JP2004256478A

JP2004256478A - 免疫グロブリンａ抗体産生促進剤

Info

Publication number: JP2004256478A
Application number: JP2003050876A
Authority: JP
Inventors: Tomohiro Hirabashi; 智裕平橋; Toshimitsu Kato; 敏光加藤; Osamu Hayashi; 修林
Original assignee: Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 2003-02-27
Filing date: 2003-02-27
Publication date: 2004-09-16

Abstract

【課題】免疫グロブリンＡ抗体の産生を促進し、かつ、優れた抗炎症効果を有する免疫グロブリンＡ産抗体生促進剤を提供すること。
【解決手段】好ましくは藍藻類、紅藻類、クリプト藻類等の藻類、特に好ましくはスピルリナ、フィッシェレラ、ネンジュモ等の藍藻類から抽出精製して得られる青色蛋白質であるフィコシアニン色素を好ましくは２０〜８０重量部、より好ましくは４０〜７０重量部を含有することを特徴とする免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は免疫グロブリンＡ抗体の産生を促進し、かつ、優れた抗炎症効果を有する免疫グロブリンＡ産抗体生促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、花粉症、喘息、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患は年々増加してきている。アレルギー疾患とは、体内に抗原となる物質が進入することで、血管拡張、血管透過性亢進等により組織が炎症を起こし、結果として末端神経が刺激されかゆみ、痛み、発作等が起こる疾患で、特に小児患者の増加が著しい。
【０００３】
前記アレルギー疾患の症状を改善するための研究が種々行われており、例えば、アレルギー疾患の原因となる抗原と結合することで抗原の体内への進入を阻止する役目を担う免疫グロブリンＡ抗体の産生が、スピルリナの熱水抽出物の投与により促進されることが知られている（例えば、非特許文献１参照。）。しかしながら、前記非特許文献１では、スピルリナの熱水抽出物が炎症を抑制するという記載はない。
【０００４】
【非特許文献１】
「マウスＩｇＥ抗体産生に及ぼすスピルリナエキス摂取の影響」，第４９回日本栄養・食料学会講演要旨集，日本栄養・食料学会，平成７年４月１０日，ｐ．８６
【０００５】
【発明の解決しようとする課題】
本発明の課題は、免疫グロブリンＡ抗体産生を促進し、かつ、抗炎症効果に優れる免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、下記（１）および（２）の知見を見出した。
（１）前記非特許文献１で開示されているスピルリナの熱水抽出物中には存在しない色素蛋白質であるフィコシアニンが免疫グロブリンＡ抗体の産生を促進すること。
（２）前記フィコシアニンは炎症を抑制する抗炎症効果に優れること。
本発明は、上記の知見に基づき完成したものである。
【０００７】
即ち、本発明は、フィコシアニンを有効成分とすることを特徴とする免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤を提供するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明で用いるフィコシアニンは、例えば、藍藻類由来のフィコシアニン、紅藻類由来のフィコシアニン、クリプト藻由来のフィコシアニン等の藻類由来のフィコシアニン等が挙げられ、なかでも、大量に採取できることから藍藻類由来のフィコシアニンが好ましい。
【０００９】
前記藍藻類由来のフィコシアニンの調製に用いる藍藻類としては、例えば、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）属、フィッシェレラ（Ｆｉｓｃｈｅｒｅｌｌａ）属、ネンジュモ（Ｎｏｓｔｏｃ）属、シネコキスチス（Ｃｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）属、シネココッカス（Ｃｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）属、トリポスリクス（Ｔｏｌｙｐｏｔｈｒｉｘ）属等が挙げられる。藍藻類としては、食用に供され、安全性が確認されているスピルリナ属が特に好ましい。
【００１０】
本発明で用いるフィコシアニンを調製する方法は特に制限は無く、例えば、前記藻類を水やリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液中に懸濁し、藻類中のフィコシアニンを抽出させた後、遠心分離して上清を回収し、ここに硫酸アンモニウムを添加して塩析したのち遠心分離し、水にて透析処理後、ＤＥＡＥセルロースを用いて精製し液状のフィコシアニンを得る等の調製方法により得られる。抽出する際に用いる水や緩衝液が熱水、例えば、９０℃の熱水だと、フィコシアニンは熱により変性し回収できないので通常４〜４０℃、好ましくは１０〜３０℃の水や緩衝液を用いる。フィコシアニンは液状のフィコシアニンを使用しても良いし、前記液状のフィコシアニンを凍結乾燥等により乾燥させた固形状のフィコシアニンを使用しても良い。
【００１１】
前記した調製方法で得られるフィコシアニンは通常下記式（１）で表される純度が７５重量％以上である。更に純度を上げるには、例えば、前記ＤＥＡＥセルローズによる精製を複数回行えばよい。フィコシアニンの純度は特に制限は無いが、高いほうがより好ましく、８０〜９０％がより好ましい。尚、下記式（１）により純度を求める方法は、藻類研究法（西澤一俊、千原光雄編、共立出版社、昭和５４年１２月１日発行）の４９７頁に記載されている。この方法は、純度１００％のフィコシアニンは、６２０ｎｍ（ＯＤ６２０）の波長と２８０ｎｍ（ＯＤ２８０）における波長の比（ＯＤ６２０／ＯＤ２８０）が４．５となる知見に基づいており、測定したいサンプルの（ＯＤ６２０／ＯＤ２８０）の値（Ａ）を求め、これを下記式（１）にあてはめサンプルの純度を求める。例えば、後述する参考例１で得た精製フィコシアニンの（ＯＤ６２０／ＯＤ２８０）の値は３．６であり、下記（１）により純度は８０％となる。
フィコシアニンの純度（％）＝（Ａ／４．５）×１００（１）
【００１２】
本発明の免疫グロブリンＡ産生促進剤を製造するには、例えば、経口水溶液の免疫グロブリンＡ産生促進剤を調製する時は、例えば、フィコシアニンと精製水または緩衝液とを混合攪拌し溶解した後、必要に応じて滅菌フィルターにて滅菌濾過する等の調製方法が挙げられる。また、例えば、顆粒剤の免疫グロブリンＡ産生促進剤を調製するには、例えば、フィコシアニンと水と必要に応じて乳糖、マンニトール等の賦形剤とを攪拌練合して粘土状にした後、造粒および整粒し顆粒とする等の調製方法等が挙げられる。
【００１３】
免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤中の有効成分としてのフィコシアニンの含有率は、免疫グロブリンＡ促進剤が固形状のときは、５０〜１００重量が好ましく、７０〜９０重量％がより好ましい。免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤が液状のときは、０．０２〜３．８重量％が好ましく、０．０４〜２．０重量％がより好ましい。
【００１４】
本発明の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤は例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、トローチ剤等の固形状の形状のものや、経口水溶液、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤等の液状の形状のものが好ましく使用できる。
【００１５】
本発明の免疫グロブリンＡ産生促進剤は、例えば、経口投与、点滴、注射等の方法により摂取することができ摂取方法には特に制限は無いが、簡便なことから経口投与がより好ましい。
【００１６】
本発明の免疫グロブリンＡ産生促進剤の摂取量は、炎症の軽重、医師の判断等により広範囲に変えることができるが、一般に経口投与で、体重１ｋｇあたり１日にフィコシアニンの摂取量が０．５〜５０ｍｇになるように摂取するのが好ましく、０．５〜２０ｍｇがより好ましい。また、摂取は１日１回の摂取でも良いし、数回に分けて摂取しても良い。
【００１７】
【実施例】
以下に本発明を実施例および比較例により具体的に説明する。
実施例１
リナブルーＨＧＥ（大日本インキ化学工業株式会社製のスピルリナ色素の粉末）５００ｇを７５００ｍｌの１００ｍｍｏｌ／ｍｌのリン酸塩緩衝液（ｐＨ６．０）に懸濁し１時間攪拌した。その後、３０℃のインキュベータに移し、攪拌しながら、１６時間かけてスピルリナに含まれるフィコシアニンをリン酸塩緩衝液中に抽出させた懸濁液を調製した。この懸濁液を１０，０００Ｇ、３０分の条件で２回遠心分離し上清を回収した。この上清に２０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、４℃にて１５分間攪拌し更に４℃で１５分間静置した。その後１０，０００Ｇ、３０分の条件で遠心分離し上清を回収した。この上清に５０％飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え、４℃にて１５分間攪拌し更に４℃で１５分間静置した。その後１０，０００Ｇ、３０分間の条件で遠心分離し上清を廃棄し沈殿を回収した。得られた沈殿を５００ｍｌの蒸留水にて溶解した後、蒸留水にて透析を行った。その後透析内液を凍結乾燥しフィコシアニンの粗精製物を得た。
【００１８】
前記フィコシアニンの粗精製物をＤＥＡＥセルロースＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ社製の陰イオン交換樹脂カラム）と１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いたカラムクロマトグラフィーにて分画し、凍結乾燥にて乾燥させ、精製フィコシアニンを得た。得られた精製フィコシアニン１００ｍｇをｐＨ６．６の０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液に溶解し、１００ｍｌとした後、更に該溶液を１０倍希釈した溶液を用いて６２０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度を測定した結果、６２０ｎｍの吸光度（ＯＤ６２０）は０．８９２であり、２８０ｎｍの吸光度（ＯＤ２８０）は０．２４７となった。（ＯＤ６２０）／（ＯＤ２８０）の比が３．６となり、前記式（１）で表されるフィコシアニンの純度は８０％であった。
【００１９】
前記精製フィコシアニン０．５ｇおよび精製水１０００ｍｌｇを混合し精製フィコシアニンを精製水に溶解した。溶解後、３，５００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心し、上清を回収した。その後、上清を孔径０．２μｍのメンブランフィルター（コーニング社製）を用いて濾過滅菌し、フィコシアニンの含有率が０．０４重量％である免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１を調製した。
【００２０】
免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１の免疫グロブリンＡ抗体産生促進作用および抗炎症作用の評価を以下の通り行った。
１）使用動物および抗原
使用動物：４週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウス（雌性、日本クレア株式会社製）
初期免疫用抗原：オボアルブミン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭＣＯＲＰ製）、濃度１．０ｍｇ／ｍｌ、不活性化百日咳菌（和光純薬株式会社製）１×１０^１０個含有。
経口投与用抗原：オボアルブミン（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭＣＯＲＰ製）、濃度２．０ｍｇ／ｍｌ。
【００２１】
２）免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１および抗原の投与
室温度２５℃、相対湿度４５％および明時間１２時間の飼育環境下で前記Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＪｃｌマウスに前記免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１を１日あたり４ｍｌを投与し、２週間育成した。２週間後、前記免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１の投与を中止し、その後、初期免疫用抗原０．５ｍｌを腹腔注射した。更に腹腔注射した日を０日として、３、６、９、１２、１５および１８日目に経口投与用抗原を胃ゾンデにて経口投与した。投与量は１回の投与につき０．２ｍｌである。抗原の経口投与を２週間かけて行った。尚、免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤１および抗原の投与期間中、飼料（ＭＦ、オリエンタル酵母株式会社製）および水は自由摂取させた。
【００２２】
３）オボアルブミン抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量の測定
初期免疫用抗原を腹腔注射した日を０日として２１日目にマウスの脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板および小腸粘膜を採取し、各組織に存在するオボアルブミン抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体の量を測定し、抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体産生能の評価を行った。以下に測定に用いた試料の調製方法と抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量の測定方法を示す。測定結果を第１表に示す。
【００２３】
▲１▼マウスの脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板由来の試料の調製
マウスから脾臓、腸間膜リンパ節およびパイエル板を無菌的に摘出した。それぞれをホモジナイズして細胞をばらばらにした後、細胞数が２×１０^６個／ｍｌとなるように最終濃度でウシ胎児血清を１０重量％含有させたＲＰＭＩ１１６４０液体培地（日研生物医学研究所製）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液１ｍｌに前記経口用抗原を前記最終濃度でウシ胎児血清を１０重量％含有させたＲＰＭＩ１１６４０液体培地で濃度０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した抗原１０μｌを加えて、ＣＯ_２インキュベーターを用いて、３７℃で４日間培養した。培養後孔径０．２μｍのメンブランフィルターで培養液を濾過した。濾過後の培養液をオボアルブミン抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量の測定試料とした。
【００２４】
▲２▼小腸粘膜由来の試料の調製方法
マウスから全小腸を摘出した。縦方向に割断して、これを０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩生理食塩水２ｍｌに懸濁し懸濁液を得た。この懸濁液を１６，５００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離し上清をオボアルブミン抗原特異的ＩｇＡ抗体量の測定試料とした。
【００２５】
▲３▼抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量の測定
ＩｇＡ抗体量の測定方法
９６穴マイクロプレートに濃度０．１ｍｇ／ｍｌのオボアルブミン溶液を１ウェルあたり５０μｌ加えてオボアルブミンをウェルに固着させたのち、精製水で４倍希釈したブロッキング剤（大日本製薬株式会社製）でブロッキング処理した。このマイクロプレートの各ウェルに標準曲線作成用のＩｇＡ抗体標準液および測定試料を１ウェル当たり５０μｌずつ加え、４℃にて１２時間静置した。標準液にはマウスメラノーマＩｇＡ（ＺＹＭＥＤＬＡＢＯＲＴＡＴＯＲＩＥＳＩＮＣ．製）を１０倍希釈ブロッキング剤にて８，０００ｎｇ／ｍｌから２倍希釈して調製したものを用い、０ｎｇ／ｍｌとして前記１０倍希釈ブロッキング剤を用いた。測定試料は小腸管粘膜由来試料については１０倍希釈ブロッキング剤にて２倍に希釈して用い、脾臓、腸間膜リンパ節、パイエル板由来試料については希釈せずに使用した。静置後、二次抗体としてセイヨウワサビペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリンＡ抗体（ＺＹＭＥＤＬＡＢＯＲＴＡＴＯＲＩＥＳＩＮＣ．製）を１０倍希釈ブロッキング剤にて１，０００倍希釈したものを各ウェルに５０μｌずつ加え、３７℃、３０分間静置した。静置後、ο−フェニレンジアミンジヒドロクロリド錠（和光純薬株式会社製）を０．１ｍｏｌ／ｌクエン酸−０．２ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２５ｍｌに溶解し、更に過酸化水素水１０μｌを加えて調製して得た基質液を各ウェルに５０μｌずつ加えて７分間室温にて静置した。静置後、１０％硫酸水溶液を各ウェルに５０μｌずつ加えて反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍ波長における吸光度を測定した。得られた標準曲線より抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量を算出した。
【００２６】
５）抗炎症作用の測定
生理食塩水にエバンスブルー０．５ｇを溶解し最終的に１００ｍＬとした。これをろ紙で濾過した後、０，２μｍのメンブランフィルターで濾過滅菌し、濃度０．５％のエバンスブルー水溶液を調製した。初期免疫用抗原を腹腔注射した日を０日として２１日目にエバンスブルー水溶液０．２ｍｌをマウスに尾静脈内投与した後、経口投与用抗原を０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝生理食塩水で希釈し２倍に希釈した抗原０．５ｍＬを胃ゾンデにて経口投与した。３０分後にマウスを頸椎脱臼により屠殺し、全小腸を摘出した。腸内容物を０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝生理食塩水で洗浄除去後、摘出した小腸は１００％ホルムアミド（和光純薬）４ｍｌに浸漬し、３７℃で３日間培養してエバンスブルーを抽出した。培養終了後、３，５００ｒｐｍ、４℃にて２０分間遠心分離し上清を回収した。上清の６３７ｎｍにおける吸光度を測定した。吸光度が高い程オボアルブミンによる小腸の炎症が重大であることを示す。測定結果を第１表に示す。
【００２７】
比較例１
前記２）の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤および抗原の投与において免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤の代わりに水を用いた以外は実施例１と同様にして、オボアルブミン抗原特異的免疫グロブリンＡ抗体量の測定および抗炎症作用の測定を行った。測定結果を第１表に示す。
【００２８】
【表１】

【００２９】
【発明の効果】
本発明の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤は優れた免疫グリブリンＡ抗体産生促進作用を有し、更に、優れた抗炎症効果も有する。

Claims

フィコシアニンを有効成分とすることを特徴とする免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。
フィコシアニンが藍藻類由来のフィコシアニンである請求項１記載の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。
藍藻類がスピルリナである請求項２記載の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。
常温固形であり、かつ、フィコシアニンの含有率が７０〜９０重量％である請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。
常温液状であり、かつ、フィコシアニンの含有率が０．０４〜２．０重量％である請求項１〜３のいずれか１項記載の免疫グロブリンＡ抗体産生促進剤。