BR112021013617A2

BR112021013617A2 - Processo para extrair ficocianinas

Info

Publication number: BR112021013617A2
Application number: BR112021013617-7A
Authority: BR
Inventors: Olivier CAGNAC; Axel Athane; Julien Demol
Original assignee: Fermentalg
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-09-14
Also published as: US20220073572A1; CA3125805A1; FR3091703B1; CN113454204A; FR3091703A1; JP2022517218A; MX2021008300A; AU2020207576A1; WO2020144331A1; CN113454204B; EP3908652A1; KR20210137994A

Abstract

processo para extrair ficocianinas. a invenção refere-se a um novo processo para extração e purificação de ficocianinas produzidas pela fermentação de microalgas, em particular produzidas por galdieria sulphuraria, por meio de precipitação seletiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “PROCESSO PARA EXTRAIR FICOCIANINAS”

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a um novo processo para extração e purificação de ficocianinas produzidas pela fermentação de microalgas, em particular produzidas por Galdieria sulphuraria, por precipitação seletiva.

TÉCNICA ANTERIOR

[002] A purificação de ficobiliproteínas extraídas de Galdieria sulphuraria e Spirulina por precipitação de sulfato de amônio já foi descrita na literatura (Moon et al., 2015; Cruz de Jesús et al., 2006, CN106190853), mas é muito difícil de aplicar em um escala industrial porque requer uma grande quantidade de sulfato de amônio, o que apresenta problemas significativos no reprocessamento do sulfato de amônio e do sobrenadante.

[003] Os outros métodos de purificação descritos para obter um alto nível de pureza, como cromatografia ou purificação de resina de troca iônica (JP 2004359638), são muito caros de implementar.

[004] A precipitação de ficocianina de Spirulina foi descrita com a adição de ácido à solução bruta de ficocianina (TN 2009000406, JP 2004359638, JP06271783, CN106190853).

Porém, considerando o ponto isoelétrico da ficocianina de Spirulina em torno de 4,5 e próximo ao ponto isoelétrico de um grande número de outras proteínas, esse método não permite precipitação seletiva e, portanto, purificação da ficocianina. De forma similar, alguns descrevem o uso de ácido salicílico para precipitar ficocianina de Spirulina (WO 2016/030643). O uso desse ácido gera uma precipitação não seletiva de PC e o precipitado resultante é particularmente difícil de ressolubilizar. O mesmo resultado foi obtido com PC de Galdieria.

[005] Os processos de extração de ficocianina geralmente consistem na precipitação de matéria orgânica diferente de ficocianinas presentes em um extrato bruto aquoso de uma fermentação de microalgas para preservar ficocianinas no sobrenadante, que será filtrado antes da precipitação de ficocianinas (JP 2004359638). No entanto, alguns compostos orgânicos, particularmente polissacarídeos complexos como o glicogênio, permanecem solúveis nas mesmas condições que as ficocianinas.

[006] Em um processo de purificação de ficocianina industrial, uma etapa de filtração (ultrafiltração) pode ser usada para remover água a fim de concentrar a ficocianina e remover pequenas moléculas (proteínas, íons, ácido orgânico, etc.) menores do que o limite de corte do filtro usado, a fim de obter a ficocianina mais pura possível. Porém, sendo o limite de corte do filtro menor que o tamanho do glicogênio, ele não é removido e aumenta a viscosidade do retentado, diminuindo as taxas de filtração. O efeito da viscosidade dependente da concentração do glicogênio foi demonstrado usando glicogênio purificado de Galdieria sulphuraria (Martinez–Garcia et al., 2017).

[007] Além disso, as ficocianinas purificadas obtidas retêm níveis elevados desses açúcares, o que pode alterar as qualidades das ficocianinas, em particular o seu poder corante, exigindo a produção e/ou uso de maiores quantidades de ficocianinas para o mesmo efeito. Esses polissacarídeos residuais atuam como uma carga que aumenta os custos de fabricação da ficocianina e pode limitar os usos comerciais da ficocianina resultante, por exemplo, na preparação de alimentos com baixo teor de açúcar.

[008] O objetivo é melhorar os processos de extração e purificação das ficocianinas extraídas da biomassa, tanto do ponto de vista qualitativo quanto do ponto de vista industrial e econômico, notadamente reduzindo o teor de açúcar residual no produto final, em particular o teor de glicogênio residual.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[009] O processo de acordo com a invenção consiste em realizar uma precipitação seletiva das ficocianinas diretamente do extrato bruto que as contém em condições que respeitam a integridade das ficobiliproteínas e que permitem que as principais impurezas, em particular os polissacarídeos incluindo glicogênio, sejam mantidas em solução.

[0010] Essa precipitação seletiva resulta de uma ação combinada sobre dois fatores, simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem, por um lado o pH da solução e por outro a concentração de ficocianina.

[0011] O processo de acordo com a invenção é particularmente adequado para purificar ficocianinas resistentes ao pH ácido produzidas por Galdieria sulphuraria.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0012] A invenção se refere a um processo para extrair ficocianinas de uma solução compreendendo a(s) ficocianina(s), também chamada de solução inicial de ficocianina, compreendendo uma etapa de precipitação seletiva que consiste por um lado em ajustar o pH da solução inicial a um valor selecionado dentro uma faixa de valores de pH em que as ficocianinas são menos solúveis (também chamada de faixa de instabilidade) e por outro lado na concentração das ficocianinas na solução para promover sua precipitação, e então uma etapa de recuperação da ficocianina precipitada.

[0013] As duas ações de ajuste de pH e de concentração podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente, seja ajustando o pH da solução inicial antes da concentração,

ou concentrando a solução inicial antes de ajustar o pH.

[0014] Surpreendentemente, as condições de concentração diferencial significam que apenas ficocianinas precipitam, os outros produtos que podem ser descritos como impurezas, particularmente polissacarídeos, permanecem em solução.

[0015] Assim, é possível recuperar as ficocianinas precipitadas separando-as da solução e, se necessário, secando-as para obter um pó de ficocianina purificado.

[0016] O processo de acordo com a invenção não só permite a extração das ficocianinas da solução, mas também permite na mesma etapa purificá-las, as ficocianinas sendo obtidas particularmente puras com baixo teor de açúcar residual.

[0017] O processo de acordo com a invenção é particularmente adequado para purificar uma solução de ficocianina extraída de uma cultura de microrganismos produtores de ficocianina que também produz glicogênio, em particular no contexto de um processo de produção industrial de ficocianina que compreende cultivar os microrganismos, em seguida, recuperar a biomassa produzida para extrair a ficocianina, e recuperar a ficocianina dessa biomassa.

[0018] O processo é particularmente adequado para ficocianinas produzidas por microrganismos que produzem altos níveis de glicogênio, especialmente para extrair e purificar ficocianinas de biomassa que compreende mais de

10% de glicogênio com base na matéria seca total.

[0019] Microrganismos produtores de ficocianina são bem conhecidos, incluindo algas (ou microalgas) da ordem Cyanidiales. A ordem Cyanidiales inclui as famílias Cyanidiaceae ou Galdieriaceae, elas mesmas subdivididas nos gêneros Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria, a que pertencem entre outras espécies Cyanidioschyzon merolae 10D, Cyanidioschyzon merolae DBV201, Cyanidium caldarium, Cyanidium daedalum, Cyanidium maximum, Cyanidium partitum, Cyanidium rumpens, Galdieria daedala, Galdieria maxima, Galdieria partita ou Galdieria sulphuraria. Pode ser feita menção particular à cepa Galdieria sulphuraria (também conhecida como Cyanidium caldarium) UTEX 2919.

[0020] Também podem ser citados produtores de ficocianinas conhecidos, como as cianobactérias filamentosas do gênero Arthrospira, cultivadas industrialmente com o nome comum de espirulina.

[0021] Os microrganismos produtores de ficocianina com alto teor de glicogênio são particularmente identificados entre os microrganismos citados acima, principalmente espécies dos gêneros Cyanidioschyzon, Cyanidium e Galdieria, mais particularmente Galdieria sulphuraria.

[0022] Os processos industriais para a cultura de microrganismos produtores de ficocianina são bem conhecidos do versado na técnica. Pode ser feita menção particular aos pedidos de patente WO 2017/093345, WO 2017/050917.

[0023] A recuperação de ficocianina da biomassa também é conhecida do versado. Pode ser feita menção particular ao pedido de patente WO 2018/178334. Geralmente requer uma etapa de lise celular, mecânica ou enzimática para liberar a ficocianina produzida nos compartimentos celulares dos microrganismos. Essa lise é realizada com vantagem a um pH favorável à solubilização de ficocianinas. Essa lise celular irá geralmente gerar uma solução de ficocianina que compreende matéria orgânica em suspensão (chamada suspensão bruta) que pode ser separada por métodos de filtração usuais.

Uma solução bruta de ficocianina é então obtida, a qual pode ser posteriormente purificada para remover resíduos orgânicos de baixo peso molecular por métodos usuais de ultrafiltração para obter uma solução refinada a partir da qual ficocianina pode ser obtida por métodos usuais de precipitação e secagem. Pode ser feita menção particular à filtração tangencial em membranas cerâmicas ou membranas orgânicas, tais como fibras ocas de polietersulfona. Os limites desses filtros podem ser escolhidos para separar moléculas de peso molecular maior ou menor do que as ficobiliproteínas alvo.

[0024] O processo de acordo com a invenção é particularmente adequado para purificar soluções ácidas de ficocianinas resistentes ao pH, em particular as ficocianinas descritas no pedido WO 2017/050918.

[0025] Em particular, o processo de acordo com a invenção é usado para purificar ficocianinas resistentes ao pH ácido produzidas por Galdieria sulphuraria, mais particularmente em um processo industrial para a produção dessas ficocianinas por cultura fermentadora de Galdieria sulphuraria.

[0026] O processo é implementado vantajosamente para extrair ficocianina do sumo bruto obtido de uma biomassa de microrganismo produtor de ficocianina.

[0027] Vantajosamente, a solução inicial de ficocianina, em particular o sumo bruto, compreende de 0,1 a 10 g/L de ficocianina.

[0028] A concentração consiste em retirar água de forma a obter um teor de ficocianina de pelo menos 15 g/L, preferivelmente pelo menos 20 g/L, mais preferivelmente pelo menos 30 g/L, ou ainda pelo menos 40 g/L.

[0029] Essa concentração pode ser definida como % de perda de volume com base no conteúdo de ficocianina na solução inicial.

[0030] Em um processo industrial de produção de ficocianina, o sumo bruto compreenderá vantajosamente pelo menos 1 g/L de ficocianinas. Nesse caso, a concentração consistirá em remover pelo menos 93% do volume inicial de líquido.

[0031] A concentração é feita por qualquer método conhecido que permita a remoção de água em condições que preservem a integridade das ficocianinas. Podem ser mencionados os métodos de evaporação da água, em particular sob pressão reduzida, para promover essa evaporação sob condições de temperatura que respeitem a integridade das ficocianinas, sem alterar o seu poder corante. Também podem ser mencionados métodos que permitem a remoção de um líquido, como a filtração tangencial com tamanhos de poros que permitem a passagem de água e pequenas moléculas em solução, mas retêm proteínas.

[0032] Esses métodos de filtração e os dispositivos para realizá-los são bem conhecidos do versado na técnica, em particular os sistemas Spectrum Labs TFF da Repligen. Para ficocianinas, é vantajoso escolher filtros com poros de 50 kD a 100 kD, em particular filtros de polietersulfona ou polissulfona.

[0033] O ajuste do pH consiste em adicionar um ácido ou uma base à solução inicial ou à solução concentrada para atingir um valor de pH na faixa de instabilidade. A faixa de instabilidade dependerá das ficocianinas a serem purificadas e, em particular, do microrganismo que as produziu. Em geral, essa faixa de instabilidade é de 4,5 a 5,5, em particular para ficocianinas resistentes ao pH ácido, conforme descrito acima.

[0034] Para essas ficocianinas resistentes ao pH ácido, a lise celular é feita em pH ácido, preferivelmente abaixo de 4,5, geralmente cerca de 4, ou mesmo abaixo de 3.

[0035] O ajuste do pH consiste então em adicionar uma base para atingir o pH na faixa de instabilidade.

[0036] De acordo com uma primeira modalidade da invenção, o processo consiste primeiro em concentrar o sumo inicial. Nesse caso, a concentração é realizada a um pH favorável à solubilização das ficocianinas, ou seja, fora da faixa de instabilidade. Para as ficocianinas resistentes ao pH ácido descritas acima, esse pH favorável à solubilização de ficocianinas será vantajosamente menor que 4 ou maior que

5.

[0037] De acordo com outra modalidade preferida da invenção, o processo consiste primeiro em ajustar o pH à faixa de instabilidade e depois concentrar a solução até que as ficocianinas precipitem.

[0038] O processo pode então ser descrito como a obtenção de uma solução de pH instável de uma solução inicial, em seguida, a concentração da solução de pH instável para causar a precipitação de ficocianinas. A porcentagem de redução de volume será atingida quando for observada a precipitação de ficocianinas.

[0039] Essa etapa de precipitação seletiva é vantajosamente realizada à temperatura ambiente. Obviamente,

o versado na técnica será capaz de modificar a temperatura de modo a favorecer a precipitação, por exemplo, baixando a temperatura para implementar a segunda parte da etapa (concentração ou ajuste de pH) durante a qual ocorre a precipitação.

[0040] Os polissacarídeos em solução, em particular o glicogênio, podem então ser recuperados por métodos usuais de precipitação de polissacarídeos, por exemplo, por adição de etanol (Martinez–Garcia et al., 2016), cujos polissacarídeos também podem ser posteriormente purificados.

[0041] De acordo com uma modalidade particular da invenção, os polissacarídeos contidos na solução inicial com as ficocianinas são submetidos a lise enzimática que favorece a sua retenção em solução. As quantidades residuais desses polissacarídeos provavelmente carregadas com a precipitação de ficocianina, que já são baixas, são reduzidas ainda mais quando os polissacarídeos são lisados em oligossacarídeos de baixo peso molecular que são ainda mais solúveis. Além disso, quando a etapa de concentração é realizada por filtração tangencial, os oligossacarídeos de baixo peso molecular são removidos com as outras pequenas moléculas em solução, o que favorece a obtenção de uma solução com teor de ficocianina ainda maior.

[0042] Em particular, a lise enzimática do glicogênio é realizada a um pH menor que ou igual a 5, preferivelmente de cerca de 4,5, à temperatura ambiente.

[0043] Essas condições de temperatura e pH são particularmente adequadas para preservar a ficocianina durante a reação enzimática.

[0044] As enzimas ativas sob condições de pH ácido e à temperatura ambiente são selecionadas a partir de enzimas conhecidas por terem atividade de α1–4 glucuronidase, α1–4 glucosidase (ou alfa–glucosidase). Será feita menção particular às pectinases conhecidas por degradarem a pectina e em particular as pectinases extraídas de fungos filamentosos como Aspergillus, mais particularmente as pectinases extraídas de Aspergillus aculeatus, tais como as enzimas comercializadas sob o nome de Pectinex® pela empresa Novozymes.

[0045] A lise enzimática do glicogênio também pode ser alcançada com uma α1–6 glicosidase além da α1–4 glicuronidase ou α1–4 glicosidase. α1–6 glucosidases ativas sob as condições de pH e temperatura estabelecidas acima também são conhecidas pelo versado. Em particular, essas são pululanases conhecidas por hidrolisar ligações glicosídicas α1–6 de pululana, em particular conhecidas por remover ramificações de amido.

[0046] Geralmente são enzimas extraídas de bactérias, principalmente do gênero Bacillus. US 6.074.854, US

5.817.498 e WO 2009/075682 descrevem pululanases extraídas de Bacillus deramificans ou Bacillus acidopullulyticus. As pululanases disponíveis comercialmente também são conhecidas, principalmente sob os nomes “Promozyme D2” (Novozymes), “Novozym 26062” (Novozymes) e “Optimax L 1000” (DuPont–Genencor).

[0047] Será notado que as misturas de pululanase/alfa- amilase são descritas na técnica anterior, mas em particular para produzir xarope de glicose a partir de amido (US 2017/159090).

[0048] O versado saberá como determinar as condições de reação apropriadas para melhor reduzir a quantidade de glicogênio em função do teor de glicogênio inicial na solução a ser tratada, a quantidade de enzimas usadas e a pureza desejada da ficocianina produzida.

[0049] A recuperação de ficocianinas precipitadas sólidas é feita por qualquer método conhecido do versado, tal como filtração ou centrifugação.

[0050] O versado será capaz de imaginar qualquer método de recuperação dos sólidos de modo a reduzir o volume a ser tratado por filtração ou centrifugação.

[0051] Essa recuperação pode ser feita de forma descontínua, em lotes, ou de forma contínua, com adição de solução inicial para compensar a recuperação de ficocianinas sólidas.

[0052] Essa etapa de recuperação contínua será vantajosamente implementada com uma concentração por filtração tangencial em uma solução de pH instável, sendo o versado na técnica capaz de ajustar as respectivas vazões de remoção de água e fornecimento de solução de pH instável para promover a precipitação de ficocianinas.

[0053] Tal processo contínuo será particularmente adaptado para tratar soluções iniciais em que os polissacarídeos e em particular o glicogênio tenham sofrido uma lise enzimática que favorece sua remoção por filtração tangencial com água e outras pequenas moléculas solúveis.

[0054] A invenção também se refere a um processo para produzir ficocianinas por fermentação de microrganismos, o dito processo compreendendo as seguintes etapas de (i) cultivar os microrganismos para obter uma biomassa rica em ficocianina, (ii) recuperar a biomassa e lise celular para solubilizar as ficocianinas liberadas em uma suspensão de partículas de células, (iii) clarificar a suspensão previamente obtida para obter uma solução bruta de ficocianina e (iv) recuperar a ficocianina da solução bruta obtida anteriormente, distinguida pelo fato de que a recuperação da ficocianina compreende uma etapa de precipitação seletiva conforme definida acima.

[0055] O sólido recuperado pode então ser seco por qualquer método adequado e, se necessário, moído.

[0056] O sólido recuperado compreendendo ficocianina também pode ser submetido a purificação por métodos conhecidos do versado, como a diafiltração.

[0057] Os métodos de cultivo de fermentação, recuperação de biomassa, lise e clarificação são bem conhecidos do versado, em particular aqueles descritos nos pedidos de patente WO 2017/050917, WO 2017/093345 e WO 2018/178334.

[0058] A precipitação seletiva implementada de acordo com a invenção diminui globalmente a energia necessária para produzir ficocianina em pó a partir de uma solução inicial, em particular de um sumo bruto, tanto em termos da quantidade de material a ser manipulado quanto da energia necessária para secar a ficocianina sólida e moer.

[0059] A ficocianina obtida por esse processo tem um índice de pureza de pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3, ou mesmo maior que 4.

[0060] Esse índice de pureza é medido pela medição de absorbância com o método descrito por Moon et al. (2014).

[0061] Vantajosamente, a ficocianina obtida é uma ficocianina que tem uma razão glicogênio/ficocianina (em peso seco) menor que 6, vantajosamente menor que 4, preferivelmente menor que 3, mais preferivelmente menor que 2,5, ainda mais preferivelmente menor que 1.

[0062] A invenção também se refere ao uso de ficocianinas obtidas como corantes, em particular como corantes alimentícios. Também se refere a alimentos sólidos ou líquidos, em particular bebidas, que compreendem uma ficocianina de baixo teor de glicogênio de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0063] A Figura 1 mostra a massa do precipitado obtido em diferentes concentrações de ficocianina e diferentes pHs na solução inicial.

[0064] A Figura 2 mostra a concentração de ficocianina no sobrenadante após a recuperação do precipitado em função do pH para diferentes concentrações de ficocianina.

EXEMPLOS Material e métodos

[0065] Cepa: Galdieria sulphuraria (também chamada Cyanidium caldarium) UTEX#2919.

Condições de cultivo:

[0066] A biomassa é obtida por fermentação em batelada alimentada usando as condições descritas na patente WO2017050918A1.

Condições de extração:

[0067] As células são moídas mecanicamente usando um moinho de esferas DYNO®–MILL KD (Willy A. Bachofen AG Maschinenfabrik). Como a ficocianina (PC) é uma molécula hidrofílica, ela é extraída com água ajustando o pH ao valor desejado com uma base (NaOH, KOH, NH4OH, etc.) ou um ácido

(H2SO4, ácido cítrico, etc.). O extrato bruto de PC é recuperado após a separação dos resíduos celulares por centrifugação a 10.000 g por 10 min em temperatura ambiente.

O extrato bruto é concentrado por filtração tangencial com uma membrana cerâmica ou orgânica com um limite de corte que permite a retenção da ficocianina. As amostras são então centrifugadas para separar o precipitado do sobrenadante. A massa do glóbulo é medida com uma balança de precisão. O glóbulo é ressuspenso em solução aquosa de pH 7 permitindo sua ressolubilização, a fim de quantificar a ficocianina precipitada.

Determinação de PC:

[0068] A estimativa do teor de ficocianina e do índice de pureza foi realizada por medição de absorbância usando o método descrito por Moon et al. (Moon et al., Korean J. Chem.

Eng., 2014, 1–6).

Exemplo 1: Efeito da concentração e do pH na precipitação e purificação da ficocianina (PC)

[0069] Uma solução bruta de ficocianina com uma concentração inicial de 1 g/L de PC e uma pureza inicial de 1,6 é concentrada por filtração tangencial em pH 4 para obter um retentado com uma concentração de 20 g/L, depois 30 g/L e depois 45 g/L. Um aumento na pureza do produto pode ser observado durante a filtração, porém essa pureza não ultrapassa o valor de 2 apesar do grau de concentração do produto. Na Figura 1 pode ser visto que para uma concentração de 20 g/L, a precipitação de ficocianina é baixa em pH 4 e aumenta ligeiramente à medida que o pH aumenta para valores mais elevados (Fig. 1). Ao mesmo tempo, a medição da concentração de ficocianina solúvel no sobrenadante durante o aumento do pH mostra uma diminuição relativamente pequena.

Para uma concentração de PC de 30 g/L, esse fenômeno de precipitação por mudança de pH é muito mais acentuado e parece ser máximo para valores de 4,5 e 5,5 (Fig. 1 e Fig.

2). Após filtração adicional e concentração de ficocianina até o valor de 40 g/L solúvel, a formação de um precipitado significativo é observada durante a filtração, mesmo antes da modificação do pH (Fig. 1). Como antes, a mudança no pH aumenta o fenômeno da precipitação da ficocianina.

[0070] Por filtração tangencial, a pureza da ficocianina diminui e, inversamente, a pureza do precipitado coletado e ressolubilizado em pH 7. Isso indica uma precipitação preferencial de ficocianina, que pode ser ressolubilizada em condições de pH mais favoráveis.

[0071] A Tabela 1 relata a medição da pureza da ficocianina após a ressolubilização do precipitado de ficocianina para precipitação em pH 7,5.

Tabela 1

Pureza de PC do Concentração Pureza de PC do sedimento de PC na sobrenadante ressuspenso em pH amostra 7,5 20 g/L 1,96 2,18 30 g/L 1 2,27 45 g/L 0,31 2,88 Exemplo 2: Efeito da concentração e do pH na precipitação e purificação de PC de uma amostra digerida enzimaticamente.

[0072] Nesse exemplo, a solução bruta é submetida à digestão enzimática para degradar o glicogênio presente. A degradação enzimática é feita em temperatura ambiente e pH = 4 com as enzimas alfa 1–4 glucuronidase (“Pectinex Ultra SP–L”) e alfa 1–6 glucosidase (“Novozyme 26062”).

[0073] O enriquecimento por filtração tangencial é realizado para atingir uma concentração de ficocianina de várias dezenas de g/L e então é realizado um ajuste de pH, causando precipitação. Amostras de pH a 4,5, 5 e 5,5 são tomadas com uma medição de ficocianina solúvel residual e uma medição de ficocianina precipitada após coleta e ressolubilização do sedimento com uma solução tampão a pH 7,5.

[0074] Similar ao exemplo anterior, a precipitação é significativa para uma faixa de pH compreendida entre 4,5 e

5,5, e o nível de pureza nesse caso atinge valores acima de 3,8 após a ressolubilização da ficocianina precipitada. A digestão enzimática do glicogênio não afeta a purificação por precipitação. A Tabela 2 abaixo provê os valores do índice de pureza da ficocianina após a precipitação por ajuste ao pH de instabilidade e também após a ressolubilização do precipitado de ficocianina.

Tabela 2 [PC] (g.L– Amostra Pureza 1) Sobrenadante pH 4,5 5,90 1,08 Sobrenadante pH 5 7,19 1,25 Sobrenadante pH 5,5 10,79 1,51 Glóbulo pH 4,5 22,26 3,82 Glóbulo pH 5 19,82 3,90 Glóbulo pH 5,5 16,55 3,87

REFERÊNCIAS - Cruz de Jesùs et al., Int J Food Nutr Sci (2016) 3(3): 1–0 - Martinez–Garcia et al., Int J Biol Macromol. (2016)

89:12–8

- Martinez–Garcia et al., Carbohydrate Polymers (2017)

169: 75-82

- Moon et al., 2014 Korean J.

Chem.

Eng., 2014, 1–6

- TN 2009000406, US 6.074.854, US 5.817.498, US

2017/159090, WO 2009/075682, WO 2016/030643, WO 2017/050917,

WO 2017/050918, WO 2017/093345, WO 2018/178334

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para extrair ficocianinas de uma solução inicial de ficocianina caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) precipitação seletiva que consiste em ajustar o pH da solução inicial a um valor selecionado dentro de uma faixa de valores de pH em que as ficocianinas são menos solúveis (também chamada de faixa de instabilidade) e em concentrar as ficocianinas na solução para promover sua precipitação, e b) recuperação da ficocianina precipitada.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as duas ações de ajuste de pH e de concentração são realizadas simultaneamente ou sequencialmente, seja por ajuste do pH da solução inicial antes da concentração, seja por concentração da solução inicial antes do ajuste do pH.

3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução inicial é uma solução bruta proveniente da lise de uma biomassa de microrganismos cultivada para a produção de ficocianina.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a ficocianina é uma ficocianina estável em pH ácido.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a ficocianina é uma ficocianina de origem microbiana, produzida por um microrganismo selecionado a partir de espécies do gênero Cyanidioschyzon, Cyanidium ou Galdieria.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o pH da faixa de instabilidade é de 4,5 a 5,5.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração consiste em retirar água de modo a obter um teor de ficocianina de pelo menos 15 g/L, preferivelmente de pelo menos 20 g/L, mais preferivelmente de pelo menos 30 g/L, ou ainda pelo menos 40 g/L.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a concentração é realizada por filtração tangencial com um limite de corte que permite a retenção da ficocianina.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a ficocianina recuperada é seca e opcionalmente moída.

10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a ficocianina recuperada tem um índice de pureza de pelo menos 2, preferivelmente pelo menos 3.

11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a ficocianina recuperada tem um índice de pureza maior que 4.

12. Ficocianina purificada caracterizada pelo fato de que é obtida pelo processo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.

13. Uso de uma ficocianina purificada conforme definida na reivindicação 12 caracterizado pelo fato de ser como corante alimentício.

14. Alimento caracterizado pelo fato de que compreende uma ficocianina purificada conforme definida na reivindicação 12.