CN108841882B - 一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法 - Google Patents

一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于固体废弃物资源化利用和氨基酸生产领域，公开了一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备菌体蛋白水解液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备聚谷氨酸。通过水解谷氨酸发酵废弃菌体将其开发为蛋白质水解液，为聚谷氨酸的生产找到了廉价氮源，大大降低了生产成本，提高了企业利润，为聚谷氨酸的规模化应用创造了条件。

Description

一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于固体废弃物资源化利用和氨基酸生产领域，具体涉及一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法。
背景技术
谷氨酸发酵废菌体是味精生产过程中的副产品，是提取精制味精过程中经分离得到的单细胞蛋白，每年产量可达上百万吨。为了节约资源，目前大多数味精生产企业将谷氨酸菌体蛋白作为饲料出售，虽然取得了一定的经济效益，但是还没有完全挖掘出其应用价值。通过对菌体蛋白进行营养成分分析发现其蛋白质含量丰富，氨基酸组份齐全，并含有丰富的维生素、核酸、多糖等。因此，将谷氨酸菌体蛋白作为原料探索并开发出具有更高价值的副产品意义重大。目前这方面的研究主要集中于将菌体蛋白开发为动物饲料、生物肥料、调味品、提取寡肽、提取核酸等。
γ-聚谷氨酸是一种经微生物发酵合成的水溶性高分子材料，由L-谷氨酸和D-谷氨酸经γ-酰胺键聚合而成，分子量在100k-10000kDa之间。由于其对环境无污染，具有极好的生物可降解性、成膜性、成纤维性、保水性等特殊的理化性质，因此被广泛应用到医药、农业、环境保护、化妆品、食品等行业。
本发明以谷氨酸菌体蛋白为原料，利用化学串联生物处理，将其开发为蛋白质水解液，替代正常发酵产γ-聚谷氨酸过程中的氮源，为味精生产企业开辟出一条菌体蛋白利用的新途径，同时降低生产γ-聚谷氨酸过程中的原材料成本。
发明内容
本发明的目的是提高谷氨酸发酵废弃菌体的利用价值，并且解决现有聚谷氨酸发酵培养基成本较高以及发酵效率低的缺陷，提供了一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备菌体蛋白水解液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备聚谷氨酸。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）制备菌体蛋白水解液：利用微生物发酵制得的谷氨酸发酵液，离心收集发酵废弃菌体，添加相同重量的水，搅拌均匀，配制菌体悬浮液，再置于反应罐中, 加入盐酸，料液比为1:（0.3-0.5），在110℃下搅拌水解12-18小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氢氧化钠调节溶液的pH为4.0，加入酸性蛋白酶水解，温度为55℃，300转/min搅拌8-12h，即得菌体蛋白水解液；
步骤2）制备发酵培养基：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖 60g·L -1，谷氨酸钠60 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1，CaCl2 1.0 g·L-1，KH2PO40.75 g·L-1，酵母膏 40 g·L-1；计算酵母膏总氮，按照总氮相等的原则，将步骤1）制得的菌体蛋白水解液替代酵母膏，用作培养基的氮源，搅拌均匀后，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，制得发酵培养基；
步骤3）发酵制备聚谷氨酸：常规培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.2108获得枯草芽孢杆菌种子液，常规培养地衣芽孢杆菌CGMCC No.4156获得地衣芽孢杆菌种子液，将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液混合得到混合种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，35-37℃，连续发酵48-72小时，得到聚谷氨酸发酵液。
优选地，所述步骤2）制备发酵培养基，包括如下步骤：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖 60g·L -1，谷氨酸钠60 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1，CaCl2 1.0 g·L-1，KH2PO4 0.75 g·L-1，酵母膏 40 g·L-1；计算酵母膏总氮，按照总氮相等的原则，将步骤1）制得的菌体蛋白水解液替代50%的酵母膏，用作培养基的氮源，搅拌均匀后，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。
优选地，所述盐酸的浓度为3mol/L。
优选地，所述枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液的浓度均为1×108cfu/ml。
优选地，所述酸性蛋白酶的酶活力为5万U/g。
优选地，所述枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1-2:1的体积比混合得到混合种子液。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明以直接水解废弃菌体后的水解液作为发酵氮源，既包含大分子有机氮，也含有小分子的氨基酸态氮，可作为微生物发酵养料。
通过水解谷氨酸发酵废弃菌体将其开发为蛋白质水解液，为聚谷氨酸的生产找到了廉价氮源，大大降低了生产成本，提高了企业利润，为聚谷氨酸的规模化应用创造了条件。
本发明通过两种菌株混合发酵，优于单一菌株发酵方式，两种菌株协同性能好，发酵产聚谷氨酸效率大大提高。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备菌体蛋白水解液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备聚谷氨酸。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）制备菌体蛋白水解液：利用微生物发酵制得的谷氨酸发酵液，离心收集发酵废弃菌体，添加相同重量的水，搅拌均匀，配制菌体悬浮液，再置于反应罐中, 加入3mol/L的盐酸，料液比（v/v）为1: 0.5，在110℃下搅拌水解12小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氢氧化钠调节溶液的pH为4.0，加入酸性蛋白酶（5万U/g）水解，酶和底物的质量比例为2.5:100，温度为55℃，300转/min搅拌8h，即得菌体蛋白水解液；水解效果如表1所示。
表1化学串联生物处理菌体蛋白效果
Figure 221934DEST_PATH_IMAGE001
步骤2）制备发酵培养基：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖 60g·L -1，谷氨酸钠60 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1，CaCl2 1.0 g·L-1，KH2PO40.75 g·L-1，酵母膏 40 g·L-1；计算酵母膏总氮，按照总氮相等的原则，将步骤1）制得的菌体蛋白水解液替代酵母膏，用作培养基的氮源，搅拌均匀后，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。
步骤3）发酵制备聚谷氨酸：常规培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.2108获得枯草芽孢杆菌种子液（浓度为1×108cfu/ml），常规培养地衣芽孢杆菌CGMCC No.4156获得地衣芽孢杆菌种子液（浓度为1×108cfu/ml），将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合，按照10％的接种量接入发酵培养基中，连续发酵48小时，得到聚谷氨酸发酵液。发酵过程中的温度控制在37℃，pH控制在7.0，控制葡萄糖浓度不低于20g/L。
取发酵液m 0 ，调节pH为3左右，离心取上清液，加入4倍体积酒精，取沉淀，加入无水乙醇脱水，倒去酒精，取沉淀在60 ℃烘箱中烘干，用精密天平称量烘干物m 1 ，粉碎过100目筛，取过筛后固体m 2 于水解管中水解，水解完成后使用氨基酸自动分析仪检测谷氨酸含量m 3 ，产胶率和纯度计算公式如下：
Figure 279889DEST_PATH_IMAGE002
实施例2
种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）制备菌体蛋白水解液，步骤2）制备发酵培养基，步骤3）发酵制备聚谷氨酸。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1）制备菌体蛋白水解液：利用微生物发酵制得的谷氨酸发酵液，离心收集发酵废弃菌体，添加相同重量的水，搅拌均匀，配制菌体悬浮液，再置于反应罐中, 加入3mol/L的盐酸，料液比（v/v）为1:0.4，在110℃下搅拌水解18小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氢氧化钠调节溶液的pH为4.0，加入酸性蛋白酶（5万U/g）水解，酶和底物的质量比例为2:100，温度为55℃，300转/min搅拌12h，即得菌体蛋白水解液；水解效果如表2所示。
表2化学串联生物处理菌体蛋白效果
Figure 683188DEST_PATH_IMAGE003
步骤2）制备发酵培养基：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖 60g·L -1，谷氨酸钠60 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1，CaCl2 1.0 g·L-1，KH2PO40.75 g·L-1，酵母膏 40 g·L-1；计算酵母膏总氮，按照总氮相等的原则，将步骤1）制得的菌体蛋白水解液替代酵母膏，用作培养基的氮源，搅拌均匀后，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。
步骤3）发酵制备聚谷氨酸：常规培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.2108获得枯草芽孢杆菌种子液（浓度为1×108cfu/ml），常规培养地衣芽孢杆菌CGMCC No.4156获得地衣芽孢杆菌种子液（浓度为1×108cfu/ml），将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照2:1的体积比混合，按照10％的接种量接入发酵培养基中，35℃，连续发酵72小时，得到聚谷氨酸发酵液。
实施例3
本发明菌体水解液替代酵母膏发酵产聚谷氨酸试验：
以实施例1为例，采用步骤1）的方式制得菌体蛋白水解液，按照总氮相等的原则替代不同比例的酵母膏，其余与步骤2）的方法相同，按照步骤3）的方法发酵制备聚谷氨酸。具体实验结果如表3所示。
表3 水解液替代酵母膏发酵产聚谷氨酸
Figure 505913DEST_PATH_IMAGE004
结论：
1）菌体蛋白水解的最佳工艺条件为盐酸浓度3mol·L-1，温度110 ℃，时间12 h，料液比1:0.5，处理完后调节pH值使用酸性蛋白酶酶解，酶底比为2.5%，酶解时间为8 h，温度为55 ℃，pH为4，蛋白质水解度达到47.18%，溶解度达到94.09%。
2）水解液完全替代酵母膏时聚谷氨酸产量可以达到正常酵母膏作为氮源时产量的76.7%。部分替代时，使用50%酵母膏与水解液的组合可以达到正常培养基聚谷氨酸的产量的116%。实验室发酵实验表明，经过处理后的菌体蛋白水解液可以用作发酵过程中的氮源。
实施例4
菌株协同发酵：
以实施例1为实验组，对照组1为：采用枯草芽孢杆菌单一菌株发酵方式；对照组2：采用地衣芽孢杆菌单一菌株发酵方式。上述组别的发酵培养基氮源均采用：50%酵母膏+水解液。具体发酵效率见表4：
表4
Figure 119297DEST_PATH_IMAGE005
结论：
如表4所示，与单一菌株发酵方式的对照组1和对照组2相比，本发明采用两种菌株混合发酵，不产生拮抗，协同性能好，发酵产聚谷氨酸产量大大提高，分别比对照组1和对照组2提高了40.56%和63.50%。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种利用谷氨酸发酵废弃菌体发酵生产聚谷氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1）制备菌体蛋白水解液：利用微生物发酵制得的谷氨酸发酵液，离心收集发酵废弃菌体，添加相同重量的水，搅拌均匀，配制菌体悬浮液，再置于反应罐中, 加入3mol/L盐酸，料液比为1: 0.5，在110℃下搅拌水解12小时，搅拌速度为300转/min，反应终止后用氢氧化钠调节溶液的pH为4.0，加入酸性蛋白酶水解，酶和底物的质量比例为2.5:100，温度为55℃，300转/min搅拌8-12h，即得菌体蛋白水解液；
所述酸性蛋白酶的酶活力为5万U/g；
步骤2）制备发酵培养基：取发酵培养基原料，按照以下浓度配制，葡萄糖 60g·L -1，谷氨酸钠60 g·L-1，NaCl 10 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1，CaCl2 1.0 g·L-1，KH2PO40.75 g·L-1，酵母膏 40 g·L-1；计算酵母膏总氮，按照总氮相等的原则，将步骤1）制得的菌体蛋白水解液替代部分酵母膏，用作培养基的氮源，搅拌均匀后，调节pH为7.0，121℃灭菌20min，制得发酵培养基；
步骤3）发酵制备聚谷氨酸：常规培养枯草芽孢杆菌CGMCC No.2108获得枯草芽孢杆菌种子液，常规培养地衣芽孢杆菌CGMCC No.4156获得地衣芽孢杆菌种子液，将枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液按照1:1的体积比混合得到混合种子液，再按照10％的接种量接入发酵培养基中，37℃，连续发酵48小时，得到聚谷氨酸发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液的浓度均为1×108cfu/ml。
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