CN105362250B - 一种制备转移因子胶囊的工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备转移因子胶囊的工艺，其具体步骤为：将脾脏绞碎、低温匀浆、冻融、加酶反应、pH调节‑超滤、过滤除菌冻干后得到转移因子冻干粉，以淀粉和微晶纤维素以及微量的二氧化硅作为辅料混合均匀，填充胶囊。虽然目前有许多分离提取转移因子的方法，但此工艺极大简化了转移因子的分离提取过程，所制得的转移因子生物活性高、产量多，其胶囊制剂性质稳定，缩短了生产周期、节约了成本、操作简单、适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种制备转移因子胶囊的工艺，具体是利用脾脏绞碎、低温匀浆、数次冻融、加酶反应、pH调节-超滤、过滤除菌冻干后得到转移因子冻干粉，以淀粉、微晶纤维素和微量的二氧化硅作为辅料混合均匀，进行填充的一种制备转移因子胶囊的工艺，属于生物制药领域。
技术背景
转移因子是具有免疫活性的T淋巴细胞在抗原或丝裂原的刺激下释放的一类小分子多肽，分子量小于6000，其内含物还包括游离氨基酸(16～18种)、核酸、K、Na、Mg、Ca、Zn等金属元素。转移因子具有可透析性，能与抗原结合而本身却无抗原性。并且参与机体免疫功能的淋巴因子，具有增强淋巴细胞转化，从而提高机体免疫功能的作用。TF可将供体的细胞免疫功能特异地转给受体，而且能转移包括真菌、细菌、病毒、寄生虫、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫，被誉为T细胞活性的触发剂，细胞免疫的增强剂、细胞免疫调节剂及干扰素产生启动剂。转移因子自20世纪50年代被发现以来，国内外学者对其研究也从基础理论研究深入到临床应用方面。
从发现转移因子至今，转移因子多采用注射的形式，剂型主要是注射液及冻干粉针剂，为了更加方便使用，近年来市场上出现了胶囊制剂，在中国专利(公开号为：CN102973603)中从动物脾脏中提取粗转移因子溶液，采用凝胶色谱层析法分离纯化提取的转移因子，但转移因子溶液的浓度对凝胶色谱层析法的分离效果影响较大，工业化生产不易控制。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术地不足而提供了一种制备转移因子胶囊工艺，本发明分离提取转移因子的方法，简化了现有的提取工艺，制得的转移因子溶液杂质含量低，转移因子冻干粉生物活性在20％以上，符合并高于国家规定的标准(生物活性在10％以上)，并且以淀粉、微晶纤维素和微粉硅胶作为辅料填充胶囊，胶囊性质稳定。
本发明的技术方案为：一种制备转移因子胶囊的工艺，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的脾脏，冲洗干净，沥干，绞碎成肉糜状，称重；
(2)将步骤(1)中的肉糜放入匀浆机内，加入生理盐水，进行匀浆；
(3)将步骤(2)得到的匀浆冻融后，用碱调节pH值至6.5～7.5，加入木瓜蛋白酶，恒温进行反应后，离心取上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液用酸调节pH值至4.5～5.5，然后在冷冻离心机内离心，弃去残渣，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液用碱调节pH值调至6.5～7.5，先用澄清滤板抽滤，将得到的滤液经超滤膜进行超滤，在无菌环境下，用微孔滤膜过滤除菌后，分装入灭菌好的器具中速冻；
(6)将步骤(5)速冻后的溶液送入冻干箱中进行冻干，得到转移因子冻干粉，称重；
(7)将步骤(6)得到的转移因子冻干粉与辅料淀粉、微晶纤维素和二氧化硅混合均匀；
(8)将步骤(7)得到混匀物加入料斗中，将空心胶囊盛入容器内，打开送囊开关，进行填充可。
优选步骤(2)中按照脾脏肉糜的质量与生理盐水的体积比为1:(1.4～1.8)kg/L；匀浆次数为3～5次；每次匀浆3～5min；每次间隔4～6min；匀浆温度控制在20～25℃。
优选步骤(3)中冻融的次数为3～5次；冷冻温度为-20～-30℃；融化温度15～25℃；木瓜蛋白酶的加入量占匀浆质量的0.4％～0.8％；恒温反应温度控制在20～25℃；反应时间3～5h；离心时离心机的转速在2500～3000r/min，离心时间15～20min。
优选步骤(4)中所述的酸味盐酸或醋酸；更优选盐酸；冷冻离心机的转速在2500～3000r/min；离心时间25～30min。
优选步骤(3)和(5)所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙；更优选为氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化钙。
优选步骤(5)所述的超滤膜的截留分子量为10000～8000d；所述的微孔滤膜的孔径为0.20～0.24μm，进行过滤除菌。
优选步骤(7)中所述的辅料二氧化硅和微晶纤维素均过70～80目筛；过筛后外观无异物。
优选步骤(7)中按转移因子冻干粉、辅料淀粉、微晶纤维素和二氧化硅的混合物每100重量份计，其中转移因子冻干粉2.2～2.8重量份，淀粉72.2～84.8重量份，微晶纤维素10～20重量份，二氧化硅3～5重量份。
有益效果：
根据本发明所得到的转移因子溶液经蛋白定性反应、紫外光谱分析A260/A280符合国家标准(≥1.8)；HPLC检测其杂质含量少；用T细胞活性测定法测其活性，活性在20％以上；无菌试验、安全试验、过敏试验按照《中国生物制品规程》检测均符合要求；冻干后的转移因子粉末与淀粉、微晶纤维素和微粉硅胶混合后填充入胶囊，经国家食品药品监督管理局颁发的转移因子胶囊国家药品标准WS1-XG-039-2 000进行检测，结果均符合规定。
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
(1)取新鲜的脾脏，用纯化水冲洗三次，去脂肪、筋膜等杂质，沥干，用绞肉机绞碎成肉糜状，称重为5.66kg；
(2)将步骤(1)中的肉糜放入匀浆机内，按肉糜匀浆的质量与生理盐水的体积比为1:1.4kg/L的比例加入生理盐水，进行匀浆，每次匀浆5min，共3次，每次间隔6min，温度控制在20℃；
(3)将步骤(2)得到的匀浆经3次数反复冻融，冷冻温度-30℃，融化温度25℃，并在第3次融化时，用氢氧化钠溶液调节pH值至6.5，木瓜蛋白酶加入量占匀浆质量的0.4％，反应时间3h，恒温20℃进行反应一段时间后，经离心机离心20min，转速为2500r/min，取上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液用醋酸调pH值至4.5，冷冻离心机的转速在2500r/min，离心30min。弃去残渣，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液以氢氧化钠溶液将pH值调至为6.5，先用澄清滤板抽滤，将得到的滤液经截留分子量为10000d的超滤膜超滤，超滤后的转移因子提取液在无菌环境下，用0.20μm的微孔滤膜过滤除菌后，分装入灭菌好的器具中速冻，同时取10ml的转移因子溶液经蛋白定性反应无沉淀产生，符合标准。取1ml转移因子溶液稀释后经紫外光谱分析A260/A280值为3.52，符合国家标准(A260/A280≥1.8)。经HPLC检测杂质含量少。用T细胞活性测定法测其活性，活性为22.1％。无菌试验、安全试验、过敏试验按照《中国生物制品规程》检测均符合要求；
(6)将步骤(5)检测合格的转移因子提取液取出，装盘送入冻干箱中进行冻干，得到转移因子冻干粉，称重2.2g；
(7)将步骤(6)得到的转移因子冻干粉与84.8g的淀粉，10g的微晶纤维素，3g的二氧化硅辅料混合，其中二氧化硅和微晶纤维素过70目筛，过筛后外观无异物后按等量递增法与冻干粉在洁净盘内用手工混匀，每次混合时间4min。当混合物总重≥10kg时，直接加入多向运动混合机中混匀，混合1.5h；
(8)将步骤(7)得到混匀物加入料斗中，将空心胶囊盛入容器内，打开送囊开关，进行填充即可，将所制得的胶囊按照国家食品药品监督管理局颁发的转移因子胶囊国家药品标准WS1-XG-039-2 000进行检测，结果均符合规定。
实施例2
(1)取新鲜的脾脏，用纯化水冲洗三次，去脂肪、筋膜等杂质，沥干，用绞肉机绞碎成肉糜状，称重为5.66kg；
(2)将步骤(1)中的肉糜放入匀浆机内，按肉糜匀浆的质量与生理盐水体积比为1:1.6kg/L的比例加入生理盐水，进行匀浆，每次匀浆4min，共4次，每次间隔5min，温度控制在23℃；
(3)将步骤(2)得到的匀浆经4次数反复冻融，冷冻温度-25℃，融化温度20℃，并在第4次融化时用氢氧化钾溶液调节pH值至7，木瓜蛋白酶加入量占匀浆质量的0.6％，反应时间4h，恒温23℃进行反应一段时间后，经离心机离心17min，转速为2800r/min，取上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液用盐酸调pH值至5，冷冻离心机的转速在2800r/min，离心27min。弃去残渣，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液以氢氧化钾溶液将pH值调至为7，先用澄清滤板抽滤，将得到的滤液经截留分子量为8000d的超滤膜超滤，，超滤后的转移因子提取液在无菌环境下，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，分装入灭菌好的器具中速冻，同时取10ml的转移因子溶液经蛋白定性反应无沉淀产生，符合标准。取1ml转移因子溶液稀释后经紫外光谱分析A260/A280值为3.69，符合国家标准(A260/A280≥1.8)。经HPLC检测杂质含量少。用T细胞活性测定法测其活性，活性为24.8％。无菌试验、安全试验、过敏试验按照《中国生物制品规程》检测均符合要求；
(6)将步骤(5)检测合格的转移因子提取液取出，装盘送入冻干箱中进行冻干，得到转移因子冻干粉，称重2.5g；
(7)将步骤(6)得到的转移因子冻干粉与78.5g的淀粉，15g的微晶纤维素，4g的二氧化硅辅料混合，其中二氧化硅和微晶纤维素过80目筛，过筛后外观无异物后按等量递增法与冻干粉在洁净盘内用手工混匀，每次混合时间5min。当混合物总重≥10kg时，直接加入多向运动混合机中混匀，混合2h；
(8)将步骤(7)得到混匀物加入料斗中，将空心胶囊盛入容器内，打开送囊开关，进行填充即可，将所制得的胶囊按照国家食品药品监督管理局颁发的转移因子胶囊国家药品标准WS1-XG-039-2 000进行检测，结果均符合规定。
实施例3
(1)取新鲜的脾脏，用纯化水冲洗三次，去脂肪、筋膜等杂质，沥干，用绞肉机绞碎成肉糜状，称重为5.66kg；
(2)将步骤(1)中的肉糜放入匀浆机内，按肉糜匀浆的质量与生理盐水体积比为1:1.8kg/L的比例加入生理盐水，进行匀浆，每次匀浆3min，共5次，每次间隔4min，温度控制在25℃；
(3)将步骤(2)得到的匀浆经5次数反复冻融，冷冻温度-20℃，融化温度15℃，并在第5次融化时以氢氧化钙溶液调节pH值至7.5，木瓜蛋白酶加入量占匀浆质量的0.8％，反应时间5h，恒温25℃进行反应一段时间后，经离心机离心15min，转速为3000r/min，取上清液；
(4)将步骤(3)得到的上清液用盐酸调pH值至5.5，冷冻离心机的转速在3000r/min，离心25min。弃去残渣，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液以氢氧化钙溶液将pH值调至为7.5，先用澄清滤板抽滤，将得到的滤液经截留分子量为8000d的超滤膜超滤，，超滤后的转移因子提取液在无菌环境下，用0.24μm的微孔滤膜过滤除菌后，分装入灭菌好的器具中速冻，同时取10ml的转移因子溶液经蛋白定性反应无沉淀产生，符合标准。取1ml转移因子溶液稀释后经紫外光谱分析A260/A280值为3.62，符合国家标准(A260/A280≥1.8)。经HPLC检测杂质含量少。用T细胞活性测定法测其活性，活性为23.5％。无菌试验、安全试验、过敏试验按照《中国生物制品规程》检测均符合要求；
(6)将步骤(5)检测合格的转移因子提取液取出，装盘送入冻干箱中进行冻干，得到转移因子冻干粉，称重2.8g；
(7)将步骤(6)得到的转移因子冻干粉与72.2g的淀粉，20g的微晶纤维素，5g的二氧化硅辅料混合，其中二氧化硅和微晶纤维素分别过80目筛，过筛后外观无异物后按等量递增法与冻干粉在洁净盘内用手工混匀，每次混合时间6min。当混合物总重≥10kg时，直接加入多向运动混合机中混匀，混合2.5h。
(8)将步骤(7)得到混匀物加入料斗中，将空心胶囊盛入容器内，打开送囊开关，进行填充即可，将所制得的胶囊按照国家食品药品监督管理局颁发的转移因子胶囊国家药品标准WS1-XG-039-2 000进行检测，结果均符合规定。
Claims (7)
1.一种制备转移因子胶囊的工艺，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的脾脏，冲洗干净，沥干，绞碎成肉糜状，称重；
(2)将步骤(1)中的肉糜放入匀浆机内，加入生理盐水，进行匀浆；
(3)将步骤(2)得到的匀浆冻融后，用碱调节pH值至6.5～7.5，加入木瓜蛋白酶，恒温进行反应后，离心取上清液；其中冻融的次数为3～5次；
(4)将步骤(3)得到的上清液用酸调节pH值至4.5～5.5，然后在冷冻离心机内离心，弃去残渣，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液用碱调节pH值调至6.5～7.5，先用澄清滤板抽滤，将得到的滤液经超滤膜进行超滤，在无菌环境下，用微孔滤膜过滤除菌后，分装入灭菌好的器具中速冻；其中所述的超滤膜的截留分子量为10000～8000d；所述的微孔滤膜的孔径为0.20～0.24μm；
(6)将步骤(5)速冻后的溶液送入冻干箱中进行冻干，得到转移因子冻干粉，称重；
(7)将步骤(6)得到的转移因子冻干粉与辅料淀粉、微晶纤维素和二氧化硅混合均匀；
(8)将步骤(7)得到混匀物加入料斗中，将空心胶囊盛入容器内，打开送囊开关，进行填充可。
2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(2)中按照脾脏肉糜的质量与生理盐水的体积比为1:(1.4～1.8)kg/L；匀浆次数为3～5次；每次匀浆3～5min；每次间隔4～6min；匀浆温度控制在20～25℃。
3.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(3)中冷冻温度为-20～-30℃；融化温度15～25℃；木瓜蛋白酶的加入量占匀浆质量的0.4％～0.8％；恒温反应温度控制在20～25℃；反应时间3～5h；离心时离心机的转速在2500～3000r/min，离心时间15～20min。
4.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(4)中所述的酸为 盐酸或醋酸；冷冻离心机的转速在2500～3000r/min；离心时间25～30min。
5.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(3)和(5)所述的碱为氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢钙。
6.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(7)中所述的辅料二氧化硅和微晶纤维素均过70～80目筛。
7.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于：步骤(7)中按转移因子冻干粉、辅料淀粉、微晶纤维素和二氧化硅的混合物每100重量份计，其中转移因子冻干粉2.2～2.8重量份，淀粉72.2～84.8重量份，微晶纤维素10～20重量份，二氧化硅3～5重量份。
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