JP2022517218A - フィコシアニンを抽出するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、微細藻類の発酵によって産生された、特に、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａによって産生されたフィコシアニンを、選択的沈殿によって抽出および精製するための新規な方法に関する。
Description
本発明は、微細藻類の発酵によって産生された、特に、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａによって産生されたフィコシアニンを、選択的沈殿によって抽出および精製するための新規な方法に関する。
硫酸アンモニウム沈殿による、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａおよびＳｐｉｒｕｌｉｎａから抽出されたフィコビリンタンパク質の精製は、文献（Ｍｏｏｎら、２０１５；Ｃｒｕｚ ｄｅ Ｊｅｓｕｓら、２００６、ＣＮ１０６１９０８５３）に既に記載されているが、大量の硫酸アンモニウムを必要とし、硫酸アンモニウムおよび上清を再処理する際に深刻な問題を引き起こすため、産業的規模で適用することは非常に困難である。
高い純度レベルを得るための他の開示された精製方法、例えば、クロマトグラフィーまたはイオン交換樹脂精製（ＪＰ２００４３５９６３８）は、実施するのが非常に高価である。
粗製フィコシアニン溶液への酸の添加を用いたＳｐｉｒｕｌｉｎａフィコシアニンの沈殿が記載されている（ＴＮ２００９０００４０６、ＪＰ２００４３５９６３８、ＪＰ０６２７１７８３、ＣＮ１０６１９０８５３）。しかしながら、おおよそ４．５の、多数の他のタンパク質の等電点に近いＳｐｉｒｕｌｉｎａフィコシアニンの等電点を考慮すると、この方法は、選択的沈殿を可能とせず、したがって、フィコシアニンの精製を可能としない。同様に、Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ由来のフィコシアニンを沈殿させるためのサリチル酸の使用を記載しているものがある（ＷＯ２０１６／０３０６４３）。この酸の使用は、ＰＣの非選択的沈殿を生じ、得られた沈殿物は、特に、再可溶化が困難である。同じ結果がＧａｌｄｉｅｒｉａ ＰＣで得られた。
フィコシアニン抽出方法は、一般に、上清中にフィコシアニンを保護するために、微細藻類発酵に由来する水性粗製抽出物中に存在するフィコシアニン以外の有機物を沈殿させることにあり、この有機物は、フィコシアニンを沈殿させる前に濾過される（ＪＰ２００４３５９６３８）。しかしながら、一部の有機化合物、特に、複雑な多糖、例えば、グリコーゲンは、フィコシアニンと同じ条件下で可溶性のままである。
産業的なフィコシアニン精製方法において、水を除去して、フィコシアニンを濃縮するために、使用されるフィルターのカットオフ閾値よりも小さい小分子（タンパク質、イオン、有機酸など）を除去して、可能な限り最も純粋なフィコシアニンを得るために、濾過（限外濾過）工程が使用され得る。しかしながら、フィルターのカットオフ閾値がグリコーゲンのサイズよりも小さい場合、これは除去されず、残物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）の粘度を増加させ、濾過速度を減少させる。グリコーゲンの濃度依存的粘度効果が、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ由来の精製されたグリコーゲンを使用して実証されている（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａら、２０１７）。
また、得られた精製されたフィコシアニンは、高レベルのこれらの糖を保持し、これにより、フィコシアニンの品質、特に、それらの着色力が変わることがあり、同じ効果のために、より多くの量のフィコシアニンの産生および／または使用が必要となる。これらの残留多糖は、フィコシアニン製造コストを増大させるフィラーとして作用し、例えば、糖含有量の低い食料の調製における、得られたフィコシアニンの商業的使用を制限し得る。
本発明の目的は、とりわけ、最終産物中の残留糖含有量、特に、残留グリコーゲン含有量を低減させることによって、質的観点ならびに産業的および経済的観点の双方から、バイオマスから抽出されたフィコシアニンを抽出および精製するための方法を改善することである。
本発明による方法は、フィコビリンタンパク質の完全性に配慮し、また主要な不純物、特に、グリコーゲンを含む多糖が溶液中に維持されるのを可能にする条件下で、フィコシアニンを含む粗製抽出物から直接的にフィコシアニンの選択的沈殿を実施することにある。
この選択的沈殿は、２つの因子、すなわち一方は溶液のｐＨおよび他方はフィコシアニンの濃縮を、同時にまたは任意の順序で連続的に組み合わせた行為から生じる。
本発明による方法は、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａによって産生された酸性ｐＨ耐性フィコシアニンを精製するために特に適切である。
本発明は、初期フィコシアニン溶液とも呼ばれるフィコシアニンを含む溶液からフィコシアニンを抽出するための方法であって、
一方では、初期溶液のｐＨを、フィコシアニンの可溶性が低いｐＨ値の範囲（不安定範囲ともいう）内の選択された値に調節すること、および他方では、溶液中のフィコシアニンを濃縮してそれらの沈殿を促進することからなる選択的沈殿工程、および次いで、
沈殿したフィコシアニンの回収工程
を含む、方法に関する。
一方では、初期溶液のｐＨを、フィコシアニンの可溶性が低いｐＨ値の範囲（不安定範囲ともいう）内の選択された値に調節すること、および他方では、溶液中のフィコシアニンを濃縮してそれらの沈殿を促進することからなる選択的沈殿工程、および次いで、
沈殿したフィコシアニンの回収工程
を含む、方法に関する。
ｐＨ調節および濃縮の２つの行為は、同時に、または、濃縮の前に初期溶液のｐＨを調節することによって、もしくはｐＨ調節の前に初期溶液を濃縮することによって、連続的に実施され得る。
驚くべきことに、特徴的な濃縮条件とは、フィコシアニンのみが沈殿し、不純物として記載され得る他の産物、特に多糖が溶液中に残存することを意味する。
したがって、沈殿したフィコシアニンを、溶液からそれらを分離することによって回収し、そして必要に応じて、それらを乾燥させて、精製されたフィコシアニン粉末を得ることが可能である。
本発明による方法は、溶液からのフィコシアニンの抽出を可能にするだけでなく、同じ工程でそれらを精製することも可能にし、得られたフィコシアニンは、特に、残留糖含有量が低く、純粋である。
本発明による方法は、微生物を培養すること、次いで、産生されたバイオマスを回収し、フィコシアニンを抽出すること、およびこのバイオマスからフィコシアニンを回収することを含む、とりわけ産業的フィコシアニン製造方法という観点において、グリコーゲンをも産生するフィコシアニン産生微生物の培養物から抽出されたフィコシアニン溶液を精製するために特に適切である。
この方法は、高レベルのグリコーゲンを産生する微生物によって産生されたフィコシアニンのために、特に、総乾物基準で１０％よりも多くのグリコーゲンを含むバイオマスからフィコシアニンを抽出および精製するために、特に適切である。
Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ目の藻類（または微細藻類）等のフィコシアニン産生微生物は周知である。Ｃｙａｎｉｄｉａｌｅｓ目は、ＣｙａｎｉｄｉａｃｅａｅまたはＧａｌｄｉｅｒｉａｃｅａｅ科を含み、それら自身は、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ、ＣｙａｎｉｄｉｕｍまたはＧａｌｄｉｅｒｉａ属に下位分類され、これらには、他の種の中でも、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ １０Ｄ、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ ｍｅｒｏｌａｅ ＤＢＶ２０１、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｄａｅｄａｌｕｍ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｍａｘｉｍｕｍ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｐａｒｔｉｔｕｍ、Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｒｕｍｐｅｎｓ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｄａｅｄａｌａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｐａｒｔｉｔａまたはＧａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａが属する。特に、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍとしても公知）株ＵＴＥＸ ２９１９が挙げられる。
公知のフィコシアニン産生体、例えば、ｓｐｉｒｕｌｉｎａの一般名の下に産業的に培養されるＡｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ属の糸状性シアノバクテリアも挙げられる。
高いグリコーゲン含有量を伴ってフィコシアニンを産生する微生物は、特に、上述の微生物、特に、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ、ＣｙａｎｉｄｉｕｍおよびＧａｌｄｉｅｒｉａ属の種、より具体的にはＧａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの中から、同定されている。
フィコシアニン産生微生物を培養するための産業的方法は、当業者に周知である。特に、特許出願ＷＯ２０１７／０９３３４５、ＷＯ２０１７／０５０９１７が挙げられる。
バイオマスからのフィコシアニンの回収もまた、当業者に公知である。特に、特許出願ＷＯ２０１８／１７８３３４が挙げられる。これは、微生物の細胞区画において産生されたフィコシアニンを放出するために、機械的または酵素的細胞溶解の工程を通常必要とする。この溶解は、有利には、フィコシアニンの可溶化に有益なｐＨで実施される。この細胞溶解は、一般に、通常の濾過方法によって分離することができる懸濁物（粗製懸濁物と呼ばれる）中の有機物を含むフィコシアニン溶液を生成する。次いで、通常の沈殿および乾燥方法によってフィコシアニンを得ることができる純化された溶液を得るために、通常の限外濾過方法によって低分子量有機残渣を除去するためにさらに精製され得る、粗製フィコシアニン溶液が得られる。特に、セラミックメンブレンまたは有機メンブレン、例えば、ポリエーテルスルホン中空繊維でのタンジェンシャル濾過が挙げられる。これらのフィルターの閾値は、標的フィコビリンタンパク質よりも高いまたは低い分子量の分子を分離するために選択され得る。
本発明による方法は、酸ｐＨ耐性フィコシアニン溶液、特に、出願ＷＯ２０１７／０５０９１８に記載されるフィコシアニンを精製するために特に適切である。
特に、本発明による方法は、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａによって産生される酸ｐＨ耐性フィコシアニンを精製するために、より具体的には、Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａの発酵槽培養によってこれらフィコシアニンを産生するための産業的方法において、使用される。
この方法は、有利には、フィコシアニン産生微生物バイオマスから得られる粗製ジュースからフィコシアニンを抽出するために実施される。
有利には、初期フィコシアニン溶液、特に、粗製ジュースは、０．１～１０ｇ／Ｌのフィコシアニンを含む。
濃縮は、少なくとも１５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌ、より優先的には少なくとも３０ｇ／Ｌ、またはさらにより優先的には少なくとも４０ｇ／Ｌのフィコシアニン含有量を得るように水を除去することにある。
この濃縮は、初期溶液中のフィコシアニン含有量に基づく体積喪失のパーセンテージ（％）として定義され得る。
産業的なフィコシアニン産生方法において、粗製ジュースは、有利には、少なくとも１ｇ／Ｌのフィコシアニンを含む。この場合、濃縮は、液体の初期体積の少なくとも９３％を除去することにある。
濃縮は、フィコシアニンの完全性を保護する条件下での水の除去を可能にすることが知られている任意の方法によって実施される。水蒸発方法、特に、フィコシアニンの着色力に影響を与えることなしに、フィコシアニンの完全性を配慮する温度条件下でのこの蒸発を促進するための減圧下での水蒸発方法が挙げられる。また、液体の除去を可能にする方法、例えば、溶液中の水および小分子を通過させることが可能であるがタンパク質は保持する孔サイズを用いたタンジェンシャル濾過が挙げられる。
これらの濾過方法およびそれらを実施するためのデバイス、特に、ＲｅｐｌｉｇｅｎからのＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ ＴＦＦ ｓｙｓｔｅｍｓは、当業者に周知である。フィコシアニンについて、５０ｋＤ～１００ｋＤの孔を有するフィルター、特に、ポリエーテルスルホンまたはポリスルホンフィルターを選択することが有利である。
ｐＨ調節は、不安定範囲内のｐＨ値に到達するために、酸または塩基を初期溶液または濃縮溶液に添加することにある。不安定範囲は、精製されるフィコシアニンに、特に、フィコシアニンを産生した微生物に依存する。一般に、不安定範囲は、特に、上記酸ｐＨ耐性フィコシアニンについて、４．５～５．５である。
これらの酸ｐＨ耐性フィコシアニンについて、細胞溶解は、酸性ｐＨ、好ましくは４．５未満の、通常は約４の、またはさらには３まで低下されたｐＨで実施される。
その結果、ｐＨ調節は、不安定範囲内のｐＨに到達するために塩基を添加することからなる。
本発明の第１の実施形態によれば、本発明の方法は、第１に、初期ジュースを濃縮することにある。この場合、濃縮は、フィコシアニンの可溶化に有益なｐＨ、即ち、不安定範囲外で実施される。上記酸ｐＨ耐性フィコシアニンについて、フィコシアニンの可溶化に有益なｐＨは、有利には、４よりも低いまたは５よりも高い。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、第１に、ｐＨを不安定範囲に調節し、次いで、フィコシアニンが沈殿するまで溶液を濃縮することにある。
その結果、この方法は、不安定なｐＨの溶液を初期溶液から得て、次いで、不安定なｐＨの溶液を濃縮してフィコシアニンの沈殿を引き起こすものとして記載され得る。体積低減のパーセンテージには、フィコシアニンの沈殿が観察された時点で到達する。
この選択的沈殿工程は、有利には、室温で実施される。当然ながら、当業者は、例えば、沈殿が起こる工程の第２の部分（濃度またはｐＨ調節）を実施するために温度を低下させることによって、沈殿に好都合な方法で、温度を改変することができる。
次いで、溶液中の多糖、特に、グリコーゲンは、例えば、エタノールの添加による通常の多糖沈殿方法によって回収することができ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ－Ｇａｒｃｉａら、２０１６）、これらの多糖もまた、引き続いて精製することができる。
本発明の特定の実施形態によれば、フィコシアニンと共に初期溶液中に含まれる多糖は、溶液中でのそれらの保持に好都合な酵素的溶解に付される。微量のこれらの多糖は、フィコシアニン沈殿によって取り除かれる可能性が高く、多糖の量が既に低く、さらにより可溶性である低分子量オリゴ糖へと多糖が溶解された場合には、なおさらに低減される。さらに、濃縮工程がタンジェンシャル濾過によって実施される場合、低分子量オリゴ糖は、溶液中の他の小分子と共に除去され、これは、さらにより高いフィコシアニン含有量を有する溶液を得るのに好都合である。
特に、グリコーゲンの酵素的溶解は、５以下、好ましくは約４．５のｐＨで、室温で実施される。
これらの温度およびｐＨ条件は、酵素的反応の間にフィコシアニンを保護するのに特に適切である。
酸性ｐＨ条件下および室温で活性な酵素は、α１－４グルクロニダーゼ活性、α１－４グルコシダーゼ（またはアルファ－グルコシダーゼ）活性を有することが知られている酵素から選択される。特に、ペクチンを分解することが知られているペクチナーゼ、特に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの糸状性真菌から抽出されたペクチナーゼ、より具体的には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓから抽出されたペクチナーゼ、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社から名称Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）の下で販売されている酵素が挙げられる。
グリコーゲンの酵素的溶解は、α１－４グルクロニダーゼまたはα１－４グルコシダーゼに加えて、α１－６グルコシダーゼを用いても達成することができる。上述したｐＨおよび温度条件下で活性なα１－６グルコシダーゼもまた、当業者に公知である。特に、これらは、プルランのα１－６グリコシド結合を加水分解することが知られている、特に、デンプン分岐を除去することが知られている、プルラナーゼである。
これらは、一般に、細菌から、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属から抽出された酵素である。ＵＳ６，０７４，８５４、ＵＳ５，８１７，４９８およびＷＯ２００９／０７５６８２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｒａｍｉｆｉｃａｎｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓから抽出されたプルラナーゼを記載している。市販のプルラナーゼは、とりわけ、名称「Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ Ｄ２」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、「Ｎｏｖｏｚｙｍ ２６０６２」（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）および「Ｏｐｔｉｍａｘ Ｌ １０００」（ＤｕＰｏｎｔ－Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）の下でも公知である。
プルラナーゼ／アルファ－アミラーゼ混合物は、先行技術に記載されているが、とりわけデンプンからグルコースシロップを生産するためのものであることに留意されたい（ＵＳ２０１７／１５９０９０）。
当業者は、処理される溶液中の初期グリコーゲン含有量、使用される酵素の量、および産生されたフィコシアニンの所望の純度の関数として、グリコーゲンの量を最良に低減させる適切な反応条件を決定する方法を知っているであろう。
沈殿した固体フィコシアニンの回収は、当業者に公知の任意の方法、例えば、濾過または遠心分離によって実施される。
当業者は、濾過または遠心分離によって処理される体積を低減させるための、固体の回収の任意の方法を想起することができる。
この回収は、固体フィコシアニンの回収を補う初期溶液の添加を伴って、不連続に、バッチ中で、または連続的に実施され得る。
この連続的回収工程は、有利には、不安定なｐＨの溶液に対するタンジェンシャル濾過による濃縮を用いて実施され、当業者は、フィコシアニンの沈殿を促進するために、水除去および不安定なｐＨの溶液の供給のそれぞれの流速を調節することができる。
このような連続的方法は、初期溶液を処理するために特に適合され、多糖、特にグリコーゲンは、水および他の可溶性小分子と一緒にタンジェンシャル濾過によるそれらの除去に好都合な酵素的溶解を受ける。
本発明はまた、微生物の発酵によってフィコシアニンを産生するための方法であって、（ｉ）微生物を培養して、フィコシアニンに富んだバイオマスを得る工程、（ｉｉ）バイオマスを回収し、細胞溶解して、細胞粒子の懸濁物中の放出されたフィコシアニンを可溶化する工程、（ｉｉｉ）先に得られた懸濁物を清澄化して、粗製フィコシアニン溶液を得る工程、および（ｉｖ）先に得られた粗製溶液からフィコシアニンを回収する工程を含み、フィコシアニンの回収が、上で定義した選択的沈殿工程を含むことを特徴とする、方法に関する。
次いで、回収された固体は、任意の適切な方法によって乾燥され、必要に応じて粉砕され得る。
フィコシアニンを含む回収された固体は、当業者に公知の方法、例えば、透析濾過による精製に付されてもよい。
発酵培養、バイオマス回収、溶解および清澄化の方法、特に、特許出願ＷＯ２０１７／０５０９１７、ＷＯ２０１７／０９３３４５およびＷＯ２０１８／１７８３３４に記載されるものは、当業者に周知である。
本発明において実施される選択的沈殿は、扱われる材料の量、および固体フィコシアニンを乾燥させ、それを粉砕するのに必要なエネルギーの双方に関して、初期溶液から、特に、粗製ジュースからフィコシアニン粉末を生産するために必要なエネルギーを全体として減少させる。
本発明の方法によって得られたフィコシアニンは、少なくとも２、好ましくは少なくとも３の、またはさらには４よりも高い純度インデックスを有する。
この純度インデックスは、Ｍｏｏｎら（２０１４）によって記載される方法を用いた吸光度測定によって測定される。
有利には、得られたフィコシアニンは、６未満、有利には４未満、好ましくは３未満、より優先的には２．５未満、さらにより優先的には１未満のグリコーゲン／フィコシアニン比（乾燥重量による）を有するフィコシアニンである。
本発明はまた、得られたフィコシアニンの着色料としての、特に、食品着色料としての使用に関する。本発明はまた、本発明による低グリコーゲンのフィコシアニンを含む固体または液体の食品、特に、飲料に関する。
材料および方法
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍとも呼ばれる）ＵＴＥＸ＃２９１９。
株：Ｇａｌｄｉｅｒｉａ ｓｕｌｐｈｕｒａｒｉａ（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ ｃａｌｄａｒｉｕｍとも呼ばれる）ＵＴＥＸ＃２９１９。
培養条件：
バイオマスを、ＷＯ２０１７０５０９１８Ａ１に記載される条件を使用する流加発酵によって得る。
バイオマスを、ＷＯ２０１７０５０９１８Ａ１に記載される条件を使用する流加発酵によって得る。
抽出条件：
細胞を、ＤＹＮＯ（登録商標）－ＭＩＬＬ ＫＤボールミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ）を使用して機械的に粉砕する。フィコシアニン（ＰＣ）は親水性分子であるため、塩基（ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨなど）または酸（Ｈ２ＳＯ４、クエン酸など）によってｐＨを所望の値に調節することによって、水を用いて抽出する。粗製ＰＣ抽出物を、室温で、１００００ｇで、１０分間の遠心分離による細胞破壊片（ｄｅｂｒｉｓ）の分離後に回収する。粗製抽出物を、フィコシアニンの保持を可能にするカットオフ閾値を有するセラミックまたは有機メンブレンを用いたタンジェンシャル濾過によって濃縮する。次いで、サンプルを遠心分離して、上清から沈殿物を分離する。ペレットの質量を、精密てんびんを用いて測定する。沈殿したフィコシアニンを定量化するために、ペレットをｐＨ７の水溶液中に再懸濁して、その再可溶化を可能にする。
細胞を、ＤＹＮＯ（登録商標）－ＭＩＬＬ ＫＤボールミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆｅｎ ＡＧ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ）を使用して機械的に粉砕する。フィコシアニン（ＰＣ）は親水性分子であるため、塩基（ＮａＯＨ、ＫＯＨ、ＮＨ４ＯＨなど）または酸（Ｈ２ＳＯ４、クエン酸など）によってｐＨを所望の値に調節することによって、水を用いて抽出する。粗製ＰＣ抽出物を、室温で、１００００ｇで、１０分間の遠心分離による細胞破壊片（ｄｅｂｒｉｓ）の分離後に回収する。粗製抽出物を、フィコシアニンの保持を可能にするカットオフ閾値を有するセラミックまたは有機メンブレンを用いたタンジェンシャル濾過によって濃縮する。次いで、サンプルを遠心分離して、上清から沈殿物を分離する。ペレットの質量を、精密てんびんを用いて測定する。沈殿したフィコシアニンを定量化するために、ペレットをｐＨ７の水溶液中に再懸濁して、その再可溶化を可能にする。
ＰＣ測定：
フィコシアニン含有量および純度インデックスの評価を、Ｍｏｏｎら（Ｍｏｏｎら、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．、２０１４、１－６）によって記載された方法を使用する吸光度測定によって実施した。
フィコシアニン含有量および純度インデックスの評価を、Ｍｏｏｎら（Ｍｏｏｎら、Ｋｏｒｅａｎ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．、２０１４、１－６）によって記載された方法を使用する吸光度測定によって実施した。
実施例１：フィコシアニン（ＰＣ）の沈殿および精製に対する濃縮およびｐＨの影響
１ｇ／Ｌの初期濃度のＰＣおよび１．６の初期純度を有する粗製フィコシアニン溶液を、ｐＨ４におけるタンジェンシャル濾過によって濃縮して、２０ｇ／Ｌ、次いで３０ｇ／Ｌ、および次いで４５ｇ／Ｌの濃度を有する残物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を得る。産物の純度における増加が濾過の間に観察され得るが、この純度は、産物の濃縮の程度にもかかわらず、２の値を越えない。図１において、２０ｇ／Ｌの濃度について、フィコシアニンの沈殿は、ｐＨ４において低く、ｐＨがより高い値に増加するにつれて、わずかに増加することが理解できる（図１）。同時に、このｐＨ上昇の間の上清中の可溶性フィコシアニン濃度の測定値は、比較的小さい減少を示している。３０ｇ／ＬのＰＣ濃度について、ｐＨの変化による沈殿のこの現象は、さらにいっそう顕著であり、４．５および５．５の値について最大であるように見える（図１および図２）。最大で４０ｇ／Ｌの可溶物の値までのフィコシアニンのさらなる濾過および濃縮では、顕著な沈殿物の形成が、ｐＨ改変前でさえも、濾過の間に観察される（図１）。先と同様、ｐＨにおける変化は、フィコシアニン沈殿の現象を増加させる。
１ｇ／Ｌの初期濃度のＰＣおよび１．６の初期純度を有する粗製フィコシアニン溶液を、ｐＨ４におけるタンジェンシャル濾過によって濃縮して、２０ｇ／Ｌ、次いで３０ｇ／Ｌ、および次いで４５ｇ／Ｌの濃度を有する残物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を得る。産物の純度における増加が濾過の間に観察され得るが、この純度は、産物の濃縮の程度にもかかわらず、２の値を越えない。図１において、２０ｇ／Ｌの濃度について、フィコシアニンの沈殿は、ｐＨ４において低く、ｐＨがより高い値に増加するにつれて、わずかに増加することが理解できる（図１）。同時に、このｐＨ上昇の間の上清中の可溶性フィコシアニン濃度の測定値は、比較的小さい減少を示している。３０ｇ／ＬのＰＣ濃度について、ｐＨの変化による沈殿のこの現象は、さらにいっそう顕著であり、４．５および５．５の値について最大であるように見える（図１および図２）。最大で４０ｇ／Ｌの可溶物の値までのフィコシアニンのさらなる濾過および濃縮では、顕著な沈殿物の形成が、ｐＨ改変前でさえも、濾過の間に観察される（図１）。先と同様、ｐＨにおける変化は、フィコシアニン沈殿の現象を増加させる。
タンジェンシャル濾過によって、フィコシアニンの純度は減少し、収集されｐＨ７で再可溶化される沈殿物の純度については逆である。これは、より有益なｐＨ条件下で再可溶化され得るフィコシアニンの優先的な沈殿を示す。
表１は、ｐＨ７．５における沈殿についての、フィコシアニン沈殿物の再可溶化後のフィコシアニン純度の測定値を報告している。
実施例２：酵素的に消化されたサンプル由来のＰＣの沈殿および精製に対する濃縮およびｐＨの影響
この実施例では、粗製溶液を酵素的消化に付し、存在するグリコーゲンを分解する。酵素的分解は、酵素アルファ１－４グルクロニダーゼ（「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ Ｕｌｔｒａ ＳＰ－Ｌ」）およびアルファ１－６グルコシダーゼ（「Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２６０６２」）を用いて、室温でおよびｐＨ＝４で実施する。
この実施例では、粗製溶液を酵素的消化に付し、存在するグリコーゲンを分解する。酵素的分解は、酵素アルファ１－４グルクロニダーゼ（「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ Ｕｌｔｒａ ＳＰ－Ｌ」）およびアルファ１－６グルコシダーゼ（「Ｎｏｖｏｚｙｍｅ ２６０６２」）を用いて、室温でおよびｐＨ＝４で実施する。
タンジェンシャル濾過による富化を、数十ｇ／Ｌのフィコシアニン濃度に到達するように実施し、次いで、ｐＨ調節を実施して、沈殿を引き起こす。４．５、５および５．５におけるｐＨサンプルで、残留可溶性フィコシアニンの測定、そしてペレットの収集およびｐＨ７．５の緩衝溶液でのその再可溶化後に、沈殿したフィコシアニンの測定を行う。
先の実施例と同様に、沈殿は、４．５と５．５との間に含まれるｐＨ範囲について顕著であり、この場合の純度レベルは、沈殿したフィコシアニンの再可溶化の際に、３．８を上回る値に到達する。グリコーゲンの酵素的消化は、沈殿による精製に影響を与えない。以下の表２は、不安定性ｐＨへの調節による沈殿の後、およびまた、フィコシアニン沈殿物の再可溶化の後の、フィコシアニンの純度インデックス値を与える。
参考文献
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・Martinez-Garcia et al., Int J Biol Macromol. (2016) 89:12-8
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Claims (14)
- 初期フィコシアニン溶液からフィコシアニンを抽出するための方法であって、
ａ）前記初期溶液のｐＨを、フィコシアニンの可溶性が低いｐＨ値の範囲（不安定範囲ともいう）内の選択された値に調節すること、および前記溶液中のフィコシアニンを濃縮してその沈殿を促進させることからなる選択的沈殿を行う工程と、
ｂ）沈殿したフィコシアニンの回収を行う工程と
を含むことを特徴とする、方法。 - ｐＨ調節および濃縮の２つの行為が、同時に、または、濃縮の前に前記初期溶液のｐＨを調節することによって、もしくはｐＨ調節の前に前記初期溶液を濃縮することによって、連続的に実施されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
- 前記初期溶液が、フィコシアニンを産生するように培養された微生物バイオマスの溶解からの粗製溶液であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
- フィコシアニンが、酸性ｐＨにおいて安定なフィコシアニンであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- フィコシアニンが、Ｃｙａｎｉｄｉｏｓｃｈｙｚｏｎ、ＣｙａｎｉｄｉｕｍまたはＧａｌｄｉｅｒｉａ属の種から選択される微生物によって産生される、微生物起源のフィコシアニンであることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記不安定範囲のｐＨが、４．５～５．５であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮が、少なくとも１５ｇ／Ｌ、好ましくは少なくとも２０ｇ／Ｌ、より優先的には少なくとも３０ｇ／Ｌ、またはさらにより優先的には少なくとも４０ｇ／Ｌのフィコシアニン含有量を得るように水を除去することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記濃縮が、フィコシアニンの保持を可能にするカットオフ閾値を有するタンジェンシャル濾過によって実施されることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
- 回収されたフィコシアニンが、乾燥され、場合により粉砕されることを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 回収されたフィコシアニンが、少なくとも２、好ましくは少なくとも３の純度インデックスを有することを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
- 回収されたフィコシアニンが、４よりも高い純度インデックスを有することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
- 請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法によって得られた、精製されたフィコシアニン。
- 請求項１２に記載の精製されたフィコシアニンの食品着色料としての使用。
- 請求項１２に記載の精製されたフィコシアニンを含むことを特徴とする、食料。
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