CN104404109A - 一种酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的方法 - Google Patents

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李剑芳
赵梅
唐诗涵
邬敏辰
王春娟
董运海
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Abstract

本发明提供了一种酶法结合超滤工艺从魔芋精粉中制备低聚甘露糖的方法。利用重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)对魔芋精粉进行酶解得到低聚甘露糖。该方法所用关键酶的催化活力较高，酶的生产和使用成本较低，生产周期短，无污染，纯化、分离步骤简便，极大地提高魔芋精粉的附加值，为进一步精制低聚甘露糖奠定理论基础，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。

Description

一种酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的方法
技术领域
本发明涉及一种利用生物酶水解魔芋精粉制备低聚甘露糖的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
低聚甘露糖(Mannooligosaccharide，MOS)是由2～10个单糖分子通过β-1,4或β-1,3糖苷键连接而形成的低聚糖，主要通过嗜碱性芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等细菌产生的β-甘露聚糖酶水解甘露聚糖(从魔芋、角豆胶及瓜尔豆胶等植物中提取)制得。研究表明，低聚甘露糖可有效促进双歧杆菌、乳酸杆菌等肠道有益菌群的特异性增殖，降低肠道pH以抑制有害菌的生长；并可以通过提高肠粘膜局部免疫力、增强动物非特异性免疫、促进肝脏分泌甘露糖结合蛋白来增强机体免疫力；还具有改善血清脂质、降低胆固醇和三酸甘油酯含量、不增加血糖浓度等特点，是新一代功能性食品。
魔芋是广泛分布在我国云南、四川、贵州等地区的特有经济作物，目前在国内主要作为一种粗纤维食物或食品添加剂使用。魔芋的主要成分是由葡萄糖和甘露糖残基组成的葡甘露聚糖(glucomannan)，其基本化学结构是由葡萄糖和甘露糖按一定的摩尔比以β-1,4糖苷键相结合形成主链，在主链的甘露糖C-3的位置上以β-1,3糖苷键形成分支。利用酶法水解魔芋制成的低聚葡甘露糖，可极大拓宽魔芋的应用范围，大幅度提高原料的附加值，具有重大的经济效益和社会效益。目前低聚甘露糖的制备通常都是利用高温水解、酸水解或者碱水解，酶法水解虽然也有报道，但条件还不够成熟。酶法生产低聚甘露糖主要受制于生产所用的关键酶的催化效率较低、酶的生产和使用成本较高，以及底物的粘度过大难以实现高浓度的生产等。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法结合超滤工艺从魔芋精粉中制备低聚甘露糖的方法，具有酶活力高、周期短、操作简易及纯化、分离步骤简便等特点，为低聚甘露糖的酶法生产及精制奠定理论基础。
本发明的技术方案：以底物魔芋精粉的水解率为指标，通过研究酶液添加量、酶解温度、底物浓度及酶解时间四个因素对魔芋精粉水解率的影响，确定酶法制备低聚甘露糖的最佳酶解条件。在优化条件下利用重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)对魔芋精粉进行酶法水解，测定魔芋精粉中总糖含量及其释放的还原糖含量。酶解液经灭活、冷却、离心、过0.45μm水膜后移至超滤装置，收集超滤透过液并浓缩冻干。溶解冻干粉至所需浓度，利用高效液相色谱(HPLC)检测酶解产物的组分构成。
所涉及到的具有表达重组β-甘露聚糖酶(reAuMan26A)能力的工程菌株GS115/Auman26A(专利申请号：CN201310666414.3)由本实验室构建保存。
所述的魔芋精粉总糖含量的测定方法：
采用DNS试剂法测定魔芋精粉中魔芋甘露聚糖(KGM)总糖含量，该总糖仅指KGM粗提液被酸完全水解后所有还原糖之和(本发明中所有还原糖均以甘露糖计)。
所述的魔芋精粉酶法水解条件的初步研究：
本发明中分别对影响魔芋精粉酶法水解的4个因素(酶液添加量、酶解温度、底物浓度和酶解时间)进行单因素实验，每确定一因素将作为下一单因素实验的固定条件，最终获得的最佳条件用于低聚甘露糖的制备研究。
所述的魔芋精粉水解产物的色谱分析：
本发明利用高效液相色谱(HPLC)对酶解产物进行分析，色谱条件：色谱柱Sugarparl(6.5mmid×300mm)，柱温85℃，流速0.4mL·min-1，进样量为10μL，流动相：纯水，检测器：示差折光。根据保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。
本发明的有益效果：本发明提供了一种酶法结合超滤法制备低聚甘露糖的工艺。该方法所用关键酶的催化活力较高，酶的生产和使用成本较低，纯化、分离步骤简便，生产周期短，有较大的工业化生产、应用潜力和经济价值。
附图说明
图1：魔芋精粉酶解产物组分的HPLC色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
实施例1魔芋精粉总糖含量的测定方法
总糖是指样品被酸完全水解后所有还原性单糖之和。测定方法：准确称取0.2g魔芋精粉，置于25mL具塞试管内，依次加入去离子水10mL和0.5mL H2SO4，于100℃水解2h，冷却后用NaOH溶液中和。将中和液转移并定容至100mL，滤纸过滤，取清液1mL用DNS法测定还原糖(以甘露糖计)量，计算总糖量取上清液1mL用DNS法测定还原糖的量，计算出魔芋精粉中KGM的总糖含量为87.1％。
实施例2魔芋精粉酶法水解条件的初步研究
(1)酶液添加量：以去离子水构建反应体系在45℃条件下，分别用不同的酶量(30～80U·g-1魔芋)将20g·L-1的魔芋精粉溶液水解4h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示随着酶液添加量的增加，魔芋精粉的水解率逐渐增加，当酶液添加量达到60U·g-1魔芋精粉时，最高水解率为40.5％，后逐渐降低。
(2)酶解温度：以去离子水构建反应体系在不同温度下(30～50℃)，分别用60U·g-1魔芋精粉的酶液添加量将20g·L-1的魔芋精粉溶液水解4h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示魔芋精粉的水解率随温度升高而升高，当水解温度为40℃时，魔芋精粉的水解率最高可达41.4％；温度高于50℃时，酶解能力迅速下降。
(3)底物浓度：以去离子水配制不同质量浓度的魔芋精粉(5～60g·L-1)作为研究对象，分别用60U·g-1魔芋精粉的酶液添加量在40℃下水解4h，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。随着魔芋精粉浓度的增加，其水解率逐渐增加，在质量浓度为30g·L-1时，魔芋精粉水解率最高为42.7％，随后魔芋精粉的水解率明显下降。
(4)酶解时间：以去离子水构建反应体系在40℃条件下，用60U·g-1魔芋精粉的酶液添加量将30g·L-1的魔芋胶溶液水解不同的时间(3～10h)，然后用DNS法测定水解产物中还原糖的含量并计算魔芋精粉的水解率。结果显示随着酶解时间的延长，魔芋精粉的水解率逐渐增加，当酶解时间达到6h时，水解率最高可达60.1％，后趋于平缓。
实施例3超滤法制备魔芋精粉低聚甘露糖
以优化过的反应条件进行酶解反应，反应完毕在沸水中将酶灭活、冷却，酶解液离心过0.45μm水膜后移至超滤装置，在0.2MPa的压力下使用截留分子量为2000kDa的超滤膜进行超滤，截取分子量<2000左右的低聚糖，收集超滤透过液。旋转蒸发仪浓缩糖液后冻干，取样用于高效液相色谱(HPLC)检测酶解产物的组分构成。
实施例4魔芋精粉水解产物组分分析
称取低聚甘露糖冻干粉末溶解到浓度为4mg·mL-1，用HPLC检测酶解产物中组分的含量及组成。色谱条件：色谱柱Sugarparl(6.5mmid×300mm)，柱温85℃，流速0.4mL·min-1，进样量为10μL，流动相：纯水，检测器：示差折光。根据MOS保留时间定性，色谱峰面积归一化法定量。结果如图1所示，比较图中出峰的保留时间可知，各种糖是按照相对分子质量从小到大规律出峰，HPLC色谱图中自左向右分别是低聚甘露糖、葡萄糖和甘露糖。其中单糖含量占9.83％，二糖以上的甘露低聚糖占90.17％。

Claims (2)

1.利用实验室自主构建的毕赤酵母工程菌GS115/Auman26A所产生的β-甘露聚糖酶对魔芋精粉进行水解制备低聚甘露糖。
2.酶法结合超滤工艺制备低聚甘露糖：以底物魔芋精粉的水解率为指标，通过单因素试验确定酶法制备低聚甘露糖的酶解条件；优化条件如下：加酶量60U·g-1魔芋精粉，酶解温度40℃，魔芋精粉质量分数30g·L-1，酶解时间5h；以优化过的反应条件进行酶解反应，反应完毕在沸水中将酶灭活、冷却，酶解液离心过0.45μm水膜后移至超滤装置，在0.2MPa的压力下使用截留分子量为2000kDa的超滤膜进行超滤，截取分子量<2000左右的低聚糖。
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