KR20210104847A - 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법 - Google Patents
바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법에 관한 것으로서, 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액을 제공하는 단계, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 용액의 pH 값을 7 미만으로 낮추는 단계, 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액에 흡착제를 첨가하는 단계, 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하기 위해 제 1 막 여과를 수행하는 단계를 포함한다.
Description
본 발명은 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법에 관한 것이다.
인간 모유 올리고당 (HMO) 은 락토스 및 지질 다음으로 인간 모유의 3 번째로 가장 풍부한 고형 성분이다. 상이한 HMO 의 농도 및 인간 모유에서의 이들의 총량은 유즙분비 단계 내에서 그리고 개체들 사이에서 다양하며, 이는 부분적으로 유전적 배경에 기초하는 것으로 여겨진다. 그러나, 중요하게는, HMO 는 소, 양, 또는 염소 우유와 같은 다른 천연 공급원에서 비교할만큼 풍부하게 발견되지 않는다. 유아에 대한 HMO 의 몇몇 유익한 효과는 비피도박테리아 성장의 선택적 증진, 병원체에 대한 항 점착 효과 및 장관 상피 세포에 대한 글리컴-변경 효과를 포함하는 것으로 나타나거나 제안되었다. 삼당류 2'-푸코실락토스 (2'-FL) 는 인간 모유에서 가장 풍부한 올리고당 중 하나이다. 프리바이오틱 및 항감염 특성으로 인해, 2'-FL 은 유아용 조제분유용 영양 첨가제로서 논의된다. 또한, 2'-FL 을 함유하는 유아의 영양분은 더 낮은 설사 비율과 연관되어, 충분한 양으로 그리고 합리적인 가격으로 이용가능한 경우, 2'-FL 을 잠재적인 영양 보충제 및 치료제가 되게 한다.
이전에, 2'-FL 은 인간 모유로부터의 추출 또는 화학적 합성을 통해 얻어졌으나, 인간 모유의 제한된 이용가능성 또는 화학적 합성에서의 사이드 그룹 보호 및 탈보호의 필요성은 공급 및 비용 효율에 대한 제한을 설정하였다. 따라서, 2'-FL 의 대체 공급원이 관심의 대상이 되었다. 인간 모유로부터의 화학적 합성 및 추출 이외에, 2'-FL은 시험관 내 (in vitro) 및 생체 내 (in vivo) 에서 효소적으로 생성될 수 있다. 2'-FL 의 대규모 형성에 대한 가장 유망한 접근법은 GDP-L-푸코스의 세포내 합성 및 적절한 α1,2-푸코실 트랜스퍼라제를 사용한 락토스의 후속적인 푸코실화에 의한 대장균 (Escherichia coli) 에서의 전체 세포 생합성이다.
따라서, HMO 는 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 바람직하게는 2'-FL 을 포함하는 용액을 제공하는, 발효에 의해 생성될 수도 있다. 이러한 용액은 또한 발효 브로스라고 불릴 수도 있다.
HMO 공정으로부터의 발효 브로스로부터의 바이오매스 분리는 HMO 의 생산에서 제 1 다운스트림 처리 단계이다. 이 단계를 위한 최신 기술은 원심분리 및 또는 필터 프레스이며, 때때로 응집제를 사용한다. 그러나, 미세여과가 또한 사용될 수 있고, 이는 다른 분리 기술에 비해 여러 이점을 갖는다. 유전적으로 변형된 유기체 자유 생성물 용액을 가능하게 하기 위해, 미세여과가 가장 좋은 옵션인데, 이는 유전적으로 변형된 미생물을 포함한 모든 용해되지 않은 고형물을 완전히 보유할 수 있기 때문이다.
막 여과는 종종 용액 중의 더 큰 분자로부터 더 작은 분자를 분리하는데 사용된다. 올리고당 함유 용액의 일 예는 CN 100 549 019 로서 공개된 중국 특허 출원에 개시되어 있으며, 이 특허 출원은 효소 및 막 기술을 사용하여 스트로우 (straw) 로부터 고순도 자일로올리고당을 제조하는 방법을 개시한다. 또 다른 예는 발효 브로스를 함유하는 올리고당의 막 여과에 이어서 여과액에 활성탄을 첨가하는 것을 포함하는 추가의 공정 단계를 수행하는 것을 개시하는 특허 출원인 EP 2 896 628 에 개시된다.
HMO 의 발효 생산 후에 바이오매스의 분리는 일반적으로 초기 원심분리 또는 필터 프레스 및 추가 원심분리에 의해 pH 값 7 에서 수행된다. 때때로 중합체 막이 대신 사용된다.
그러나, 막이 사용될 때, 막 성능은 다소 낮고 투과물은 많은 단백질 및 색 성분을 함유하는데, 이들은 이하 단계들에서 제거되아만 하고 복잡한 다운스트림 공정, 높은 생성물 수율 손실 및 일부 품질 문제를 야기한다.
전형적으로, 발효 브로스로부터 바이오매스를 분리하는 이들 초기 단계 후에, 수행된 다음 단계는 전형적으로 10 kDa 폴리에테르술폰 막으로 완료된 한외여과 (ultrafiltration) 이지만, 모든 단백질 및 다당류가 이에 의해 분리될 수 있는 것은 아니다. 따라서, 한외여과 투과물은 활성 탄소 컬럼으로 설정되어 용액을 탈색시키고 1000 미만의 APHA 값을 달성한다. 활성 탄소 컬럼에서의 탈색은 다소 지루한 공정이며, 발효 브로스의 초기 양과 관련하여 약 14% 중량/중량의 활성 탄소를 사용하는 것이 종종 필요하다. 이 단계는 높은 생성물 손실을 초래하고, 거대한 활성 탄소 컬럼을 필요로 한다.
따라서, 본 발명의 목적은 상기 언급된 단점들을 회피하는 것이었다. 특히, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 성능을 향상시키고 여과 투과물의 단백질 양 및 색상을 감소시키기에 적합한 방법이 제공되어야 한다.
본 발명에 따르면, 이 목적은 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법에 의해 해결되며, 상기 방법은:
- 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액을 제공하는 단계,
- 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 용액의 pH 값을 7 미만, 바람직하게는 pH 5.5 이하로 낮추는 단계,
- 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액에 흡착제를 첨가하는 단계, 및
- 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하기 위해, 본원에서 제 1 막 여과로도 불리고 전형적으로 미세여과 또는 한외여과인, 막 여과를 수행하는 단계
를 포함한다. 바람직하게는, 방법 단계들의 순서는 이전 문장에 주어진 것이다.
본 발명의 방법에 따르면, 놀랍게도 용액의 pH 값을 7 미만으로 낮출 경우, 막 성능을 상당히 증가시킬 수 있고, 단백질 제거를 상당히 개선할 수 있음을 확인하였다. 또한, 임의의 막 여과 전에 흡착제를 용액에 첨가할 경우, 막 성능이 추가로 증가되고, 투과물의 색상은 요구되는 사양 아래로 상당히 감소될 수 있음을 확인하였다. 또한 유리하게는, pH 값이 pH 7 미만의 원하는 목표 값으로 설정되고 적어도 하나의 흡착제가 첨가된 후에 막 여과가 실행될 경우, 활성 탄소와 같은 흡착제의 필요한 양은 공지된 방법에 비해 훨씬 더 낮고, 또한 탈색을 위한 필요한 시간은 공지된 방법에서보다 훨씬 더 짧다.
바람직하게는, 흡착제는 활성 탄소이다. 활성화된 탄소 (activated carbon) 또는 활성탄 (activated charcoal) 으로도 알려져 있는 활성 탄소 (active carbon) 는 저가이고, 대량으로 입수가능하며, 취급이 용이하고 식품에 안전하기 때문에 바람직한 흡착제이다.
바이오매스 및 하나 이상의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하는 용액의 pH 값은 제 1 막 여과가 수행될 때, 및 더욱 바람직하게는 흡착제가 첨가될 때, pH 7.0 미만인 것이 본 발명의 방법에 유리하다. 따라서, 발효 브로스의 pH 값은 전형적으로 pH 7.0 이상이기 때문에, pH 값은 목표 pH 값을 달성하기 위해 필요한 적어도 하나의 산의 첨가에 의해 낮춰진다. 바이오매스 및 하나 이상의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하는 용액의 pH 값이 초기에 이미 pH 7.0 미만인 경우, 필요에 따라 pH 값을 pH 7.0 미만으로 안정적으로 설정하기 위해 적어도 하나의 산이 사용될 수도 있다. 또한 바람직하게는, 용액의 pH 값은 임의의 막 여과가 시작되기 전에, 5.5 이하의 pH 값으로 설정된다. 바람직하게는 pH 값은 3.0 내지 5.5 의 범위, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 5 의 범위의 목표 pH 값으로 낮춰지며, 여기서 주어진 범위는 주어진 수를 포함한다. 더욱 더 바람직한 실시형태에서, 용액의 pH 값은 pH 3.5 이상이지만 pH 4.5 이하로 설정되며, 가장 바람직하게는 pH 값은 4.0 내지 4.5 를 포함하는 범위의 값으로 설정된다. 이를 위해, 적어도 하나의 산을 용액에 첨가한다. 상기 적어도 하나의 산은, 더욱 바람직하게는, H2SO4, H3PO4, HCl, HNO3 및 CH3CO2H 으로 이루어진 군으로부터 선택된 산이다. 기본적으로, 임의의 산이 사용될 수도 있다. 그러나, 이 산들은 보통 다루기 용이하다.
상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 전형적으로 0.25 중량% 내지 3 중량% 의 범위, 바람직하게는 0.5 중량% 내지 2.5 중량% 의 범위, 더욱 바람직하게는 0.75 중량% 내지 2.2 중량% 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 1.0 중량% 내지 2.0 중량% 의 범위의 양으로 첨가되며, 여기서 백분율 값은 용액 중량 당 흡착제의 중량 기반이다. 따라서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소의 다소 적은 양이, 바람직하게는 1000 APHA 인 상한 규격 미만으로 색상 수를 감소시키기에 충분하다. 이는 활성 탄소 소비의 상당한 감소를 허용할 뿐만 아니라, 활성 탄소 컬럼에 비해 생성물 손실의 상당한 감소를 허용한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 흡착제는, 바이오매스 및/또는 다당류 및/또는 단백질 및/또는 존재할 수 있는 DNA 또는 RNA 와 같은 핵산을 포함하는 시작 용액 내의 컬러 성분 및/또는 단백질의 적어도 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 90 %, 92 %, 94%, 95 % 또는 그 이상을 - 선호도 증가 순서로 - 결합하기에 적합한 양으로 첨가된다. 또한, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 전형적으로, 직경 d50 이 2 ㎛ 내지 25 ㎛ 의 범위, 바람직하게는 3 ㎛ 내지 20 ㎛ 의 범위, 더욱 바람직하게는 3 ㎛ 내지 7 ㎛ 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 5 ㎛ 내지 7 ㎛ 의 범위인 입자 크기 분포를 갖는 분말로서 첨가된다. d50 값은 표준 절차에 의해 결정된다. 이러한 크기 범위의 입자 크기는 막의 마모 위험을 감소시킨다. 또한, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 물에서 분말의 현탁액으로서 첨가되는 것이 더욱 바람직하다. 이는 분말의 현탁액이 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 현탁액과 더 잘 혼합될 수도 있기 때문에, 흡착제의 취급을 용이하게 한다. 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 용액에 첨가하는 것은 전형적으로, 상기 용액에 적어도 하나의 산을 첨가한 후에 수행된다. 예상외로, pH 값이 먼저 조정된 후에 흡착제 또는 적어도 대부분의 흡착제가 후속하여 첨가될 때, 색 감소 및 단백질 감소가 훨씬 더 양호하다. 적어도 하나의 산을 용액에 첨가하기 전에 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 발효 브로스에 첨가하는 것이 가능하다.
또 다른 변형에서, 용액의 pH 값은 적합한 산 중 적어도 하나의 첨가에 의해 5.5, 더욱 바람직하게는 5.0, 더욱 더 바람직하게는 4.5 로 저하되고, 그 후 원하는 최종 pH 값이 달성될 때까지 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소, 및 추가의 산이 첨가된다.
또한, 흡착제의 일부는 임의의 산을 첨가하기 전에 첨가되어 pH 값을 낮추고, 이어서 pH 값이 pH 7.0 미만의 목표 값으로 설정된 후에 더 많은 흡착제를 첨가할 수 있다.
바람직하게는, 바이오매스 및 올리고당, 전형적으로 발효 브로스를 포함하는 상기 용액은 배양 배지, 바람직하게는 적어도 하나의 탄소 공급원, 적어도 하나의 질소 공급원 및 무기 영양소를 포함하는 배양 배지에서, 하나 이상의 유형의 세포, 바람직하게는 박테리아 또는 효모, 더욱 바람직하게는 박테리아, 더욱 더 바람직하게는 유전적으로 변형된 대장균의 배양에 의해 수득된다. 따라서, 비용 효율적인 방법으로 충분한 양의 상기 올리고당을 생산할 수도 있다.
바람직하게는, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액을 제공하는 단계는 미생물 발효에 의해 상기 용액을 제조하는 단계를 포함한다. 따라서, 비용 효율적인 방법으로 충분한 양의 상기 올리고당을 생산할 수도 있다.
제 1 막 여과 단계의 상기 미세여과 또는 한외여과는 전형적으로 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과로서 수행된다. 따라서, 여과 효율을 향상시킬 수도 있다. 상기 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과는 세라믹 모노-채널 및 멀티-채널 요소가 사용되는 경우, 0.2 m/s 초과, 바람직하게는 0.5 m/s 내지 6.0 m/s 범위, 더욱 바람직하게는 2.0 m/s 내지 5.5 m/s 범위, 더욱 더 바람직하게는 2.8 m/s 내지 4.5 m/s 범위, 가장 바람직하게는 3.0 m/s 내지 4.0 m/s 범위의 직교류 속도를 포함한다. 다른 실시형태에서, 직교류 속도는 3.0 m/s 이하이다. 제 1 막 여과를 위해 고분자 막을 사용하는 경우, 2 m/s 이하의 직교류 속도를 사용할 수 있으며; 바람직하게는 0.5 m/s 내지 1.7 m/s 범위의 직교류 속도를 사용하지만, 0.5 m/s 이하의 직교류 속도도 사용할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 중합체 막이 사용되는 경우, 직교류 속도는 1.7 m/s, 1.6 m/s, 1.5 m/s, 1.4 m/s, 1.3 m/s, 1.2 m/s, 1.1 m/s 또는 1.0 m/s 이하이다. 따라서, pH 값 조절 및 흡착제 첨가를 포함하지 않고, 여과 공정에 비하여 여과 속도를 최적화할 수도 있다. 이로써, 이전에 알려진 방법에 비해 낮은 직교류 속도로 동작함으로써 막 여과 설비의 마모와 파손 및/또는 에너지 소비를 감소시킬 수 있고, 그 결과 양호한 분리가 가능하다.
상기 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과는 전형적으로 4 ℃ 내지 55 ℃ 의 범위, 바람직하게는 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 40 ℃ 의 범위의 용액 온도에서 수행된다. 따라서, 상기 여과 단계 동안의 온도는 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액의 점도를 감소시키고 막 성능을 추가로 개선하는, 발효 동안의 온도와 동일할 수도 있다. 또한, 제 1 막 여과는, 또한 바람직하게, 20 nm 내지 800 nm 의 범위, 바람직하게는 40 nm 내지 500 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위의 공극 크기를 갖는 세라믹 미세여과 막 또는 세라믹 한외여과 막에 의해 수행된다. 개선된 내마모성을 갖도록 설계된 다층 막, 예를 들어 400 nm 및 200 nm 및 50 nm 공극 크기의 Al2O3 층을 사용하는 것도 가능하다. 따라서, 원하는 사양을 준수하기 위해 충분한 양의 단백질 및 다당류를 제거할 수도 있다. 또한 전형적으로, 제 1 막 여과는 4 kDa 이상, 바람직하게는 10 kDa 내지 200 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 kDa 내지 200 nm 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 50 kDa 이상의 컷오프를 갖는 중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막에 의해 수행된다. 다른 바람직한 실시형태에서, 컷오프는 100 nm 이하이다. 따라서, 원하는 사양을 준수하기 위해 충분한 양의 단백질 및 다당류가 제거될 수도 있다.
중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막의 중합체 재료는, 바람직하게는, 폴리에테르술폰, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중합체 재료이다. 개질된 중합체 재료, 예를 들어, 친수성 폴리에테르술폰이 또한 사용될 수 있다.
세라믹 미세여과 막 또는 세라믹 한외여과 막의 세라믹 재료는, 바람직하게, TiO2, ZrO2, SiC 및 Al2O3 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 세라믹 재료이다.
제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과는 전형적으로, 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소가 용액에 첨가된 후의 미리 결정된 시간 후에 수행된다. 이는 색 성분이 흡착되는 흡착 시간을 제공할 수 있다. 상기 미리 결정된 시간은 적어도 2 분, 바람직하게는 적어도 10 분, 더욱 바람직하게는 적어도 20 분이다. 따라서, 색 성분의 흡착은 다소 빠르다.
상기 방법은 바람직하게는, 제 1 막 여과의 미세여과 또는 한외여과에 의해 수득되는 바이오매스가 본질적으로 없고, 하나 이상의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하고, 바람직하게는 시작 용액으로부터의 이들 당류의 대부분을 포함하고, 예를 들어 바이오매스를 또한 포함한 발효 브로스를 포함하는 용액을 사용하여, 제 2 의 또는 추가의 막 여과, 바람직하게는 한외여과를 수행하는 단계를 더 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 제 2 막 여과는 제 1 막 여과의 투과물 및 제 1 막보다 낮은 컷오프를 갖는 막으로 수행된다. 따라서, 제 1 막 여과에 의해 수득된 투과물의 유리한 추가 처리가 실현된다. 제 2 막 여과는 전형적으로, 한외여과 막에 의해 수행되고, 바람직하게는, 적어도 부분적으로 중합체 재료로 만들어지고, 1 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 바람직하게는 2 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 더욱 바람직하게는 4 kDa 내지 5 kDa 의 범위의 컷오프를 갖는 한외여과이다.
상기 제 2 막 여과는 1 내지 25 kDa 컷오프의 세라믹 막으로 수행될 수도 있다. 추가의 실시형태에서, 막은 적어도 부분적으로 중합체 재료로 만들어지는 것이 바람직하다. 상기 중합체 재료는, 더욱 바람직하게는, 폴리에테르술폰, 폴리술폰, 폴리아크릴로니트릴, 셀룰로오스 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중합체 재료이다. 상기 제 2 막 여과는 전형적으로, 용액의 온도를 20 미만의 온도로 조정한 후, 바람직하게, 4 ℃ 내지 15 ℃ 의 범위, 바람직하게는 8 ℃ 내지 13 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 8 ℃ 내지 12 ℃ 의 범위의 용액의 온도에서 수행된다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 제 1 막 여과는 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 2 개 또는 바람직하게는 3 개의 단계를 포함한다. 상기 제 1 단계는, 정용여과 인자 (DF).(정용여과수의 양 = 발효 브로스의 출발량 x 정용여과 인자) 가 0.5 이하 내지 3 이상 범위인 제 1 정용여과를 포함한다. 예를 들어, 용액을 포함하는 2'FL 의 경우, 0.5 의 DF 를 갖는 것이 유리하고, 다른 HMO 에 대하여 분자 값 3 은 농축 단계를 따르는 경우 더 양호한 것으로 입증되었다. 정용여과 동안, 첨가된 물 또는 적합한 수용액의 양은 배출되는 투과물의 양과 동일하다. 배치 방식 정용여과에서, 공급 용기 내의 부피는 따라서 일정하게 유지된다. 제 2 단계는 정용여과수의 공급을 중단함으로써 바람직하게는 인자 2 이상으로 발효 브로스를 농축하는 단계를 포함하고, 그 수준은 목표 값 (목표 값 = 발효 브로스의 시작시 부피 또는 질량/농축 인자) 으로 감소할 것이다. 선택적으로, 후속하는 제 3 단계는 제 2 정용여과를 포함한다. 이들 3 개 단계들에 의해, 투과물 내의 생성물의 더 낮은 희석 및 ≥ 95 % 의 증가된 수율이 실현된다. 제 2 정용여과의 인자를 증가시킴으로써, 수율은 더욱 증가될 수도 있다.
그 후 투과물은 전형적으로 이들 3 개 단계들에서 막을 통과하는 모든 용액의 조합이다. 배치 공정에서, 각 단계는 혼합을 위해 하나의 용기에 수집될 수 있거나 개별적으로 처리될 수 있는, 시간-분리된 방식으로 투과물 분획을 생성한다. 연속 공정에서, 3 개 단계들의 각각은 시간 분리되지 않은 투과물 분획을 생성하고, 이들 분획은 결합되어 원하는 경우 개별적으로 처리되거나 결합된 투과물을 형성할 수 있다.
선택적으로, 제 1 막 여과의 제 1 단계는 제 2 농축 단계가 수행되기 전에, 1 회 이상 반복될 수도 있다. 선택적으로, 제 2 단계는 수행될 수도 있거나, 또는 용액을 농축하는 것이 바람직하지 않다면 스킵될 수도 있다. 이는, 예를 들어, 발효 브로스가 높은 점도 및/또는 매우 높은 바이오매스 함량을 가질 때 유용하다.
선택적으로, 제 1 단계는 스킵될 수도 있고, 대안적으로 제 2 단계는 제 1 단계 없이 수행되어, 따라서 먼저 발효 브로스의 농축이 투과물을 생성하는 동안 수행되고, 이어서 최종 단계의 정용여과는 바이오매스 및 하나 이상의 올리고당, 이당류 또는 단당류를 포함하는 용액에 물 또는 수용액을 공급함으로써 수행된다.
바람직하게, 적어도 하나의 올리고당은 인간 모유 올리고당, 바람직하게는 중성 또는 시알릴화된 인간 모유 올리고당, 더욱 바람직하게는 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 및/또는 2'-푸코실락토스를 포함하고, 더욱 더 바람직하게는 2'-푸코실락토스, 6'-시알릴락토스 및/또는 락토-N-테트라오스를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 단당류 및/또는 이당류 및 바이오매스를 함유하는 용액으로부터 바이오매스로부터 단당류 및/또는 이당류의 분리, 예를 들어 바이오매스로부터 락토스, 푸코스, 말토스 또는 사카로스의 분리를 위해 적용된다
추가의 실시형태는 본 발명의 방법을 수행하기에 적합한 본 발명의 장치이다.
본 발명의 추가의 특징들 및 실시형태들은 특히 종속항들과 관련하여 후속 설명에서 보다 상세하게 개시될 것이다. 여기서, 각각의 특징들은 당업자가 인식하는 바와 같이, 어떤 임의의 가능한 조합뿐만 아니라 격리된 방식으로 실현될 수도 있다. 실시형태들은 도면들에 개략적으로 도시된다. 여기에서, 이들 도면에서 동일한 참조 번호들은 엘리먼트들을 동일하거나 기능적으로 동일한 엘리먼트들을 지칭한다.
도 1 은 본 발명에 따른 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법의 블록도를 도시한다.
하기에서 사용된 바와 같이, "가지다 (have)", "포함하다 (comprise)" 또는 "포함하다 (include)" 또는 어떤 임의의 문법적 변형들은 비-독점적인 방식으로 사용된다. 따라서, 이들 용어들은 이들 용어들에 의해 도입되는 특징 이외에, 이 문맥에서 기술된 실체에 추가적인 특징들이 존재하지 않는 상황 및 하나 이상의 추가적인 특징들이 존재하는 상황 양자 모두를 표현할 수도 있다. 일례로서, 표현 "A 는 B 를 가지다", "A 는 B 를 포함하다" 및 "A 는 B 를 포괄하다" 는 B 이외에, 다른 엘리먼트가 A 에 존재하지 않는 상황 (즉, A 가 오직 배타적으로 B 로 이루어지는 상황) 및 B 이외에 하나 이상의 추가 엘리먼트들, 예컨대 엘리먼트 C, 엘리먼트들 C 및 D 또는 더 추가의 엘리먼트들이 존재하는 상황 양자 모두를 표현할 수도 있다.
추가로, 특징 또는 엘리먼트가 1 회 또는 1 회 초과로 존재할 수도 있음을 나타내는 용어들 "적어도 하나", "하나 이상" 또는 유사한 표현들은 개별 특징 또는 엘리먼트를 도입할 때 통상적으로 오직 1 회만 사용될 것임이 주목될 것이다. 이하에서, 대부분의 경우, 각각의 특징 또는 엘리먼트를 언급할 때, 그 각각의 특징 또는 엘리먼트가 1 회 또는 1 회 초과로 존재할 수도 있다는 사실에도 불구하고, "적어도 하나" 또는 "하나 이상" 이라는 표현은 반복되지 않을 것이다.
또한, 이하에서 사용되는 바와 같이, 용어 "특히", "더 특히", "구체적으로", "더 구체적으로", "전형적으로", "더 전형적으로", "바람직하게는", "더 바람직하게는" 또는 유사한 용어들은 대안적인 가능성들을 제한하지 않고 추가적인/대안적인 특징들과 함께 사용된다. 따라서, 이들 용어들에 의해 도입된 특징들은 추가적인/대안적인 특징들이며 어떠한 방식으로도 청구항들의 범위를 제한하지 않는다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명은 대안적인 특징들을 사용함으로써 수행될 수도 있다. 유사하게, "본 발명의 실시형태에서" 또는 유사한 표현들에 의해 도입된 특징들은 본 발명의 대안적인 실시형태들에 관한 임의의 제한 없이, 본 발명의 범위에 관한 임의의 제한 없이, 그리고 이러한 방식으로 도입된 특징들을 본 발명의 다른 추가적인/대안적인 또는 비-추가적인/대안적인 특징들과 결합하는 가능성에 관한 임의의 제한 없이, 추가적인/대안적인 특징들인 것으로 의도된다.
본 명세서에서 사용되는 것과 같이, 용어 "바이오매스" 는 용액 내에 포함된 생물학적 유기체의 질량을 의미한다. 전형적으로, 본 발명에 따른 상기 생물학적 유기체는 하나 이상의 유형의 원핵 또는 진핵 유기체, 바람직하게는 박테리아 또는 효모이다. 더욱 바람직하게는, 상기 바이오매스는 배양 배지, 바람직하게는 적어도 하나의 탄소 공급원, 적어도 하나의 질소 공급원 및 무기 영양소를 포함하는 배양 배지에서 배양되는 박테리아, 더욱 더 바람직하게는 유전적으로 변형된 대장균을 포함한다.
추가의 실시형태에서, 본 발명의 방법은 목재, 스트로우, 줄기 및 리그닌, 셀룰로오스 및/또는 스타치를 함유하는 다른 식물 물질과 같은 거대분자 바이오매스로부터, 또는 상기 거대분자 바이오매스의 나머지로부터의 키틴 함유 물질, 다당류 등과 같은 거대분자 바이오매스 또는 동물 또는 미생물 기원으로부터 생산된 올리고당, 이당류 및 단당류를 분리하기 위해 적용된다.
바이오매스와 올리고당(들), 이당류(들) 및/또는 단당류(들)를 분리하는 것의 성공을 평가하는 가장 쉬운 방법은 제 1 막 여과의 투과물이 광학적으로 투명한 것을 모니터링하는 것이다. 비성공적인 분리는 투과물의 광학 검사에서 바이오매스가 검출되게 할 것이고, 투과물 내의 흑색 활성 탄소와 같은 흡착제의 존재는 또한 광학 검사에서 쉽게 검출될 것이며 막 여과 장비의 누설 또는 고장을 나타낼 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고당" 은 소량의 전형적으로 3 내지 10 개의 단당류(단당)를 함유하는 당류 중합체를 지칭한다. 바람직하게는, 상기 올리고당은 인간 모유 올리고당, 바람직하게는 중성, 산성 비푸코실화 및/또는 산성 푸코실화, 더욱 바람직하게는 2'-푸코실락토스, 디푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, LNFP I, LNFP II, LNFP III, LNFP V, LNDFH I, LNDFH II 및/또는 3'-시알릴락토스 및/또는 6'-시알릴락토스, 훨씬 더 바람직하게는 2'-푸코실락토스와 같지만 이에 제한되지 않는 인간 모유 올리고당을 함유하는 시알산을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이당류" 는 2 개의 단당류, 예를 들어, 글루코스와 갈락토스 모이어티로 이루어진 락토스, 또는 하나의 글루코스와 하나의 프럭토스 분자로 만들어진 사카로스로 이루어진 당류를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단당류" 는 단당, 바람직하게는 5 개 또는 6 개의 탄소 원자를 포함하는 당 분자, 예를 들어 글루코스, 프럭토스, 갈락토스 또는 푸코스를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "흡착제" 는 기체, 액체 또는 용해된 고체로부터의 원자, 이온 또는 분자가 표면에 접착되도록 하는 원소를 지칭한다. 용어 "접착" 은 상이한 입자 또는 표면이 서로 달라붙는 경향을 지칭한다. 바람직하게는, 흡착제는 색 성분에 대한 접착을 제공하도록 구성된다. 바람직하게는, 흡착제는 활성 탄소이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "미세여과" 는 바람직하지 않은 입자들을 포함하는 유체, 예를 들어 오염된 유체를 특수한 공극-크기 막을 통과시켜 공정 액체, 특히 더 큰 박테리아, 효모, 및 임의의 고형 입자들로부터 미생물들 및 현탁된 입자들을 분리하는, 물리적 여과 공정의 유형을 지칭한다. 미세여과 막은 공극 크기가 0.1 ㎛ 내지 10 ㎛ 이다. 이에 의해, 이러한 막은 100000 kDa 초과의 분자 질량에 대한 컷오프를 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "한외여과" 는 바람직하지 않은 입자들을 포함하는 유체, 예를 들어 오염된 유체를 특수한 공극-크기 막을 통과시켜 공정 액체, 특히 박테리아, 거대분자, 단백질, 더 큰 바이러스로부터 미생물들 및 현탁된 입자들을 분리하는, 물리적 여과 공정의 유형을 지칭한다. 한외여과 막은 전형적으로 2 nm 내지 100 nm 의 공극 크기를 가지며, 2 kDa 내지 250000 kDa 의 분자 질량에 대한 컷오프를 갖는다. 한외여과에 기초하는 원리는 기본적인 미세여과와 근본적으로 다르지 않다. 이들 방법 모두는 크기 배제 또는 입자 잔류에 기초하여 분리되지만, 입자의 크기에 따라 분리 능력이 상이하다.
본 발명의 방법에 따르면, 제 1 막 여과는 4 kDa 이상, 바람직하게는 10 kDa 내지 200 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 kDa 내지 200 nm 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 50 kDa 내지 100 nm 의 범위의 컷오프를 갖는 중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막에 의해 수행된다.
추가로, 상기 제 2 막 여과는 바람직하게, 1 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 바람직하게는 2 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 더욱 바람직하게는 4 kDa 내지 5 kDa 의 범위의 컷오프를 갖는 한외여과 막에 의해 수행된다.
여과 막의 컷오프는 전형적으로 주어진 크기 또는 분자 질량의 용질의 90 % 의 잔류를 지칭하며, 예를 들어 x kDa 를 갖는 구상 단백질의 90 % 가 x kDa 의 컷오프를 갖는 막에 의해 잔류된다. 이들 컷오프 값은 예를 들어 정의된 덱스트란 또는 폴리에틸렌 글리콜의 사용, 및 당업계에서 통상적인 방법 및 파라미터를 사용하여 GPC 겔 투과 크로마토그래피 분석기를 사용하여 잔류물, 투과물 및 공급물로 불리는 원래의 용액을 분석하는 것에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "직교류 여과 (cross-flow filtration)" 는 대부분의 공급 흐름이 투과물 측에 대해 양압으로 필터 내로 보다는 필터의 표면을 가로질러 접선 방향으로 이동하는, 여과 유형을 지칭한다. 이의 주요 장점은 다른 방법에서 필터를 블라인드할 수 있는 필터 케이크가 여과 공정 동안 축적되지 않고, 필터 유닛이 동작될 수 있는 시간의 길이를 증가시킨다는 것이다. 이는 배치식 데드-엔드 여과와는 달리, 연속적인 공정일 수 있다. 대규모 응용의 경우, 연속적인 공정이 바람직하다. 이러한 유형의 여과는 전형적으로 투과물이 가장 가치있는 높은 비율의 소형 입자 크기 고형물을 함유하는 공급물에 대해 선택되는데, 이는 고체 재료가 데드-엔드 여과로 필터 표면을 신속하게 차단 (블라인드) 할 수 있기 때문이다. 본 개시에 따르면, 상기 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과는 0.5 m/s 내지 6.0 m/s 의 범위, 바람직하게는 2.0 m/s 내지 5.5 m/s 의 범위, 더욱 바람직하게는 3.0 m/s 내지 4.5 m/s 의 범위의 직교류 속도를 포함한다. 세라믹으로 만들어진 막의 경우, 각 막의 기하학적 형상에 따라 고분자 재료로 만들어진 막의 경우보다 직교류 속도가 더 높을 수도 있다. 예를 들어, 편평한 시트 모듈 내의 중합체 막과 같은 편평한 중합체 막의 경우에, 직교류 속도는 0.5 m/s 내지 2.0 m/s, 바람직하게는 1.0 m/s 내지 1.7 m/s, 더욱 바람직하게는 1.0 내지 1.5 m/s 이다. 특정 설정 및 바이오매스를 포함하는 특정 용액에 따라, 심지어 1.0 m/s 이하의 직교류 속도가 일부 경우에 사용될 수도 있지만, 직교류 속도가 너무 낮을 때 여과는 데드 엔드 여과로 전환될 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "컷오프" 는 달톤 단위의 분자량 컷오프인 MWCO 의 형태로 통상적으로 특정되는 막의 배제 한계를 지칭한다. 이는 용질의 최소 분자량, 예를 들어 막에 의해 90 % 까지 잔류되는 구형 단백질로서 정의된다. 컷오프는 방법에 따라, 소위 D90 으로 변환될 수 있으며, 이는 이후 메트릭 단위로 표현된다.
제 1 단계 (도 1, 단계 S10) 에서, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액이 제공된다. 상기 적어도 하나의 올리고당은 인간 모유 올리고당, 바람직하게는 2'-푸코실락토스를 포함한다. 바람직하게, 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 상기 용액은 배양 배지에서 하나 이상의 유형의 세포를 배양함으로써 수득된다. 따라서, 상기 용액은 또한 바람직한 실시형태에서 발효 브로스로 지칭될 수도 있다. 상기 배양 배지는 적어도 하나의 탄소 공급원, 적어도 하나의 질소 공급원 및 무기 영양소를 포함하는 배양 배지가 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 발효 브로스 또는 용액은 미생물 발효, 바람직하게는 호기성 미생물 발효에 의해 수득된다. 올리고당을 생성할 수 있는 미생물은, 예를 들어 종들 에스케리키아, 클렙시엘라, 헬리코박터, 바실러스, 락토바실러스, 스트렙토코쿠스, 락토코쿠스, 피치아, 사카로마이세스 및 클루이베로마이세스로 이루어지거나 WO 2015/032412 로 공개된 국제 특허 출원 또는 EP 2 379 708 로 공개된 유럽 특허 출원에 기술된 바와 같은 군으로부터의 효모 또는 박테리아, 바람직하게는 유전자 변형된 대장균 변종, 더욱 바람직하게는 lacZ 유전자 (lacZ-) 가 결핍되어 있고, 인간 영양소 물질의 생성에 적합한, 즉 조절된 조건하에서 수성 영양 배지에서 배양되는, 예를 들어 EP 2 379 708, EP 2 896 628 또는 US 9 944 965 에 개시된 바와 같이 올리고당의 생합성에 유리한, 유전자 변형된 대장균 변종일 수도 있다. 수성 영양 배지는 올리고당의 성장 및/또는 생합성을 위해 미생물에 의해 사용되는 적어도 하나의 탄소 공급원 (예를 들어, 글리세롤 또는 글루코스) 을 포함한다. 또한, 영양 배지는 또한, 미생물의 성장에 필요한, 바람직하게는 암모늄 염, 예를 들어 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 하이드록사이드 등의 형태의 적어도 하나의 질소 공급원을 함유한다. 배지 내의 다른 영양소는 예를 들어, 인광체 공급원으로서 하나 또는 수 개의 포스페이트 염, 황 공급원으로서 설페이트 염, 및 예를 들어, Mg, Fe 및 다른 미세영양소를 미생물에 제공하는 다른 무기 또는 유기 염을 포함한다. 다수의 경우에, 하나 이상의 비타민, 예를 들어 티아민은 최적의 성능을 위해 영양 배지에 보충되어야 한다. 영양 배지는 선택적으로 효모 추출물 또는 펩톤과 같은 복합 혼합물을 함유할 수도 있다. 그러한 혼합물은 보통 아미노산뿐만 아니라 비타민과 몇몇 미세영양소와 같은 질소 풍부 화합물을 함유한다.
영양소는 배양 초기에 배지에 첨가될 수 있고, 및/또는 이들은 또한 공정 과정 동안 공급될 수 있다. 대부분의 경우, 탄소 공급원(들)은 배양의 시작시 규정된 저농도까지 배지에 첨가된다. 이어서, 성장 속도 및 따라서 미생물의 산소 수요를 제어하기 위해 탄소 공급원(들)이 연속적으로 또는 간헐적으로 공급된다. 추가적인 질소 공급원은 일반적으로 암모니아를 이용한 pH 조절에 의해 수득된다 (하기 참조). 배양 과정에서 위에서 언급한 다른 영양소를 첨가하는 것도 가능하다.
일부 경우에, 전구체 화합물이 배지에 첨가되는데, 이는 올리고당의 생합성에 필요하다. 예를 들어, 2'-푸코실락토스의 경우, 일반적으로 전구체 화합물로서 락토스가 첨가된다. 전구체 화합물은 배양 초기에 배지에 첨가될 수도 있거나, 또한 배양 중에 연속적으로 또는 간헐적으로 공급될 수도 있거나, 또는 초기 첨가와 공급의 조합에 의해 첨가될 수도 있다.
교반 탱크 생물반응기에서 올리고당의 성장 및 생합성을 가능하게 하는 조건하에서 세포를 배양한다. 미생물 세포에 대한 50 mmol O2/(l*h) 내지 180 mmol O2/(l*h) 범위의 우수한 산소 공급은 성장 및 생합성에 필수적이므로, 배양 배지를 통기시키고 강하게 교반하여 액체 배지 내로의 높은 산소 전달 속도를 달성한다. 선택적으로, 배양 배지 내로의 공기 스트림은 배지 내의 세포로의 산소 전달 속도를 증가시키기 위해 순수한 산소 가스의 스트림에 의해 풍부해질 수도 있다. 배양은 24℃ 내지 41℃, 바람직하게는 32℃ 내지 39℃ 에서 수행되며, pH 값은 바람직하게는 NH3 (기체 또는 NH4OH 수용액으로서) 의 자동 첨가에 의해 6.2 내지 7.2 로 설정된다.
일부 경우에, 올리고당의 생합성은 예를 들어 EP 2 379 708 로서 공개된 유럽 특허 출원에서와 같이 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG) 와 같은 화학 화합물의 첨가에 의해 유도될 필요가 있다. 유도체 화합물은 배양 초기에 배지에 첨가될 수도 있거나, 또한 배양 중에 연속적으로 또는 간헐적으로 공급될 수도 있거나, 또는 초기 첨가와 공급의 조합에 의해 첨가될 수도 있다.
이어서, 본 발명의 방법은 제 2 단계 (도 1, 단계 S12) 에서 pH 값의 조정으로 진행한다. 상기 단계에서, 전형적으로 7 미만의 용액의 pH 값은 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 낮춰진다. 용액의 pH 값은 바람직하게는 3.0 내지 5.5 의 범위, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 5 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 4.0 내지 4.5 의 범위, 예컨대 4.0 또는 4.1 의 목표 pH 값으로 낮춰진다. 상기 적어도 하나의 산은 H2SO4, H3PO4, HCl, HNO3 (바람직하게는 농축된 형태는 아님) 및 CH3CO2H 로 이루어진 군으로부터 선택된 산, 또는 식품 또는 먹이의 생성시 안전하게 고려되는 임의의 다른 산이고; 바람직하게 산은 H2SO4, H3PO4, HCl 및 CH3CO2H 로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 산의 혼합물은 일 실시형태에서, 이들 산 중 단일 산 대신에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법의 다른 실시형태에서, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액이 이미 7 미만, 바람직하게는 pH 5.5 미만, 더욱 바람직하게는 pH 5.0 이하, 더욱 더 바람직하게는 pH 4.5 이하의 pH 값을 갖는 경우, 이들 산 중 임의의 산의 첨가는 없을 것이고, 단계 S12 는 스킵될 수도 있으며, 이러한 용액에 대한 본 발명의 방법은 단계 S14 로 계속된다.
그 후, 방법은 다음 단계 (도 1, S14) 로 진행한다. 상기 단계에서, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액에 하나 이상의 흡착제가 첨가된다. 바람직하게는, 흡착제는 활성 탄소이다. 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 0.5 중량% 내지 3 중량% 의 범위, 바람직하게는 0.6 중량% 내지 2.5 중량% 의 범위, 더욱 바람직하게는 0.7 중량% 내지 2.0 중량% 의 범위, 예컨대 1.5 % 의 양으로 첨가된다. 이러한 점에서, 흡착제의 입자가 작을수록 흡착 특성이 우수함을 주목해야 한다. 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 직경 d50 이 2 ㎛ 내지 25 ㎛ 의 범위, 바람직하게는 3 ㎛ 내지 20 ㎛ 의 범위, 더욱 바람직하게는 3 ㎛ 내지 7 ㎛ 의 범위, 예컨대 5 ㎛ 인 입자 크기 분포를 갖는 분말로서 첨가된다. 더욱 바람직하게, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 물에서 분말의 현탁액으로서 첨가된다. 바람직하게, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 용액에 첨가하는 것은 용액에 적어도 하나의 산을 첨가한 후에 수행된다. 대안적으로, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 용액에 첨가하는 것은 용액에 적어도 하나의 산을 첨가하기 전에 수행될 수도 있다. 즉, 단계들 S12 및 S14 의 순서는 변경될 수도 있으며, 그 순서는 고정되지 않는다. 그러나, 순서가 7 미만의 pH 를 원하는 pH 값으로 제 1 설정하고, 그 후에 하나 이상의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 첨가하는 것은 단백질 제거 및 탈색과 관련하여 최상의 결과를 생성할 것이다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 산의 첨가는 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소의 첨가를 수반한다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시형태에서, 단계들 S12 및 S14 은 모두 S12 다음에 S14 의 순서로 수행된다.
그 후에, 상기 방법은 분리 전에 하나 이상의 흡착제에 대한 색 성분의 접착에 적합한 시간을 포함하는 추가 단계 (도 1, 단계 S16) 에서 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과로 진행한다. 제 1 막 여과는 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스 및 하나 이상의 흡착제를 분리하기 위해 수행되며, 이에 의해 바이오매스를 제거하고 또한 올리고당, 이당류 및/또는 단당류를 포함하는 투과물이라고도 불리는 생성된 용액 내의 색 성분 및 단백질을 감소시킨다. 기본적으로, 단계 S16 는 미세여과 또는 한외여과를 포함한다. 그러나, 미세여과와 한외여과 사이에 매끄러운 전이가 존재하기 때문에, 이 둘 모두는 일 측에서는 바이오매스, 흡착제 및 단백질과 타 측에서는 원하는 하나 이상의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 다량으로 함유하는 투과물을 분리하기 위한 목적으로 당업자에 의해 사용될 수 있다. 단계 S16 에서의 여과는 또한 미세여과에 대한 대안으로서 한외여과일 수도 있다. 상기 미세여과 또는 한외여과는 바람직하게는, 막 성능을 개선하고 막 마모를 감소시키기 위해 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과로서 수행된다. 상기 S16 단계의 여과에 대한 상세한 설명은 후술될 것이다. 상기 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과는 0.5 m/s 내지 6.0 m/s 의 범위, 바람직하게는 2.0 m/s 내지 5.5 m/s 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 3.0 m/s 내지 4.5 m/s 의 범위, 예컨대 4.0 m/s 의 직교류 속도를 포함한다. 일 실시형태에서, 직교류 속도는 3.0 m/s 이하, 바람직하게는 1.0 과 2.0 사이이고 1.0 과 2.0 을 포함한다. 본 발명의 방법, 용도 및 장치의 하나의 이점은, 바람직하게는 임의의 올리고당, 이당류 또는 단당류로부터 용액의 단백질 성분들의 양호한 분리를 달성하기 위해 더 낮은 직교류 속도가 사용될 수 있다는 것이다. 따라서, 에너지 및 설비 비용을 감소시킬 수 있고, 여과 막의 마모 및 설비 마모 및 파손을 감소시킨다. 상기 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과는 8 ℃ 내지 55 ℃ 의 범위, 바람직하게는 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 40 ℃ 의 범위, 예컨대 38 ℃ 의 용액 온도에서 수행된다. 상기 미세여과 또는 한외여과는 20 nm 내지 800 nm 의 범위, 바람직하게는 40 nm 내지 500 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위, 예컨대 100 nm 의 공극 크기를 갖는 세라믹 또는 중합체 미세여과 막 또는 세라믹 한외여과 막에 의해 수행된다. 상기 세라믹 재료는 이산화티탄 (TiO2), 이산화지르코늄 (ZrO2), 탄화규소 (SiC) 및 산화알루미늄 (Al2O3) 으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세라믹 재료의 적어도 하나의 층이거나 적어도 하나의 층을 갖는다. 대안적으로, 상기 미세여과 또는 한외여과는 10 kDa 내지 200 nm 의 범위, 바람직하게는 50 kDa 내지 200 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 kDa 내지 100 nm 의 범위의 컷오프를 갖는 중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막에 의해 수행된다. 상기 중합체 재료는 폴리에테르술폰, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중합체 재료이다. 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과는 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소가 용액에 첨가된 후의 미리 결정된 시간 후에 수행된다. 따라서, 색 성분의 접착을 보장한다. 전형적으로, 용액 내의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소의 균일한 분포에 도달할 때까지, 용액을 첨가된 흡착제와 혼합하는데 필요한 시간은 색 성분의 접착을 허용하기에 충분할 수도 있지만, 이를 최대화하기 위해 더 긴 인큐베이션 시간이 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 미리 결정된 시간은 적어도 2 분, 바람직하게는 적어도 10 분, 더욱 바람직하게는 적어도 20 분, 예컨대 25 분 또는 30 분이다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 전형적으로 제 2 막 여과 단계 (도 1, 단계 S18) 로 진행한다. 바람직하게는, 단계 S16 의 제 1 막 여과에 의해 수득된 올리고당, 이당류 및/또는 단당류를 포함하는 용액의 한외여과가 수행된다. 즉, 단계 S16 에서 1 차 막 여과로부터 유래된 투과물의 한외여과를 수행한다. 바람직하게, 상기 제 2 막 여과, 바람직하게 한외여과는 1.5 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 바람직하게는 2 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 더욱 바람직하게는 4 kDa 내지 5 kDa 의 범위의 컷오프를 갖는 한외여과 막에 의해 수행된다. 특히 바람직한 실시형태에서, 4 kDa 또는 5 kDa 의 컷오프를 갖는 막이 적합하다. 상기 한외여과 막은 적어도 부분적으로 중합체 재료로 만들어진다. 상기 중합체 재료는, 폴리에테르술폰, 폴리아크릴로니트릴, 셀룰로오스 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중합체 재료이다. 상기 제 2 막 여과, 바람직하게는 한외여과는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 범위, 바람직하게는 8 ℃ 내지 13 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 8 ℃ 내지 12 ℃ 의 범위, 예컨대 10 ℃ 의 용액 온도에서 수행된다.
도 2 는 분리 단계 (도 2 의 S15) 로 도시되는 분리 전에 하나 이상의 흡착제에 색 성분을 접착하기에 적합한 시간을 갖는 본 발명의 방법의 단계들의 순서를 도시한다. 이러한 별도의 인큐베이션 단계는 흡착제에 대한 바람직하지 않은 화합물의 충분한 접착을 위해 긴 시간이 필요할 때 유리할 수도 있다. 또한, 도 2 는 3 개의 부분을 갖는 단계로서 제 1 막 여과 (도 1 에서 S16 임) 에 대해 도시하고; 제 1 막 여과의 3 개의 단계는 제 1 정용여과, 농축, 이어서 선택적으로 제 2 정용여과이다. 이들은 도 2 에서 각각 S16-1, S16-2 및 S16-3 으로서 도시된다. 다른 단계들은 도 1 에서와 같다.
다른 실시형태에서, 단계들 S10 내지 S18 이 수행되고, 여기서 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 단당류, 적어도 하나의 이당류 또는 적어도 하나의 단당류 대신, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 올리고당의 혼합물이 적어도 하나의 올리고당 대신에 존재한다.
의심을 피하기 위해, 용액 또는 투과물 또는 잔류물의 단백질 함량에 대한 임의의 참조는 용액/투과물/잔류물 중의 자유 단백질, 즉, 임의의 경우 바이오매스에 함유된 단백질이 아닌, 세포외에서 발견된 단백질을 지칭한다. 발효 및 또한 후속 취급 및 막 여과 동안, 단백질은 바이오매스로부터 유리될 수도 있고, 그 후 자유 단백질로 간주될 수도 있다.
의심을 피하기 위해, 용액 또는 투과물 또는 잔류물의 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류에 대한 임의의 참조는 용액/투과물/잔류물 내에 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류가 자유인 (free) 것을 지칭하며, 즉 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류는 세포외에서 발견되고, 임의의 경우 바이오매스에 함유된 것은 아니다. 발효 및 또한 후속 취급 및 막 여과 동안, 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류는 바이오매스로부터 유리될 수도 있고, 그 후 용액 내에서 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류가 자유인 것으로 간주될 수도 있다.
바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하기 위해, 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 단계는 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류로부터 바이오매스를 분리하는 단계로서 이해되며, 여기서 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류의 대부분은 바이오매스의 분리 후에 제 1 막 여과의 투과물에서 발견된다.
바람직한 실시형태에서, 제 1 막 여과 이후에 한외여과, 그 후에 선택적으로 나노여과, 이온 교환 및/또는 역삼투가 뒤따른다.
요약하면, 본 발명은 다음의 실시형태를 포함하고, 여기서 이들은 본 명세서에서 정의된 각각의 상호의존성에 의해 나타낸 바와 같이 실시형태의 특정 조합을 포함한다.
추가의 실시형태
실시형태 1: 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법으로서,
a. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액을 제공하는 단계,
b. pH 값이 pH 7.0 이상인 경우, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 용액의 pH 값을 7.0 미만으로 낮추는 단계,
c. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 하나 이상의 흡착제를 첨가하는 단계,
d. 선택적으로, 하나 이상의 흡착제가 용액 내의 색 성분들을 결합시키기에 충분한 인큐베이션 단계, 및
e. 바이오매스 및 하나 이상의 흡착제가 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 분리되는 효과에 대해, 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 단계
를 포함한다.
실시형태 1A: 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법으로서,
a. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액을 제공하는 단계,
b. 선택적으로 하나 이상의 흡착제를 용액에 첨가하는 단계,
c. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써, 용액의 pH 값을 7.0 미만, 바람직하게는 5.5 미만, 더욱 바람직하게는 5.0 미만, 더욱 더 바람직하게는 pH 4.5 이하로 설정하는 단계,
d. 용액 내의 색 성분들 및 세포외 단백질의 대부분을 제거하기에 적합한 양으로, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 하나 이상의 흡착제를 첨가하는 단계,
e. 선택적으로, 하나 이상의 흡착제가 용액 내의 색 성분들을 결합시키기에 충분한 인큐베이션 단계, 및
f. 바이오매스가 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류의 대부분을 포함하는 용액으로부터 분리되는 효과를 위해, 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 단계
를 포함한다.
실시형태 1B: 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법으로서,
a. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액을 제공하는 단계,
b. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 용액의 pH 값을 7.0 미만으로 낮추는 단계,
c. 바이오매스 및 적어도 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 하나 이상의 흡착제를 첨가하는 단계,
d. 선택적으로, 하나 이상의 흡착제가 용액 내의 색 성분들을 결합시키기에 충분한 인큐베이션 단계, 및
e. 바이오매스를 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 분리하기 위해, 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 단계
를 포함한다.
실시형태 A1: 장치로서,
ⅰ. 바이오매스, 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소 및 적어도 하나의 올리고당 및/또는 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 함유하는 용액으로서, 상기 용액의 pH 값은 7 미만인, 상기 용액,
ⅱ. 제 1 여과 막, 바람직하게는 미세여과 막 또는 한외여과 막,
ⅲ. 다량의 올리고당, 이당류 및/또는 단당류를 함유하는 투과물을 생성하기 위해, 상기 제 1 여과 막, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 가로질러 제 1 막 여과를 수행하는 수단, 및
ⅳ. 상기 i 에 기재된 바와 같이 용액으로부터 제 1 막 여과의 투과물을 분리하는 수단
을 포함하며, 또한 선택적으로,
ⅴ. 제 1 막 여과의 상기 투과물을 제 2 여과 막으로 이동시키는 수단,
ⅵ. 투과물의 온도를 20 ℃ 미만의 온도로 조정하는 수단,
ⅶ. 제 2 여과 막, 바람직하게는 한외여과 막,
ⅷ. 20 ℃ 미만의 온도에서 제 2 막 여과, 바람직하게는 한외여과를 수행하는 수단, 및
ⅸ. 상기 제 1 막 여과의 투과물로부터 상기 제 2 막 여과액의 투과물을 계속 분리하는 수단
을 포함하며,
상기 용액 또는 임의의 상기 투과물들과 접촉하는 장치의 부분의 표면은 식품의 생산에 적합한 재료로 제조되고, pH 3.5 만큼 낮은 pH 값에 내성이 있다.
실시형태 A2: 장치로서,
ⅰ. 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당 및/또는 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 함유하는 용액을 홀딩하는 용기,
ⅱ. 상기 용액의 온도를 5℃ 와 70 ℃ 사이의 온도로 조정하는 수단;
ⅲ. 용기 내의 용액의 pH 값을 측정하기 위한 측정 시스템;
ⅳ. 용액의 pH 값을 7.0 미만의 값, 바람직하게는 5.5 미만의 목표 pH 값으로 설정하는 수단으로서, 바람직하게는 pH 를 설정하는 수단은 적어도 하나의 산의 첨가에 적합한, 상기 용액의 pH 값을 설정하는 수단,
ⅴ. 상기 용액에 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 첨가하는 수단,
ⅵ. 용액에서 흡착제의 본질적으로 균일한 분포를 생성하는 수단,
ⅶ. 제 1 여과 막, 바람직하게는 미세여과 막 또는 한외여과 막,
ⅷ. 상기 제 1 여과 막의 도움으로, 7.0 미만의 pH 값을 가지고 바이오매스, 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소 및 적어도 하나의 올리고당 및/또는 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 함유하는 용액의 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 수단으로서, 상기 수단은 다량의 올리고당, 이당류 및/또는 단당류를 함유하는 투과물을 생성하기에 적합한, 상기 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 수단, 및
ⅸ. 7.0 미만의 pH 값을 가지고 바이오매스, 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소 및 적어도 하나의 올리고당 및/또는 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 함유하는 용액으로부터 제 1 막 여과의 투과물을 수집, 이동 및 선택적으로 저장하는 수단
을 포함하며, 또한 선택적으로,
ⅹ. 제 1 막 여과의 상기 투과물을 제 2 여과 막으로 이동시키는 수단,
ⅹⅰ. 제 1 투과물의 온도를 20 ℃ 미만의 온도로 조정하는 수단,
ⅹⅱ. 제 2 여과 막, 바람직하게는 한외여과 막,
ⅹⅲ. 20 ℃ 미만의 온도에서 제 2 막 여과, 바람직하게는 한외여과를 수행하는 수단, 및
ⅹⅳ. 상기 제 1 막 여과의 투과물로부터 상기 제 2 막 여과액의 투과물을 분리하는 수단
을 포함하며,
상기 용액 또는 임의의 상기 투과물들과 접촉하는 장치의 부분의 표면은 식품의 생산에 적합한 재료로 제조되고, pH 3.5 만큼 낮은 pH 값에 내성이 있다.
실시형태 B1
적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스의 분리에 사용되는 막 여과 장비의 마모와 파손 및/또는 에너지 소비를 감소시키는 방법으로서,
a. 바이오매스 및 당류를 포함하는 용액을 제공하는 단계,
b. pH 값이 pH 7.0 이상인 경우, 바이오매스를 포함하고 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 용액의 pH 값을 7 미만으로 낮추는 단계,
c. 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 용액에 하나 이상의 흡착제를 첨가하는 단계,
d. 선택적으로, 요구되는 바와 같이, 하나 이상의 흡착제가 용액 내의 색 성분들을 결합시키기에 충분한 인큐베이션 단계, 및
e. 3 m/s 이하의 직교류 속도로 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하기 위해 제 1 막 여과를 수행하는 단계를 포함한다.
실시형태 2: 실시형태 1, 1A, 1B 또는 B1 중 어느 하나에 따른 방법 또는 실시형태 A1 또는 A2 에 따른 장치로서, 상기 흡착제는 활성 탄소이다.
실시형태 3: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 용액의 pH 값은 3.0 내지 5.5 의 범위, 바람직하게는 3.5 내지 5 의 범위, 더욱 바람직하게는 4.0 내지 4.5 의 범위의 pH 값으로 낮춰진다.
실시형태 4: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 적어도 하나의 산은 H2SO4, H3PO4, HCl, HNO3 및 CH3CO2H 로 이루어진 군으로부터 선택된 산이다.
실시형태 5: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 0.5 중량% 내지 3 중량% 의 범위, 바람직하게는 0.75 중량% 내지 2.5 중량% 의 범위, 더욱 바람직하게는 1.0 중량% 내지 2.0 중량% 의 범위의 양으로 첨가된다.
실시형태 6: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 직경 d50 이 2 ㎛ 내지 25 ㎛ 의 범위, 바람직하게는 3 ㎛ 내지 20 ㎛ 의 범위, 더욱 바람직하게는 3 ㎛ 내지 7 ㎛ 의 범위인 입자 크기 분포를 갖는 분말로서 첨가된다.
실시형태 7: 실시형태 6 에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 물에서 흡착제 분말의 현탁액으로서 첨가된다.
실시형태 8: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 용액에 첨가하는 단계는 용액의 pH 값이 7 미만일 때, 그리고 적어도 하나의 산이 용액에 계속 첨가되는 동안 또는 적어도 하나의 산을 용액에 첨가하는 것이 완료된 후에 수행된다.
실시형태 9: 실시형태 8 을 제외한 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 용액에 첨가하는 단계는 상기 용액에 적어도 하나의 산을 첨가하기 전에 수행된다.
실시형태 10: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 바이오매스 및 하나 이상의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하는 상기 용액은 배양 배지, 바람직하게는 적어도 하나의 탄소 공급원, 적어도 하나의 질소 공급원 및 무기 영양소를 포함하는 배양 배지에서, 하나 이상의 유형의 세포, 바람직하게는 박테리아 또는 효모, 더욱 바람직하게는 박테리아, 더욱 더 바람직하게는 유전적으로 변형된 대장균을 배양함으로써 수득된다.
실시형태 11: 이전 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하는 용액을 제공하는 단계는 미생물 발효에 의해 상기 용액을 제조하는 단계를 포함한다.
실시형태 12: 실시형태 B1 을 제외한 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 제 1 막 여과는 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과로서 수행된다.
실시형태 13: 실시형태 12 에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과는 0.5 m/s 내지 6.0 m/s 의 범위, 바람직하게는 2.0 m/s 내지 5.5 m/s 의 범위, 더욱 바람직하게는 2.2 m/s 내지 4.5 m/s 의 범위, 더욱 더 바람직하게는 2.5 내지 4.5 의 범위의 직교류 속도를 포함한다.
실시형태 14: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 제 1 막 여과는 8 ℃ 내지 55 ℃ 의 범위, 바람직하게는 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 40 ℃ 의 범위의 용액 온도에서 수행된다.
실시형태 15: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 제 1 막 여과는, 20 nm 내지 800 nm 의 범위, 바람직하게는 40 nm 내지 500 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위의 공극 크기를 갖는 세라믹 미세여과 막 또는 세라믹 한외여과 막에 의해 수행된다.
실시형태 16: 실시형태 15 에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 세라믹 재료는 TiO2, ZrO2, SiC 및 Al2O3 로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 세라믹 재료이다.
실시형태 17: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 제 1 막 여과는, 10 nm 내지 200 nm 의 범위, 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위, 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위의 컷오프를 갖는 중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막에 의해 수행된다.
실시형태 18: 실시형태 17 에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 중합체 재료는 폴리에테르술폰, 폴리술폰, 폴리프로필렌, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리비닐리덴 플루오라이드로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 중합체 재료이다.
실시형태 19: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 제 1 막 여과는 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소가 용액에 첨가된 후 미리 결정된 시간 후에 수행된다.
실시형태 20: 실시형태 19 에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 미리 결정된 시간이 적어도 2 분, 바람직하게는 적어도 10 분, 더욱 바람직하게는 적어도 20 분이다.
실시형태 21: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제 1 막 여과는 바람직하게는 2 개, 더욱 바람직하게는 3 개의 단계들: 제 1 정용여과 단계, 농축 단계 및 선택적으로 제 2 정용여과 단계를 포함하고, 이들 각각은 본 출원에 상세히 개시된 바와 같다.
실시형태 22: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 제 1 막 여과, 바람직하게는 제 1 막 여과의 투과물의 한외여과에 의해 수득된 적어도 하나의 올리고당, 하나 이상의 이당류 및/또는 하나 이상의 단당류를 포함하는 용액의 제 2 막 여과를 수행하는 단계를 더 포함한다.
실시형태 23: 실시형태 22 에 따른 방법으로서, 상기 제 2 막 여과는 한외여과이고, 1.0 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 바람직하게는 2 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 더욱 바람직하게는 4 kDa 내지 5 kDa 의 범위의 컷오프를 갖는 한외여과 막에 의해 수행된다.
실시형태 24: 실시형태 23 에 따른 방법으로서, 상기 한외여과 막은 적어도 부분적으로 중합체 재료로 제조된다.
실시형태 25: 실시형태 24 에 따른 방법으로서, 상기 중합체 재료는: 폴리에테르술폰, 폴리아크릴로니트릴, 셀룰로오스 아세테이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 중합체 재료이다.
실시형태 26: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제 2 막 여과는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 범위, 바람직하게는 8 ℃ 내지 13 ℃ 의 범위, 더욱 바람직하게는 8 ℃ 내지 12 ℃ 의 범위의 용액 온도에서 수행된다.
실시형태 27: 실시형태 22 내지 26 중 어느 하나에 따른 방법으로서, 상기 제 1 막 여과에 의해 수득된 올리고당을 포함하는 용액은 상기 제 2 막 여과 이전에 20 ℃ 미만의 온도가 되고 바람직하게는 상기 제 2 막 여과 동안 20 ℃ 미만의 온도로 유지된다.
실시형태 27: 이전의 실시형태들 중 어느 하나에 따른 방법 또는 장치로서, 상기 적어도 하나의 올리고당은 인간 모유 올리고당, 바람직하게는 2'-푸코실락토스, 6'-시알릴락토스 또는 락토-N-테트라오스, 및 더욱 바람직하게는 2'-푸코실락토스를 포함한다.
실시형태 28:
이전의 실시형태들 중 어느 하나에서, 상기 바이오매스는 거대분자 바이오매스이다.
실시형태 29:
실시형태 28 에서, 상기 거대분자 바이오매스는:
- 목재, 스트로우, 줄기 및 리그닌, 리그노셀룰로오스, 셀룰로오스 및/또는 스타키를 함유하는 다른 식물성 재료; 및/또는
- 동물 및/또는 미생물 기원의 고분자 바이오매스, 바람직하게는 키틴 함유 물질 및/또는 다당류를 포함한다.
실시형태 30:
이전 실시형태들 중 어느 하나에서, 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당, 적어도 하나의 이당류 및/또는 적어도 하나의 단당류를 포함하는 용액은 다음 중 중 적어도 2 개의 혼합물을 포함한다:
- 적어도 하나의 올리고당, 및
- 적어도 하나의 이당류.
실시예들
본 발명에 따른 방법을 하기에 보다 구체적으로 설명할 것이다. 어떠한 것이든, 실시예는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1
바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 복합 용액으로서 발효 브로스는 2.4 kg 의 양으로 표준 방법에 의해 제조되었다. 그 pH 값은 92 g 의 10 % 황산을 첨가함으로써 4 ± 0.1 로 저하되었다. 이후, 식품 안전제인 활성 탄소 Carbopal Gn-P (Donau Carbon GmbH, Gwinnerstraße 27-33, 60388 Frankfurt am Main, Germany) 의 30 % 현탁액 98g 을 첨가하고 20 분 동안 교반하였다.
이렇게 제조된 용액을 Sartorius AG, Otto-Brenner-Str.20, 37079 Goettingen, Germany 의 반자동 MF 랩 유닛인 공정 장치에 공급하고, 그 목적을 위해 개질하고, 폐쇄 투과물에 의해 순환 방식으로 37 ℃ 로 가열하였다. 분리 목적을 위해, 공정 장치는 외경 10 mm, 내경 6 mm, 길이 1.2 m 의 모노 채널 엘리먼트 (Atech Innovations GmbH, Gladbeck, Germany) 및 50 nm 의 공극 크기를 갖는 Al2O3 으로 제조된 막을 포함하였다. 용액의 순환이 진행되고 용액이 37 ℃ 의 목표 온도를 포함하자마자, 투과물의 배출이 시작되었고 막 투과 압력의 제어가 활성화되었다.
본 발명의 방법의 종료 후에, 공정 장치를 정지시키고, 농축물을 배치하고, 공정 장치를 세정하였다. 세정은 50 ℃ 내지 80 ℃ 의 온도에서 0.5 % 내지 1 % NaOH 에 의해 수행하였으며, 여기서 NaOH 는 후속적으로 퍼징에 의해 제거되었다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 제 1 막 여과는 하기에 더 상세히 설명되는 바와 같이 3 개의 단계를 포함한다. 제 1 단계는 0.5 의 인자 (정용여과수의 양 = 발효 브로스의 시작량 x 정용여과 인자) 를 갖는 제 1 정용여과를 포함한다. 정용여과 동안, 첨가된 물의 양은 배출되는 투과물의 양과 동일하다. 제 1 단계는 연속 단계이고, 따라서 공급 용기 내의 부피는 일정하게 유지된다. 제 2 단계는 정용여과수의 공급을 중단함으로써 인자 2 로 발효 브로스를 농축하는 단계를 포함하고, 그 수준은 목표 값 (목표 값 = 발효 브로스의 시작시 부피 또는 질량/농축 인자) 으로 감소할 것이다. 후속하여, 제 3 단계는 제 2 정용여과를 포함한다. 이들 3 개의 단계들 동안 수집된 투과물은 전형적으로 조합되어 하기 표에 언급된 투과물을 형성한다. 이들 3 개 단계들에 의해, 투과물 내의 생성물의 더 낮은 희석 및 ≥ 95 % 의 증가된 수율이 실현된다. 제 2 정용여과의 인자를 증가시킴으로써, 수율은 더욱 증가될 수도 있다.
다음과 같은 분석 방법이 수행되었다.
- 생성물, 즉 인간 모유 올리고당 및 이차 성분의 결정을 위한 HPLC
- 건조 함량 측정용 건식 밸런스
- 표준 방법, 예를 들어 DIN EN ISO 6271 을 사용하여 색상을 측정하는 APHA
- 단백질의 농도 측정을 위한 브래드포드 단백질 분석.
일부 실험은 상이한 발효 브로스로 이루어졌는데, 이는 이들이 더 긴 기간에 걸쳐 저장되지 않을 수도 있기 때문이다. 방법이 정확히 작동하고 알려진 이점을 제공하는지 여부를 결정하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행했다:
- pH 값을 조절하지 않고 활성 탄소를 첨가하지 않음,
- pH 값을 조절하지 않고 활성 탄소를 첨가함,
- pH 값을 조절한 후에 활성 탄소를 첨가하지 않음,
- pH 값을 조절한 후에 활성 탄소를 첨가함,
- 활성 탄소를 첨가한 후 pH 값을 조절함.
이 후, 하기 약어가 사용된다:
- AC = 활성 탄소
- UF = 한외여과
- DF = 정용여과 인자 (비율: 물의 양 및 시작 부피)
- CF = 농축 인자 (시작 부피와 최종 부피의 비율)
- DP = 모듈을 따른 압력 강하 (pfeed-pretentate)
- 플럭스 = m2 및 시간 당 투과유량 (l/m2h)
- 직교류 속도 = 막 채널에서 현탁액의 선형 속도 (m/s)
- 막 하중 = 1m2 의 막 면적 (m3/m2) 으로 생성되는 투과물의 양
또한, 액체 분리에 대해서는 다음의 기호 및 설명을 사용한다.
또한, 하기 표에서, 용어 "시리즈" 는 각각의 실험 번호를 지칭한다.
표 1 은 pH 값과 활성 탄소에 따른 막 성능을 나타낸다.
상이한 색 성분들을 갖는 용액 및 그 용액의 상이한 올리고당 및 이당류 조성물을 생성하는 다양한 파라미터를 갖는 발효로부터 유래하는 발효 브로스의 상이한 배치들은 본 발명의 방법의 광범위한 적용성을 입증한다.
약어 "ads.[h]" 는 흡착제를 용액에 첨가한 후 제 1 막 여과를 시작하기 전의 시간이다.
시리즈 A1 은 여전히 상이한 pH 값에서 임의의 흡착제의 부재 하에 수행되었다. 시리즈 A2 는 활성 탄소의 존재 또는 부재 하에 pH 7.0 및 4.0 에서 수행되었다. 시리즈 A3 은 표시된 바와 같이 pH 4 및 다양한 양의 활성 탄소 및 상이한 직교류 속도에서 수행되었다. 이들 3 개 시리즈의 경우, DF = 1 인 제 1 정용여과 단계 및 CF = 2 인 농축 단계만을 수행한 후, 제 1 막 여과를 중지하고, 생성된 용액 및 시작 용액의 나머지를 분석하고 결과를 비교하였다.
하기 결과는 표 1 로부터 유도될 수 있다:
막 성능은 4 의 pH 값에서 4 m/s 의 직교류 속도에서 최대치를 갖는다. 막 성능은 1 % 활성 탄소의 존재시 pH 값 7 에서 감소되는 반면, 막 성능은 4 m/s 의 직교류 속도로 1 % 활성 탄소의 존재시 4 의 pH 값에서 대략 4 의 인자만큼 향상된다. 0.3 시간에서 24 시간까지 활성 탄소를 첨가한 후의 흡착 시간을 증가시키는 것은 단지 막 성능의 무시할만한 향상을 제공한다. 활성 탄소의 첨가량을 1 % 에서 2 % 로 증가시키면 막 성능이 낮춰진다. 4 m/s 에서 3 m/s 까지 직교류 속도의 감소는 막 성능을 감소시키지만, 이는 활성 탄소의 부재시보다 여전히 더 높다. 직교 속도의 감소는 전력 소비를 상당히 감소시키고 또한 막 마모의 위험을 감소시킨다.
표 2 는 시리즈 A1 의 pH 값과 활성 탄소에 따른 분석 결과들을 나타낸다. DC 는 건조 함량의 약어이다. OD 는 광학 밀도에 대한 것이다. 공급물은 바이오매스, 올리고당 및 이당류를 포함하는 용액을 의미한다. 투과물은 제 1 막 여과 후 생성된 용액이고, 공급물의 나머지를 농축시킨다.
하기 결과는 표 2 로부터 유도될 수 있다:
pH 값의 변동은 투과물의 색상 값에 영향을 미치지 않는다. 더 낮은 pH 값에서 더 낮은 APHA 값은 10 % 황산에 의한 발효 브로스의 약한 희석의 결과이다. 단백질의 농도는 더 낮은 pH 값에서 상당히 감소된다. 발효 브로스의 pH 값은 올리고당 3.2-Di-푸코실락토스 (3.2-Di-Fl) 및 2'푸코실락토스 (2FL) 또는 이당류 락토스에 큰 영향을 미치지 않는다.
표 3 은 시리즈 A2 의 pH 값과 활성 탄소에 따른 분석 결과들을 나타낸다. DC 는 건조 함량의 약어이다. OD 는 광학 밀도에 대한 것이다.
하기 결과는 표 3 로부터 유도될 수 있다:
발효 브로스에 1 % 활성 탄소를 첨가하는 것은 투과물의 색상 값을 감소시킨다. pH 값이 7 인 경우 1 % 활성 탄소는 약 65 % 에서 색상 값을 감소시킨다. pH 값이 4 인 경우 1 % 활성 탄소는 약 84 % 에서 색상 값을 감소시킨다. 따라서, 색상 값이 1000 의 상단보다 낮으므로 추가의 탈색은 필요가 없다. pH 값이 7 에서 활성 탄소를 첨가하는 것은 투과물 내의 단백질의 농도를 대략 40 % 로 감소시키는 반면, 활성 탄소를 첨가함으로써 이러한 관점에서 어떠한 효과도 단백질 농도에 대한 pH 효과에 비해 4 의 pH 값에서 유도될 수 없다. 그럼에도 불구하고, pH 값이 4 이고 1 % 활성 탄소를 첨가한 투과물 내의 단백질의 농도는, pH 값이 7 이고 1 % 활성 탄소를 첨가한 투과물 내의 단백질의 농도에 비해, 4 의 인자만큼 더 작다. 활성 탄소를 첨가하는 것은 양자의 pH 값에서 투과물 내에서 올리고당 3.2-디-푸코실락토스 (3.2-Di-Fl). 2'푸코실락토스 (2F-락툴로스) 와 2'푸코실락토스 (2FL). 의 농도에 큰 영향을 미치지 않는다. 따라서 이들 성분이 상당한 양으로 활성 탄소에 접착되지 않는다는 것이 유도될 수 있다. 이당류 락토스는 활성 탄소가 사용될 때 농도의 약간의 감소를 이 실험에서 보여준다. 그러나, 낮춰진 pH 및 활성 탄소의 유익한 효과는 이러한 이당류에 대한 본 발명의 방법의 적용을 허용한다.
표 4 는 시리즈 A3 의 pH 값과 활성 탄소에 따른 분석 결과들을 나타낸다. DC 는 건조 함량의 약어이다. OD 는 광학 밀도에 대한 것이다.
하기 결과는 표 4 로부터 유도될 수 있다:
활성 탄소를 첨가하는 것은 활성 탄소를 첨가하지 않는 실험과 비교할 경우, 투과물 내의 단백질의 농도를 95 % 로 감소시킨다. 활성 탄소의 첨가량을 1 % 에서 2 % 로 증가시키면 단백질의 농도에 유의한 또는 검출가능한 영향을 미치지 않는다. 활성 탄소를 첨가하는 것은 APHA 를 상당히 감소시킨다. 감소는 1 % 활성 탄소를 첨가할 때 대략 85 % 이고, 2 % 활성 탄소를 첨가할 때 93% 내지 95 % 이다. 여과 전에 더 긴 흡착 시간은 APHA 또는 단백질의 농도에 유의한 또는 검출가능한 영향을 미치지 않는다. 흡착 시간이 길어지거나 활성 탄소의 양이 증가하지 않은 것은 투과물 내의 올리고당 3.2-디-푸코실락토스 (3.2-Di-Fl). 2'푸코실락툴로스 (2F-락툴로스) 및 푸코실락토스 (2FL), 또는 이당류 락토스에 강한 영향을 미치지 않았다.
추가적인 실험은 제 2 정용여과 단계를 사용할 때 이러한 우수한 결과가 더욱 개선될 수 있음을 보여주었다.
또 다른 실험 (시리즈 A4) 에서, 바이오매스 (또한 공급물로도 불림) 를 포함하는 용액을 pH 를 낮추기 전에 또는 후에 활성 탄소를 첨가하는 효과를 시험하였다. 이 실험에서, DF 가 3 인 제 1 정용여과 단계만을 사용하였고, 제 1막 여과를 중지하고, 바이오매스를 포함하는 투과물 및 농축 용액을 분석하고, 2 개의 처리를 비교하였다.
표 5 는 시리즈 A4 의 pH 값과 활성 탄소에 따른 분석 결과들을 나타낸다.
하기 결과는 표 5 로부터 유도될 수 있다:
pH 값을 4 로 먼저 조절한 후, 색상 및 단백질의 활성 탄소 감소를 첨가하는 것이 활성 탄소를 먼저 첨가한 후 pH 값을 조절하는 경우보다 약 15 % 더 양호하다. 측정된 올리고당에 대한 강한 효과는 관찰되지 않았다. pH 값이 먼저 낮아질 때 이당류 락토스의 약간 더 강한 잔류가 관찰되었다. 빈 셀은 값이 결정되지 않았음을 나타낸다.
반대의 방식에 비해 막의 더 안정적인 성능 (플럭스. TMP. DP) 은 먼저 pH 를 4 로 조절한 후, 활성 탄소 현탁액을 첨가하였을 때 수득되었다.
실시예 2
이하에서는 실시예 1 과 차이점에 대해서만 설명하고, 동일한 파라미터는 반복하지 않는다.
바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 복합 용액으로서 발효 브로스를 제조하였다. 그 pH 값은 kg 당 38 g 의 20 % 황산을 발효 브로스에 첨가함으로써 4 ± 0.1 로 저하되었다. 추가로, 1 % 의 활성 탄소 분말을 첨가하였다. 분리는 친수성 50 kDa 폴리에테르술폰 (PES) 막 (NADIR® UH050 P. MICRODYN-NADIR GmbH. Kasteler Straße 45. 65203 Wiesbaden. Germany) 으로 수행하였다.
표 6 은 1 % 활성 탄소 분말로 pH = 4 에서의 흡착 시간 및 상이한 발효 브로스에 대한 직교류 속도의 함수로서 바이오매스 분리의 성능 데이터를 나타낸다. "Pe" 는 투과량을 나타낸다.
하기 결과는 표 6 로부터 유도될 수 있다:
상이한 시작 용액을 사용하여, pH 4.4, 1 % 활성 탄소 및 낮은 직교류 속도를 시험하였고, 우수한 막 성능을 생성하였다. 시작 용액에서 흡착제의 더 긴 인큐베이션 기간은 필요하지 않았다.
표 2, 3 및 6 의 결과를 비교하면, pH = 4 및 1 % 활성 탄소에서, 막 성능은 활성 탄소가 없는 발효 브로스로 pH 값 7 에서 측정된 성능과 비교하여 인자 4 내지 10 만큼 더 높았고, 1.5 m/s 부터 1.1 m/s 까지의 직교류 속도의 감소는 상당한 플럭스 감소를 초래하지만, 그 성능은 1.5 m/s 의 직교류 속도로 pH 값 7 에서의 시도와 비교하여 인자 2 만큼 여전히 더 높다는 결론을 내릴 수 있다.
추가 실험에서, 표 6 에 나타낸 발효 브로스의 배치들은 추가 시험을 위한 시작 용액 실험들로서 사용하였다. 배치 4 를 사용하여, 먼저 pH 를 4.0 으로 세팅한 후 1 % w/w 활성 탄소를 첨가하거나, 또는 먼저 동일한 백분율의 탄소를 첨가하고 그 후 pH 를 4.0 으로 세팅한 후, 제 1 막 여과가 뒤따르는 2 가지 변형들을 시험하였다. 이전에 관찰된 바와 같이, 막 여과의 투과물은 활성 탄소를 이미 pH 4.0 에서 용액에 첨가하는 것에 비해, 활성 탄소의 첨가 후에 pH 를 설정할 때 3 내지 4 배 더 많은 단백질을 나타내었다. 또한, 투과물의 APHA 값은 pH 조절 전에 활성 탄소를 첨가하였을 때 더 높았다. 양자의 처리는 측정된 올리고당 및 이당류에 대해 유사한 효과를 나타내었으며, 이들은 투과물에서 상당히 회수되었고, 잔류물에서의 손실은 10 % 내지 20 % 정도, 일부 경우에는 30 % 까지이다.
배치들 5, 6 및 7 을 사용하고 pH 를 4.0 으로 설정한 후에 1 % w/w 활성 탄소를 첨가하는 테스트에서, 투과물이 시작 용액의 단백질 양을 5 내지 15 % 만큼 적게 함유하는 것을 확인하였다. 700 미만 (배치 7) 및 400 미만 (배치 5 및 6) 의 투과물의 APHA 값이 달성되었다. 올리고당 및 이당류와 관련하여, 다시 대다수가 투과물에서 회수되었고, 잔류물은 배치 4 에서 관찰된 것과 유사한 양을 함유한다.
추가적인 관찰은 발효 브로스 내의 올리고당 및 락토스 농도가 상당히 변화할 수도 있다는 것이었다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 방법은 올리고당 및 락토스에 대해 유사한 결과로 적용될 수 있고; 하나의 추세로서 투과물 내의 더 낮은 색상 수는 투과물 내의 더 낮은 단백질 농도와 상관된다.
또한, 6'-시알릴락토스 또는 락토-N-테트라오스를 포함하는 표준 방법으로 생산된 발효 브로스의 여러 배치가 본 발명의 방법에서 시험되었다. pH 를 먼저 낮추고, 이어서 활성 탄소를 첨가했을 때의 결과는 상기에 나타낸 것과 비교할만하고 종종 훨씬 더 우수하였다. 예를 들어, 고농도의 색 성분으로 시작하여 공급물에 7000 이상의 APHA 값을 초래하는 락토-N-테트라오스를 포함하는 발효 브로스는 1000 미만, 그러나 전형적으로는 300 미만, 심지어 100 미만만큼 낮은 APHA 값을 갖는 제 1 막 여과 후 투과물을 제공하였다. 단백질 농도는 전형적으로 약 3 g/l 로부터 0.01 g/l 미만으로 저하되었다. 발효 브로스에서 본래 발견된 락토-N-테트라오스의 대다수, 전형적으로 95 % 초과는 조합된 투과물 내에 존재하였다. 유사하게, 존재하는 다른 올리고당 및 또한 이당류 락토스에 대해, 대부분은 조합된 투과물 내에 존재하였고, 제 1 막 여과의 말단에서 잔류물에서 단지 소량의 양만이 발견되었다. 적용된 DF 값은 3 미만이었다. 또한, 제 1 막 여과 후에 약 7000 의 APHA 값을 갖는 6'-시알릴락토스를 포함하는 발효 브로스는 300 미만 및 심지어 70 미만 만큼 낮은 APHA 값을 갖는 투과물을 생성하였다. 단백질 농도는 3 미만의 DF 값에서 발효 브로스에서의 시작 값과 비교하여 10 이상의 인자만큼 저하되었다. 발효 브로스에서 본래 발견된 6'-시알릴락토스의 대다수, 전형적으로 90 % 초과는 조합된 투과물 내에 존재하였다. 유사하게, 존재하는 다른 올리고당 및 또한 이당류 락토스에 대해, 대부분은 조합된 투과물 내에 존재하였고, 제 1 막 여과의 말단에서 잔류물에서 단지 소량의 양만이 발견되었다.
또한, pH 가 5.5 미만인 방법을 수행하는 것은 더 높은 pH 값 (직교류 속도 3.5 m/s, 온도 30 ℃; DF = 3) 에 비해 제 1 막 여과에서 플럭스가 개선된 것을 발견하였다. 이는 바이오매스 및 6'-시알릴락토스를 포함하는 용액의 pH 값이 pH 4.2 인 경우 더욱 개선되었다. pH 6.3 과 비교하여, 플럭스는 pH 5.2 가 사용되는 경우 2 배 이상 증가하였고, pH 값이 pH 4.2 인 경우 3 배 이상 증가하였다.
인용문헌
- WO 2015/032412
- EP 2 379 708
- CN 100 549 019
- EP 2 896 628
- US 9 944 965
Claims (15)
- 바이오매스 및 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 용액으로부터 바이오매스를 분리하는 방법으로서,
- 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 상기 용액을 제공하는 단계,
- 바이오매스 및 상기 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 상기 용액에 적어도 하나의 산을 첨가함으로써 상기 용액의 pH 값을 7 미만으로 설정하는 단계;
- 바이오매스 및 올리고당을 포함하는 상기 용액에 적어도 하나의 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소를 첨가하는 단계; 및
- 적어도 하나의 올리고당을 포함하는 상기 용액으로부터 상기 바이오매스를 분리하기 위해, 제 1 막 여과, 바람직하게는 미세여과 또는 한외여과를 수행하는 단계를 포함하는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항에 있어서,
상기 용액의 상기 pH 값은 3.0 내지 5.5 의 범위, 바람직하게는 3.5 내지 5 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 4.0 내지 4.5 의 범위의 pH 값으로 낮춰지는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 산은 H2SO4, H3PO4, HCl, HNO3 및 CH3CO2H 로 이루어진 군으로부터 선택된 산인, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 0.5 중량% 내지 3 중량% 의 범위, 바람직하게는 0.75 중량% 내지 2.5 중량% 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 1.0 중량% 내지 2.0 중량% 의 범위의 양으로 첨가되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 직경 d50 이 2 ㎛ 내지 25 ㎛ 의 범위, 바람직하게는 3 ㎛ 내지 20 ㎛ 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 3 ㎛ 내지 7 ㎛ 의 범위인 입자 크기 분포를 갖는 분말로서 첨가되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 5 항에 있어서,
상기 흡착제, 바람직하게는 활성 탄소는 물에서 상기 분말의 현탁액으로서 첨가되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 막 여과는 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과로서 수행되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 직교류 미세여과 또는 직교류 한외여과는 0.5 m/s 내지 6.0 m/s 의 범위, 바람직하게는 2.0 m/s 내지 5.5 m/s 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 3.0 m/s 내지 4.5 m/s 의 범위의 직교류 속도를 포함하는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 7 항에 있어서,
상기 직교류 속도는 3 m/s 이하이고, 바람직하게는 중합체 막에 대하여 1.7 m/s 이하인, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 막 여과는 8 ℃ 내지 55 ℃ 의 범위, 바람직하게는 10 ℃ 내지 50 ℃ 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 30 ℃ 내지 40 ℃ 의 범위의 용액 온도에서 수행되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 막 여과는 20 nm 내지 800 nm 의 범위, 바람직하게는 40 nm 내지 500 nm 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 50 nm 내지 200 nm 의 범위의 공극 크기를 갖는 세라믹 미세여과 또는 한외여과 막에 의해 수행되거나, 또는
상기 제 1 막 여과는 10 kDa 내지 200 nm 의 범위, 바람직하게는 50 kDa 내지 200 nm 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 50 kDa 내지 100 nm 의 범위의 컷오프를 갖는 중합체 미세여과 막 또는 중합체 한외여과 막에 의해 수행되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제 1 막 여과에 의해 수득된 올리고당을 포함하는 용액으로 제 2 막 여과, 바람직하게는 상기 제 1 막 여과의 막보다 더 낮은 컷오프를 갖는 막을 갖는 한외여과를 수행하는 단계를 더 포함하는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 12 항에 있어서,
상기 제 2 막 여과는 한외여과이고, 1.5 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 바람직하게는 2 kDa 내지 10 kDa 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 4 kDa 내지 5 kDa 의 범위의 컷오프를 갖는 한외여과 막에 의해 수행되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
상기 제 2 막 여과는 5 ℃ 내지 15 ℃ 의 범위, 바람직하게는 8 ℃ 내지 13 ℃ 의 범위, 및 더욱 바람직하게는 8 ℃ 내지 12 ℃ 의 범위의 용액 온도에서 수행되는, 바이오매스를 분리하는 방법. - 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 적어도 하나의 올리고당은 인간 모유 올리고당, 바람직하게는 2'-푸코실락토스, 6'-시알릴락토스 및/또는 락토-N-테트라오스, 및 더욱 바람직하게는 2'-푸코실락토스를 포함하는, 바이오매스를 분리하는 방법.
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