CN106977618B - 一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法 - Google Patents

一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于发酵产物的提取，特别是指一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法。包括发酵液预处理、一次萃取、一次离心、二次萃取、二次离心、三次洗脱等工艺步骤，本发明解决了现有定优胶后提取工艺所存在的制备的定优胶产品纯度及黏度低等技术问题，具有工艺周期短、易于控制、生产成本低、产品的纯度及黏度等性能指标明显优于现有产品等优点。

Description

一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法
技术领域
本发明属于发酵产物的提取，特别是指一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法。
背景技术
定优胶是继黄原胶、结冷胶、温轮胶后的一种新型微生物多糖，是由微生物发酵生成的水溶性生物聚合物，具有优良的增稠性、假塑性、耐高温、耐高盐及较宽范围的pH适应性等优良特性，可广泛用于石油、建材等行业，应用前景广阔。
现有利用微生物发酵生产定优胶的工艺包括发酵和后提取两部分。申请人在专利号为201410541800.4的发明专利中公开了一种鞘氨醇单胞菌以及利用其制取定优胶发酵液的方法，其主要技术构思是生产菌种选用鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)，将菌种接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中进行需氧发酵制取含有定优胶的发酵液，然后将含有定优胶的发酵液进行后提取，提取步骤通常借鉴黄原胶的后提取工艺，其主要技术路线包括：一是将定优胶发酵液与乙醇进行混合，使定优胶在混合液中形成絮状物料，二是采用板框过滤的方法进行固液分离，固体物料再经干燥机干燥、粉碎机粉碎制得定优胶成品。
就申请人了解的范围而言，定优胶目前在国外的主要生产厂家有美国的Kelco公司，国内尚无可进行规模化工业生产的厂家，定优胶作为增稠剂在性能上要求产品的粘度越高越好，但定优胶在发酵生产中由于发酵液黏度大，残存在提取后的产品中的微生物菌体、以及营养物质如蛋白等不易去除的原因，导致成品定优胶纯度难于进一步提高，上述因素直接影响定优胶产品黏度。美国的产品质量1％KCL黏度一般在2000-3000cp，纯度不超过95％。申请人未在国内专利文献中检索到有关改进定优胶后提取工艺以提高产品黏度及纯度的文献报道。
因目前尚无国家标准及行业标准对定优胶的性能指标进行限定，而定优胶和黄原胶属于性能相近的微生物多糖，因此本领域技术人员一般借鉴《食品添加剂黄原胶》(GB1886.41-2015)的黏度评价方法对定优胶成品黏度性能进行检测。而由于《食品添加剂黄原胶》(GB1886.41-2015)未见对其纯度有规范的检测方法，因此本领域技术人员一般借鉴《食品添加剂结冷胶》(GB25535-2010)中结冷胶含量的检测方法对定优胶的纯度进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供从定优胶发酵液中提取定优胶的方法，所制备的定优胶具有纯度及黏度高等优点。
本发明的整体技术构思是：
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为100-200ppm，搅拌均匀后维持反应3-5小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至130℃-140℃维持5-8分钟再降至60-70℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为200-400ppm，在pH＝3-4、温度为50℃-60℃条件下，反应2-4小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5-0.6的比例将二者混配后搅拌30-40分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.3-0.5的比例将二者混配后搅拌30-35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4-0.6的比例将二者混配后搅拌30-35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
本发明的具体技术构思还有：
为便于定优胶的储存及稳定性，保证产品的品质，所述的步骤F后还包括一步骤G，是将步骤F中制成的纤维状定优胶在70℃-90℃条件下干燥。
为便于定优胶的分装运输，同时满足其在应用中能够快速分散于水中，所述的步骤G后还包括一步骤H,是将步骤G中得到的干燥物粉碎，粉碎温度不超过65℃，目数80-100目。
可以显而易见的是，固液分离可以采用多种现有工艺进行，其中包括但不局限于板框过滤、离心等，为实现工业化生产的连续性，同时提高工作效率，优选的技术实现方式是，所述的步骤C、E、F中的固液分离采用离心方法,离心在转速为3000-5000转/分的条件下进行。
申请人对利用本发明的方法得到的产品(定优胶)进行了如下实验：
一、1％KCL黏度的检测
1、仪器和设备：Brook field旋转或其他同性能黏度计
2、测定条件：转子型号为3号转子
转子速度为60rpm
测定温度为24-25℃
3、分析步骤
(1)用洁净、干燥的称量纸分别称取3g定优胶样品和氯化钾(精确至0.01g)，混合均匀；量取300ml蒸馏水倒入400ml烧杯中；将该盛水的烧杯置于搅拌器下，开启搅拌器，将混合好的试样慢慢向搅拌叶与杯壁之间的水中加入，并开始计时，800r/min连续搅拌2h，温度保持24-25℃；停止搅拌，取出杯子，用搅拌棒或其他类似物上下翻动溶液几下；取适量的含有1％试样和1％氯化钾的溶液，置于100ml高型烧杯中在规定条件下测定。
检测结果为：采用本发明的后提取方法制备的定优胶的黏度(1％的KCL黏度)为4000-5000cp。
二、纯度的检测
1、试剂和材料
a)硅藻土：色谱纯
b)无水乙醇
c)乙醇溶液：78+22
2、仪器和设备
a)玻璃过滤器
b)干燥器(180mm)
3、分析步骤
称取1.0g色谱纯的硅藻土，置于一个玻璃过滤器中，均匀铺平，105℃下干燥5h，在干燥器内冷却后准确称量。称取约0.2g干燥后(105℃,2.5h)的定优胶试样(精确到0.001g)，加50mL水，在约80℃水浴锅中搅拌溶解30min，加入200ml预先加热至60-70℃的无水乙醇，混合均匀，静置12h，用上述装有硅藻土的玻璃过滤器过滤，然后用乙醇溶液洗涤滤渣5次，前3次每次洗涤用量20ml，后2次每次洗涤用量10mL。在105℃下将滤渣干燥5h，在干燥器内冷却后准确称量。
4、结果计算
定优胶的含量X1按公式(A.1)计算：
X1＝m1/m0×100％……………(A.1)
式中：
X1―定优胶的含量，％；
m1―残渣的质量，单位为克(g)；
m0―试样的质量：单位为克(g)；
检测结果为：采用本发明的后提取方法制备的定优胶纯度不低于98％。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明通过酶解的方式去除产品中残存的微生物菌体及蛋白等营养物质，因酶解反应速度快、条件温和、效果好且成本低，因此后提取工艺周期短、易于控制且生产成本低。
2、利用在充分研究发酵液中杂质成分的基础上，科学采用溶菌酶水解细菌细胞壁的肽聚糖，将菌体水解；利用蛋白酶能有效的将发酵液中残存的蛋白等水解成小分子可溶物，采用乙醇萃取时将水解后的产物随着萃取剂带出，从而使萃取后的定优胶物料含菌体和残存的杂质少，有效提高了产品的纯度及黏度等技术指标，所制备的产品的纯度及黏度指标明显优于国外产品，从而进一步提高了产品的品质性能及经济价值，更为有利于其作为增稠剂的工业化应用。
3、在对发酵液中的菌体、蛋白采用充分酶解预处理的基础上，通过采用两次萃取、三次洗脱的工艺步骤，将酶解后的可溶杂质溶于乙醇溶液并随着固液分离时去除，有效提高了定优胶的纯度及黏度。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为100ppm，搅拌均匀后维持反应5小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至130℃维持8分钟再降至60℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为200ppm，在pH＝3-4、温度为50℃条件下，反应4小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例将二者混配后搅拌30分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.3的比例将二者混配后搅拌30分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4的比例将二者混配后搅拌30分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
G、将步骤F中制成的纤维状定优胶在70℃-90℃条件下干燥。
H、是将步骤G中得到的干燥物粉碎，粉碎温度不超过65℃，目数80-100目。
所述的步骤C、E、F中的固液分离采用离心方法,离心在转速为3000-5000转/分的条件下进行。
因定优胶的发酵以及发酵液的获得申请人在专利号为201410541800.4的专利文献中已有详细的记载，在此申请人对其不再赘述。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于:
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为200ppm，搅拌均匀后维持反应3小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至140℃维持5分钟再降至70℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为400ppm，在pH＝3-4、温度为60℃条件下，反应2小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.6的比例将二者混配后搅拌40分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例将二者混配后搅拌35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.6的比例将二者混配后搅拌35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
其余条件同实施例1。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于:
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为150ppm，搅拌均匀后维持反应4小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至135℃维持7分钟再降至65℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为300ppm，在pH＝3-4、温度为55℃条件下，反应3小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.55的比例将二者混配后搅拌35分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.4的比例将二者混配后搅拌32分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例将二者混配后搅拌32分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
其余条件同实施例1。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于:
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为130ppm，搅拌均匀后维持反应4.5小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至133℃维持6分钟再降至62℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为250ppm，在pH＝3-4、温度为52℃条件下，反应3.5小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.5的比例将二者混配后搅拌38分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.35的比例将二者混配后搅拌33分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.45的比例将二者混配后搅拌33分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
其余条件同实施例1。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于:
一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在发酵液中的浓度为180ppm，搅拌均匀后维持反应3.5小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至138℃维持6分钟再降至68℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为350ppm，在pH＝3-4、温度为58℃条件下，反应2.5小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：按照预处理后的发酵液：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.58的比例将二者混配后搅拌32分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：按照步骤C中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.45的比例将二者混配后搅拌34分钟，调混合液的pH值为6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：按照步骤E中制成的纤维状定优胶：体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1：0.55的比例将二者混配后搅拌32分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶。
其余条件同实施例1。
申请人采用本发明中公开的的检测方法对利用实施例1-5中的方法所制备的定优胶、先有后提取工艺制备的定优胶以及国外定优胶产品(购自Kelco公司)的黏度及纯度进行了检测，结果如表一。
表一
Figure BDA0001268552810000091
Figure BDA0001268552810000101
从检测结果可以看出，采用本发明的方法所制备的定优胶产品纯度及1％KCL黏度性能指标明显优于现有后提取工艺所制备的产品及国外产品。

Claims (1)

1.一种从定优胶发酵液中提取定优胶的方法,是将发酵液离心、萃取后从中提取定优胶；其特征在于，所述方法包括如下工艺步骤：
A、发酵液预处理：
A1、将含有定优胶的发酵液在pH＝6-8时加入酶活为10万u/g的溶菌酶，溶菌酶在 发酵液中的浓度为200ppm，搅拌均匀后维持反应3小时；
A2、将步骤A1中反应后的发酵液升温至140℃维持5分钟再降至70℃，加入酶活力50000u/g的酸性蛋白酶，酸性蛋白酶在发酵液中的浓度为400ppm，在pH＝3-4、温度为60℃条件下，反应2小时制成预处理后的发酵液；
B、一次萃取：
按照预处理后的发酵液:体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1:0.6 的比例将二者混配后搅拌40分钟，调混合液的pH＝8.0-9.5，使定优胶呈絮状沉淀；
C、一次离心：
将步骤B中的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
D、二次萃取：
按照步骤C中制成的纤维状定优胶:体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1:0.5的比例将二者混配后搅拌35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀；
E、二次离心：
将步骤D中制成的混合液固液分离，得到纤维状定优胶；
F、三次洗脱：
按照步骤E中制成的纤维状定优胶:体积百分比不低于85％的乙醇溶液＝1:0.6的比例将二者混配后搅拌35分钟，调混合液的pH值为6.0-6.5，使定优胶呈絮状沉淀，将混合液固液分离得到纤维状定优胶；
G、将步骤F中制成的纤维状定优胶在70℃-90℃条件下干燥；
H、将步骤G中得到的干燥物粉碎，粉碎温度不超过65℃，目数80-100目；
其中，
所述的步骤C、E、F中的固液分离采用离心方法，离心在转速为3000-5000转/分的条件下进行；
所制备的定优胶产品纯度及1％KCL黏度性能指标如下：
1％KCL黏度为3750cp；
纯度97.5%；
其中，测定条件如下：
转子型号为3号转子；
转子速度为60rpm；
测定温度为24-25℃。
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