CN105920044B - 一种水螅干细胞制剂及其制备方法与应用 - Google Patents
一种水螅干细胞制剂及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及干细胞领域，公开了一种水螅干细胞制剂及其制备方法与应用。本发明公开了一种含有水螅干细胞的口服液。本发明所述干细胞制剂包括水螅干细胞提取物，其来源丰富，安全性高，制备方法简单。本发明的口服液或注射液无毒副作用，对人体有益。本发明的制备方法制备时间短，适合规模化生产。本发明所述干细胞制剂及口服液可延缓器官及皮肤衰老，抗老化。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体涉及一种干细胞制剂及其制备方法与应用。尤其涉及一种含有水螅干细胞的干细胞制剂及其制备方法，以及一种含有所述制剂的口服液和注射液，及两者在制备治疗延缓衰老、抗老化的药物中的应用。
背景技术
本发明所用水螅(Hydra)为灯塔水母(Turritopsis nutricula)的幼年阶段生命形式。灯塔水母水螅属腔肠动物，多见于海水中。其身体主要由干细胞构成。很多科学家发现其老化速度极慢。目前研究发现，灯塔水母天生具有“返老还童”的能力，是现今世界上唯一不会死亡的生物。灯塔水母“返老还童”是通过细胞转分化过程实现的，就是细胞从一个类型转变为另一个类型，即从老年转化为幼年类型。这种细胞功能的转化，通常会在器官再生的情况下出现，然而，灯塔水母这种转化似乎是其生命周期中的常态。如果把一个灯塔水母切开，它能在24小时内变成两条水螅虫，72小时后长出触角。即使把它打碎，只要它的细胞完整，也可以变成一条水螅虫，重新开始生命。所以说，灯塔水母的生命是没有终结的。也就是说，灯塔水母在死前回到了生命的开端，重新演绎了自己的生长、发育。
灯塔水母之所以可以永生，是因为它有再生基因。而这种基因人类也有，只是不表达。如果将这种能够使细胞逆分化成为干细胞的基因，通过口服和注射等用到人身体，就可调节人体细胞基因逆分化，使人类细胞年轻化成为干细胞，就可以使人类返老还童，抗衰老年轻化，延年益寿。
干细胞是一种具有再生和自我更新的细胞，即具有增殖、自我修复、大量制造及分化成后代能力的细胞。对于人体坏死或病变组织的修复，对老化凋亡细胞的替换都具有重要意义。未来可望用于治疗心脑血管病，糖尿病，癌症，外伤和组织器官再生等。
衰老的主要原因是机体内部矛盾相互作用的结果，导致体内和细胞内分解代谢大于合成代谢。研究人类的衰老过程是非常有意义的，因此，通过研究动物衰老过程来寻找有效预防和延缓衰老的方法，多年来被科学界所重视。尽管有许多有关衰老的文献报道，完全了解衰老的过程对人类在科学上仍旧是一个巨大的挑战。长生不老是人们长久以来的一个梦想，为了这一梦想人们却一直在不懈努力，虽说长生不老违背自然规律不可能实现，但延缓衰老、延长寿命、提高生存质量，在科技不断进步的今天是有可能实现的。一般而言，三十岁过后，身体会逐渐走下坡路，皮肤也会出现老化，给人们尤其是女性朋友带来了烦恼。目前，世界上老年人口的增加导致的社会老龄化发展很快，相应的健康医疗的负担和花费也大大增加，因此，研究延缓衰老试剂也变得很迫切。因此，有必要寻求一种新的安全、无副作用，能够帮助人体抗衰老、防止器官及皮肤老化，延年益寿的干细胞制剂。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种含有水螅干细胞的干细胞制剂及其制备方法。本发明的干细胞制剂含有水螅干细胞，来源丰富，安全性高，治疗效果好。
为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：
一种干细胞制剂，包括水螅干细胞。在一些优选的实施方案中，本发明所述水螅干细胞的用量为每1mL含有1-2X108水螅干细胞。
在一些实施方案中，本发明所述的干细胞制剂，还包括白蛋白和生理盐水。
在一些实施方案中，本发明所述白蛋白的用量为每lOmL所述干细胞制剂含0.1-0.2白蛋白；所述生理盐水的用量为每lOmL所述干细胞制剂含5mL-8mL生理盐水。
在一些实施例方案中，本发明的水螅应理解为所有水螅动物，包括灯塔水母(Turritopsis nutricula)的幼年阶段生命形式。灯塔水母水螅属腔肠动物，多见于海水中。其身体主要由干细胞构成。
在一些实施方案中，本发明还提供了含有水螅干细胞制剂的制备方法，所述制剂为口服液，按以下步骤制成:
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成 细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2×108细胞的干细胞提取物；
(4)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得。
在一些实施方案中，本发明还提供了含有水螅干细胞制剂的制备方法，所述制剂为注射液，按以下步骤制成:
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2X108细胞的干细胞提取物；
(4)将细胞提取物经微孔滤膜过滤，滤液经含DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，采用洗脱液以1-7mL/min流速进行纯化分离，收集洗脱液在低温下用3-5K的超滤管进行浓缩，待用；所述洗脱液为含不同浓度NaCl 的磷酸缓冲液，收集采用含0.1-0.5M NaCl的磷酸缓冲液洗脱下的组分；
(5)将上述所得洗脱组分经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱Superdex200采用0.15M NaC1,5-60mM,pH7.O PBS缓冲液以0.1-1.5mL/min流速进行分离纯化，收集洗脱体积处于30-90mL的洗脱液，而后在1-8℃下用3-5K的超滤管进行浓缩，浓缩后即得水螅干细胞提取物；
(6)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得。
所述培养基为，每1000mL蒸馏水中加入0.342g KCl，0.566g CaCl2，2.035gMgSO4·H2O，2.03g柠檬酸钠，0.53g丙酮酸钠，1.08g葡萄糖，2.6g N-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸。
本发明还提供了所述干细胞制剂在制备抗衰老药物中的应用。
本领域技术人员可将所述的干细胞制剂直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如注射液、冻干粉、口服液、片剂、颗粒剂、水剂、或软胶囊剂等。
在一些实施方案中，所述制剂优选为口服液，所述口服液还包括矫味剂、澄清剂、防腐剂。所述的矫味剂，选自蔗糖、单糖浆、芳香糖浆、糖精钠、阿斯巴甜、柠檬、薄荷油、苹果香精、香蕉香精等中的一种或两种以上的组合。所述的澄清剂，选自壳聚糖、天然澄清剂明胶、鞣酸、蛋清等中的一种或两种以上的组合。所述的防腐剂选自对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐等中的一种或两种以上的组合。所述的稳定剂为阿拉伯胶、黄原胶、海藻酸钠、卵磷脂，脂肪酸甘油酯、聚山梨酯、淀粉浆、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆、 聚维酮、葡聚糖、枸橼酸盐、酒石酸盐、磷酸盐及氯化物等中的一种或两种以上的组合。
本发明的干细胞制剂具有以下优点：
1.能够延缓机体系统多脏器生理功能的退化与衰老进程，使其保持健康体魄，延年益寿，返老还童；
2.提高体质体力，提高精神，消除疲劳，防止皮肤衰老，使老年斑清退；
3.对记忆力、视力、听力退化，肢体运动失调等均有改善与恢复其功能的效果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
实施例一：水螅干细胞口服液的制备方法
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2X108细胞的干细胞提取物；
(4)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得。
实施例二：水螅干细胞注射液的制备方法
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2X108细胞的干细胞提取物；
(4)将细胞提取物经微孔滤膜过滤，滤液经含DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，采用洗脱液以1-7mL/min流速进行纯化分离，收集洗脱液在低温下用3-5K的超滤管进行浓缩，待用；所述洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，收集采用含0.1-0.5M NaCl的磷酸缓冲液洗脱下的组分；
(5)将上述所得洗脱组分经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱 Superdex200采用0.15M NaC1,5-60mM,pH7.O PBS缓冲液以0.1-1.5mL/min流速进行分离纯化，收集洗脱体积处于30-90mL的洗脱液，而后在1-8℃下用3-5K的超滤管进行浓缩，浓缩后即得水螅干细胞提取物；
(6)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得。
实施例三-六：含有干细胞制剂的口服液
本试验用4个实施例分别制备成口服液，具体参数详见表1。
含有干细胞制剂的口服液的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别取水螅干细胞提取物、白蛋白、生理盐水；
(2)将干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合；
(3)将混合液浓缩，加入稳定剂、防腐剂、矫味剂、澄清剂，混匀；
(4)滤过，加入适量水，混匀，灭菌，即得。
表1口服液实施例制备参数表
实施例七：含有干细胞制剂的口服液的疗效观察
选择640例具有牙齿动摇、耳聋失聪、面憔无华、腰膝酸软、疲倦乏力、头晕眼花、盗汗、骨质疏松、老年斑等症状的中老年，随机分为实验组和对照组，每组320例，其中实验组男性119人，女性201人，年龄最大77岁，最小50岁；对照组男性176人，女性144人，年龄最大76岁，最小48岁。
诊断标准：参照临床诊断标准，并以症状分度轻、中、重度。
治疗方法：实验组早晚服用本发明所述含有干细胞制剂的口服液，每次一支，每支10mL，一个月为一个疗程，连服三个疗程，期间停止其他中西药及保健品。对照组早晚服用六味地黄丸，每次1袋，每袋5克，一个月为一个疗程，连服三个疗程，期间停止其他中西药及保健品。
疗效评判标准：
治愈：精神焕发、体力恢复、面色红润，头昏、盗汗、腰膝酸软、等症状消失；
显效：精神改善、体力有所恢复，头昏、盗汗、腰膝酸软等症状缓解；
无效：主要症状没有减轻，体力和精神差。
统计结果：本发明在临床上取得了较好的疗效，在320例中老年中，服用本发明所述中药组合物口服液三个疗程后，治愈279例，治愈率占87.2％， 好转35例，显效率占10.9％，总有效率为98.1％，无效6例，无效率占1.9％。对照组治愈率为53.3％，两组治愈率比较有显著性差异(P＜0.05)。
Claims (9)
1.一种干细胞制剂，其特征在于,所述制剂为口服液，按以下步骤制成:
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2X108细胞的干细胞提取物；
(4)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得；
所述白蛋白的用量为每lOmL所述干细胞制剂含0.1g-0.2g白蛋白；所述生理盐水混合物的用量为每lOmL所述干细胞制剂含5mL-8mL生理盐水混合物。
2.一种干细胞制剂，其特征在于，所述制剂为注射液，按以下步骤制成:
(1)将活水螅清洁饲养24-48小时，用无菌生理盐水反复冲洗后，70％酒精消毒，在4℃无菌条件下去皮去触手，粉碎过滤，加细胞分离消化液和缓冲培养液后制成单细胞悬液，生理盐水离心洗剂3次，加适量培养基后，与带有选择标记的干细胞标志物抗体37℃二氧化碳孵箱中孵育45分钟，4℃冰浴过夜；
(2)用流式细胞仪对上述带有干细胞标记的细胞悬液进行干细胞分离，收集干细胞，4℃无菌条件下离心洗剂三次，去除标记物，加缓冲液制成细胞悬液；
(3)将所述细胞悬浮液加入预冷缓冲液中无菌条件下超声破碎细胞，4℃离心，收集上清液，测量蛋白质浓度，制成每ml含有1-2×108细胞的干细胞提取物；
(4)将细胞悬液经微孔滤膜过滤，滤液经含DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，采用洗脱液以1-7mL/min流速进行纯化分离，收集洗脱液在低温下用3-5K的超滤管进行浓缩，待用；所述洗脱液为含不同浓度NaCl的磷酸缓冲液，收集采用含0.1-0.5MNaCl的磷酸缓冲液洗脱下的组分；
(5)将上述所得洗脱组分经微孔滤膜过滤，滤液经凝胶色谱柱Superdex200采用0.15MNaC1,5-60mM,pH7.OPBS缓冲液以0.1-1.5mL/min流速进行分离纯化，收集洗脱体积处于30-90mL的洗脱液，而后在1-4℃下用3-5K的超滤管进行浓缩，浓缩后即得水螅干细胞提取物；
(6)将所得的干细胞提取物与白蛋白、生理盐水混合物、辅料混合均匀即得。
3.根据权利要求1所述的干细胞制剂，其特征在于，所述辅料包括矫味剂、澄清剂、防腐剂、稳定剂。
4.根据权利要求3所述的干细胞制剂，其特征在于，所述的矫味剂选自蔗糖、单糖浆、芳香糖浆、糖精钠、阿斯巴甜、柠檬、薄荷油、苹果香精、香蕉香精中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求3所述的干细胞制剂，其特征在于，所述的澄清剂选自壳聚糖、天然澄清剂明胶、鞣酸、蛋清中的一种或两种以上的组合。
6.根据权利要求3所述的干细胞制剂，其特征在于，所述的防腐剂选自对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐中的一种或两种以上的组合。
7.根据权利要求3所述的干细胞制剂，其特征在于，所述的稳定剂为阿拉伯胶、黄原胶、海藻酸钠、卵磷脂，脂肪酸甘油酯、聚山梨酯、淀粉浆、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆、聚维酮、葡聚糖、枸橼酸盐、酒石酸盐、磷酸盐及氯化物等中的一种或两种以上的组合。
8.根据权利要求1或2所述的干细胞制剂的制备方法，其特征在于,所述培养基为，每1000mL蒸馏水中加入0.342g KCl，0.566g CaCl2，2.035g MgSO4·H2O，2.03g柠檬酸钠，0.53g丙酮酸钠，1.08g葡萄糖，2.6gN-三(羟甲基)甲基-2-氨基乙烷磺酸。
9.权利要求1-2任意一项所述干细胞制剂在制备抗衰老药物中的应用。
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