CN110538320A - 载有转移因子的微球制剂、制备方法及在水产养殖的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种载有转移因子的微球制剂、制备方法及在水产养殖的应用，属于水产养殖用免疫增强剂类药物技术领域，其制备方法包括以下步骤：S1.制备转移因子；S2.筛选转移因子；S3.制备转移因子微球。本发明采用壳聚糖、海藻酸钠对转移因子进行包被，形成复合微球，使转移因子能够保留良好的刺激免疫的活性，并能够应用于水产养殖领域的病毒感染性疾病的预防。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖用免疫增强剂类药物技术领域，涉及一种载有转移因子的微球制剂、制备方法及在水产养殖的应用。
背景技术
转移因子（TF），又称传输因子，是具有免疫活性的T淋巴细胞分泌产生的一类可以透析的多肽与多核苷酸复合物，能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能，具有无毒性、无抗原性、无过敏性、无热源性、无种属特异性的特点。研究显示，转移因子具有增强动物的细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫、抗免疫抑制及促进动物的生长发育等功能，并且在临床上对肿瘤和艾滋病，尤其是对病毒性疾病，如疱疹等的临床治疗具有一定疗效。
随着现代化养殖业的发展及规模化、集约化程度的不断提高，疾病已成为阻碍养殖业发展的一大难题。为了减少耐药菌株的增加和交叉感染的产生，将转移因子作为免疫增强剂，以提高动物机体的抵抗力及疫苗的免疫效果，减少疾病对养殖所产生的经济损失，是解决疾病阻碍养殖业发展的一个重要途径。现有技术中，公布号为CN103565834A的专利申请公开了一种猪疫苗特异性牛脾脏转移因子的制备方法及用途，通过对健康牛免疫一种以上的猪疫苗，选择猪疫苗抗体阳性的牛，取其脾脏，对牛脾脏进行低温保藏和解冻，除去筋膜并清洗后绞碎，匀浆后得到匀浆液，对低温保存后的匀浆液反复冻融、离心后取上清液进行微滤和超滤，灭活后得到粗制品，经过pH调节和渗透压调节，除菌后得到猪疫苗特异性牛脾脏转移因子。这样从牛脾脏中提取转移因子用于猪养殖的免疫增强剂，有利于减少疾病对养殖业的影响，但这种转移因子的应用目前还局限于畜牧兽医领域，对于水产养殖领域的应用还缺乏普及性。
在水产养殖领域，鱼类的病原体，特别是RNA病毒，每年都会对水产养殖业造成破坏性的经济影响，如传染性造血组织坏死病毒，有可能导致鲑鱼饲养场出现80~100%的损失，疾病爆发后，存活的鱼又有可能成为病毒携带者，而采用抗生素和化学疗法对病毒无效，因此需要有效的免疫制剂用于预防病毒感染性疾病。对于鱼类而言，免疫制剂的注射给药方式既不经济，又有可能造成鱼体产生很大应激和继发感染等风险，故往往采用口服的给药方式，但转移因子在口服给药时，容易在水环境和消化过程中损失，难以有效发挥其免疫增强作用。因此，以转移因子作为免疫增强剂在水产养殖方面的应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种载有转移因子的微球制剂、制备方法及在水产养殖的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种载有转移因子的微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备转移因子：对成年牛的脾脏进行灭菌处理，除去表面筋膜、脂肪组织，捣碎、匀浆后得到匀浆液；将匀浆液的pH值调至2~3，反复冻融3~6次，再将pH值调至6.5~6.8，离心后取上清液过滤，得到转移因子提取液。
S2.筛选转移因子：检测转移因子提取液中的多肽和蛋白含量、OD260/OD280值，选择检测结果中多肽和蛋白含量为6~8mg/mL，OD260/OD280值为2.1~2.3，且蛋白质测定呈阴性的转移因子提取液为合格品。
S3.制备转移因子微球：将合格品稀释至1~3 mg/mL，并与等体积的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后得到水相，所述海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1~2%；将含有Span-80的液体石蜡作为油相，所述Span-80的质量体积浓度为3~5%；将水相滴加至油相中，搅拌均匀后得到乳化液，所述水相与油相的体积比为1:1~2.4；将质量体积浓度为6~10%的氯化钙溶液加入乳化液中，搅拌8~12min后离心，收集沉淀，得到初级微球。采用清洗液对初级微球进行洗涤和重悬，与质量体积浓度为0.6~1%的壳聚糖溶液混合，搅拌8~12min后离心，收集沉淀，得到复合微球；对复合微球进行洗涤，即得转移因子微球。
在所述的步骤S3中，对合格品的稀释采用生理盐水。生理盐水能够模拟动物体内的渗透压环境，不影响转移因子的活性，有利于更好地保留转移因子刺激免疫的活性。
在所述的步骤S3中，搅拌采用的转速为800~1200r/min。由于转移因子的本质为多肽与多核苷酸复合物，是从生物体内提取的自然物质，在较低转速下，有利于维持转移因子的结构稳定，进而有利于保持转移因子活性的稳定性。
在所述的步骤S3中，所述的清洗液采用乙酸钠溶液，所述的清洗液的pH值为3.5~4.5。步骤S1提取的转移因子在偏酸性环境下较为稳定，且初级微球处于收缩状态，对转移因子具有良好的包被效果，也有利于维持初级微球对转移因子包被的稳定性。
在所述的步骤S3中，壳聚糖溶液以pH值为4.8~5.2的乙酸钠溶液为溶剂。当初级微球以乙酸钠为清洗剂进行重悬后，由乙酸钠溶液与壳聚糖形成的壳聚糖溶液与初级微球的混悬液混合，有利于初级微球与壳聚糖的充分接触，进而有利于复合微球的快速形成。
本发明的制备方法还包括冻干步骤，所述的冻干步骤包括用清洗液对转移因子微球进行重悬，加入等体积的甘露醇溶液，搅拌均匀后冻干，得到转移因子微球的冻干剂。这样转移因子微球以冻干剂的状态保存，便于储存和携带。
本发明的另一个目的为提供一种载有转移因子的微球制剂，该转移因子的微球制剂由上述制备方法制得。
本发明的第三个目的为提供一种载有转移因子的微球制剂在水产养殖的应用。在应用时，先对转移因子微球进行重悬，将饲料磨成粉状，将粉状的饲料与重悬后的转移因子微球混合，混合均匀后进行干燥，得到口服制剂，所述的干燥在36~38℃下进行。通过将载有转移因子的微球制剂与粉状的饲料混合，使鱼在进食的过程中实现对转移因子的微球制剂的摄入，有利于控制和确保转移因子的微球制剂的摄入量。饲料与转移因子的微球制剂混合后在较低温度下干燥，有利于防止高温烘干导致转移因子的活性下降。
在具体的生产实践中，所述的口服制剂的每日投喂量为鱼体重的2%，每尾鱼每天的转移因子投喂量大于等于25μg。根据不同阶段鱼体重的规格，制备不同转移因子含量的口服制剂，以确保按照其进食量摄入了足够的转移因子。
本发明的有益效果是：
1）本发明通过采用海藻酸钠和壳聚糖对转移因子进行包被，形成载有转移因子的复合微球，使转移因子在以口服的形式对鱼类给药的过程中依然能够保留有良好的刺激免疫的活性。
2）本发明通过对转移因子制备条件的控制和制备完成后的筛选步骤，选择出活性含量合格的转移因子，然后利用海藻酸钠和壳聚糖对其进行包被，制备得到活性稳定、不易降解、适于水产动物口服的转移因子微球制剂。本发明制得的微球制剂安全性高、质量稳定，能够作为水产养殖的免疫增强剂，达到提高鱼体免疫力和降低鱼体感染的效果，有利于降低病毒感染性疾病对水产养殖的影响和损失。
附图说明
图1为本发明免疫效果试验中血清免疫相关指标检测结果；
图2为本发明免疫效果试验中肠黏液免疫相关指标检测结果；
图3为本发明免疫效果试验中免疫相关基因表达检测结果；
图4为本发明攻毒试验中各组虹鳟鱼的生存曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明提供一种技术方案：一种载有转移因子的微球制剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.制备转移因子：采用健康的成年牛的新鲜脾脏，对其进行灭菌处理，除去牛脾脏表面的筋膜、脂肪组织，然后将脾脏捣碎、匀浆后得到匀浆液。将匀浆液的pH值调至3，反复冻融5次，这里的反复冻融是指对匀浆液进行冷冻-解冻的循环过程，引起冰晶的多次重新形成，损坏匀浆液中的细胞结构。再将pH值调至6.6，在3000r/min的转速下离心30min，取上清液进行中空纤维过滤和0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，得到转移因子提取液。
S2.筛选转移因子：检测转移因子提取液中的多肽和蛋白含量为7.0 mg/mL，OD260/OD280值为2.19，蛋白质测定呈阴性，转移因子提取液为合格品。本实施例检测多肽和蛋白含量采用Folin-酚法进行测定。
S3.制备转移因子微球：用生理盐水将合格品稀释至2mg/mL，取稀释后的合格品20mL，并与20mL质量体积浓度为1.58%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后得到水相。将含有4%Span-80的液体石蜡作为油相，将水相滴加至40mL的油相中，1000r/min搅拌10min后得到乳化液。将质量体积浓度为8.65%的氯化钙溶液加入乳化液中，1000r/min搅拌10min，然后8000r/min离心5min，收集沉淀，得到初级微球。采用pH值为4，浓度为0.01mol/L的乙酸钠溶液对初级微球进行洗涤，洗涤3次后用20mL的乙酸钠溶液对初级微球重悬，重悬是使初级微球重新悬浮于乙酸钠溶液中，然后与质量体积浓度为0.81%的壳聚糖溶液混合，本实施例采用的壳聚糖溶液是以pH值为5的乙酸钠溶液作为溶剂进行配置，1000r/min搅拌10min，形成海藻酸钠-壳聚糖复合微球，8000r/min离心5min，收集沉淀，得到复合微球。用乙酸钠溶液对复合微球洗涤3次，即得转移因子微球。
实施例二
本实施例与实施例一的区别主要在于：在步骤S1中，匀浆液的pH值调整至2，反复冻融3次，再将pH值调至6.5后离心，取上清液过滤得到转移因子提取液。在步骤S2中，检测多肽和蛋白含量为6.32 mg/mL，OD260/OD280值为2.13，蛋白质测定呈阴性，转移因子提取液为合格品。在步骤S3中，用生理盐水将合格品稀释至1mg/mL，采用的海藻酸钠溶液质量体积浓度为1%，油相为含有3%Span-80的液体石蜡，水相与油相的体积比为1:1.5。本实施例采用的氯化钙溶液质量体积浓度为6%，乳化液与氯化钙溶液混合后搅拌8min，清洗液采用pH值为3.5的乙酸钠溶液，采用的壳聚糖溶液质量体积浓度为0.6%，壳聚糖溶液以pH值为5.2的乙酸钠溶液作为溶剂进行配置，搅拌8min后离心，本实施例的搅拌转速为1200 r/min。
实施例三
本实施例与实施例一的区别主要在于：本实施例的步骤S1中，匀浆液的pH值调整至2.5，反复冻融6次，再将pH值调至6.8，去上清液过滤得到转移因子提取液。在步骤S2中，检测多肽和蛋白含量为7.16 mg/mL，OD260/OD280值为2.24，蛋白质测定呈阴性，转移因子提取液为合格品。在步骤S3中，用生理盐水将合格品稀释至3mg/mL，采用的海藻酸钠溶液质量体积浓度为2%，油相为含有5%Span-80的液体石蜡，水相与油相的体积比为1:2.4。本实施例采用的氯化钙溶液质量体积浓度为10%，乳化液与氯化钙溶液混合后搅拌12min，清洗液采用pH值为4.5的乙酸钠溶液，采用的壳聚糖溶液质量体积浓度为1%，壳聚糖溶液以pH值为4.8的乙酸钠溶液作为溶剂进行配置，搅拌12min后离心，本实施例的搅拌转速为800 r/min。本实施例还包括冻干步骤，将洗涤后的复合微球再次用20mL的清洗液重悬，然后加入20mL质量体积浓度为2%的甘露醇，搅拌均匀后分装冻干，得到转移因子微球的冻干剂。
对比例一
本对比例提供一种空微球，包括以下步骤：
用20 mL的PBS缓冲液取代转移因子溶液与20mL质量体积浓度为1.58%的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后得到水相。将含有4%Span-80的液体石蜡作为油相，将水相滴加至40mL的油相中，1000r/min搅拌10min后得到乳化液。将质量体积浓度为8.65%的氯化钙溶液加入乳化液中，1000r/min搅拌10min，然后8000r/min离心5min，收集沉淀，得到初级空微球。采用pH值为4，浓度为0.01mol/L的乙酸钠溶液对初级空微球进行洗涤，洗涤3次后用20mL的乙酸钠溶液对初级空微球重悬，然后与质量体积浓度为0.81%的壳聚糖溶液混合，本对比例采用的壳聚糖溶液是以pH值为5的乙酸钠溶液作为溶剂进行配置，1000r/min搅拌10min，形成海藻酸钠-壳聚糖复合空微球，8000r/min离心5min，收集沉淀，得到复合空微球。用乙酸钠溶液对复合空微球洗涤3次，即得空微球。
载有转移因子的微球制剂在水产养殖中的免疫效果试验
制备水产养殖用口服制剂：将饲料研磨成粉状，分别将实施例一制备的转移因子微球、实施例一制备的转移因子提取液、对比例一制备的空微球与粉状饲料混合，其中，转移因子微球和空微球均重悬后再与饲料混合，混合均匀后在37℃下干燥，得到转移因子微球口服制剂、转移因子口服制剂和空微球口服制剂，且转移因子微球口服制剂中转移因子的质量百分数大于0.9%。
免疫试验前，先对成年虹鳟鱼进行为期14d的喂料驯养，取每日进料情况良好、健康的虹鳟鱼450尾，随机分为3组，每组150尾，其中，采用转移因子微球口服制剂喂养的组为TF微球组，采用转移因子口服制剂喂养的组为TF组，采用空微球口服制剂喂养的组为PBS组。以每日2%鱼体重的量投喂相应的口服制剂，每日投喂2次，连续投喂14d，然后对其进行以下检测。
血清免疫相关指标检测
分别从各组随机取6尾鱼，用鱼用麻醉剂MS222（1mg.mL）对其进行麻醉，尾静脉采血0.2mL/尾，将采集的血液放于室温静置2h，然后于4℃冰箱静置过夜析出血清，在4℃下以4000r/min离心10min，收集上层血清。分别检测各上清液的血清溶酶菌活性、补体C3含量和总蛋白含量，并采用ELISA法检测其抗体效价，检测结果如图1所示。
肠黏液免疫相关指标检测
分别从各组随机取6尾鱼，用鱼用麻醉剂MS222（1mg.mL）对其进行麻醉，麻醉后进行无菌解剖，取后肠组织，纵向划开后刮取黏液和黏膜，置于PBS溶液中，经过匀浆和离心后，收集上清液。分别检测各上清液的溶菌酶活性、补体C3含量、总蛋白含量和抗体水平，检测结果如图2所示。
免疫相关基因表达分析
分别从各组随机取6尾鱼，采用荧光定量PCR的方法检测其白介素-1β、α肿瘤坏死因子、主要组织相容性复合体Ⅰ、主要组织相容性复合体Ⅱ、白介素-6和1型干扰素这六个免疫相关基因的表达量。以β-actin为内参基因，采用ΔΔCt法进行分析，根据各组Ct平均值和内参基因的Ct平均值计算各组六个免疫相关基因的相对表达量：相对表达量=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=实验ΔCt-对照ΔCt，ΔCt=目的基因的平均Ct值-两个内参基因的平均Ct值，计算结果如图3所示。
攻毒试验
分别从各组随机取15尾鱼，在16℃水温条件下，腹腔注射105.2TCID50的传染性造血器官坏死病毒的培养液200 ul，并在16℃水温下饲养观察2周，饲养观察期间投喂正常饲料，记录各组每天的死亡率，记录结果如图4所示。
在图1中，A图为血清中的溶菌酶活性检测结果，B图为血清中补体C3含量的检测结果，C图为血清中总蛋白含量的检测结果，D图为血清中抗体效价的检测结果，由上述四项检测结果可见，TF微球组的上述各项检测结果均显著高于PBS组和TF组（P＜0.01，**）。在图2中，A图为肠黏液中溶菌酶活性检测结果，B图为肠黏液中补体C3含量的检测结果，C图为肠黏液中总蛋白含量的检测结果，D图为肠粘液中抗体效价的检测结果，由图2可见，TF微球组的各项结果均显著高于PBS组和TF组（P＜0.01，**）。在图3中，A图为白介素-6（IL-6）的基因表达量，B图为白介素-1β（IL -1β）的基因表达量，C图为α肿瘤坏死因子（TNF α）的基因表达量，D图为主要组织相容性复合体Ⅰ（MHC Ⅰ）的基因表达量，E图为主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）的基因表达量，F图为Ⅰ型干扰素（IFN1）的基因表达量，由图3可见，TF微球组的以上免疫相关基因的表达量均显著高于PBS组和TF组。由上述免疫相关的检测结果可见，本发明制备的口服制剂对水产动物具有增强其免疫功能的作用，且作用效果明显优于直接用转移因子混饲的TF组。从攻毒试验的结果图4可以看出，与PBS组和TF组相比，本发明的口服制剂（TF微球组）能够明显提高虹鳟鱼的存活率，有利于降低病毒类病原体对水产养殖业造成的经济损失。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.制备转移因子：对成年牛的脾脏进行灭菌处理，除去表面筋膜、脂肪组织，捣碎、匀浆后得到匀浆液；将匀浆液的pH值调至2~3，反复冻融3~6次，再将pH值调至6.5~6.8，离心后取上清液过滤，得到转移因子提取液；
S2.筛选转移因子：检测转移因子提取液中的多肽和蛋白含量、OD260/OD280值，选择检测结果中多肽和蛋白含量为6~8mg/mL，OD260/OD280值为2.1~2.3，且蛋白质测定呈阴性的转移因子提取液为合格品；
S3.制备转移因子微球：将合格品稀释至1~3 mg/mL，并与等体积的海藻酸钠溶液混合，搅拌均匀后得到水相，所述海藻酸钠溶液的质量体积浓度为1~2%；将含有Span-80的液体石蜡作为油相，所述Span-80的质量体积浓度为3~5%；将水相滴加至油相中，搅拌均匀后得到乳化液，所述水相与油相的体积比为1:1~2.4；将质量体积浓度为6~10%的氯化钙溶液加入乳化液中，搅拌8~12min后离心，收集沉淀，得到初级微球；采用清洗液对初级微球进行洗涤和重悬，与质量体积浓度为0.6~1%的壳聚糖溶液混合，搅拌8~12min后离心，收集沉淀，得到复合微球；对复合微球进行洗涤，即得转移因子微球。
2.根据权利要求1所述的载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中，对合格品的稀释采用生理盐水。
3.根据权利要求1所述的载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中，搅拌采用的转速为800~1200r/min。
4.根据权利要求1所述的载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中，所述的清洗液采用乙酸钠溶液，所述的清洗液的pH值为3.5~4.5。
5.根据权利要求4所述的载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤S3中，壳聚糖溶液以pH值为4.8~5.2的乙酸钠溶液为溶剂。
6.根据权利要求1所述的载有转移因子的微球制剂的制备方法，其特征在于：还包括冻干步骤，所述的冻干步骤包括用清洗液对转移因子微球进行重悬，加入等体积的甘露醇溶液，搅拌均匀后冻干，得到转移因子微球的冻干剂。
7.一种根据权利要求1至6中任意一项所述的制备方法制得的载有转移因子的微球制剂。
8.按照权利要求1至6中任意一项所述的制备方法制得的载有转移因子的微球制剂在水产养殖的应用。
9.根据权利要求8所述的载有转移因子的微球制剂在水产养殖的应用，其特征在于：对转移因子微球进行重悬，将饲料磨成粉状，将粉状的饲料与重悬后的转移因子微球混合，混合均匀后进行干燥，得到口服制剂，所述的干燥在36~38℃下进行。
10.根据权利要求9所述的载有转移因子的微球制剂在水产养殖的应用，其特征在于：所述的口服制剂的每日投喂量为鱼体重的2%，每尾鱼每天的转移因子投喂量大于等于25μg。
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Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105362250A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-03-02 | 南京新百药业有限公司 | 一种制备转移因子胶囊的工艺 |
| CN106377543A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-08 | 福建贝迪药业有限公司 | 一种脾脏源转移因子的制备方法 |
| CN106723082A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 无限极（中国）有限公司 | 一种活性肽微粒制剂及其制备方法 |
| CN108114275A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-05 | 成都市农林科学院 | 一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（ihnv）灭活疫苗的制备方法及其应用 |
-
2019
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105362250A (zh) * | 2015-11-16 | 2016-03-02 | 南京新百药业有限公司 | 一种制备转移因子胶囊的工艺 |
| CN106377543A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-02-08 | 福建贝迪药业有限公司 | 一种脾脏源转移因子的制备方法 |
| CN106723082A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 无限极（中国）有限公司 | 一种活性肽微粒制剂及其制备方法 |
| CN108114275A (zh) * | 2018-01-24 | 2018-06-05 | 成都市农林科学院 | 一种虹鳟传染性造血器官坏死病毒（ihnv）灭活疫苗的制备方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 符华林: "《猪脾转移因子微囊的制备及其活性检测》", 《中国兽医科学》 * |
| 赖为民: "《牛脾转移因子联合核酸疫苗对虹鳟鱼IHN病的保护率影响研究》", 《当代水产》 * |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191206 |
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