度条件下即可形成高粘度的溶液，在建筑、钻井、采油等高技术领域应用广泛；随着生物技术的发展，越来越多的可产鞘氨醇胶的菌株被鉴定，而这些新发现的天然聚合物资源在未来的生物胶应用中必将发挥更加重要的作用。
聚β羟基丁酸是微生物在营养不均衡条件下(如碳源过剩、而其它的氮、磷、硫源限制)积累在体内作为其营养和能量储存物质参与细胞代谢的天然产物。而聚β羟基丁酸的生产主要靠优化纯菌株生产条件，重组大肠杆菌过量表达以及活性污泥中微生物菌群合成来得到，目前，可用于生产聚β羟基丁酸的菌属主要有产碱杆菌属，芽孢杆菌属等。聚β羟基丁酸具有良好的生物降解性，其分解产物可全部为生物利用，对环境无污染，是一种可完全分解的热塑性塑料。同时，作为一种生物合成材料，还具有生物相容性、压电性、抗凝血性、密度大、光学活性好和透氧性低等优点，可望在电子、光学、生物医学等高技术领域获得应用。
目前，还没有关于共同生产生物多糖和聚β羟基丁酸的报道。尽管在Sphingomonaselodea ATCC3161发酵结冷胶和Sphingomonas sp.ATCC53159发酵迪特胶的过程中，有少量的聚β羟基丁酸在菌体内产生，但是在生产中，人们却利用化学突变的方法筛选到了不产聚β羟基丁酸的Sphingomonas elodea ATCC3161和Sphingomonas sp.ATCC53159的突变菌株，使其更高效的专一的生产结冷胶和迪特胶。主要原因是因为：首先这两株菌中聚β羟基丁酸的产量较低；其次，结冷胶和迪特胶与聚β羟基丁酸的分离需要经过稀释，膜分离的过程，分离后稀释发酵液中结冷胶和迪特胶的提取需要多倍稀释发酵液体积的乙醇提取，成本很高；同时，少量聚β羟基丁酸的存在影响了结冷胶和迪特胶的特性，限制了结冷胶和迪特胶的应用。
在工业生产中如果有一株能同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的菌株，且两种产物能简单有效的分离，同时具有低成本的提取方法，那么这两种产物的共同发酵则会极大地降低生产成本，减少生物多糖和聚β羟基丁酸单独发酵造成的资源浪费，促进两种产物的工业化生产应用。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株可同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3。
本发明的第二个目的是提供利用鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3发酵同时大量生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法。两种产物分离方法简单，提取成本低，减少了生物多糖和聚β羟基丁酸单独发酵造成的资源浪费，促进两种产物的工业化生产应用。
本发明所提供的菌株Sphingomonas sp.T-3分离自土壤，在固体平板上表现为菌落成圆形凸起，边缘整齐湿润、粘稠、乳白色。革兰氏呈阴性。利用超薄切片技术处理发酵初期和发酵末期的菌株，在投射电镜下可看到生物多糖广泛分布于胞外，而胞内则充满了白色的聚β羟基丁酸颗粒(图1)。根据16S rDNA序列(见序列表)，将其命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3。该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为：CGMCCNo.10150，保藏日期为2014年12月10日。
本发明所述共发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法包括：
(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100或300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至玻璃摇瓶或发酵罐中，30℃，恒定pH 7.2，培养72小时；
(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；
(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；
(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸；
其中：
TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L；
种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L，pH 7.0；
发酵培养基：葡萄糖30～50g/L，豆饼粉0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L，NaNO31～2g/L，pH 7.0。
本发明方法生产的生物多糖具有明显的增稠作用，良好的剪切稀释性能和耐温、耐酸碱和抗盐性能，生物乳化性能以及成凝胶特性，可应用于建筑，食品，医疗，钻井和采油等高技术领域。生产的聚β羟基丁酸作为一种生物可降解材料，可应用于电子、光学和生物医学等高技术领域。
本发明的优点和积极效果：
鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3可同时高效发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸。胞外产物生物多糖与胞内聚合物聚β羟基丁酸的积累均倾向于利用相同的高C/N比的条件。两者分离提取工艺简单、成本较低。分离后的上清液可利用低成本的酸沉法提取，沉淀则用来提取聚β羟基丁酸。因此，共同发酵生物多糖和聚β羟基丁酸可充分利用资源、底物，具有很好的工业价值。
附图说明
图1是鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.T-3发酵初期和发酵末期的超薄切片分析。胞内的白色颗粒为聚β羟基丁酸颗粒，而胞外的纤维状聚合物即为生物多糖。其中A，发酵2h时菌株的透射电镜图；B，发酵72h时菌株的透射电镜图；
图2是Sphingomonas sp.T-3的进化树；
图3是不同培养基配方的产量分析图；
图4是鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.T-3分批发酵的动力学曲线图；
图5聚β羟基丁酸含量与峰面积的标准曲线
图6是生物多糖样品的气相色谱图分析。其中，1指鼠李糖，2指甘露糖，3指葡萄糖，4指内标肌醇六乙酸酯；
图7是1.2％生物多糖凝胶的力-时间曲线图；
图8是不同浓度生物多糖形成凝胶的TPA测试图。具体为硬度、弹性、粘附性、内聚性、胶粘性、咀嚼性及回复性随生物多糖浓度的变化曲线图；
图9是鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.T-3产物聚β羟基丁酸的400M核磁共振氢谱图。
具体实施方式
实施例1、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3的筛选及鉴定
该菌株分离自石油污染的土壤中。
具体实施步骤如下：取1g新鲜土样与9ml灭菌的0.9％的生理盐水震荡混匀，取上清接种至已灭菌的100ml菌株筛选液体培养基中，30℃震荡培养7天富集菌种。然后用0.9％的生理盐水稀释涂布菌液，将10-2,10-3两个梯度分别吸取200μL涂布至筛选培养基的固体平板，30℃静置培养3天后，观察生长菌株的菌落形态。选取菌落大且厚，边缘整齐，似有胞外多糖产生的单菌，经革兰氏染色、16S rDNA基因序列(见序列表)分析以及BIOLOG微生物分类鉴定系统确定该菌株为鞘氨醇单胞菌，命名为Sphingomonas sp.T-3。其进化关系如图2所示。保藏编号为：CGMCC No.10150。
其中：
筛选液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L；
筛选固体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L，琼脂粉15g/L；
实施例2、在摇瓶中共同生产生物多糖和聚β羟基丁酸
(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至含55ml发酵培养基的的玻璃摇瓶中，30℃，恒定pH 7.2，培养72小时；
(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；
(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；
(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸；
其中：
TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L；
种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L，pH 7.0；
发酵培养基：以不同底物量发酵，配方分别为
配方一：葡萄糖30g/L，豆饼粉0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.11g/L，NaNO31g/L，pH7.0。
配方二：葡萄糖30g/L，豆饼粉2g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，NaNO32g/L，pH 7.0。
配方三：葡萄糖40g/L，豆饼粉0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.1g/L，NaNO31g/L，pH7.0。
配方四：葡萄糖40g/L，豆饼粉2g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，NaNO32g/L，pH 7.0。
配方五：葡萄糖50g/L，豆饼粉0.5g/L，K2HPO41g/L，MgSO40.1g/L，NaNO31g/L，pH7.0。
配方六：葡萄糖50g/L，豆饼粉2g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，NaNO32g/L，pH 7.0。
根据以上不同的配方的优化实验，以配方4发酵可得到最高的生物多糖和聚β羟基丁酸产量分别为18.5±1.0g/L和5.7±0.5g/L，而以配方6可得到最低的生物多糖和聚β羟基丁酸产量分别为9.2±2.0g/L和3.5±0.8g/L，每个配方产生的两种产物的量如图3所示。
实施例3：利用5L发酵罐共同生产生物多糖和聚β羟基丁酸
(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至含3.5L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃，恒定pH 7.2，培养72小时；
(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；
(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖，产量为20.7g/L；
(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸，产量为6.5g/L；
其中：
TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L；
种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L，pH 7.0；
发酵培养基：葡萄糖40g/L，豆饼粉2g/L，K2HPO42g/L，MgSO41g/L，NaNO32g/L，pH7.0。
发酵液中葡萄糖含量的测定按照以下方法进行：采用安装有葡萄糖酶膜圈的生物传感分析仪SBA-40C(山东省生物传感器重点实验室)测定发酵液中葡萄糖的含量。在发酵结束后，将发酵液用蒸馏水进行5倍体积的稀释，100℃加热10分钟,离心分离上清和沉淀。上清液用于测定发酵液中葡萄糖的含量。以100mg/dl的葡萄糖作为标准液。不同发酵时期发酵液中残留的葡萄糖含量从40g/L至0g/L不等，具体如图4所示。
发酵液中聚β羟基丁酸含量的测定按照以下方法进行：将不同发酵时期的发酵液离心，将菌体沉淀悬浮在2ml含3％硫酸的色谱甲醇溶液和2ml色谱级氯仿中，将该体系放在10ml的螺口玻璃瓶中，100℃加热4小时，冷却至室温后加入1ml蒸馏水，剧烈震荡10分钟，分离有机氯仿相和上层水相，取1μL有机相用于气相色谱分析。以苯甲酸作为内标。所用仪器为安捷伦6820气相色谱仪。所用色谱条件为：T-1：90℃；T-2：150℃；以8℃/分钟上升至T-2；T-1停留1分钟；T-2停留10分钟。其中7.973分钟位置处为羟基丁酸甲酯，13.322分钟位置处为内标苯甲酸甲酯。
首先选取100，200，300，500，700，900，1100，1300，1500μg的聚β羟基丁酸标准品，各加入500μg的苯甲酸，按照以上方法得到聚β羟基丁酸含量与峰面积的标准曲线(图5)，从而确定发酵液中聚β羟基丁酸的含量。经测定，鞘氨醇单胞菌T-3从12小时时开始产生聚β羟基丁酸，在培养至68小时时，聚β羟基丁酸产量达到最大值为6.5g/L(图4)。
发酵液粘度的测定采用美国Brookfield viscometer DV_II+进行粘度测定，使用64#转子，60转/分钟条件下测定粘度。经测定，在培养至40小时时，发酵液粘度开始增加，培养至72小时时发酵液粘度达到最大值为7.0pa.s(图4)。
实施例4、生物多糖的气相色谱分析及糖醛酸含量测定
生物多糖样品需要经过糖腈乙酸酯衍生化处理。取纯化后的多糖样品5mg放入2的安培瓶中，加入1.52摩尔每升的三氟乙酸，120℃下水解12个小时，去酸后加入10mg盐酸羟胺，7mg的内标肌醇六乙酸酯以及0.5吡啶，90℃加热反应30分钟，加热后冷却至室温，加入0.5乙酸酐，90℃下继续反应30分钟进行乙酰化处理，反应产物则可直接进行气相分析。用同样方法制备葡萄糖、鼠李糖、甘露糖等标准单糖的糖腈乙酸酯衍化产物。
气相色谱分析条件为：HP-5MS石英毛细管色谱柱，载气N2，进样温度280℃，程序升温：120℃保持5分钟，然后10度/分程序升温至250℃，保持5分钟，FDI检测温度为280℃。由标准单糖的保留时间确定鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas sp.T-3产生生物多糖的单糖组成。
取1.0ml的生物多糖溶液，冰浴下加入6.0ml浓硫酸，摇匀后在100℃水浴中保持10分钟，取出冷却至室温，加入0.2ml咔唑液，摇匀后沸水浴10分钟，取出冷却至室温，在518nm处测定吸光度值，以不加多糖的溶液做为对照。
经分析鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3T-3产生的生物多糖主要包含葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸四种单糖组分(图6)。
实施例5、生物多糖的成凝胶特性及其质构分析
配制不同浓度的生物多糖溶液，溶于蒸馏水中，涡旋震荡至充分溶解。将不同浓度的多糖溶液在80～100℃之间加热10～30分钟，冷却至室温，待形成凝胶后，用TPA方法测定生物多糖凝胶的硬度、粘附性、内聚性、弹性、胶粘性、咀嚼性和恢复性。采用英国SMS公司的TA.XT Plus质构仪进行测定，数据采集频率为200pps；p/0.5的12.7厘米的柱形探头；TPA测试的程序为：
测试前速度：2.00mm/sec
测试速度：1.00mm/sec
测试后速度：1.00mm/sec
目标模式：压缩
压缩率：50％
两次压缩时间间隔：1.00sec
触发类型：自动(力)
触发力：5.00g
每项测试重复5次，室温下测定。
经过分析鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3产生生物多糖形成的凝胶具有良好的硬度，弹性，胶粘性，粘附性，回复性，咀嚼性及内聚性。属于弹性凝胶，没有脆性值。且其硬度，粘附性，胶粘性和咀嚼性随着生物多糖凝胶浓度的增加而增大。1.2％生物多糖凝胶的力-时间曲线图如图7所示。不同浓度生物多糖形成凝胶的TPA测试图如图8所示，具体为硬度、弹性、粘附性、内聚性、胶粘性、咀嚼性及回复性随生物多糖浓度的变化曲线图。
实施例6、聚β羟基丁酸的核磁分析
将发酵后获得的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸。称取20mg的聚β羟基丁酸产物溶于500微升的氘代氯仿溶剂中，利用400M核磁共振波谱仪确定其结构式。经过分析鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.T-3产生的聚酯类化合物确定为具有典型的甲基、亚甲基和次甲基基团的聚β羟基丁酸(图9)。

Claims (3)

1.一种鞘氨醇单胞菌T-3发酵生产生物多糖和聚β羟基丁酸的方法，具体方法为：
(1)将鞘氨醇单胞菌T-3单菌落接种至5ml的TPG液体培养基中，30℃振荡培养24小时；
(2)将步骤(1)制得的培养液以1％的接种量接种至100或300ml的种子培养基中，30℃振荡培养24小时；
(3)以10％的接种量将步骤(2)制得的种子液接种至玻璃摇瓶或发酵罐中，30℃，恒定pH 7.2，培养72小时；
(4)将步骤(3)的发酵液用蒸馏水至少5倍体积稀释，90～105℃加热15分钟，膜分离发酵液和菌体沉淀；
(5)将步骤(4)中膜分离后的上清液用稀盐酸调节pH至3.0得到果冻状沉淀，沉淀经NaOH调节至pH中性，将调节至pH中性的沉淀烘干得到生物多糖；
(6)将步骤(4)中的菌体沉淀经烘干后研磨成粉末，加氯仿抽提，低速离心5分钟，上清液经60℃烘干除去氯仿，得到聚β羟基丁酸；
其中：
TPG液体培养基：葡萄糖10g/L,蛋白胨5g/L，酵母粉3g/L，牛肉浸粉3g/L；
种子培养基：蔗糖10g/L，蛋白胨2.5g/L，酵母粉1.5g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO40.1g/L，pH7.0；
发酵培养基：葡萄糖30～50g/L，豆饼粉0.5～2g/L，K2HPO41～2g/L，MgSO40.1～1g/L，NaNO31～2g/L，pH 7.0；
所述鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)T-3的保藏号为CGMCC No.10150，保藏日期为2014年12月10日。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法产生的生物多糖具有明显的增稠作用，良好的剪切稀释性能和耐温、耐酸碱和抗盐性能，生物乳化性能以及成凝胶特性，可应用于建筑，食品，医疗，钻井和采油高技术领域。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法产生的聚β羟基丁酸作为一种生物可降解材料，可应用于电子、光学和生物医学高技术领域。
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