CN104306401B - 一种升高白细胞作用的梅花鹿鹿脾提取物的制备及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种鹿脾提取物的新提取方法及在提高免疫力药物中的应用，对传统的鹿脾提取工艺进行了改进，对离心沉淀用复合酶进行进一步提取，多肽和核苷酸的含量均提高了30%，同时提取物中肌苷成分占总核苷酸含量达8%，提高了提取物中肌苷的含量；同时本发明方法的提取物较原工艺提取的转移因子的升高白细胞的活性提高了20%。
Description
技术领域：
本发明公开了一种升高白细胞作用的梅花鹿鹿脾提取物的制备及用途，属于生物制药技术领域。
技术背景：
白细胞减少在临床上非常多见，多为继发性。白细胞降低的同时，抵抗力也会降低，会出现头晕、乏力、心悸、低热、精神萎靡、失眠、食欲减退、咽喉炎及黏膜溃疡等症状，严重影响人们的生活质量和健康水平。白细胞减少临床上用激素、锂盐治疗，疗效虽有提高，但副作用大。对于一种疗效好、费用低、无副作用的治疗白细胞减少的保健品，市场需求巨大。
转移因子是一种由多肽和低聚核苷酸组成的复合物，对中性粒细胞趋化活性强。近年来，主要从动物脾脏中进行提取。目前，转移因子的提取方法多为：取新鲜猪或牛脾脏除结缔组织，用组织捣碎机绞碎，加适量生理盐水后，用高速组织捣碎机高速（12000r/min）匀浆，得匀浆液；匀浆液进行冻融数次；离心，取上清；将上清置于透析袋内进行透析，收集透析袋外的透析液即为制备的转移因子，或将离心后上清进行超滤，得转移因子提取物。
梅花鹿自古以来具有很高的经济价值，其为仙兽，全身皆为宝，无一废弃，鹿制品都具有极高的药用价值和保健功效，鹿脾富含多肽、多糖、核酸等人体必须的营养物质。由梅花鹿的鹿脾为原材料提取的转移因子，具有热原低、营养物质高且安全等特点，通过本发明方法得到的鹿脾提取物为口服，其在升高白细胞的功能上相比于原有工艺提取的转移因子具有更显著的效果。
发明内容
本发明公开了鹿脾提取物在升高白细胞药物中的用途，可用于制备升高白细胞作用的药物和保健食品，在剂型方面可采用各种剂型，如口服液、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、胶囊等剂型或缓释制剂。
本发明公开的一种鹿脾提取物是通过以下方法制备的：
1）称取梅花鹿鹿脾250份，去除表面结缔组织；
2）加入3~8重量的生理盐水，胶体磨研磨2~5min；
3） 将鹿脾混悬液升温至50~55℃，调PH值至5~6，加入0.6～4.6%重量的复合酶A保温0.5h~2h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液液；
4）上一步骤得到的鹿脾沉淀物（约为原鹿脾重量的1/4）继续加入等质量的生理盐水，升温至60~65℃，继续加入2～5%重量的复合酶B保温1~3h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液液；
5）将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的鹿脾提取物干粉。
所述的复合酶A为中性蛋白酶：胰蛋白酶：5’-磷酸二酯酶的质量比为1~2：2~4：4~9；
所述的复合酶B为中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：5’-磷酸二酯酶的质量比为1~2：2~9：4~12；
所述的鹿脾提取物中含 25~32重量份多肽，1.6~2.2 重量份核酸，0.12~0.25重量份肌苷。
本发明的积极效果在于：对传统的鹿脾提取工艺进行了改进，增加了步骤4，对离心沉淀用复合酶B进行进一步提取，多肽和核苷酸的含量均提高了30%，同时提取物中肌苷成分占总核苷酸含量达8%，提高了提取物中肌苷的含量；同时本发明方法的提取物较原工艺提取的转移因子的升高白细胞的活性提高了20%。
具体实施方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1:
. 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织；
. 加入750ml生理盐水，胶体磨研磨5min；
. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至5，同时加入0.25g中性蛋白酶，0.75g胰蛋白酶和1.5g 5'-磷酸二酯酶保温2h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液I液；
. 上一步骤得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至60℃，同时加入0.12g中性蛋白酶，0.48g木瓜蛋白酶和0.6g 5'-磷酸二酯酶保温3h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液II液；
e. 将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的梅花鹿鹿脾提取物干粉，多肽含量为28.32%，核酸含量为1.76%。
实施例2：
. 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织；
. 加入1200ml生理盐水，胶体磨研磨5min；
. 将鹿脾混悬液升温至55℃，调PH值至5，同时加入0.51g中性蛋白酶，1.48g胰蛋白酶和3.1g 5'-磷酸二酯酶保温保温2h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液I液；
. 上一步骤得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至60℃，同时加入0.22g中性蛋白酶，0.78g木瓜蛋白酶和1.05g 5'-磷酸二酯酶保温1h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液II液；
e. 将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的梅花鹿鹿脾提取物干粉，多肽含量为29.18%，核酸含量为1.85%。
实施例3：
. 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织；
. 加入1400ml生理盐水，胶体磨研磨4min；
. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至5，同时加入0.54g中性蛋白酶，1.62g胰蛋白酶和3.52g 5'-磷酸二酯酶保温1h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液I液；
. 上一步骤得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至60℃，同时加入0.28g中性蛋白酶，0.89g木瓜蛋白酶和1.45g 5'-磷酸二酯酶保温2h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液II液；
e. 将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的梅花鹿鹿脾提取物干粉，多肽含量为28.79%，核酸含量为1.91%。
实施例4：
. 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织；
. 加入1500ml生理盐水，胶体磨研磨3min；
. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至5，同时加入0.70g中性蛋白酶，2.01g胰蛋白酶和4.32g 5'-磷酸二酯酶保温2h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液I液；
. 上一步骤得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至65℃，同时加入0.33g中性蛋白酶，0.93g木瓜蛋白酶和1.45g 5'-磷酸二酯酶保温2h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液II液；
e. 将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的梅花鹿鹿脾提取物干粉，多肽含量为29.38%，核酸含量为1.96%。
实施例5：
. 称取梅花鹿鹿脾250g，去除表面结缔组织；
. 加入2000ml生理盐水，胶体磨研磨5min
. 将鹿脾混悬液升温至50℃，调PH值至5，同时加入0.91g中性蛋白酶，1.82g胰蛋白酶和7.38g 5'-磷酸二酯酶保温1.5h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液I液
. 上一步骤得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至60℃，同时加入0.32g中性蛋白酶，1.04g木瓜蛋白酶和1.46g 5'-磷酸二酯酶保温2h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液II液；
e. 将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的梅花鹿鹿脾提取物干粉，多肽含量为29.26%，核酸含量为1.86%。
对照例1（物理法提取）：
a.称取250g新鲜梅花鹿鹿脾，去除表面结缔组织，剪刀剪碎备用；
b.加入250ml超纯水，制备脾脏匀浆；
c.取匀浆，-20℃反复冻融5次，4℃4000rpm离心30min，取上清液；
d.上清液放入到透析袋中，按比例加入超纯水，4℃透析，透析外液0.22μm微控滤膜过滤除菌，即得转移因子溶液。喷雾干燥得鹿脾提取物干粉，多肽含量为28.79%，核酸含量为1.18%。
对照例2（物理法提取）：
a.称取250g新鲜猪脾，去除表面结缔组织,剪刀剪碎备用；
b.加入250ml超纯水，制备脾脏匀浆；
c.取匀浆，-20℃反复冻融5次，4℃4000rpm离心30min，取上清液；
d.上清液放入到透析袋中，按比例加入超纯水，4℃透析，透析外液0.22μm微控滤膜过滤除菌，即得转移因子溶液。喷雾干燥得猪脾提取物干粉，多肽含量为17.64%，核酸含量为0.94%。
以下试验表明通过工艺改进后采用本发明工艺，梅花鹿鹿脾提取物干粉中多肽和核苷酸的含量均提高了30%，同时提取物中肌苷成分占总核苷酸含量达8%。
表1 各提取方法得到鹿脾提取物干粉中各有效成分的含量结果
结论：从表1可看出，实施例1、2、3的鹿脾提取物干粉中多肽分别占总含量的28.32%、29.18%、28.79%，而对照例1和对照例2的脾脏提取物干粉中多肽仅占总含量的19.84%、17.64%，本发明提取方法得到的鹿脾提取物总量中多肽成分提高了40%以上；实施例1、2、3的鹿脾提取物干粉中核酸分别占总含量的1.76%、1.85%、1.91%，而对照例1和对照例2的脾脏提取物干粉中核酸占总含量的1.18%、0.94%，本发明的提取方法得到的鹿脾提取物总量中核酸成分提高了30%以上；且本发明提取物中肌苷含量占核酸总量比重高达8%。
下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。为了更好地理解本发明的实质，下面将用鹿脾提取物药物试验及结果来说明其在制药领域中的用途。
一、小鼠外周血白细胞数量的测定
方法：Balb/c 小鼠40 只，18-22g 雌性。按体重分为6组，分别灌胃相同体积生理盐水、实施例1鹿脾提取物、实施例2鹿脾提取物、实施例3鹿脾提取物、对照例1鹿脾提取物、对照例2猪脾提取物，一日分为两次口服给药，每次给药100mg/kg，共9 次四天半。于给药前、给药后1 天、3 天、7 天割尾取血20ul，F-820 血小板计数仪检测血象。
表2 鹿脾提取物对小鼠外周血白细胞数量的影响（109/L，x±s，n=10）
| 组别 | 药前 | 1天 | 3天 | 7天 |
| 生理盐水组 | 14.57±2.13 | 15.32±1.89 | 14.79±2.43 | 14.86±2.17 |
| 实施例1 | 14.51±2.03 | 14.63±2.16 | 15.88±2.06* | 16.34±2.13* |
| 实施例2 | 14.53±2.06 | 14.61±1.79 | 15.98±2.02* | 16.48±1.96* |
| 实施例3 | 14.58±2.11 | 14.77±2.14 | 15.85±2.08* | 16.38±2.11* |
| 对照例1 | 14.49±1.73 | 14.63±2.14 | 15.15±1.69 | 15.98±2.11* |
| 对照例2 | 14.58±2.03 | 14.17±2.16 | 15.39±2.56 | 15.94±2.76* |
与生理盐水组比较：*p<0.05
表2结果表明，与生理盐水组比较，实施例1、2、3给药组的白细胞数量在给药后具有增加白细胞数量的趋势，且具有统计学意义（p<0.05），较对照例1、2更加明显，表明本发明改进方法得到的梅花鹿鹿脾提取物在升高正常小鼠的白细胞水平作用上有增强的效果。
二、鹿脾提取物对失血小鼠的治疗作用
对失血小鼠的影响 ICR 小鼠70 只，♀♂各半，均分成7 组（n=10），1组模型组和实施例1鹿脾提取物、实施例2鹿脾提取物、实施例3鹿脾提取物、对照例1鹿脾提取物、对照例2猪脾提取物，每次每只小鼠给药50mg/kg。除生理盐水组外，其它组每只小鼠从眼眶静脉放血0.5ml，24h 后再取血测全部各组指标，然后连续灌胃给药1 周，末次给药1h 后，从眼眶静脉丛取血用F-800 全血小板分析仪测上述指标。
表3 鹿脾提取物对因失血所致白细胞减少的治疗作用（x±s，n=10）
| 组别 | 给药前（1011/L） | 给药一周后（1011/L） |
| 生理盐水组 | 12.57±1.56 | 12.67±1.89 |
| 模型组 | 8.11±1.76 | 7.66±1.98 |
| 实施例1 | 8.28±1.33 | 12.07±2.16** |
| 实施例2 | 8.16±1.29 | 11.85±1.74** |
| 实施例3 | 8.22±1.18 | 11.96±1.96** |
| 对照例1 | 8.13±1.47 | 10.27±1.61* |
| 对照例2 | 8.17±1.52 | 10.03±1.93* |
与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01
表3结果表明，与正常对照组比较，失血后小鼠白细胞数量显著低于正常对照组，失血能够使小鼠白细胞数量减少。经过给药一周后失血小鼠经服用鹿脾提取物治疗7 天后，本发明给药组实施例1、2、3的白细胞数量显著高于模型组（p<0.01），对照例1和对照例2组小鼠的白细胞较模型组有差异性，由实验结果得，本发明给药组较对照组白细胞数量增加提高了20%以上。
三、鹿脾提取物对环磷酰胺致血细胞减少的治疗作用
BALB/c 小鼠共分为7组，分别为空白对照组、模型组、实施例1鹿脾提取物、实施例2鹿脾提取物、实施例3鹿脾提取物、对照例1鹿脾提取物、对照例2猪脾提取物，每组20只小鼠，每次每只小鼠给药50mg/kg。（1）空白对照组，给予生理盐水，每日1次。（2）模型组，第1-3日给予环磷酰胺溶液50 mg/kg，第4-14日给予生理盐水，每日1次。（3）鹿脾提取组，第1-3日给予环磷酰胺溶液50 mg/kg，第4-14日给予相同体积的鹿脾提取物，每日1次，口服灌胃。结果共监测14天。末次给药后1h，眼球采血测定血WBC( 白细胞计数)，取股骨骨髓计数有核细胞数。
表4 鹿脾提取物对环磷酰胺致血细胞减少的治疗作用（x±s，n=10）
| 组别 | 白细胞（109/L） | 骨髓有核细胞（109/L） |
| 生理盐水组 | 13.32±1.89 | 9.21 |
| 模型组 | 6.66±1.68 | 4.82 |
| 实施例1 | 12.37±2.32** | 8.64 |
| 实施例2 | 12.46±2.07** | 8.62 |
| 实施例3 | 12.53±2.07** | 8.67 |
| 对照例1 | 10.27±1.96** | 6.93 |
| 对照例2 | 10.13±2.04** | 6.59 |
与模型组比较：*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001
表4结果表明，与生理盐水组比较，环磷酸胺能使小鼠骨髓损伤，造成外周血细胞下降且骨髓有核细胞减少，经过鹿脾提取物治疗后（实施例1、实施例2、实施例3），小鼠外周血的白细胞和骨髓有核细胞较模型组有显著增加，对照例1和对照例2提取物组在治疗后，小鼠外周血的白细胞和骨髓有核细胞也有明显增加，从结果可得，本发明改进方法提取的鹿脾提取物组小鼠的外周血白细胞和骨髓有核细胞较对照例提高了20%以上。
综上述实验结果说明，本发明改进方法提取的鹿脾提取物的升高白细胞的效果较现有工艺提取的提取物更加明显。
Claims (1)
1.梅花鹿鹿脾提取物在制备升高白细胞药物中的用途，所述的梅花鹿鹿脾提取物，是通过以下方法制成的：
1）称取梅花鹿鹿脾250份，去除表面结缔组织；
2）加入3~8重量的生理盐水，胶体磨研磨2~5min；
3） 将梅花鹿鹿脾混悬液升温至50~55℃，调PH值至5~6，加入0.6～4.6%重量的复合酶A保温0.5h~2h，保温完毕后在4000g离心力下进行离心，得上清液液；
4）将步骤3）得到的鹿脾沉淀物继续加入等质量的生理盐水，升温至60~65℃，继续加入2～5%重量的复合酶B保温1~3h，然后在4000g离心力下离心10min，得上清液液；
5）将上清I液和II液进行混合，然后用10KD超滤膜进行超滤，超滤液进行喷雾干燥即得具有升高白细胞功能的鹿脾提取物干粉；
所述的复合酶A为中性蛋白酶：胰蛋白酶：5’-磷酸二酯酶的质量比为1~2：2~4：4~9；
所述的复合酶B为中性蛋白酶：木瓜蛋白酶：5’-磷酸二酯酶的质量比为1~2：2~9：4~12。
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