CN102373256B - 酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种酶解含甘露聚糖的半纤维素，制备高纯度的甘露低聚糖方法及产品，它是利用保藏号为CCTCC No:M 211147枯草芽孢杆菌TQBm发酵产出的高效能β-甘露聚糖酶BM—Ⅱ，将魔芋胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、田菁胶等含甘露聚糖的半纤维素水解成相对小分子物质，然后经离心分离，絮凝澄清，离子交换技术脱盐、脱色、脱味，再用超滤技术和分子筛层析技术相结合分离糖液中的大分子物质，最后经浓缩、干燥，制备出高纯度甘露低聚糖。用本发明制备出高纯度甘露低聚糖，不仅操作简单，分离效果好，而且成本低，无化学污染，可实现工业化生产。本发明的甘露聚糖产品可极显著增殖人体肠道双歧杆菌等有益菌，极显著减少肠杆菌等有害菌，还具有降血糖、血脂及免疫调节作用，是胃肠道健康、降糖降脂、免疫调节、抗病防病药物的新型原料和助剂。
Description
技术领域
本发明涉及酶技术和生物化工技术，更确切说是一种酶解含甘露聚糖的半纤维素生成纯度高达98%（P98）的甘露低聚糖的制备方法及产品，是胃肠道健康、免疫调节、抗病防病药物的新型原料和助剂。
背景技术
半纤维素(Hemicellulose)是指在植物细胞壁中与纤维素共生、可溶于碱溶液，遇酸后远较纤维素易于水解的那部分植物多糖。半纤维素主要分为三类，即聚木糖类、聚葡萄甘露糖类和聚半乳糖葡萄甘露糖类。本发明所涉及到的半纤维素是聚葡萄甘露糖类（代表产品是魔芋胶）和聚半乳甘露糖类（代表产品是瓜尔豆胶），统称甘露聚糖类。
半纤维素中的甘露聚糖经酶水解生成低碳链甘露糖杂聚物。已有的文献表明，低碳链甘露糖杂聚物（也称甘露低聚糖或甘露寡糖），能显著增进人体肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖、减少动物肠道病原菌，还能增强免疫力、提高肠黏膜功能等多种特性。最近的报道是，黄代勇等（酶法生产高纯度P95甘露低聚糖中试研究，食品科技，2007，10），李剑芳等（β-甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的研究,食品与发酵工业, 2007，01），张敏等（野皂荚多糖胶制备半乳甘露低聚糖的研究，食品工业斜技，2008，09,），王玲玲等（酶解法制备低相对分子质量胡芦巴半乳甘露聚糖及其产物的表征，林产化学与工业，2009，29卷（2），吴长菲等（魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究，生物技术通报，2010，01）。
迄今为止，有关低碳链甘露糖杂聚物的制备方法研究中，或是存在酶活力不高，底物浓度低，成本高，缺乏工业生产的基础；或是水解过程中加碱、加酸，给后处理工艺带来困难，还不利于环保；或是产品的纯度较低，普遍仅为70～80%，虽然黄代勇等（2007）的研究成果中，魔芋甘露低聚糖的纯度达到了95%，但其糖分子聚合度大至3～10糖，由于功能作用的局限性，还只能应用于食品和化工产品中，要应用到医药产品中还有一定的差距。特别是半乳甘露低聚糖研究水平还很低，离工业化还有很大的差距。因此，甘露低聚糖的原料多样性及高纯度制备方法仍然面临很多的技术难题。而这也是本发明创新技术的起点。
发明内容
本发明的目的是提供一种以含甘露聚糖的半纤维素为原料，采用保藏号为CCTCC No: M 211147（中国典型培养物保藏中心，地址.中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年08月14日）的枯草芽孢杆菌TQBm（Bacillus subtilis）的枯草芽孢杆菌TQBm发酵产出的高效能β-甘露聚糖酶技术、食品生产技术、精细化工技术之系统集成生产纯度高达 98％（P98），分子聚合度为4～8糖的甘露低聚糖的方法及产品，该产品可作为胃肠道健康、免疫调节、抗病防病药物的新型原料和助剂。
本发明是这样实现的，其工艺过程为：
1、酶解转化。加入保藏号为 CCTCC No: M 211147的枯草芽孢杆菌TQBm发酵产出的高效能β-甘露聚糖酶，底物为魔芋胶时，酶解转化的底物浓度为15～20%，酶料比为酶：魔芋胶=1ml：30g；；底物为瓜尔豆胶时，解转化的底物浓度为10～15%，酶料比为酶：瓜尔豆胶=1ml：15g。；降解温度 48～52℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，降解时间：3～4 小时，降解粘度至80～100 mPa??s时停止酶解转化，降解原液半纤维素中甘露聚糖的生物转化率为85～95%。
2、离心分离，将酶解物离心去杂；
3、絮凝、澄清、过滤处理；
4、离子交换处理；
5、超滤和分子筛纯化处理；
6、真空浓缩处理；
7、喷雾干燥处理，产出甘露低聚糖成品。
8、利用液相色谱和质谱对甘露低聚糖进行检测：总糖：≥ 99.5%；功效成份甘露2糖～甘露10糖：≥ 98.0 %，其中，甘露4糖～甘露8糖占85%以上。
本发明采用保藏号为 CCTCC No: M 211147的枯草芽孢杆菌TQBm发酵产出的高效能β-甘露聚糖酶技术和食品生产技术、精细化工技术之系统集成制备源于魔芋胶和瓜尔豆胶的P98甘露低聚糖，工艺简单，能耗低，操作方便，产品纯度高，成本可控，无化学污染。
本发明所用甘露聚糖的半纤维素包括魔芋胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、田菁胶、皂荚胶、胡芦巴胶等。
本发明所生产出的产品纯度高，功效成份甘露4糖～甘露8糖占的比重大，具有在同类产品中可唯一应用于医药产品的优势，将大大启发人们拓展低聚糖高端应用范围的新思路，新创造、新前景。
具体实施方式
下面以实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
l、酶解；
a）加水：在1000L酶解罐中，按有效容量700kg计，魔芋胶：水=20:80（w/w），加水560kg于降解罐中，水的 pH 在 6.5～7.5之间。
b）预热：酶解罐夹套通入蒸汽或热水把罐内的水预热至 50～52℃。
c）加酶：待降解水温稳定后，按酶与底物之比为 1: 20～30加入β-甘露聚糖酶BM—Ⅱ，并不断搅拌，使其混合均匀，保温5～10 min后投料。
d）加料：称取魔芋胶140kg加入酶解罐中，底物浓度15～20%，并充分搅拌。
e）酶解：罐内温度保持在50～55℃ 之间，不断搅拌，酶解 3～4 小时。在酶解过程中用NDJ一1型旋转粘度计，以 12rpm 的转速检测 50℃ 时酶解液的粘度，当酶解液粘度为 80～100 mPa??s时，停止降解，该液体称为“酶解液原液”。
2、用离心机过滤除渣得初滤液；
3、采用硅藻土过滤和0.2μm 微滤膜进行微滤处理得微滤液；
4、用孔径为截留 3 万分子量的聚矾超滤膜作超滤提纯，工作条件为：温度25～35℃，压力0.1～0.12 Mpa，物料流速300～350L/h。
5、用孔径为截留 6 千分子量的聚飒超滤膜作进一步超滤提纯，工作条件为：温度25～35℃，压力0.1～0.12MPa，物料流速300～350L/h。
6、采用 D315 大孔树脂 一 732 阳离子交换树脂 一 717 阴离子交换树脂的树脂组合对降解液进行脱盐、脱色、脱味的提纯处理，取样检测色值和灰分，脱色率为97%，灰分0.1%，得离子交换提纯液；
7、将离子交换提纯液经真空浓缩、喷雾干燥后得到P98甘露聚糖58.3kg，糖粉得率为 41.64％（相对于魔芋胶）。利用液相色谱一质谱联用检测P98魔芋甘露低聚糖，总糖：≥99.5%，功效成份（甘露2糖～甘露10糖）≥98.0%,其中，甘露4糖～甘露8糖占85%以上。
实施例2：
l、酶解；
a）加水：在1000L酶解罐中，按有效容量700kg计，瓜尔豆胶：水=15:85（w/w），加水595kg于酶解罐中，水的 pH 在 6.5～7.5之间。
b）预热：酶解罐夹套通入蒸汽或热水把罐内的水预热至 50～52℃。
c）加酶：待温度稳定在要求的温度时，按酶与底物之比为 1: 10～15加入β-甘露聚糖酶BM—Ⅱ。并不断搅拌，使其混合均匀，保温5～10 分钟后投料。
d）加料：称取瓜尔豆胶105kg加入酶解罐中（底物浓度15%），充分搅拌。
e）酶解：罐内温度保持在50～55℃ 之间，不断搅拌，酶解 3～4 小时。在酶解过程中用NDJ一1型旋转粘度计，以 12rpm 的转速检测 50℃ 时酶解液的粘度，当酶解液粘度为 80～100 mPa??s时，停止酶解，该液体称为“酶解液原液”。
以下离心分离、过滤、微滤、超滤提纯、树脂处理提纯、浓缩干燥等工序与实施例1相同。
制备出P98甘露低聚糖成品47.72kg，糖粉得率为 45.45％（相对于瓜尔豆胶）。利用液相色谱一质谱联用检测P98瓜尔豆胶甘露低聚糖，总糖：≥99.5%，功效成份（甘露2糖～甘露10糖）≥98%,其中，甘露4糖～甘露8糖占85%以上。
实施例3：
以槐豆胶，田菁胶，皂荚胶，胡芦巴胶为原料，应用β-甘露聚糖酶BM—Ⅱ制备P98甘露低聚糖的方法与实施例2相同。
功能试验结果
P98甘露低聚糖<调节人体肠道菌群的功能试验>
体检指标全部正常的30名成年志愿者试食P98甘露低糖后的检测结果如下：
*与食用前比较P＜0.05 **与食用前比较P＜0.01
结论：受试人群肠道内的菌群数量发生有益的变化：粪便中双歧杆菌、乳杆菌的数量明显增加，差异有极显著性﹙P＜0.01﹚，拟杆菌的数量明显增加，差异有显著性﹙P＜0.05﹚，肠杆菌数量明显减少，差异有极显著性﹙P＜0.01﹚。
P98甘露低聚糖<调节人体血糖血脂功能试验>
结论：P98甘露低聚糖有调节血糖血脂的作用较明显。
P98甘露低聚糖<调节人体免疫功能试验>
P98甘露低聚糖聚对体液免疫功能的影响
*与空白组比较P＜0.05，表明中高剂量组可显著升高血清溶血素含量。
P98甘露低聚糖对单核—巨噬细胞功能的影响
*与空白组比较P＜0.05，表明中高剂量组能显著提高吞噬率、吞噬指数和碳廓清指数。
P98甘露低聚糖对NK细胞活性的影响
*与空白组比较P＜0.05，表明中高剂量组能显著增强NK细胞活性
结论：P98甘露低聚糖有调节免疫功能的作用。
Claims (2)
1.一种酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的生产方法，其特征在于其工艺过程为：
l）、酶解转化：使用保藏号为 CCTCC No: M 211147的枯草芽孢杆菌TQBm发酵产出的β-甘露聚糖酶来酶解含甘露聚糖的半纤维素，底物浓度 10～20%，酶底比为1:15～30(v/w)；降解温度 48～52℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，降解时间：3～5 小时，降解粘度至80～100 mPa·s时停止酶解转化，降解原液半纤维素中甘露聚糖的生物转化率为85～95%；所述含甘露聚糖的半纤维素是指：魔芋胶，瓜尔豆胶，槐豆胶，田菁胶，皂荚胶，胡芦巴胶；
2）、离心分离，将酶解物离心去杂；
3）、絮凝、澄清、过滤处理；
4）、离子交换处理；
5）、超滤和分子筛纯化处理；
6）、真空浓缩处理；
7）、喷雾干燥处理，产出甘露低聚糖成品，经检测：总糖：≥ 99.5%；功效成份甘露2糖～甘露10糖≥98.0%，其中，甘露4糖～甘露8糖占85%以上。
2.根据权利要求 1 所述的酶解半纤维素制备高纯度甘露低聚糖的方法，其特征在于酶解反应的最佳条件为：底物浓度 15～20%，酶底比为1:15～30(v/w)，pH 7.0，温度50℃，时间3小时，降解原液中半纤维素酶解成甘露聚糖的生物转化率为85～95%。
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