CN110475479A - 微生物细胞、产生其的方法以及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物细胞，包括但不限于需氧细菌细胞和厌氧细菌细胞，以及酵母细胞，和用于产生所述细胞、饲料添加剂和包含所述细胞的组合物的方法，以及牵涉向动物施用所述细胞的用途。

Description

微生物细胞、产生其的方法以及其用途
发明领域
本发明涉及埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)细胞，用于产生埃氏巨球形菌细胞的方法，包含所述细胞的饲料添加剂和组合物，以及牵涉向动物施用所述细胞的用途，包括例如用于经改善的生长性能和/或健康。本发明还涉及微生物细胞，包括但不限于需氧细菌、厌氧细菌和酵母细胞，和用于产生微生物细胞的方法，包含所述微生物细胞的饲料添加剂和组合物，以及牵涉向动物施用所述微生物细胞的用途，包括例如用于经改善的生长性能和/或健康。
发明背景
埃氏巨球形菌是一种不动的革兰氏阴性双球菌，其利用乳酸盐作为优先碳源并且可以有助于防止酸中毒，所述酸中毒是一种每年影响数百万头肉用和奶用牛的常见的消化系统病症。
当牛和其他反刍动物摄取大量的含淀粉的食物(例如，谷物颗粒)或者简单糖时，在胃中的机会微生物可以将这些化合物快速地发酵成乳酸。乳酸是一种强有力的有机酸并且可以导致乳酸酸中毒，其可以在反刍动物中破坏正常的消化活动并且引起对于消化道内衬的广泛损害。受影响的动物表现欠佳。并且，乳酸酸中毒的最急性形式可以引起对于动物的消化和呼吸系统的不可逆的损害，以及增加的死亡率。
埃氏巨球形菌可以通过细菌将乳酸转化为挥发性脂肪酸(VFA；例如丁酸盐、丙酸盐和乙酸盐)的能力来帮助控制乳酸酸中毒，所述挥发性脂肪酸是无害的有机化合物。但是，在反刍动物的胃肠道中的埃氏巨球形菌菌群经常处于过低的水平，从而无法防止酸中毒的风险。因此，开发出了一种来自埃氏巨球形菌菌株的活细胞的液体培养物，以增加在反刍动物的胃肠道中埃氏巨球形菌的菌株建群率。参见例如美国专利号7,550,139。但是，存在限制了包含埃氏巨球形菌的产品的使用的实际的约束，包括在所述生物所需要的厌氧条件下维持埃氏巨球形菌产品的困难以及在14天之内将埃氏巨球形菌产品从生产设施运输至最终使用地点的困难，在这个时间之后，在所述产品中的埃氏巨球形菌的生存力显著降低。
虽然美国专利号4,138,498一般性地讨论了埃氏巨球形菌的可能的冻干，但是它未提供任何可以在商业规模上进行使用以克服现有商业限制的用于产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的方法。而且，至少一个小组最近报道，冷冻干燥微生物(包括厌氧生物，例如埃氏巨球形菌)在商业上是不实际的。参见例如，WO 2017/015022。
因此，对于巨球形菌属(Megasphaera)细胞，例如埃氏巨球形菌细胞，包括克服了现有限制的产生所述细胞的方法，存在需要。对于其他微生物细胞，包括克服了现有限制的产生所述细胞的方法，也存在需要，所述其他微生物细胞为例如双歧杆菌属(Bifidobacterium)，例如短双歧杆菌(B.breve)，乳杆菌属(Lactobacillus)，例如植物乳杆菌(L.plantarum)，双歧杆菌属，例如动物双歧杆菌乳亚种(B.animalis subsp.lactis)，片球菌属(Pediococcus)，例如乳酸片球菌(P.acidilactici)，乳杆菌属，例如干酪乳杆菌(L.casei)，芽孢杆菌属(Bacillus)，例如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，糖酵母属(Saccharomyces)，例如布拉尔氏糖酵母(S.boulardii)和酿酒糖酵母(S.cerevisiae)。
发明简述
本公开内容旨在产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括：(a)在厌氧条件下制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、山梨醇、甘露醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在厌氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述至少两种碳源由大约50-90％的第一碳源和大约10-50％的第二碳源组成，其中所述第二碳源不同于所述第一碳源，并且其中100％的所述至少两种碳源由所述第一碳源和所述第二碳源组成。
本公开内容旨在产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括：(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，(b)在所述培养物结束其指数生长期后12小时之内并且在所述培养物开始其稳定生长期之前，在厌氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述收获包括至少一种从由下列各项组成的组中选择的技术：离心、过滤、透析、反渗透及其组合。在某些实施方案中，所述过滤包括切向流过滤。
在某些实施方案中，所述培养物包含液体，并且所述收获包括去除大约60％至大约100％的所述液体。
在某些实施方案中，所述冷冻处于大约-80℃至大约-210℃的温度。
本公开内容旨在产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括：(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，(b)收获所述细胞，(c)在收获的5小时之内在大约-80℃至大约-210℃的温度下冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述冷冻包括使包含所述埃氏巨球形菌细胞的容器与液氮相接触。
在某些实施方案中，所述冷冻包括使所述细胞与液氮相接触。
在某些实施方案中，所述冷冻处于大约-196℃的温度并且产生包含所述细胞的经冷冻的丸粒，其中所述经冷冻的丸粒的直径为大约0.001至大约0.5英寸。
在某些实施方案中，在收获之前所述埃氏巨球形菌培养物的pH为大约4.5至大约7.0。
在某些实施方案中，大约1×103至大约1×1012CFU/g的所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约25℃的温度下贮存至少2周后是有生存力的。
在某些实施方案中，大约1×103到大约1×1012CFU/g的所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约4℃下贮存至少1个月后是有生存力的。
在某些实施方案中，所述培养物进一步包含至少一种冷冻保护剂。
在某些实施方案中，所述至少一种冷冻保护剂选自由下列各项组成的组：果糖、葡萄糖、蔗糖、奶粉、婴儿配方奶粉、脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、甜菜碱及其组合。
在某些实施方案中，所述至少一种冷冻保护剂以所述培养物的大约1％至大约20％(w/v)的量存在。
在某些实施方案中，所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌以商业规模产生。
在某些实施方案中，所述培养物的体积为至少大约50升。
在某些实施方案中，大约1×103至1×1012CFU/g的埃氏巨球形菌细胞在冷冻干燥后是有生存力的。
在某些实施方案中，在所述培养物中的细胞由埃氏巨球形菌细胞组成。
本公开内容旨在固体饲料添加剂，其包含通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述固体饲料添加剂进一步包含另一种微生物。
在某些实施方案中，所述固体饲料添加剂选自由下列各项组成的组：粉末、颗粒、微粒、丸粒、块状物或其组合。
在某些实施方案中，所述固体饲料添加剂为益生菌。
本公开内容旨在组合物，其包含通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞或者上述固体饲料添加剂中的任一种。
在某些实施方案中，所述组合物为胶囊。
本公开内容旨在试剂盒，其包含通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种。
本公开内容旨在向动物施用埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括向所述动物施用通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种。
本公开内容旨在用于治疗或预防与在动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种。
在某些实施方案中，所述状况或病症为酸中毒。
在某些实施方案中，所述状况或病症为瘤胃酸中毒。
在某些实施方案中，所述状况或病症为呼吸系统疾病。
在某些实施方案中，所述状况或病症为蹄叶炎。
在某些实施方案中，所述状况或病症为感染。
在某些实施方案中，所述感染为沙门氏菌属(Salmonella)或弯曲杆菌属(Campylobacter)感染。
本公开内容旨在用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种。
在某些实施方案中，所述机会微生物是致病性的。
在某些实施方案中，所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
本公开内容旨在改善在动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种。
本公开内容旨在在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过上述方法中的任一种而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、上述固体饲料添加剂中的任一种或者上述组合物中的任一种，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，在用食物饲喂所述动物之前、与用食物饲喂所述动物相伴地或在用食物饲喂所述动物之后，施用所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、所述固体饲料添加剂或所述组合物。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在施用之前将所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞或所述固体饲料添加剂与液体相混合。
在某些实施方案中，所述液体以口服方式或者通过用所述液体喷淋所述动物来进行施用。
在某些实施方案中，所述施用包括单次施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
在某些实施方案中，所述施用包括每日施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
在某些实施方案中，所述施用包括在单日内超过一次施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
在某些实施方案中，所述动物为反刍动物。
在某些实施方案中，所述反刍动物选自由下列各项组成的组：牛、绵羊、山羊、鹿、水牛和驯鹿。
在某些实施方案中，所述动物为非反刍动物。
在某些实施方案中，所述非反刍动物选自由下列各项组成的组：马科动物、家禽和猪。
在某些实施方案中，所述动物为家禽动物。
在某些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡或鸽子。
在某些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：烤焙用鸡、烤焙用鸡种鸡和产蛋用鸡。
在某些实施方案中，所述家禽动物为鸡。
在某些实施方案中，所述动物为马科动物。
在某些实施方案中，所述马科动物为马、矮种马、驴或骡。
本公开内容旨在用于治疗或预防与在家禽动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述状况或病症为酸中毒。
在某些实施方案中，所述状况或病症为呼吸系统疾病。
在某些实施方案中，所述状况或病症为感染。
在某些实施方案中，所述感染为沙门氏菌属或弯曲杆菌属感染。
本公开内容旨在用于防止或减少在家禽动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述机会微生物是致病性的。
在某些实施方案中，所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
本公开内容旨在改善在家禽动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
本公开内容旨在在家禽动物中改善生长性能的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡或鸽子。
在某些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：烤焙用鸡、烤焙用鸡种鸡和产蛋用鸡。
在某些实施方案中，所述家禽动物为鸡。
本公开内容旨在用于治疗或预防与在马科动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述状况或病症为酸中毒。
在某些实施方案中，所述状况或病症为呼吸系统疾病。
在某些实施方案中，中所述状况或病症为蹄叶炎。
在某些实施方案中，所述状况或病症为感染。
在某些实施方案中，所述感染为沙门氏菌属或弯曲杆菌属感染。
本公开内容旨在用于防止或减少在马科动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述机会微生物是致病性的。
在某些实施方案中，所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
本公开内容旨在改善在马科动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
本公开内容旨在在马科动物中改善生长性能的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、奶产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述马科动物为马、矮种马、驴或骡。
在某些实施方案中，饲料添加剂包含所述埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述饲料添加剂为粉末、颗粒、微粒、丸粒、块状物、液体、凝胶或其组合。
在某些实施方案中，组合物包含所述埃氏巨球形菌细胞或含有所述细胞的饲料添加剂。
在某些实施方案中，所述组合物为胶囊。
在某些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞为经冷冻干燥的细胞。
在某些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞在液体中进行施用。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括再水化饲料添加剂或经冷冻干燥的细胞以产生所述液体。
在某些实施方案中，所述液体通过经口管饲法或者通过用所述液体喷淋所述动物来进行施用。
在某些实施方案中，在用食物饲喂所述动物之前、与用食物饲喂所述动物相伴地或在用食物饲喂所述动物之后，施用所述埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述施用包括单次施用所述埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述施用包括每日施用所述埃氏巨球形菌细胞。
在某些实施方案中，所述施用包括在单日内超过一次施用所述埃氏巨球形菌细胞。
本公开内容旨在产生经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞的方法，其包括：(a)在厌氧条件下制备包含巨球形菌属细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在厌氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，(d)冷冻干燥所述细胞，和(e)对所述细胞进行包囊，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在某些实施方案中，所述在动物中改善生长性能的方法包括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在某些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法包括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在某些实施方案中，所述组合物包含经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
本公开内容旨在产生经冷冻干燥的厌氧细菌细胞的方法，其包括：(a)在厌氧条件或部分厌氧条件下制备包含厌氧细菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在厌氧条件或部分厌氧下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述在动物中改善生长性能的方法包括向所述动物施用有效量的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法包括向所述动物施用有效量的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述组合物包含经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
本公开内容旨在产生经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞的方法，其包括：(a)在厌氧条件或部分厌氧条件下制备包含厌氧细菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在厌氧条件或部分厌氧下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，(d)冷冻干燥所述细胞，和(e)对所述细胞进行包囊，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述在动物中改善生长性能的方法包括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在某些实施方案中，所述组合物包含经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
本公开内容旨在产生经冷冻干燥的需氧细菌和/或酵母细胞的方法，其包括：(a)在有氧条件下制备包含需氧细菌细胞和/或酵母细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的需氧细菌和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述在动物中改善生长性能的方法包括向所述动物施用有效量的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法包括向所述动物施用有效量的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述组合物包含经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
本公开内容旨在产生经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞的方法，其包括：(a)在有氧条件下制备包含需氧细菌细胞和/或酵母细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在有氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，(d)冷冻干燥所述细胞，和(e)对所述细胞进行包囊，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述在动物中改善生长性能的方法包括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在某些实施方案中，所述用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法包括向所述动物施用有效量的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
在某些实施方案中，所述组合物包含经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
附图简述
图1显示了在28天时间段内贮存温度对于埃氏巨球形菌NCIMB41125的液体培养物的生存力的影响，按照以采用对数(Log10)标度的“菌落形成单位/毫升”(“CFU/mL”)表示的埃氏巨球形菌细胞的产量。
图2显示了在室温下进行0、7、14、21和28天的贮存后埃氏巨球形菌NCIMB 41125的液体培养物的生存力，按照以采用Log10标度的CFU/mL表示的埃氏巨球形菌细胞的产量。
图3显示了切向流过滤(“TFF”)系统的示意图。
图4在采用Log10标度的y-轴上显示了在通过TFF系统进行加工后以CFU/mL截留物表示的埃氏巨球形菌细胞的产量。x-轴指明了通过所述系统的70％、80％或90％体积减少。“目标”是指在TFF加工后埃氏巨球形菌细胞的理论回收量。“现实”是指在截留物(其是在所注明的体积减少后留下的浓缩细胞的体积)中的埃氏巨球形菌细胞的实际回收量。
图5显示了在-80℃下或在液氮(LiqN)中冷冻细胞以及使用缓慢(在135mTorr下38小时)或急速(在250mTorr下18.5小时)循环冷冻干燥细胞之后的细胞损失。所述细胞来自在对具有8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)或者8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)作为冷冻保护剂的培养物用TFF进行70％、80％或90％体积减少之后的截留物。
图6显示了在初始的快速(液氮)或缓慢(-20℃)冷冻以及随后的冷冻干燥(在15％麦芽糖糊精和0％或7.5％海藻糖存在下)之后埃氏巨球形菌NCIMB 41125的产量。
图7显示了在-80℃下或在液氮(LiqN)中在具有或不具有4％海藻糖或7.5％脱脂乳的情况下进行冷冻的埃氏巨球形菌NCIMB 41125中所观察到的细胞损失。
图8显示了在经冷冻干燥的样品上所观察到的细胞损失，所述经冷冻干燥的样品获得自90％体积减少截留物，与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在-80℃下或在液氮(LiqN)中进行冷冻，和使用急速循环进行冷冻干燥，并且在厌氧条件下在室温或4℃下贮存直至24周。
图9显示了在经冷冻干燥的样品上所观察到的细胞损失，所述经冷冻干燥的样品获得自90％体积减少截留物，与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在-80℃下或在液氮(LiqN)中进行冷冻，和使用急速循环进行冷冻干燥，并且在厌氧条件下在室温或4℃下贮存24周。没有共同上标的柱状物是在统计学上不同的，P<0.02。
图10显示了在厌氧条件下在4或25℃下进行12、16、20或24周的贮存后，对未冷冻干燥的或者经再水化的经冷冻干燥的产品制作的生长曲线，所述经冷冻干燥的产品获得自90％体积减少截留物，与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在液氮(LiqN)中进行冷冻，和使用急速循环进行冷冻干燥。显示了在600纳米(nm)处的光密度(OD)，从0小时至20小时进行测量。黄色线＝未冷冻干燥的，红色线＝T/SM，蓝色线＝M/SM，虚线＝在4℃下进行贮存，和实线＝在25℃下进行贮存。
图11显示了以采用Log10标度的“CFU/克”(“CFU/g”)表示的埃氏巨球形菌，其来自在4℃下贮存直至11个月的经冷冻干燥的小瓶。每个数据点相应于来自2个不同冷冻干燥循环的3个小瓶(总共6个小瓶)的平均产量。
图12显示了在作为表施(top-dress)处理(即，通过将处理混合到饲料中或者将处理放置在饲料上面而添加至动物饲料的处理)每日给予的经冷冻干燥的产品中的埃氏巨球形菌浓度(CFU/头/天)。取样周显示在x-轴上，取样效应，P<0.0001。水平实线表示待每日递送的目标埃氏巨球形菌浓度(CFU/头/天)。
图13显示了在研磨碎的玉米中的埃氏巨球形菌浓度，所述研磨碎的玉米用经冷冻干燥的产品进行表施，并且在处于室温的实验室中在没有直接暴露于太阳的情况下(“室内”)或者在处于直至95°F的平均每日温度的外面在直接暴露于太阳的情况下(“室外”)暴露于大气条件0至4小时。暴露时间和贮存条件的组合效应，P＝0.0007；暴露时间的效应，P<0.0001；贮存条件的效应，P<0.0001。
图14显示了关于下列每一个组的在第一次饲喂后26小时获得的在瘤胃液样品中的内毒素浓度(EU/mL)(作为在瘤胃中细菌裂解的指示物进行测量)：对照组(未接受埃氏巨球形菌)，未冷冻干燥组(接受了50mL的包含1010CFU的埃氏巨球形菌的埃氏巨球形菌液体培养物)，再水化组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物)，和表施组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物，并且还接受了包含108CFU的埃氏巨球形菌的、作为每日表施而掺入的经冻干的埃氏巨球形菌产品)。处理的效应，P＝0.3462。
图15显示了关于下列每一个组的以1小时间隔进行测量的瘤胃pH：对照组(未接受埃氏巨球形菌)，未冷冻干燥组(接受了50mL的包含1010CFU的埃氏巨球形菌的埃氏巨球形菌液体培养物)，再水化组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物)，和表施组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物，并且接受了包含108CFU的埃氏巨球形菌的、作为每日表施而掺入的经冻干的埃氏巨球形菌产品)。处理和天数的组合效应：P<0.001；处理的效应，P<0.001；天数的效应，P<0.001。平均值的标准误差(SEM)＝0.041。
图16显示了关于下列每一个组的用瘤胃液进行接种的半合成乳酸盐培养基在600nm处的光密度的变化：对照组(未接受埃氏巨球形菌)，未冷冻干燥组(接受了50mL的包含1010CFU的埃氏巨球形菌的埃氏巨球形菌液体培养物)，再水化组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物)，和表施组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物，并且还接受了包含108CFU的埃氏巨球形菌的、作为每日表施而掺入的经冻干的埃氏巨球形菌产品)。处理和时间的组合效应：P<0.02；处理的效应，P<0.01；时间的效应，P<0.01。SEM＝0.04。
图17显示了关于下列每一个组的用混合的瘤胃微生物进行接种的半合成乳酸盐培养基的L-乳酸盐浓度(mM)的变化：对照组(未接受埃氏巨球形菌)，未冷冻干燥组(接受了50mL的包含1010CFU的埃氏巨球形菌的埃氏巨球形菌液体培养物)，再水化组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物)，和表施组(接受了包含1010CFU的埃氏巨球形菌的、在即将施用之前进行再水化的经冻干的培养物，并且还接受了包含108CFU的埃氏巨球形菌的、作为每日表施而掺入的经冻干的埃氏巨球形菌产品)。a,b,c具有不同上标的柱状物是在统计学上相互不同的，P<0.05。
图18显示了在埃氏巨球形菌NCIMB 41125细胞中的植酸酶活性。x-轴指明了从培养开始(“0”小时)起和其后以2小时间隔，即在培养开始后“2”、“4”、“6”和“8”小时，从埃氏巨球形菌NCIMB 41125细胞的培养物取得的细胞样品。植酸酶活性显示在y-轴上，作为以“微摩尔/分钟”表示的从样品的细胞粒状沉淀中释放出的无机磷的量(μmol的释放出的P/分钟)。在包含无机磷酸盐(KH2PO4)的培养基中进行培养的细胞之中的植酸酶活性以浅灰色显示，而在包含植酸盐的培养基中进行培养的细胞之中的植酸酶活性以深灰色显示。
图19显示了在来自15日龄的烤焙用鸡的盲肠样品中埃氏巨球形菌对于沙门氏菌属细菌浓度的效应。x-轴指明了下列处理：没有埃氏巨球形菌(“对照”)，随意自由接近包含液体埃氏巨球形菌的瓶式喂食器(“随意”)，每日的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌(“经冷冻干燥的”)，或者在第0天经口管饲液体埃氏巨球形菌。y-轴指明了关于所述处理组的以采用Log10标度的“菌落形成单位/毫升”(CFU/mL)表示的沙门氏菌属细菌浓度。
图20显示了在来自15日龄的烤焙用鸡的盲肠样品中的沙门氏菌属细菌的流行率。x-轴显示了处理组。y-轴指明了关于沙门氏菌属细菌来说阳性的盲肠样品的百分比。
图21显示了在没有用巨球形菌属细菌进行处理(“对照”)或者用经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行处理(“经冷冻干燥的”)的18日龄的烤焙用鸡中的饲料增重比(feed togain ratio)(y-轴)。所述饲料增重比是总的所消耗的饲料与总的所增进的重量的比率。
图22显示了在来自没有用埃氏巨球形菌进行处理(“对照”)、通过在每个7天处理期的第1天经口灌服埃氏巨球形菌进行处理(“灌服”)或者每日用经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行处理(“经冷冻干燥的”)的马的盲肠样品中的pH。
图23显示了在包含70％乳酸盐和30％葡萄糖的半合成培养基上埃氏巨球形菌菌株(NCIMB 41125、ATCC 25940、NCIMB 702261、NCIMB 702262和NCIMB 702410)的生长。
图24显示了在包含60％乳酸盐和40％葡萄糖的半合成培养基上埃氏巨球形菌菌株(NCIMB 41125、ATCC 25940、NCIMB 702261、NCIMB 702262和NCIMB 702410)的生长。
图25显示了在包含40％乳酸盐和60％葡萄糖的半合成培养基上埃氏巨球形菌菌株(NCIMB 41125、ATCC 25940、NCIMB 702261、NCIMB 702262和NCIMB 702410)的生长。
图26显示了通过使用方法2进行包囊并且在有氧环境中在室温下进行贮存的、经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的稳定性。
图27显示了通过使用方法3进行包囊并且在有氧环境中在室温下进行贮存的、经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的稳定性。
图28显示了在40或75°F下贮存在具有麦芽糖糊精(M.e.+麦芽糖糊精)或没有麦芽糖糊精(M.e.)的Mylar小袋中的经冷冻干燥的产品之中的埃氏巨球形菌NCIMB 41125浓度(Log10 CFU/小袋)。
发明详述
本发明涉及埃氏巨球形菌细胞，用于产生埃氏巨球形菌细胞的方法，包含所述细胞的饲料添加剂和组合物，以及牵涉向动物施用所述细胞的用途，包括例如用于经改善的生长性能和/或健康。本发明还涉及微生物细胞，包括但不限于需氧细菌、厌氧细菌和酵母，和例如双歧杆菌属，例如短双歧杆菌，乳杆菌属，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属，例如乳酸片球菌，乳杆菌属，例如干酪乳杆菌，芽孢杆菌属，例如枯草芽孢杆菌，糖酵母属，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母，和用于产生微生物细胞的方法，包含所述微生物细胞的饲料添加剂和组合物，以及牵涉向动物施用所述微生物细胞的用途，包括例如用于经改善的生长性能和/或健康。
在本文中所提到的所有出版物、专利和其他参考文献通过提及而以其整体合并以用于所有目的，就如同明确和单独地指明每一单个出版物或专利申请通过提及而合并。另外，在本申请中的任何参考文献的引用或者识别不应当被解释为承认这样的参考文献作为本发明的现有技术是可得的。
术语
除非另外定义，否则在本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在冲突的情况下，包括所述定义的本申请将起支配作用。除非上下文另外要求，否则单数术语应当包括复数，并且复数术语应当包括单数。
在使用章节标题方面，它们不应当被解释为必然是限制性的。
如在本文中和在所附的权利要求书中所使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数所指，除非上下文另有明确规定。例如，术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。例如，术语“a”、“an”、“the”、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文中可以互换使用。
如在本文中所使用的，术语“大约”，当用于修饰与本发明有关的量时，是指可以发生(例如通过常规测试和处置；通过在这样的测试和处置中的无意的错误；通过在本发明中所采用的成分的制备、来源或纯度的差异；等等)的数字量的变化。无论是否用术语“大约”来进行修饰，权利要求书包括所记述的量的等价物。在一些实施方案中，术语“大约”意指所报道的数值的加或减10％。
在整个本申请中，本发明的各种实施方案可以以范围形式来呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应当被解释为对于本发明的范围的不可改变的限制。因此，范围的描述应当被认为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在那个范围内的独个数值。例如，范围(例如1至6)的描述应当被认为已经具体地公开了子范围，例如1至2、1至3、1至4、1至5、2至3、2至4、2至5、2至6、3至4、3至5、3至6等，以及在那个范围内的独个数，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”以及其同根变形词可互换使用，并且意指“包括但不限于”。应当理解，在本文中用语言“包含”来描述方面的无论哪些地方，还提供了以“由...组成”和/或“基本上由...组成”所描述的其他类似方面。
术语“由…组成”意指“包括但不限于”。
术语“基本上由…组成”意指组合物的明确指明的材料，或方法的明确指明的步骤，以及那些不实质上影响所述材料或方法的基本特征的另外的材料或步骤。
当在本文中使用时，术语“和/或”被视为具有或不具有另一个的所述两个明确指明的特征或组分中的每一个的具体公开。因此，在本文中在短语例如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”意欲包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独地)和“B”(单独地)。同样地，在短语例如“A、B和/或C”中所使用的术语“和/或”意欲包括下列方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独地)；B(单独地)；和C(单独地)。
在本文中所使用的术语“培养”意指在允许细胞生长或分裂的体外条件下温育细胞，或者维持细胞处于活的状态中。在本文中也可以使用术语“培养物”来指在体外条件下温育的细胞(例如，在液体生长培养基中温育的细胞)。
在本文中所使用的术语“益生菌”是指一种或多种活的微生物(细菌和/或酵母)，并且可以包括或不包括其他成分，其当以足够的量进行施用时，可以将健康、消化和/或性能益处赋予动物或受试者。
在本文中所使用的术语“直接饲喂型微生物产品”是指这样的产品，所述产品包含一种或多种活的微生物(细菌和/或酵母)并且可以包括或不包括其他成分，其可以在饲料混合物、大丸剂和/或口服糊剂中施用给动物或受试者，并且当以足够的量进行施用时可以将健康益处赋予动物或受试者。
在本文中所使用的术语“饲料添加剂”是指在营养中单独或一起使用的一种或多种成分、产品或物质(例如，细胞)(例如，以便改善食物(例如，动物饲料)的质量，以便改善动物的性能和健康，和/或以便增强食物或在食物内的材料的可消化性)。饲料添加剂可以为例如益生菌。
在本文中所使用的术语“生长培养基”和“培养基”是指包含支持细胞生长的组分的固体(例如，琼脂)、半固体(例如，琼脂)或液体(例如，肉汤)组合物。
在本文中所使用的术语“收获”是指从培养物中收集细胞，例如从培养物中收集在生长培养基中的细胞，通过从细胞移除一定量的生长培养基来收集细胞(例如，通过浓缩在液体培养物中的细胞或者将细胞与生长培养基分开)，或者停止细胞的培养。所述术语包括从液体培养物中收集或移除包含细胞的液体体积，包括在其中细胞已被浓缩的体积。
在本文中所使用的术语“分离的”并不必然反映分离物已被纯化的程度，而是指明从天然形式或天然环境中的分离或分开。分离物可以包括但不限于，分离的微生物、分离的生物质或分离的培养物。
在本文中所使用的术语“有效量”是指取得所希望的结果的量。
如在本文中所使用的，“治疗有效量”或“临床有效量”是指取得所希望的治疗结果的量，包括例如无论单独地还是与其他组分相组合地使用的量。治疗结果可以为例如症状的减轻、延长的存活、经改善的活动能力等。治疗结果不需要是“治愈”。
如在本文中所使用的，“赋形剂”是指用于将所希望的特征给予在本文中所公开的饲料添加剂、食物或组合物的组分或组分的混合物。当添加至药用组合物时，可以将本发明的赋形剂描述为“在药学上可接受的”赋形剂，意指所述赋形剂为这样的化合物、材料、组合物、盐和/或剂型，其在合理的医学判断范围之内适合于与动物(即，人和非人动物)的组织相接触，而在所希望的接触持续时间内没有过多的毒性、刺激、变态反应或其他成问题的并发症，这与合理的益处/风险比相称。
术语“治疗”是指治疗性处理和预防或防备性措施两者，其中目标是阻止或减慢(减轻)不希望的生理学状况、疾病或病症，或者获得有益的或所希望的生理学结果(例如，临床、医学和/或兽医学结果)。对于本发明的目的，有益的或所希望的结果包括但不限于，与状况、疾病或病症相关的症状或征候的缓和或消除；状况、疾病或病症的程度的减小；状况、疾病或病症的稳定化(即，在所述状况、疾病或病症未恶化的情况下)；状况、疾病或病症的开始或进展的延迟；状况、疾病或病症的改善；状况、疾病或病症的缓解(无论是部分的还是全部的，和无论是可检测的还是不可检测的)；或者状况、疾病或病症的增强或改善。治疗包括引起在生理学上显著的应答，而没有过多的副作用。治疗也包括相比于如果不接受治疗而预期的存活而言延长存活。
如在本文中所使用的，术语“预防”是指部分地或完全地延迟感染、疾病、病症和/或状况的开始；部分地或完全地延迟特定感染、疾病、病症和/或状况的一种或多种征候、症状、特征或表现(例如，临床的或生理学的征候、症状、特征或表现)的开始；部分地或完全地延迟从感染、特定疾病、病症和/或状况的进展；和/或降低发展出与所述感染、疾病、病症和/或状况相关的病理学状态的风险。
如在本文中所使用的，术语“产量”是指活的或者有生存力的细胞的量，包括在特定体积(例如，菌落形成单位/毫升(“CFU/mL”))中或在特定重量(例如，CFU/克(“CFU/g”))中的量。
如在本文中所使用的，术语“有生存力的”是指活的生物(例如，活的微生物细胞)。“生存力”是指生活(尤其是在某些条件下)的能力。
如在本文中所使用的，“纯化”和“经纯化的”意指使得基本上纯的或者清除了不想要的组分、材料污损、掺合或不完美。
术语“发明”和“公开内容”可以互换使用，当例如在短语“本发明”或者“本公开内容”中描述或使用时。
术语“动物”或“受试者”是指属于动物界的任何生物，并且没有限制地包括水生动物和陆生动物，例如鱼；商业鱼；观赏鱼；鱼幼体；双壳类动物；软体动物；甲壳类动物；有壳水生动物；虾；幼虾；卤虫；轮虫；盐水丰年虾；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；人；非人类动物；家养动物；农场动物；动物园动物；运动动物；种畜；比赛用动物；展览用动物；家传动物(heirloom animal)；稀有或者濒危动物；伴侣动物；宠物动物，例如狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠或马；灵长类动物，例如猴(例如，悬猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物，例如狗和狼；猫科动物，例如猫、狮子和老虎；马科动物，例如马、矮种马、驴、骡和斑马；食用动物，例如奶牛、水牛、牛、猪、家禽和绵羊；有蹄类动物，例如鹿和长颈鹿；鸟类(即鸟)；家禽，例如鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡、鸽子、鸸鹋、鸵鸟和任何其他用作食物或农场动物的鸟，包括烤焙用鸡、烤焙用种鸡和产蛋用鸡；啮齿动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于，水产养殖饲料、家养动物饲料(包括宠物饲料)、动物园动物饲料、工作动物饲料、牲畜饲料及其组合。食物包括动物饲料和人类食物。
应当认识到，为了清楚起见而描述在分开的实施方案的上下文中的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中相组合地进行提供。反过来，为了简洁起见而描述在单个实施方案的上下文中的本发明的各种特征也可以分开地，或者在任何合适的子组合中，或者在合适时在任何其他所描述的本发明的实施方案中进行提供。在各种实施方案的上下文中所描述的某些特征并不被认为是那些实施方案的基本特征，除非所述实施方案在没有那些要素的情况下不起作用。
虽然在本发明的实践或测试中可以使用与在本文中所描述的那些相似或等价的方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅是举例说明性的，而不意欲是限制性的。从详细的描述中和从权利要求书中，本发明的其他特征和优点将会是清晰明了的。
埃氏巨球形菌
在本文中所描述的发明之中可以使用来自任何菌株或任何菌株组合的埃氏巨球形菌细胞。
埃氏巨球形菌菌株可以选自储用培养物保藏中心(例如，美国典型培养物保藏中心国家工业、食品和海洋微生物保藏中心(“NCIMB”)、国家典型培养物保藏中心(“NCTC”)，美国农业研究服务部(“ARC”)培养物保藏中心(即“NRRL”)，国家动物卫生研究院(NIAH)培养物保藏中心)，或者可以是已经从天然来源中(例如，从反刍动物的胃肠道中)分离出的菌株。
可以从培养物保藏中心中选择的埃氏巨球形菌菌株的例子包括但不限于在表1中通过保藏号所列出的菌株。还指明了所述保藏号的备选名称。
表1.埃氏巨球形菌菌株的例子和每种菌株的来源
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自具有从由下列各项组成的组中选择的保藏号的菌株：25940、17752、17753、NCIMB 702261、NCIMB 702262、NCIMB 702264、NCIMB 702331、NCIMB 702409、NCIMB 702410、NCIMB 41125、NCIMB 41787、NCIMB 41788、NRRL 18624、NIAH 1102及其组合，包括表1中的备选名称中的任一个。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自从反刍动物(例如，奶牛)中分离的菌株。参见例如美国专利号7,550,139。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自从非反刍动物(例如，人)中分离的菌株。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自就下列方面而选择出的菌株：乳酸盐利用(例如，在糖存在下利用乳酸盐的菌株)、对于离子载运体抗生素的抗性、相对高的生长速率、主要地产生乙酸盐的能力、在低于5.0和低至4.5的pH值下进行增殖的能力、挥发性脂肪酸(VFA)的产生、植酸酶活性及其组合。参见例如美国专利号7,550,139。
在一些实施方案中，就乳酸盐利用而选择出的菌株在可溶性碳水化合物(例如，葡萄糖和/或麦芽糖)存在下利用乳酸盐作为优先碳源。乳酸盐利用可以例如基于在包含乳酸盐并缺乏可溶性碳水化合物的培养基中的相比于补充有可溶性碳水化合物的相同培养基而言的生长来进行测定。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自相比于其他菌株而言具有高的生长速率的菌株。不同菌株的生长速率可以例如通过在液体培养基中培养所述细胞并监测随时间的光密度的增加来进行测定。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自能够产生VFA的菌株，所述VFA可以例如通过气相色谱法来进行测定。在一些实施方案中，所述VFA是能够抑制沙门氏菌属细菌和/或弯曲杆菌属细菌的生长的6-碳脂肪酸。在一些实施方案中，所述VFA是己酸。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属细菌为肠沙门氏菌(Salmonella enterica)和/或乍得沙门氏菌(Salmonella bongori)。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属血清型为鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和/或肠炎沙门氏菌(Salmonella entiritidis)。在一些实施方案中，所述弯曲杆菌属细菌为空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)或大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自具有植酸酶活性的菌株。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125。该埃氏巨球形菌菌株具有高的比生长速率(0.94代/小时)，能够在4.5至6.5或更高的pH范围内生长，使用D-和L-乳酸盐作为其优先底物，但也具有利用葡萄糖和其他碳水化合物的能力，并且耐受离子载运体。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41787。在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41788。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞来自埃氏巨球形菌菌株25940。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞源自从储用培养物保藏中心中选择的或者从天然来源中分离的菌株。“源自”菌株的细胞可以是天然或人工的衍生物，例如亚分离物、突变体、变体或重组菌株。
制备包含厌氧、需氧和/或酵母细胞的培养物
埃氏巨球形菌是一种厌氧细菌，其必须在严格厌氧条件下进行培养以便获得最大产量和生存力。
在一些实施方案中，所述培养物包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基。
在一些实施方案中，所述培养物包含一种或多种菌株的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，所述培养物包含单一菌株的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，所述培养物由一种或多种菌株的埃氏巨球形菌细胞组成(即，在所述培养物中的细胞由埃氏巨球形菌细胞，例如一种或多种菌株的埃氏巨球形菌细胞组成)。在一些实施方案中，所述培养物由单一菌株的埃氏巨球形菌细胞组成。
在一些实施方案中，所述培养物包含巨球形菌属细胞和生长培养基。
在一些实施方案中，所述培养物包含厌氧细菌细胞和生长培养基。在一些实施方案中，所述培养物包含双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌，和生长培养基。
在一些实施方案中，所述培养物包含需氧细菌细胞和生长培养基。在一些实施方案中，所述培养物包含芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌，和生长培养基。
在一些实施方案中，所述培养物包含酵母细胞和生长培养基。在一些实施方案中，所述培养物包含糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。
可以使用用于接种微生物细胞、使微生物细胞生长和收获微生物细胞的各种发酵参数，包括连续发酵(即，连续培养)或分批发酵(即，分批培养)。参见例如美国专利号7,550,139。
用于微生物细胞的生长培养基可以是固体、半固体或液体。培养基可以包含提供使得能够进行生长的必需元素和特殊因子的营养物。各种各样的微生物学培养基和变化形式是本领域中熟知的。可以在任何时间，包括培养开始、培养期间，或者间歇地/连续地，向培养物添加培养基。
生长培养基的例子包括但不限于：(1)半合成培养基，其包含蛋白胨，3g/L；酵母，3g/L；维生素溶液，2mL/L；矿物质溶液，25mL/L；靛卡红(0.5％)，1g/L；12.5％L-半胱氨酸，2g/L；12.5％硫化钠，2g/L；并补充有乳酸钠(半合成乳酸盐，SDL)、葡萄糖(半合成葡萄糖，SDG)或麦芽糖(半合成麦芽糖，SDM)；(2)改良的强化梭菌琼脂/肉汤培养基(经预还原的)，其包含蛋白胨，10g/L；牛肉提取物，10g/L；酵母提取物，3g/L；右旋糖，5g/L；NaCl，5g/L；可溶性淀粉，1g/L；盐酸L-半胱氨酸，0.5g/L；乙酸钠，3g/L；和刃天青(0.025％)，4mL/L；(3)具有去纤维蛋白绵羊血的胰胨豆胨琼脂/肉汤；(4)半合成无瘤胃液培养基，其包含乳酸钠(70％)，10g/l；蛋白胨，2g/l；KH2PO4 1g/l；(NH4)2SO4，3g/l；MgSO4·7H2O，0.2g/l；CaCl2·2H2O，0.06g/l；维生素(盐酸吡哆醇，4mg/l；吡哆胺，4mg/l；核黄素，4mg/l；氯化硫胺素，4mg/l；烟酰胺，4mg/l：D-泛酸钙，4mg/l；4-氨基苯甲酸，0.2mg/l；生物素，0.2mg/l；叶酸，0.1mg/l；和氰钴胺素，0.02mg/1)；Na2S·9H2O，0.25g/l；半胱氨酸，0.25g/l；防沫剂，0.07ml/l；和莫能菌素，10mg/l；并且其通过下列步骤来制备：向储库瓶添加乳酸钠和矿物质溶液并高压灭菌60分钟；将蛋白胨溶解在300ml蒸馏水中并分开地高压灭菌；预先过滤灭菌维生素溶液和两种还原试剂；在高压灭菌后，用无氧气体给储库瓶充气过夜；在冷却后分开地添加其他组分；和用5N HCl将pH调整至所希望的值；和(5)经温育的瘤胃液乳酸盐(“IRFL”)培养基，其包含400ml的来自用苜蓿饲喂的绵羊的经温育的经澄清的瘤胃液，371ml蒸馏水，2g蛋白胨，15g琼脂，100ml的10％(w/v)D,L-乳酸钠溶液，100ml的0.04％(w/v)溴甲酚紫溶液，和25ml的含有40g/l KH2PO4、120g/l(NH4)2SO4、8g/l MgSO4·7H2O和2.4g/l CaCl2·2H2O的矿物质溶液，其中使用乳酸(90％w/v)来将pH调整至5.5，之后在121℃下高压灭菌25分钟，然后在50℃水浴中进行冷却而同时用无氧气体混合物进行充气，随后为添加两毫升的Na2S·9H2O(12.5％w/v)和半胱氨酸·HCl·H2O(12.5％w/v)中的每一个。
在一些实施方案中，所述培养物包含生长培养基，所述生长培养基包含至少一种碳源。在一些实施方案中，所述至少一种碳源选自由下列各项组成的组：酪蛋白、淀粉(例如，凝胶化淀粉和/或可溶性淀粉)、乳酸盐(即，乳酸)、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合。
在一些实施方案中，所述培养物包含生长培养基，所述生长培养基包含至少两种碳源。在一些实施方案中，所述至少两种碳源选自由下列各项组成的组：酪蛋白、淀粉(例如，凝胶化淀粉和/或可溶性淀粉)、乳酸盐(即，乳酸)、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合。
在一些实施方案中，所述至少两种碳源由大约1-99％的第一碳源(例如，在本文中所描述的任何碳源)和大约1-99％的第二碳源(例如，与所述第一碳源不同的在本文中所描述的任何碳源)，其中100％的所述至少两种碳源由所述第一碳源和所述第二碳源组成。在一些实施方案中，所述至少两种碳源由大约50-60％的所述第一碳源和大约40-50％的所述第二碳源，大约50-70％的所述第一碳源和大约30-50％的所述第二碳源，大约50-80％的所述第一碳源和大约20-50％的所述第二碳源，或者大约50-90％的所述第一碳源和大约10-50％的所述第二碳源组成。在其他实施方案中，所述至少两种碳源由大约65-75％的所述第一碳源和大约25-35％的所述第二碳源组成。在一些实施方案中，所述第一碳源为乳酸盐。
在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞在大约39℃至大约40℃下，在大约35℃下，在大约36℃下，在大约37℃下，在大约38℃下，在大约39℃下，或者在大约40℃下进行生长。
在一些实施方案中，所述微生物细胞在大约15℃至大约45℃下，在大约20℃至40℃，25℃至35℃，30℃至39℃下进行生长。在一些实施方案中，所述微生物细胞在大约30℃、大约31℃，大约32℃，大约33℃，大约34℃，大约35℃，大约36℃，大约37℃，大约38℃，大约39℃，或者大约40℃下进行生长。
在一些实施方案中，将所述微生物细胞冷却至大约18℃至大约25℃以进行贮存。
在一些实施方案中，包含所述埃氏巨球形菌细胞的培养物的pH(例如，在培养期间和/或在收获之时)为大约4.5至大约7.0，大约4.5至大约6.5，大约4.5至大约6.0，大约4.5至大约5.5，大约4.5至大约5.0，大约4.6至大约6.9，大约4.7至大约6.8，大约4.8至大约6.7，大约4.9至大约6.6，大约5.0至大约7.0，大约5.0至大约6.5，大约5.0至大约6.0，大约5.0至大约5.5，大约5.1至大约6.9，大约5.2至大约6.8，大约5.3至大约6.7，大约5.4至大约6.6，大约5.5至大约7.0，大约5.5至大约6.5，大约5.1至大约6.4，大约5.2至大约6.3，大约5.3至大约6.2，大约5.4至大约6.1，大约5.5至大约6.0，大约5.0至大约6.1，大约5.0至大约6.2，大约5.0至大约6.3，大约5.0至大约6.4，大约5.1至大约6.5，大约5.2至大约6.5，大约5.3至大约6.5，或者大约5.4至大约6.5。
在一些实施方案中，包含所述微生物细胞的培养物的pH(例如，在培养期间和/或在收获之时)为大约4.0至大约9.0，大约4.5至大约8.5，大约5.0至大约8.0，大约5.5至大约7.5，大约6.0至大约7.0。
为了培养微生物细胞，可以使用维持厌氧条件的具有不同大小和设计的发酵罐。发酵罐可以能够例如发酵足够用于埃氏巨球形菌细胞的商业生产的培养体积。在一些实施方案中，所述培养体积为大约2升，大约10升，大约50升，大约100升，大约150升，大约200升，大约250升，大约300升，大约350升，大约400升，大约450升，大约500升，大约600升，大约800升，大约1,000升，大约1,200升，大约1,500升，大约1,800升，大约2,000升，大约2,200升，大约2,500升，大约2,750升，大约3,000升，大约4,000升，大约5,000升，大约6,000升，大约7,000升，大约8,000升，大约9,000升，大约10,000升，至少大约20,000升，至少大约50,000升，或者至少大约75,000升。在一些实施方案中，所述发酵体积为大约2升至大约75,000升，大约250升至大约750升，大约300升至大约800升，大约350升至大约850升，大约400升至大约900升，大约450升至大约950升，大约500升至大约1,000升，大约750升至大约1,250升，大约1,000升至大约2,000升，大约2,000升至大约4,000升，大约4,000升至大约8,000升，大约5,000升至大约10,000升，大约50升至大约75,000升，大约50升至大约50,000升，大约50升至大约25,000升，大约50升至大约20,000升，大约50升至大约15,000升，大约50升至大约10,000升，大约100升至大约10,000升，大约100升至大约5,000升，大约100升至大约4,000升，大约100升至大约3,000升，大约100升至大约2,900升，大约100升至大约2,850升，大约100升至大约2,800升，大约100升至大约2,750升，大约2升，大约10升，大约50升，大约100升，大约200升，大约500升，大约1,000升，大约1,500升，大约10,000升，大约20,000升，大约50,000升，或者大约75,000升。
在一些实施方案中，包含埃氏巨球形菌细胞的培养物还包含另一种微生物(即，不是埃氏巨球形菌细胞的微生物细胞)。在一些实施方案中，所述培养物包含埃氏巨球形菌细胞和另一种为专性厌氧菌的微生物。在一些实施方案中，所述培养物包含埃氏巨球形菌细胞和另一种从由下列各项组成的组中选择的微生物：乳杆菌属、巨球形菌属、双歧杆菌属、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、芽孢杆菌属、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、链球菌属(Streptococcus)、假丝酵母属(Candida)、梭菌属(Clostridium)、片球菌属、曲霉属(Aspergillus)和糖酵母属。
经冷冻干燥的需氧、厌氧和酵母细胞
在一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的巨球形菌属细胞的方法。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的厌氧细菌细胞的方法。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌的方法。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的需氧细菌细胞的方法。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌的方法。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的需氧细菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的酵母细胞的方法。
在另一个方面，本发明旨在产生经冷冻干燥的糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母的方法。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的酵母细胞。
在另一个方面，本发明旨在经冷冻干燥的糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的酵母细胞。
在另一个方面，本发明旨在通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。
在另一个方面，产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法包括：制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物；收获所述细胞；冷冻所述细胞；和冷冻干燥所述细胞，其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，所述方法以下述顺序来进行：制备所述培养物，然后收获所述细胞(即，收获经培养的细胞)，然后冷冻所述细胞(即，冷冻所收获的细胞)，和然后冷冻干燥所述细胞(即，冷冻干燥经冷冻的细胞)。
在一些实施方案中，所述方法在厌氧条件下施行。在一些实施方案中，所述方法包括在厌氧条件下制备所述培养物，收获所述细胞，冷冻所述细胞，冷冻干燥所述细胞，或者其组合。
所述方法可以包括在本文中所描述的制备培养物的方法中的任一个。所述方法的培养物也可以包含在本文中所描述的培养物的特性中的任一个。
在一些实施方案中，在所述培养物中的细胞包括埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，在所述培养物中的细胞由埃氏巨球形菌细胞组成。
在一些实施方案中，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐(即，乳酸)、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉及其组合。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述培养物结束其指数生长期后12小时之内并且在所述培养物开始其稳定生长期之前收获所述细胞。可以将所述培养物冷却至室温以在收获之时终止生长。
在一些实施方案中，所述培养物包含液体，并且所述方法包括收获具有一定百分比的所述液体的所述埃氏巨球形菌细胞(例如，经浓缩的埃氏巨球形菌细胞)。在一些实施方案中，所述方法包括收获具有大约1％至大约40％，大约1％至大约35％，大约1％至大约30％，大约1％至大约25％，大约1％至大约20％，大约1％至大约15％，大约1％至大约10％，大约1％至大约5％，大约10％，大约9％，大约8％，大约7％，大约6％，大约5％，大约4％，大约3％，大约2％，或者大约1％的所述液体的所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括收获具有少于大约40％，少于大约35％，少于大约30％，少于大约25％，少于大约20％，少于大约15％，少于大约10％，少于大约9％，少于大约8％，少于大约7％，少于大约6％，少于大约5％，少于大约4％，少于大约3％，少于大约2％，或者少于大约1％的所述液体的所述细胞。
在一些实施方案中，所述培养物包含液体，并且所述方法包括通过去除一定百分比的所述液体来收获所述埃氏巨球形菌细胞(例如，经浓缩的埃氏巨球形菌细胞)。在一些实施方案中，收获所述细胞包括去除大约50％至大约100％，大约55％至大约100％，大约60％至大约100％，大约65％至大约100％，大约70％至大约100％，大约75％至大约100％，大约80％至大约100％，大约85％至大约100％，大约90％至大约100％，或者大约95％至大约100％的所述液体。在一些实施方案中，收获所述细胞包括去除至少大约50％，至少大约55％，至少大约60％，至少大约65％，至少大约70％，至少大约75％，至少大约80％，至少大约85％，至少大约90％，至少大约91％，至少大约92％，至少大约93％，至少大约94％，至少大约95％，至少大约96％，至少大约97％，至少大约98％，至少大约99％，或者至少大约100％的所述液体。
在一些实施方案中，所述方法包括通过浓缩所述细胞来收获所述埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，收获所述细胞包括通过至少一种从由下列各项组成的组中选择的技术来浓缩所述细胞：离心、过滤、透析、反渗透及其组合。在一些实施方案中，所述过滤包括粘土过滤。在一些实施方案中，所述过滤包括切向流过滤，也称为交叉流过滤。
在一些实施方案中，在收获之时，包含所述埃氏巨球形菌细胞的培养物的pH为大约4.5至大约7.0，大约4.5至大约6.5，大约4.5至大约6.0，大约4.5至大约5.5，大约4.5至大约5.0，大约4.6至大约6.9，大约4.7至大约6.8，大约4.8至大约6.7，大约4.9至大约6.6，大约5.0至大约7.0，大约5.0至大约6.5，大约5.0至大约6.0，大约5.0至大约5.5，大约5.1至大约6.9，大约5.2至大约6.8，大约5.3至大约6.7，大约5.4至大约6.6，大约5.5至大约7.0，大约5.5至大约6.5，大约5.1至大约6.4，大约5.2至大约6.3，大约5.3至大约6.2，大约5.4至大约6.1，大约5.5至大约6.0，大约5.0至大约6.1，大约5.0至大约6.2，大约5.0至大约6.3，大约5.0至大约6.4，大约5.1至大约6.5，大约5.2至大约6.5，大约5.3至大约6.5，或者大约5.4至大约6.5。
在一些实施方案中，所述方法包括在发酵罐中用包含埃氏巨球形菌细胞的接种物接种生长培养基以制备培养物，并且在大约39℃的温度下温育所述培养物直至所述培养物的pH为大约6.0。在一些实施方案中，所述包含埃氏巨球形菌细胞的接种物为埃氏巨球形菌细胞的瓶培养物或其一部分。在一些实施方案中，所述方法包括在发酵罐中以1/50至1/4,000的接种物与培养基的比例接种生长培养基。在一些实施方案中，所述接种物与培养基的比例为1/100。
在一些实施方案中，所述培养物进一步包含至少一种冷冻保护剂。在一些实施方案中，所述至少一种冷冻保护剂选自由下列各项组成的组：果糖、葡萄糖、蔗糖、奶粉、婴儿配方奶粉、脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、甜菜碱及其组合。在一些实施方案中，所述至少一种冷冻保护剂以所述培养物的大约1％至大约50％(w/v)，所述培养物的大约1％至大约40％(w/v)，所述培养物的大约1％至大约30％(w/v)，所述培养物的大约1％至大约20％(w/v)，所述培养物的大约1％至大约10％(w/v)，所述培养物的大约1％至大约5％(w/v)，所述培养物的大约10％至大约20％(w/v)，所述培养物的大约15％至大约25％(w/v)，所述培养物的大约20％至大约30％(w/v)，所述培养物的大约30％至大约40％(w/v)，所述培养物的大约40％至大约50％(w/v)，所述培养物的大约60％至大约70％(w/v)，所述培养物的大约70％至大约80％(w/v)的量存在。在一些实施方案中，通过直接向经浓缩的埃氏巨球形菌细胞添加粉末化的冷冻保护剂来添加所述冷冻保护剂。在一些实施方案中，通过以1/1的比例，以1/5的比例，或者以1/10的比例直接向经浓缩的埃氏巨球形菌细胞添加冷冻保护剂的溶液来添加所述冷冻保护剂。
在一些实施方案中，冷冻所述细胞包括将所述细胞放置在冷冻器中，或者使所述细胞与干冰、液氮或其组合相接触。冷冻所述细胞包括在它们处于容器内时冷冻所述细胞。使所述细胞与...相接触包括使包含所述细胞的容器与用于冷冻所述细胞的媒介相接触。用于冷冻所述细胞的媒介包括但不限于，冷冻器、丙酮-干冰浴、液氮或其组合。
在一些实施方案中，所述方法包括在大约-20℃至大约-210℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-20℃至大约-80℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-80℃至大约-210℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-20℃至大约-196℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-80℃至大约-196℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-20℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-80℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括在大约-196℃的温度下冷冻所述细胞。在一些实施方案中，所述方法包括通过使所述细胞与液氮相接触来冷冻所述细胞。
在一些实施方案中，所述方法包括在厌氧条件下冷冻所述细胞。
在一些实施方案中，所述冷冻产生包含所述细胞的经冷冻的丸粒。例如，所述冷冻可以通过使用快速冷冻器(例如，Model 250-S01Crygran,IFQ Inc.)来实现。
在一些实施方案中，经冷冻的丸粒的直径为大约0.001至大约1.0英寸，大约0.01至大约1.0英寸，大约0.1至大约1.0英寸，大约0.2至大约1.0英寸，大约0.3至大约1.0英寸，大约0.4至大约1.0英寸，大约0.5至大约1.0英寸，大约0.6至大约1.0英寸，大约0.7至大约1.0英寸，大约0.8至大约1.0英寸，大约0.9至大约1.0英寸，大约0.001至大约0.9英寸，大约0.01至大约0.9英寸，大约0.1至大约0.9英寸，大约0.2至大约0.9英寸，大约0.3至大约0.9英寸，大约0.4至大约0.9英寸，大约0.5至大约0.9英寸，大约0.6至大约0.9英寸，大约0.7至大约0.9英寸，大约0.8至大约0.9英寸，大约0.001至大约0.8英寸，大约0.01至大约0.8英寸，大约0.1至大约0.8英寸，大约0.2至大约0.8英寸，大约0.3至大约0.8英寸，大约0.4至大约0.8英寸，大约0.5至大约0.8英寸，大约0.6至大约0.8英寸，大约0.7至大约0.8英寸，大约0.001至大约0.7英寸，大约0.01至大约0.7英寸，大约0.1至大约0.7英寸，大约0.2至大约0.7英寸，大约0.3至大约0.7英寸，大约0.4至大约0.7英寸，大约0.5至大约0.7英寸，大约0.6至大约0.7英寸，大约0.001至大约0.6英寸，大约0.01至大约0.6英寸，大约0.1至大约0.6英寸，大约0.2至大约0.6英寸，大约0.3至大约0.6英寸，大约0.4至大约0.6英寸，大约0.5至大约0.6英寸，大约0.001至大约0.5英寸，大约0.01至大约0.5英寸，大约0.05至大约0.5英寸，大约0.1至大约0.5英寸，大约0.15至大约0.5英寸，大约0.2至大约0.5英寸，大约0.3至大约0.5英寸，或者大约0.4至大约0.5英寸。
经冷冻的埃氏巨球形菌细胞可以在冷冻干燥之前进行冷冻贮存(例如，低于0℃)，或者可以立即进行冷冻干燥。在一些实施方案中，将经冷冻的埃氏巨球形菌细胞贮存在低于大约0℃，低于大约-10℃，低于大约-20℃，低于大约-50℃，低于大约-80℃，或者低于大约-196℃的温度下。在一些实施方案中，将经冷冻的埃氏巨球形菌细胞贮存在大约-20℃，大约-30℃，大约-40℃，大约-50℃，大约-60℃，大约-70℃，大约-80℃，大约-90℃，大约-100℃，大约-150℃，大约-196℃，或者大约-210℃的温度下。
在一些实施方案中，冻干经冷冻的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，冷冻干燥经冷冻的埃氏巨球形菌细胞。冷冻干燥牵涉例如从经冷冻的细胞中去除液体。
在一些实施方案中，冷冻干燥所述埃氏巨球形菌细胞包括将经冷冻的细胞放置到冷冻干燥器中。在一些实施方案中，所述冷冻干燥包括使经冷冻的细胞经历减压，并且逐渐地使所述细胞升温至室温。
在一些实施方案中，所述方法包括在厌氧条件下冷冻干燥所述细胞。
在一些实施方案中，以商业规模产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在一些实施方案中，通过在本文中所公开的方法产生大约1×103至1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，在冷冻干燥后，大约1×103至1×1012CFU/g的埃氏巨球形菌细胞是有生存力的。
在一个方面，产生根据本公开内容的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法包括：(a)在厌氧条件下制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐(即，乳酸)、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，(b)在厌氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在另一个方面，产生根据本公开内容的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法包括：(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，(b)在所述培养物结束其指数生长期后12小时之内并且在所述培养物开始其稳定生长期之前，在厌氧条件下收获所述细胞，(c)冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在另一个方面，产生根据本公开内容的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法包括：(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，(b)收获所述细胞，(c)在收获的5小时之内在大约-80℃至大约-210℃的温度下冷冻所述细胞，和(d)冷冻干燥所述细胞，其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在一些实施方案中，通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的量和/或在冷冻干燥后有生存力的埃氏巨球形菌细胞的量为大约1×103CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×1011CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×1010CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1010CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1011CFU/g，或者大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g。
在一些实施方案中，所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约-80℃，大约-20℃，大约4℃，大约25℃，或其组合下在大约14天至大约24个月内是有生存力的。在一些实施方案中，所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约-80℃，大约-20℃，大约4℃，大约25℃，或其组合下在至少大约14天，至少大约1个月，至少大约6个月，至少大约8个月，至少大约10个月，至少大约12个月，至少大约15个月，至少大约18个月，或者至少大约24个月内是有生存力的。
在一些实施方案中，大约1×103CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×1011CFU/g，大约1×103CFU/mL至大约1×1010CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1010CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1011CFU/g，或者大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约-80℃，大约-20℃，大约4℃，或其组合的温度下贮存至少大约14天，至少大约1个月，至少大约6个月，至少大约8个月，至少大约10个月，至少大约12个月，至少大约15个月，至少大约18个月，或者至少大约24个月后是有生存力的。
在一些实施方案中，大约1×103CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×1011CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×1010CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g，大约1×103CFU/g至大约1×105CFU/g，大约1×104CFU/g至大约1×106CFU/g，大约1×105CFU/g至大约1×107CFU/g，大约1×106CFU/g至大约1×108CFU/g，大约1×107CFU/g至大约1×109CFU/g，大约1×108CFU/g至大约1×1010CFU/g，大约1×109CFU/g至大约1×1011CFU/g，或者大约1×1010CFU/g至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约25℃的温度下贮存至少大约14天，至少大约1个月，至少大约6个月，至少大约8个月，至少大约10个月，至少大约12个月，至少大约15个月，至少大约18个月，或者至少大约24个月后是有生存力的。
饲料添加剂、组合物和试剂盒
在一个方面，饲料添加剂包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含在本文中所公开的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在一个方面，饲料添加剂包含在本文中所公开的巨球形菌属细胞。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含在本文中所公开的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
在一个方面，饲料添加剂包含在本文中所公开的厌氧细菌细胞。在另一个方面，饲料添加剂包含双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含在本文中所公开的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含经冷冻干燥的双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌。
在一个方面，饲料添加剂包含在本文中所公开的需氧细菌细胞。在另一个方面，饲料添加剂包含芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含在本文中所公开的经冷冻干燥的需氧细菌细胞。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含经冷冻干燥的芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌。
在一个方面，饲料添加剂包含在本文中所公开的酵母细胞。在另一个方面，饲料添加剂包含糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含在本文中所公开的经冷冻干燥的酵母细胞。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的的酵母细胞。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含经冷冻干燥的糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂为固体(即，“固体饲料添加剂”)或液体(即，“液体饲料添加剂”)。在一些实施方案中，所述饲料添加剂为半固体或凝胶(即，“半固体或凝胶饲料添加剂”)。凝胶饲料添加剂可以包含氧清除剂(例如，抗坏血酸)。
在一些实施方案中，固体饲料添加剂为粉剂(例如，可流动粉末)、颗粒剂(即，颗粒)、微粒剂(即，微粒)、丸粒、块状物、水溶性浓缩物、糊剂、大丸剂、片剂、尘剂、其组分或其组合。
在一些实施方案中，液体饲料添加剂为溶液(例如，水性的、有机的或者水性-有机的溶液)、悬浮液、乳状液、灌服液、喷剂、注射剂、饮品(例如，代乳品)、其组分或其组合。
在一些实施方案中，凝胶饲料添加剂为有机凝胶。在一些实施方案中，所述凝胶饲料添加剂为口服凝胶(即，用于口服施用的凝胶)。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂用于作为表施进行使用(即，用于添加至食物表面或者与食物(例如，动物饲料)相混合)。在一些实施方案中，所述饲料添加剂用于作为液体进行施用。
在一些实施方案中，在本文中所公开的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞可以通过将所述经冷冻干燥的细胞再水化、溶解、增溶和/或悬浮在液体中而作为液体饲料添加剂进行使用。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含载体(即，一种或多种载体)。
合适的载体的例子包括但不限于，植物材料(即，完整植物或者植物部分(例如，种子、茎、叶、花和/或根)，包括经干燥的或经加工的植物或植物部分)、经干燥的谷粒(例如，经蒸馏器干燥的谷粒)、苜蓿、玉米磨粉、柑橘磨粉、发酵残渣、研磨碎的牡蛎壳、阿塔朴盖活性白土(attapulgus clay)、小麦细麸粉、糖蜜可溶物、玉米穗轴磨粉、可食用植物物质、烘烤脱壳大豆粉、大豆碾磨机进料、抗生菌丝体、蛭石、大豆粗粒、乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、经干燥的淀粉、硅酸铝钠、水、盐溶液、酒精、硅氧烷、蜡、石油冻、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸单甘油酯和甘油二酯、石油醚脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及其组合。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂包含赋形剂(即，一种或多种赋形剂)，其包括但不限于，微晶纤维素；乳糖；柠檬酸钠；碳酸钙；磷酸氢钙和甘氨酸；崩解剂例如淀粉、羟基乙酸淀粉钠、交联羧甲纤维素钠和某些复合硅酸盐；造粒粘结剂例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和金合欢胶；填充剂例如麦芽糖糊精；水分清除剂例如二氧化硅；氧清除剂例如抗坏血酸；和/或润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸、甘油山萮酸酯和滑石。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂为颗粒剂，其包含：包含埃氏巨球形菌细胞和/或饲料添加剂的核心，和在所述核心上的包衣。在一些实施方案中，所述包衣为水合阻隔性盐。所述盐包衣可以提供经改善的热耐受性，经改善的贮存稳定性，和针对在所述颗粒剂中的其他组分的保护作用(否则所述颗粒剂可能具有所述埃氏巨球形菌细胞和/或饲料添加剂的不利效应(例如，对于稳定性))。
在一些实施方案中，将所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌与干的添加剂制剂相掺合，所述添加剂包括但不限于，生长基质、酶、糖、碳水化合物、提取物和促进生长的微量成分。所述糖可以包括但不限于，乳糖、麦芽糖、右旋糖、麦芽糖糊精、葡萄糖、果糖、甘露糖、塔格糖、山梨糖、棉子糖、直链淀粉、淀粉和半乳糖。所述糖可以在50-95％的范围内变动，独个地或相组合地。所述提取物可以包括但不限于，酵母或经干燥的酵母发酵可溶物，范围为5-50％。所述生长基质可以包括但不限于，胰蛋白酶解酪蛋白，范围为5-25％；乳酸钠，范围为5-30％；和Tween 80，范围为1-5％。所述碳水化合物可以包括但不限于，甘露醇、山梨醇、阿东糖醇和阿拉伯糖醇。所述碳水化合物可以在5-50％的范围内变动，独个地或相组合地。所述微量成分可以包括但不限于，碳酸钙，范围为0.5-5.0％；氯化钙，范围为0.5-5.0％；磷酸氢二钾，范围为0.5-5.0％；磷酸钙，范围为0.5-5.0％；蛋白锰，范围为0.25-1.00％；和锰，范围为0.25-1.00％。
在一些实施方案中，埃氏巨球形菌饲料添加剂通过将埃氏巨球形菌细胞(包括包含所述细胞和/或经冷冻干燥的细胞的培养物)与所述饲料添加剂的任何另外的组分(例如，载体和/或赋形剂)相混合(例如，用混合器)来制备。在一些实施方案中，混合所述组分以获得均一的混合物。
在一些实施方案中，所述饲料添加剂为表施动物饲料添加剂，其包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和载体。在一些实施方案中，所述载体选自由下列各项组成的组：乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石(即，碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、经干燥的淀粉、硅酸铝钠、乳、水及其组合。
在一些实施方案中，所述动物饲料添加剂为灌服液、喷剂或代乳品补充物，其包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和水溶性载体。在一些实施方案中，所述载体选自由下列各项组成的组：乳清、麦芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、经干燥的淀粉、硅酸铝钠、乳、水及其组合。
在一个方面，本发明旨在包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，在本文中所公开的经冷冻干燥的细胞，例如通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的细胞)和/或饲料添加剂的食物(例如，动物饲料)。食物产品可以是用于动物摄食(即，非人动物或人)的任何食物，并且包括固体和液体组合物两者。食物包括但不限于，普通食物；液体产品，包括水、乳、饮料、治疗性饮品和营养饮品；功能性食物；补充物；营养药用品(nutraceuticals)；婴儿(即，包括非人和人婴儿)配方奶粉，包括用于早产儿的配方奶粉；用于怀孕或育雏动物的食物；用于成年动物的食物；和老年食物。在一些实施方案中，所述食物包括包含所述饲料添加剂的液体(例如，饮品，例如水、乳或代乳品)。
在另一个方面，本发明旨在包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和/或饲料添加剂的组合物。在一些实施方案中，所述组合物包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
在一些实施方案中，基于所述组合物的要求，在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和/或饲料添加剂可以通过任何已知的技术进一步以化学方式或以物理方式进行修饰或加工。
本发明的组合物可以包含一种或多种赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂可以为但不限于，碱性试剂、稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、分离剂、包衣剂、外相组分、控释组分、溶剂、表面活性剂、湿润剂、缓冲剂、填料、软化剂或其组合。除了在本文中所讨论的那些之外，赋形剂还可以包括在Remington:The Science and Practice of Pharmacy,21st ed.(2005)中列出的赋形剂，尽管并不限于那些。在本文中的特定分类(例如，“溶剂”)中包括赋形剂意欲举例说明而非限制所述赋形剂的作用。特定赋形剂可以落在多个分类之内。
在一些实施方案中，所述组合物为药用组合物(例如，用于治疗非人动物或人)。在一些实施方案中，所述组合物为医学食物(例如，兽医学食物)。医学食物包括这样的食物，其处于待在医生(例如，兽医)的监督下进行摄食或外部施用的组合物中，并且意欲用于状况的特殊饮食管理，对于该状况，通过医学评价建立了基于公认的科学原理的独特的营养要求。在一些实施方案中，所述药用组合物包含在药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，术语“在药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的，或者在美国药典或其他通常公认的用于在动物中(和更特别地在人中)使用的国际药典中列出的。
对于组合物的口服施用，可以将所述埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和/或饲料添加剂与本领域中熟知的赋形剂相组合。此类载体可以例如允许本发明的埃氏巨球形菌细胞或饲料添加剂被配制成片剂、药丸、糖衣丸剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等，以用于由待治疗的受试者口服摄取。在一些实施方案中，所述组合物为片剂、药丸、胶囊型片剂(caplet)或胶囊。合适的赋形剂包括但不限于，填料，例如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备物，例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果希望，可以添加崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者藻酸或其盐例如藻酸钠。可以口服使用的组合物包括但不限于，由明胶制成的胶囊，以及由明胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制成的软的密封胶囊。在一些实施方案中，所述剂型为素食剂型，其中所述剂型不是从任何来自动物来源的组分形成的并且不包含任何来自动物来源的组分。所述素食剂型为素食胶囊。
在一个方面，本发明旨在包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)和/或饲料添加剂的胶囊。在一些实施方案中，所述胶囊为明胶胶囊。在一些实施方案中，所述胶囊包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞或者在本文中所公开的饲料添加剂。在一些实施方案中，所述胶囊是可降解的。在一些实施方案中，所述胶囊为可降解的明胶胶囊。
在另一个方面，本发明旨在包含厌氧细菌细胞的经包囊的经冷冻干燥的组合物，其中通过将经冷冻干燥的粉末分配到经加热的油中来对经冷冻干燥的粉末进行包囊。在另一个方面，本发明旨在包含埃氏巨球形菌细胞的经包囊的经冷冻干燥的组合物，其中通过将经冷冻干燥的粉末分配到经加热的油中来对经冷冻干燥的粉末进行包囊。
在另一个方面，本发明旨在包含在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂、食物和/或组合物的试剂盒或包装。试剂盒或包装可以包括饲料添加剂、食物、组合物或其组合的单元(例如，一个或多个单元)。在一些实施方案中，所述试剂盒包含通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或在本文中所公开的胶囊。
向动物施用厌氧细菌细胞、需氧细菌细胞和/或酵母细胞的方法
在一个方面，本发明旨在向动物施用埃氏巨球形菌细胞的方法。
在一个方面，本发明旨在向动物施用巨球形菌属细胞的方法。
在一个方面，本发明旨在向动物施用厌氧细菌细胞的方法。在另一个方面，本发明旨在向动物施用双歧杆菌属细胞，例如短双歧杆菌，乳杆菌属细胞，例如植物乳杆菌，双歧杆菌属细胞，例如动物双歧杆菌乳亚种，片球菌属细胞，例如乳酸片球菌，乳杆菌属细胞，例如干酪乳杆菌细胞的方法。
在一个方面，本发明旨在向动物施用需氧细菌细胞的方法。在另一个方面，本发明旨在向动物施用芽孢杆菌属细胞，例如枯草芽孢杆菌细胞的方法。
在一个方面，本发明旨在向动物施用酵母细胞的方法。在另一个方面，本发明旨在向动物施用糖酵母属细胞，例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母细胞的方法。
在一些实施方案中，所述方法包括向所述动物施用在本文中所描述的埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂、食物或组合物(例如，胶囊)。
所述施用可以通过任何相容的途径，包括例如以口服方式(即，可摄取的液体或固体、口服灌服液、饲料添加剂、食物、组合物或胶囊)，通过喷淋在身体上(即，通过喷洒喷雾剂)，和/或注射。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含所述埃氏巨球形菌细胞的固体、液体或凝胶。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含所述细胞的固体饲料添加剂。在一些实施方案中，所述固体饲料添加剂为粉剂(例如，可流动粉末)、颗粒剂(即，颗粒)、微粒剂(即，微粒)、丸粒、块状物、水溶性浓缩物、糊剂、大丸剂、片剂、尘剂、其组分或其组合。
在一些实施方案中，所述方法包括施用包含所述细胞的液体饲料添加剂。在一些实施方案中，所述方法包括施用在液体中的所述细胞。在一些实施方案中，所述液体为溶液(例如，水性的、有机的或者水性-有机的溶液)、悬浮液、乳状液、灌服液、喷剂、注射剂、饮品(例如，代乳品)、其组分或其组合。在一些实施方案中，所述液体以口服方式或者通过用所述液体喷淋所述动物来进行施行。
在一些实施方案中，所述方法包括将所述埃氏巨球形菌细胞或包含所述细胞的饲料添加剂与另一种动物饲料添加剂相组合，以形成用于添加至动物饲料的补充物或预混物。在一些实施方案中，该另一饲料添加剂包含除了埃氏巨球形菌之外的其他细胞。
在一些实施方案中，可以作为液体(例如，在肉汤或肉汤等价物中，其包括例如经再水化的经冷冻干燥的细胞)、作为重构的细胞糊剂或者作为经冻干的(例如，经冷冻干燥的)细胞，将所述埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)添加至所述饲料添加剂。也可以在添加至所述饲料添加剂之前对所述微生物(包括经冷冻干燥的埃氏巨球形菌)进行包囊。也可以形成剂型(具有预先确定的体积的灌服液或者胶囊)，并且如果希望，可以将所述微生物直接添加至所述动物饲料，例如通过将液体肉汤和/或经冷冻干燥的细胞洒在所述饲料上或者混合入所述饲料中。
在一些实施方案中，所述方法包括使固体饲料添加剂(例如，粉剂、颗粒、微粒、丸粒、块状物、经冷冻干燥的细胞或其组合)再水化以产生用于施用的液体。
在一些实施方案中，所述方法包括通过将固体饲料添加剂或经冷冻干燥的细胞再水化的递送系统将埃氏巨球形菌细胞施加至动物饲料，包括在分批次的基础上。例如，可以预测经冷冻干燥的粉末从聚乙烯加料斗进入冲洗系统中，所述冲洗系统稀释所述粉末并将它喷淋在待混合的饲料上。
在一些实施方案中，所述方法包括通过使用具有储料斗的容量计量装置来将埃氏巨球形菌细胞施加至动物饲料。例如，可以将经冷冻干燥的细胞(例如，包含所述细胞的粉末)贮存在储料斗中，并且在刚好在被喷淋到动物饲料上之前卸料到水或水浴中。
在一个方面，本发明旨在用于治疗或预防与在动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述动物施用有效量的在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物(例如，胶囊)。
在一些实施方案中，所述状况或病症为酸中毒。在一些实施方案中，所述状况或病症为瘤胃酸中毒。在一些实施方案中，所述状况或病症为呼吸系统疾病。在一些实施方案中，所述状况或病症为蹄叶炎。在一些实施方案中，所述状况或病症为感染。在一些实施方案中，所述感染为沙门氏菌属或弯曲杆菌属感染。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属细菌为肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属血清型为鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门氏菌。在一些实施方案中，所述弯曲杆菌属细菌为空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌。
在另一个方面，本发明旨在用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述机会微生物是致病性的。在一些实施方案中，所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属细菌为肠沙门氏菌和/或乍得沙门氏菌。在一些实施方案中，所述沙门氏菌属血清型为鼠伤寒沙门氏菌和/或肠炎沙门氏菌。在一些实施方案中，所述弯曲杆菌属细菌为空肠弯曲杆菌或大肠弯曲杆菌。
在另一个方面，本发明旨在改善在动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述动物施用有效量的在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。在一些实施方案中，所述埃氏巨球形菌细胞包含植酸酶活性。在一些实施方案中，所述方法减少由于在埃氏巨球形菌细胞不存在下施用动物膳食而引起的环境磷废物。
在另一个方面，本发明旨在在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。在一些实施方案中，在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
在另一个方面，本发明旨在使动物的下胃肠道酸化的方法，其包括向所述动物施用有效量的在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。在一些实施方案中，所述下胃肠道为家禽动物的盲肠。
在一些实施方案中，在用食物饲喂所述动物之前、与用食物饲喂所述动物相伴地或在用食物饲喂所述动物之后，施用在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在施用之前将在本文中所公开的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的细胞或者在本文中所公开的固体饲料添加剂与液体相混合。
在一些实施方案中，液体以口服方式(例如，口服灌服液)或者通过用所述液体喷淋(例如，喷洒喷雾剂)所述动物来进行施用。
在一些实施方案中，所述方法包括单次施用在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。
在一些实施方案中，所述方法包括每日施用在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。在一些实施方案中，所述施用为每日至少一次、每日至少两次、每日至少三次或每日超过三次。在一些实施方案中，所述施用是随意的(例如，通过饮用可得的液体或者吃可得的食物来进行自我施用，所述液体或食物包含所述埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、所述饲料添加剂或所述组合物)。
在一些实施方案中，所述方法包括在单日内超过一次施用在本文中所公开的埃氏巨球形菌细胞(例如，经冷冻干燥的细胞)、通过在本文中所公开的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、在本文中所公开的饲料添加剂或者在本文中所公开的组合物。在一些实施方案中，所述施用为在单日内两次、三次、四次、五次、六次或更多次施用。在一些实施方案中，所述方法包括在单日内超过一次施用，随后为没有施用的一天或多天。在一些实施方案中，所述没有施用的一天或多天为没有施用的一天、两天、三天、四天、五天或六天，一周、两周、三周或四周，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月或六个月。
在一些实施方案中，所述动物为反刍动物。在一些实施方案中，所述反刍动物可以为但不限于，牛、水牛、绵羊、山羊、鹿、驯鹿、驼鹿、长颈鹿、牦牛和麋鹿。在一些实施方案中，所述反刍动物选自由下列各项组成的组：牛、水牛、绵羊、山羊、鹿和驯鹿。
在一些实施方案中，所述动物为非反刍动物。在一些实施方案中，所述非反刍动物可以为但不限于，马科动物、家禽、猪、狗和猫。在一些实施方案中，所述非反刍动物选自由马科动物、家禽和猪组成的组。
在一些实施方案中，所述动物为动物园动物。
在一些实施方案中，所述动物为家禽动物。在一些实施方案中，所述家禽动物为用作食物动物的鸟类(即鸟)，包括但不限于鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡、鸽子、鸸鹋或鸵鸟。在一些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡或鸽子。在一些实施方案中，所述家禽动物选自由下列各项组成的组：烤焙用鸡、烤焙用鸡种鸡和产蛋用鸡。在一些实施方案中，所述家禽动物为鸡。
在一些实施方案中，所述动物为马科动物。在一些实施方案中，所述马科动物为马、矮种马、驴或骡。
实施例
现在，参照下面的实施例，其与上面的描述一起以非限制性方式举例说明本发明的一些实施方案。
实施例1
温度对于埃氏巨球形菌液体培养物的产量的影响
测试了4℃、20℃和39℃的贮存温度以评估在0、7、14、21和28天后在埃氏巨球形菌NCIMB 41125的液体培养物中的细胞生存力。结果揭示，相比于在20℃或39℃下进行贮存而言，在4℃下贮存该产品显著地(P<0.001)改善了所述培养物的生存力，不论取样日为哪天。在28天后，在4℃下贮存的产品具有3.98×106菌落形成单位/毫升(CFU/mL)，相比于分别关于在20℃或39℃下贮存的产品的1.26×106和6.3×105CFU/mL而言(P<0.01；图1)。因此，结果显示，降低的贮存温度改善了埃氏巨球形菌NCIMB 41125的液体培养物的生存力。
来自分开的研究的另外的数据显示，在液体培养物(Lactipro )中的埃氏巨球形菌NCIMB 41125产量在室温下在0、7、14、21和28天的贮存后降低(图2)。
实施例2
使用切向流过滤来浓缩埃氏巨球形菌的培养物
作为用于以高通量浓缩大体积的培养物的方法，调查了切向流过滤(TFF)。
将试验性规模TFF系统(参见图3)整合到用于埃氏巨球形菌的生产线中并且以500-升(L)生产运行进行测试，以在70％、80％和90％的体积减少水平上评估所述试验性规模系统。使用具有一个RC100kDa膜(0.875mm通道高度)的TFF模块。对于每个减少水平进行三个生产运行，总共九个运行。对于每个运行收集样品，并且就pH、光密度(OD)、需氧污染物的存在或不存在、摩尔渗透压浓度、挥发性脂肪酸特性谱、埃氏巨球形菌浓度和生长特征进行分析。在过滤开始之前从该九个埃氏巨球形菌培养物(“未冷冻干燥的”)中，从渗透物(“渗透物”)(其是通过所述系统而去除的体积)中，和从截留物(“截留物”)(其是在体积减少后留下的包含所述细胞的经浓缩的埃氏巨球形菌培养物体积)中，收集样品。
在浓缩工序的开始、中间和结束时收集的渗透物样品在所有体积减少水平上具有一致的OD读数，都低于0.045(数据未显示)。在渗透物中回收的埃氏巨球形菌的量在浓缩工序过程中增加(P＝0.0006)，但是相比于在截留物中收集的细胞的量而言仍是可忽略的(小于3×104CFU/mL)(<0.002％)。体积减少水平对于在渗透物中回收的埃氏巨球形菌浓度不具有影响(P>0.9；表2)。
表2.在为了在70％、80％和90％体积减少下评价试验性规模TFF系统而进行的九个生产运行期间收集的样品中的平均埃氏巨球形菌产量
在截留物中的埃氏巨球形菌产量在每个装袋工序的开始、中间或结束时所收集的袋中不是不同的(P＝0.6088；数据未显示)。截留物产量受到体积减少水平的影响(P<0.0001；表2和图4)。90％体积减少截留物具有比70％和80％体积减少截留物高的产量(P<0.0001)。但是，70％和80％截留物不是相互不同的(P>0.09)。
过滤工序不影响埃氏巨球形菌细胞在当被接种回SDL-20培养基中时进行生长的能力(表3)。指数期的斜率不受体积减少水平的影响(P>0.3)，但是受到样品类型的影响：“截留物”对“未冷冻干燥的”(P<0.001)。滞后时间受到体积减少水平和样品类型两者的影响(P<0.001)。关于截留物的滞后时间随着增加体积减少而降低，这是更高的细胞浓度的代表。
表3.在初始埃氏巨球形菌(过滤前＝未冷冻干燥的)和于不同体积减少TFF运行期间收集的截留物(过滤后)之间的斜率和滞后时间的比较
实施例3
用于埃氏巨球形菌的冷冻和冷冻干燥参数
A.截留物的冷冻和冷冻干燥
将通过TFF而获得的截留物用于测试冷冻规划方案、冷冻保护剂包括和各种冷冻干燥参数。
将截留物转移至无菌的经除气的血清瓶，并且与不同的冷冻保护剂制剂无菌地相混合(w/v)：无冷冻保护剂(对照)、脱脂乳(SM)、海藻糖(T)和甜菜碱。对与合适的冷冻保护剂相混合的截留物进行取样以测定冷冻干燥前的埃氏巨球形菌浓度(即，生存力计数)。将混合物转移到10mL小瓶(4mL/小瓶)中，并且在液氮中迅猛地进行冷冻或在-80℃下缓慢地冷冻过夜。将小瓶转移至冷冻干燥器以便通过使用缓慢或急速循环来进行冻干。一旦冷冻干燥完成，就通过下述方式来测定细菌的存活：用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮经冻干的产品，允许它在室温下再水化40分钟，然后铺板到SDL20琼脂上。
通过从在与或不与冷冻保护剂相混合的相应的截留物中测量的埃氏巨球形菌的初始浓度中减去在冷冻干燥后回收的埃氏巨球形菌的浓度来计算细胞损失。使用软件来计算细胞损失数据，通过分析在体积减少水平(70％、80％或90％)、冷冻干燥循环(“缓慢”对“急速”)、冷冻方法(“-80℃”对“液氮”)、冷冻保护剂(无、甜菜碱、海藻糖、脱脂乳、麦芽糖糊精、海藻糖/脱脂乳(T/SM)和麦芽糖糊精/脱脂乳(M/SM))之间的相互作用。
不管其他标准，在对照处理(无冷冻保护剂)中所观察到的细胞损失为5Log(CFU/mL)或更高。同样地，不管其他标准，在甜菜碱处理中所观察到的细胞损失为3.96Log CFU/mL或更高。将可接受的细胞损失极限设置在1.6log CFU/mL。与T/SM或M/SM相混合的截留物都低于该阈值，不论所使用的冷冻干燥循环或冷冻方法，除了在-80℃下进行冷冻并使用缓慢或急速循环进行冷冻干燥的T/SM外(图5)。
B.冷冻干燥条件对于贮存的影响
通过使用过滤装置以10x浓缩埃氏巨球形菌NCIMB 41125，并且进行冷冻干燥测定法，其中测试不同的特征：快速或缓慢的初始冷冻(“液氮”对“-20℃”)，具有或没有海藻糖(0％、4％、7.5％和10％)，和温和或急速的冷冻干燥循环(“在2×10-6Torr下38小时”对“在135×10-6Torr下16.5小时”)。所有经测试的冷冻干燥工序均导致这样的产品，其能够保留足够的生存力以在再水化后，甚至在室温下进行4至12个月的延长贮存后发动培养物的生长。然而，取决于所使用的冷冻干燥特征，观察到细菌生存力的差异(图6)。缓慢冷冻、7.5％海藻糖掺入和温和冷冻干燥步骤(其保持超过0.04的最终水活度)与埃氏巨球形菌的更大的存活相关。
C.冷冻保护剂对于经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的生存力的影响
在冻干之前，将经离心的埃氏巨球形菌NCIMB 41125细胞浓缩物重悬浮在婴儿配方奶粉中，这导致仅1-log的细胞生存力的下降，当随后使细胞再水化时。在-80℃下进行缓慢冷冻或在液氮中进行迅猛冷冻之前，测试向埃氏巨球形菌浓缩物添加4％海藻糖和7.5％脱脂乳，以测定在初始冷冻工序期间所遇到的细胞损失。如在图7中所显示的，用4％海藻糖或7.5％脱脂乳进行迅猛冷冻产生最大的有生存力细胞的回收(0.79log的有生存力细胞计数的减少)。不论所使用的冷冻技术，没有添加冷冻保护剂的产品损失2.34至1.95log CFU/mL的埃氏巨球形菌。
实施例4
贮存条件对于经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的产量和稳定性的影响
为了测定冷冻干燥规划方案和贮存条件对于埃氏巨球形菌NCIMB 41125生长特征和保存期限的影响，将从90％体积减少获得的截留物与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在-80℃下或在液氮(LiqN)中进行冷冻，并且使用急速循环进行冷冻干燥。然后，通过使用生长曲线分析和涂布铺板技术，就细菌生长特征和在有氧或厌氧条件下在4℃或25℃下贮存0、2、4、8、12、16、20和24周期间的细胞存活来测试截留物样品。简而言之，对经贮存的产品进行取样，进行系列稀释，并且铺板到SDL琼脂平板上。另外，用经再水化的经冷冻干燥的产品接种(1:100)生长培养基(SDL)，并且记录光密度(OD，600nm)直至培养物达到稳定期。在3个不同的天重复实验，并且以三次重复进行所有的处理。稀释经再水化的经冷冻干燥的样品以便制作生长曲线，因为如果不进行稀释，吸光度由于脱脂乳的存在而会超过极限。为了有助于生长曲线比较，对用作对照的未冷冻干燥的样品进行相同的稀释。
结果：将样品冷冻干燥，并且在有氧或厌氧条件下在室温或4℃下贮存6个月。不论处理为何，在有氧条件下贮存的样品急速地腐败，相比于其厌氧对应物而言具有额外的细胞损失，其在仅2周的贮存后在0.4至3.2Log的范围内变动。基于那些结果并且为了改善附图清晰性，在图8中仅呈现了在以厌氧方式贮存的经冷冻干燥的产品中观察到的细胞损失。在厌氧条件下进行贮存期间，在室温下贮存的样品比在4℃下贮存的其对应物腐败得更快，除了在液氮中进行冷冻的T/SM样品外。在16-周贮存期内，在液氮中进行冷冻并且在冷冻干燥后在室温下贮存的T/SM样品在统计学上不比在4℃下贮存的其对应物损失更多的细胞(P>0.1)。但是，在20周的贮存后，在室温和4℃贮存之间，样品间的差异变得显著(P＝0.0002)，在20周的贮存后具有0.84log差异和在24周的贮存后具有0.89log差异。所有M/SM样品均比其T/SM对应物腐败得更快。在24周的贮存后(图9)，在液氮中进行冷冻并且在厌氧条件下在4℃下贮存的T/SM样品中的细胞损失比任何其他处理显著更低(P<0.02)。在液氮中进行冷冻并且在厌氧条件下在4℃下贮存的T/SM样品具有相比于在冷冻干燥之前所观察到的埃氏巨球形菌浓度而言的2.16log损失，其中由于24-周贮存期而引起0.82log损失。在每个取样日，进行生长曲线实验以比较经冷冻干燥的产品与未冷冻干燥的产品的生长特征。图10显示了对于在液氮中进行冷冻、用急速循环(在250mTorr下18.5小时)进行冷冻干燥并且在4℃或室温下以厌氧方式进行贮存的样品制作的生长曲线。用于每个生长曲线的未冷冻干燥的样品是“新鲜的”(不超过2日龄)。在4℃下贮存的经冷冻干燥的产品具有比在室温下贮存的经冷冻干燥的产品更短的滞后时间，这与在这些样品中所观察到的埃氏巨球形菌浓度的差异相一致(表4)。不论贮存温度为何，在16周的贮存后，T/SM样品具有比M/SM样品更短的滞后时间。
表4.在厌氧条件下在4或25℃下进行12、16、20或24周的贮存后，在未冷冻干燥的或者经再水化的经冷冻干燥的样品上所观察到的滞后时间，所述经冷冻干燥的样品获得自90％体积减少截留物，与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在液氮(LiqN)中进行冷冻，和使用急速循环进行冷冻干燥。
关于未冷冻干燥的以及在25℃下贮存12周的MSM处理和在20℃下贮存16周的MSM处理的斜率是异常低的(表5)。在20和24周的贮存后，经冷冻干燥的样品的指数期斜率在数字上与未冷冻干燥的对照没有不同。
表5.在厌氧条件下在4或25℃下进行12、16、20或24周的贮存后，在未冷冻干燥的或者经再水化的经冷冻干燥的样品上所观察到的指数期的斜率，所述经冷冻干燥的样品获得自90％体积减少截留物，与8％海藻糖/15％脱脂乳(T/SM)或者8％麦芽糖糊精/15％脱脂乳(M/SM)相混合，在液氮(LiqN)中进行冷冻，和使用急速循环进行冷冻干燥。
实施例5
经冷冻干燥的埃氏巨球形菌在牛中的功效和安全性
A.经冷冻干燥的产品制备和保存期限
在实验开始之前56天作为先期的经再水化的埃氏巨球形菌培养物(用于再水化和表施处理)制备在该试验中所使用的小瓶，并且贮存在处于4℃的冰箱中，同时等待使用。每个小瓶包含5mL的经冷冻干燥的产品的等价物。将小瓶在6个不同的冷冻干燥运行中进行冷冻干燥。对于每个运行，使3个小瓶在冷冻干燥后再水化，和使3个另外的小瓶在研究当天再水化，以测定每个小瓶的埃氏巨球形菌浓度(表6)。来自再水化和表施组的动物每头以灌服方式接受小瓶的内容物，其等价于1.84×1010CFU的埃氏巨球形菌。
表6.在冷冻干燥后和在4℃下进行56天的贮存后在研究当天的埃氏巨球形菌浓度
在实验开始后，将来自运行#5和#6的额外的小瓶保持在4℃下，并且每个月使来自这些运行中的每个运行的3个小瓶再水化(图11)。
在4℃下的11个月贮存期间，小瓶中的埃氏巨球形菌浓度从4.96×1010CFU/g变化至4.17×1010CFU/g，这表示仅0.07log的产量损失。
在实验开始之前大约30天作为每日表施埃氏巨球形菌培养物(表施处理)制备在该试验中所使用的产品，并且在polyfoil袋中贮存在冷冻器中。将表施产物在6个不同的冷冻干燥运行中进行冷冻干燥，包装在15个独个polyfoil袋中(在饲喂时1袋/天)，用氮冲洗，密封，并贮存于-80℃直至使用。对于每个冷冻干燥运行，使3个包装在冷冻干燥后再水化。平均埃氏巨球形菌浓度为4×1010CFU/包装。在每周开始时使三个另外的包装再水化并用于测定每日给予动物的埃氏巨球形菌浓度，通过下述方式：向所述埃氏巨球形菌细胞添加再水化溶液，允许所述细胞静置40分钟，稀释所述细胞，并将所述细胞铺板(图12)。统计学分析显示了随时间的细胞浓度的增加。所有产品都在研究开始之前30天进行制备，和用作表施的产品在研究结束时为80日龄。动物每日平均接受2.19×108CFU的埃氏巨球形菌(2.45×1010CFU/包装)。
B.牛的研究
将肉用阉牛(n＝462：初始体重900磅)根据重量划分区组，并且随机分派至由下列组成的四种处理之一：对照组，其未接受埃氏巨球形菌(17栏；7头/栏)；未冷冻干燥组，其先期接受50mL的包含2×108CFU/mL(1010CFU的埃氏巨球形菌NCIMB 41125)的埃氏巨球形菌产品(16栏；7头/栏)；再水化组，其先期接受在即将施用之前再水化的经冻干的培养物(1010CFU的埃氏巨球形菌NCIMB41125)(16栏；7头/栏)；和表施组，其先期接受在即将施用之前再水化的经冻干的培养物(1010CFU的埃氏巨球形菌NCIMB 41125)和接受在研究持续时间内每日作为表施掺入到膳食中的经冻干的产品(每日108CFU的埃氏巨球形菌NCIMB 41125；17栏；7头/栏)。将未冷冻干燥组、再水化组和表施组的肉用阉牛在接受其先期的埃氏巨球形菌灌服后安置在10-天递升(step-up)计划中，而将对照组安置在21-天递升计划中。在饲喂第一个配给量后26小时，通过瘤胃穿刺术来提取瘤胃液。就pH、挥发性脂肪酸浓度、内毒素水平和利用乳酸的能力(在体外消失测定法中)来分析瘤胃液样品。对于乳酸盐消失测定法(lactate disappearance assay)，用0.1mL的瘤胃液接种十个包含半合成乳酸盐培养基的10-mL管。在24-小时时间段内每6个小时以两次重复测量光密度，以评价用乳酸作为主要底物进行生长的能力。在观察光密度后立即将管放置在冷冻器中以用于随后测定乳酸浓度。给每栏一头肉用阉牛配备连续的射频大丸剂以在56-天研究中追踪pH测量值。在第0、28和56天对肉用阉牛进行称重以测定平均日增重、干物质摄入量和饲料效力。
为了评估由动物所摄入的有生存力的埃氏巨球形菌，将经冷冻干燥的产品表施到在铝盘中的经灭菌的研磨碎的玉米上，并且在实验室中或者在外面在太阳下暴露于环境大气0、1、2和4小时后收集样品。在2016年7月和8月期间重复该实验4次(图13)。统计学分析揭示了暴露时间与贮存条件的相互作用(P＝0.0007)、暴露时间效应(P<0.0001)和贮存条件效应(P<0.0001)。在与研磨碎的玉米相混合并且在实验室中暴露于大气的经冷冻干燥的产品中的埃氏巨球形菌浓度在4-小时暴露期间在数字上下降，但并不与其初始浓度显著地不同。在暴露于外面条件的样品中的埃氏巨球形菌浓度下降得快得多。在1小时的暴露后，回收了仅6.4％的最初存在的埃氏巨球形菌。在2和4小时暴露后，在暴露于外面条件的样品中的埃氏巨球形菌浓度显著地不同于初始浓度和不同于保持在室温下的其对应物。在这些样品中的埃氏巨球形菌浓度在实验之间是非常易变的，如由大的标准偏差所显示的。这可能归因于外面条件(热和湿度)的差异，但也可能由于所使用的经冷冻干燥的产品(其可能或多或少耐热和湿度)的差异。在该动物研究期间，刚好在饲喂之前将经冷冻干燥的产品与研磨碎的玉米相混合，然后当将饲料放置到食槽中时，迅速地进行表施。动物冲向研磨碎的玉米，结果是经冷冻干燥的产品可能在混合后不到1小时就被摄入。假定所述产品在一小时内被摄入，那么动物应当已经接受了大约1.4×107CFU/头/天的有生存力的细胞(在表施产品中的平均浓度2.2×108CFU/头/天的6.4％)。
经埃氏巨球形菌处理的肉用阉牛的加速递升导致相似的28-天体重(P＝0.53；表7)、平均日增重(P＝0.71)和饲料效力(P＝0.69)。表施处理具有比对照低的干物质摄入量(P＝0.05)。在饲喂的头56天内的围栏肥育性能在处理之间产生了相似的结果(P>0.10)。用接受保守的21-天递升期的对照，在处理之间的这些相似性表明，加速的递升计划可以通过使用所述三种形式的埃氏巨球形菌处理中的任一种来实施，而不会不利地影响牛的健康或围栏肥育性能。
瘤胃液pH(在饲喂第一次膳食后26小时提取的)在处理之间是相似的(P>0.10；表8)。存在总VFA浓度的差异，其中表施处理显著地高于其他处理(P<0.01)。表施处理具有比再水化处理高的乙酸盐浓度(P＝0.02)。虽然存在乙酸盐浓度的显著差异，但是乙酸盐:丙酸盐比例在处理之间是相似的(P＝0.96)。其他VFA在处理之间是相似的(P>0.18)。
在瘤胃液(在饲喂第一次膳食后26小时提取的)中的内毒素浓度在处理之间是相似的(P＝0.3462；图14)。测量内毒素水平，作为在瘤胃中细菌裂解的指示物。已报道罹患酸中毒的动物具有大于150,000EU/mL的内毒素水平。在该研究中所测量的内毒素水平均低于那个阈值，不论处理为何。
给在32个围栏中的每个围栏之中的一头肉用阉牛配备留置的瘤胃pH探针(8头肉用阉牛/处理)，其在56-天研究内每小时报告瘤胃pH测量值(图15)。以1-小时间隔报告关于每种处理的平均瘤胃pH测量值，在图15中。对于瘤胃pH检测到处理与天数的相互作用(P<0.01)。还存在处理(P<0.01)和饲喂天数(P<0.01)对于瘤胃pH的效应。埃氏巨球形菌处理的加速的递升并不引起平均瘤胃pH降低至临床酸中毒的状态。随着饲喂天数增加，经冻干的处理(再水化和表施)维持比对照和未冷冻干燥处理高的瘤胃pH。
表7.围栏肥育性能
1在一行内的没有共同上标字母的平均值是不同的，P<0.05
表8.在饲喂初始膳食后26小时的瘤胃液特征
1在一行内的没有共同上标字母的平均值是不同的，P<0.01
在24-小时时间段内以6-小时间隔观察光密度测量值，以测定接种到半合成乳酸盐培养基中的混合型瘤胃微生物的生长曲线，这些数据呈现在图16中。在处理和检测时间之间存在相互作用(P<0.02)。还发现了处理(P<0.01)和时间(P<0.01)的独自的效应。未检测到在处理之间的差异，直至第12小时，这是再水化冷冻干燥组高于每日冷冻干燥组(P<0.02)和对照(P＝0.007)之时。在第24小时，在埃氏巨球形菌处理之间不存在差异(P>0.10)，但是对照处理具有比所有埃氏巨球形菌处理显著更低的微生物生长(P<0.01)。
图17图解说明了用混合型瘤胃微生物进行接种并且温育0、6、12、18或24小时的半合成乳酸盐培养基的L-乳酸盐消失。与处理(P＝0.01)和温育时间(P<0.0001)的效应一起，检测到在处理和时间之间的相互作用(P＝0.007)。在第0小时，未冷冻干燥处理比其他处理包含更少的L-乳酸盐(P＝0.04)。在6、12和18-小时时间点，L-乳酸盐的浓度在处理之间是类似的(P>0.10)。与上面提及的光密度结果相似，在温育的24小时之时来自对照肉用阉牛的瘤胃微生物比埃氏巨球形菌处理全体利用更少的乳酸盐(P<0.003)，而在埃氏巨球形菌处理之间未检测到差异(P>0.10)。这些数据举例说明，来自用埃氏巨球形菌进行处理的肉用阉牛的瘤胃微生物在半合成乳酸盐培养基中比来自对照肉用阉牛的那些更有效地生长，这暗示了在这些处理中的更大的乳酸利用能力。此外，关于利用L-乳酸的能力，巨球形菌属处理是相似的。
对于用于光密度和乳酸盐消失测定法的样品测量VFA浓度并且呈现在表9中。对于总VFA(P＝0.002)、乙酸盐(P＝0.0002)、异丁酸盐(P＝0.04)、丁酸盐(P<0.0001)、异戊酸盐(P＝0.0007)和戊酸盐(P<0.0001)的浓度，以及对于乙酸盐:丙酸盐比例(P＝0.02)，检测到存在处理与小时的相互作用。对于总VFA和所有独个的VFA发现了时间的效应(P<0.0001)。对于异丁酸盐(P＝0.02)、丁酸盐(P＝0.0004)和戊酸盐(P＝0.001)，发现了在处理之间的差异。当与对照和再水化组相比较时，对于未冷冻干燥和表施处理组来说异丁酸盐的浓度在第18小时之时是更低的(分别，P<0.005和P<0.004)。在24-小时时间点，表施具有比未冷冻干燥和再水化处理少的异丁酸盐(P＝0.002)，但是与对照相似(P>0.10)。在18小时的温育后，再水化样品的丁酸盐浓度高于表施(P＝0.02)。在24小时，对照处理产生比埃氏巨球形菌处理少的丁酸盐(P<0.0001)。在该时间点，还在巨球形菌属处理之间检测到丁酸盐的差异，其中未冷冻干燥样品包含比再水化处理高的浓度(P＝0.01)。第18小时对于再水化处理揭示了更低的戊酸盐浓度，当与其他处理相比较时(P＝0.01)。在温育的24小时之时，对于戊酸盐和丁酸盐浓度得到了相似的观察结果。对照包含比所有埃氏巨球形菌处理少的戊酸盐(P<0.0001)，而浓度在未冷冻干燥样品中比在再水化样品中高(P＝0.03)。对于其他VFA，未检测到处理的主要效应(P>0.05)。测量到可忽略的浓度的异己酸盐、己酸盐和庚酸盐。对于乙酸盐:丙酸盐比例发现了处理与时间的相互作用(P＝0.02)以及时间的效应(P>0.0001)，但在处理之间是相似的(P＝0.57)。
表9.用混合型瘤胃微生物进行接种的半合成乳酸盐培养基的VFA特性谱的变化
1,2,3,4没有共同上标数字的时间点是不同的，P<0.01
a,b,c在一行内的没有共同上标字母的平均值是不同的，P<0.05
实施例6
埃氏巨球形菌的植酸酶活性
评估了埃氏巨球形菌细胞的体外植酸酶活性。
在包含无机磷酸盐(KH2PO4)或植酸盐作为磷源的半合成乳酸盐培养基中，如在本文中所描述的那样在厌氧条件下培养埃氏巨球形菌NCIMB 41125细胞。以2小时间隔从培养开始(0小时)直至8小时，从培养物中移出1毫升(mL)样品并进行离心以形成细胞粒状沉淀。然后，通过使用钼蓝(Molybdate blue)方法来测定在细胞粒状沉淀中的植酸酶活性。参见Yanke等人,Microbiol.144:1565-1573(1998)。简而言之，通过在700纳米(nm)处的分光光度法来定量在pH 5.0下在37℃下在30分钟的温育内通过酶促切割而释放出的无机磷酸盐，并且与标准曲线相比较。将植酸酶活性测定为在测试条件下每分钟从细胞粒状沉淀中释放出的无机磷的量。
图18显示，在植酸盐存在或不存在下埃氏巨球形菌细胞的生长导致显著的植酸酶活性，这确认了：(1)埃氏巨球形菌NCIMB 41125细胞产生植酸酶，(2)植酸酶产生不被培养基中磷的存在所抑制，和(3)通过埃氏巨球形菌的植酸酶产生看起来在培养基中存在植酸盐的情况下更大。
实施例7
埃氏巨球形菌对于沙门氏菌属细菌浓度和流行率的影响
将一日龄的烤焙用鸡(n＝384)随机分配至四个不同的处理组：1)对照组，其未接受巨球形菌属细菌，2)随意组，其可自由接近包含液体埃氏巨球形菌NCIMB 41125的瓶式喂食器，3)冷冻干燥组，其每日接受在其饲料中的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌NCIMB 41125，和4)经口管饲组，其在第0天接受液体埃氏巨球形菌NCIMB 41125。
所述四种处理中的每一种由16个笼子(每个笼子包含6只鸟)代表。在15-天试验期内记录动物重量、饲料消耗和饲料转化。在15-天饲喂期后，随机选择2只动物/笼，屠宰，并且回收盲肠以测定沙门氏菌属细菌流行率。简而言之，取回盲肠，放置在Ziploc袋中，并且存放在冰上。然后，用70％乙醇洗涤盲肠，并且用手揉搓以提取内容物。将一毫升的所回收的内容物在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中进行系列稀释，并且铺板到亮绿琼脂(BGA)上。将BGA平板在37℃下温育24小时。对假定的沙门氏菌属菌落(粉红色菌落)进行计数，并且通过使用Oxoid沙门氏菌属胶乳测试FT0203(Oxoid-Thermo Scientific,Hampshire,UK)来确认为沙门氏菌属细菌。另外，将一毫升的盲肠内容物样品添加至9mL的Rappaport-Vassiliadis(RV)以进行选择性富集。如果在BGA平板上未观察到可检测的沙门氏菌属细菌生长，那么就将RV富集物铺板到BGA平板上，在37℃下温育24小时，并且就沙门氏菌属细菌的存在进行评价。给予用直接铺板没有生长但用RV富集具有阳性生长的样品以9的任意计数(比理论检测极限低1)，和给予在直接铺板或RV富集中均没有生长的样品以0的计数。
结果表明，接受了经冷冻干燥的材料的鸟具有更低的以“菌落形成单位/毫升(CFU/mL)”的数目表示的盲肠沙门氏菌属细菌浓度，相比于对照组而言具有-1Log的差异。参见图19。当与对照组相比较时，在冷冻干燥组的样品中的沙门氏菌属细菌的流行率也降低了13％。参见图20。
实施例8
埃氏巨球形菌对于烤焙用鸡的生长性能和盲肠特征的影响
A.实验设计和处理
使用在处理开始时为一日龄的Cobb 500烤焙用鸡(Cobb-Vantress in SiloamSprings,Arkansas)来进行使用一日龄雄性的以随机化完全区组设计的三种处理的24次重复。处理为作为经口管饲或者施加至鸟的身体表面的气溶胶化喷雾剂进行施用的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125(MS-Biotec,Wamego,Kansas)，和对照(无埃氏巨球形菌)。将鸟收容在72个围栏中，每个围栏在实验开始时包含35只鸟(总共2,520只鸟)。
在施用埃氏巨球形菌之前，剧烈摇晃新鲜培养物的5L箔袋以使内容物均质化。使用Tygon管道系统来将手工操作的按剂量给药装置连接至所述袋。将所述按剂量给药装置的储库重复地充满并分发操作数次以排除空气。当包含氧指示剂的培养物保持其正常颜色时，认为所述内容物没有环境空气。
将鸡分配到具有35只的组中，并且记录每个组的重量。通过区组来对鸟组进行加工，其中在每个区组内随机分派实验处理。
使用Scorex Classic 173.05005自动填充注射器(Ecublens,Switzerland)，用0.2mL的包含1.97×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的新鲜培养物，通过经口管饲对24个围栏(35只鸟/栏；共840只鸟)进行按剂量给药。技术员通过使用拇指和食指将鸟喙撑开来束缚住鸟，同时将注射器的内容物直接卸料到鸟的口腔中。
通过包含1.97×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的新鲜培养物的气溶胶化喷雾剂(其通过安装有雾化尖头的气动灌服装置来进行施加)对24个围栏(35只鸟/栏；共840只鸟)进行按剂量给药。将鸟放置到塑料盆(50cm x 35cm x 40cm)中，并且将所述培养物以60mL的体积/栏(～1.7mL/鸟)作为雾化喷雾剂施加至它们的身体表面。
24个围栏(35只鸟/栏；共840只鸟)不与埃氏巨球形菌相接触并且充当对照。为了防止与经处理的鸟的交叉污染，对照鸡仅由不与经处理的鸟相接触的指定人员来进行操作，并且放置在指定运送器中以进行称重并转移至围栏。在一个情况下，由于技术员的错误，鸟被数错了，因而围栏51接受了33只鸟而不是35只鸟。
B.饲喂和给水
通过从供水管线上悬挂下来的吸饮器(6个吸饮器/栏)随意提供新鲜水。在整个试验中调整吸饮器高度以适应鸟的生长。下面的表10显示了在实验中所使用的膳食。所有膳食都在悬挂在围栏中央的重力喂食器中进行饲喂。需要时添加饲料以确保在整个研究持续时间期间随意获取。在将鸟放置到围栏中之前，在重力喂食器中放置5kg的幼雏膳食。
表10.膳食的组成
将膳食通过3-mm模具进行丸粒化，冷却，粉碎，并且分配到纸袋中以进行贮存直至饲喂。
在研究的第16天，从围栏中移除幼雏膳食。对残留的饲料进行称重，从每个喂食器中移除，并且放置到与围栏编号相应的编了号的箱中。用中雏膳食重新填充喂食器。在研究的第30天，重复该工序，这次用肥育膳食代替中雏膳食。在第36天，终止实验，并且对于每个围栏对残留的肥育膳食进行称重并记录。
如下来计算关于每个时期(幼雏、中雏和肥育)的总饲料消耗/栏：添加的饲料-回收的饲料。
如下来计算每天每只鸟的摄入量：总的所消耗的饲料÷[围栏中的每日头计数x总饲喂天数]。
C.鸟重量
在每个饲喂期(幼雏、中雏和肥育)结束时记录围栏重量。在幼雏期结束时(第16天)，将每个围栏中的所有鸟放置到盆(50cm x 35cm x 40cm)中并称重。从总重量中减去盆的重量以测定在该围栏中的鸟的重量。在中雏期结束时(第30天)，将每个围栏中的所有鸟放置到2个具有相等重量的盆(每个103cm x 55cm x 41cm)中，称重，并将重量加在一起。从总重量中减去每个盆的重量(在将鸟放置到它们中之前称取的)以测定在该围栏中的鸟的重量。在肥育期结束时(第36天)，将每个围栏中的所有鸟放置到2个具有相等重量的盆(每个103cm x 55cm x 41cm)中并称重。这次，用在现场的盆对刻度扣除皮重。然后，加上在每个盆中的鸟的重量以测定总围栏重量。在围栏之间，对刻度再次扣除皮重以解释排泄物积累。在所述称重期中的每一个处，当将鸟放置到盆中时，进行头计数验证。
D.取样程序
每周(第7、14、21、28和35天)，从每个围栏中随机选择1至3只鸟并通过颈脱位法进行安乐死。收集盲肠内容物(0.5g)，并且通过使用涡旋混合器在20mL HDPE闪烁管(FisherSci.；03-337-23B)中与去离子水(2mL)相混合。使用便携式pH计(Thermo ScientificOrion 3-star便携式pH计，Waltham,MA)来测定pH。向将4份盲肠混合物添加至1份25％w/v偏磷酸溶液，并且通过使用涡旋混合器来进行均质化。然后，将样品以1-mL等分试样转移到2个微量离心管中，并且在-18℃下进行冷冻以等待挥发性脂肪酸(VFA)的分析。
在第7和21天，将盲肠内容物分成2个等分试样。将一个等分试样用于VFA分析，并且如上面所解释的那样进行制备。将另一个等分试样(0.5g)直接放置到分开的20-mL HDPE闪烁管(Fisher Sci.；03-337-23B)中并进行冷冻(-80℃)以通过使用定量实时PCR来定量细菌数目。
E.盲肠pH和挥发性脂肪酸的分析
将事先经稀释并酸化的盲肠样品解冻，使用涡旋混合器来均质化，并以24x g离心18分钟。将水性上清液转移至气相色谱法瓶。使用配备有DB-WAX毛细管柱(30m x 0.53mm x0.5mm薄膜厚度；Sigma Aldrich,St.Louis,MO)和火焰离子化检测器的Agilent 7890气相色谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来测量挥发性脂肪酸。使用氦气作为载气，以22cm/s的流速，具有1-μL的分流进样和50:1的分流。初始炉温度为80℃，并且使温度以10℃/分钟增加至220℃。进口和检测器温度为250℃。通过与包含乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丁酸盐、异戊酸盐、戊酸盐、异己酸盐、己酸盐和庚酸盐的已知标准物(SupelcoVolatile Fatty Acid Standard Mix；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行比较来定量挥发性脂肪酸。
F.屠体测量
在5周龄时将鸟屠宰以测定屠体测量值。在屠宰前大约4小时停止饲喂。从每个围栏中选择五只平均大小的鸟，并且放置到捕捉箱中以运输至加工区域。按照围栏对5只鸟进行称重，以便在刚好在通过击晕和放血进行屠宰之前测定活重量。将鸟放血2分钟，然后放置到处于63℃的旋转烫池中大约30秒。将鸟转移至转鼓式机械拔毛机30秒以去除羽毛。去除脚、头和小腿，并且通过围绕肛门的切口取出屠体的内脏。然后，按照围栏对屠体进行称重以测定热屠体产量。
G.统计学分析
通过使用软件9.4版的混合程序来分析数据。模型包括固定的处理的效应、随机的区组的效应和作为实验单元的围栏。以P<0.05宣告了显著性。使用软件的PDiff选项来测定在最小二乘方平均值之间的差异。
H.结果
在处理之间，烤焙用鸡表现出相似的饲料摄入量、饲料效力和平均日增重。鸟重量和死亡率也不受处理的影响。但是，相比于对照鸟或者接受了作为气溶胶化喷雾剂的埃氏巨球形菌的鸟而言，对于接受了作为经口管饲的埃氏巨球形菌的鸟来说胴体产量是更低的。
相比于对照鸟而言，在通过喷雾剂或经口施加而接受了埃氏巨球形菌的鸟中，盲肠pH是更低的(P<0.01；表11)。
表11.埃氏巨球形菌对于盲肠pH和VFA浓度的影响
*以mM报告的VFA浓度
1对照鸟未与埃氏巨球形菌相接触
2接受了作为以～1.7ml/鸟的比率施加至其身体表面的气溶胶化喷雾剂的埃氏巨球形菌的鸟
3鸟接受了作为经口管饲的0.2ml埃氏巨球形菌
τT＝处理的效应；D＝取样日的效应；I＝在处理和取样日之间的相互作用；P<0.05
ττ对比‘埃氏巨球形菌vs对照’
A,B在一行内的没有共同上标的平均值是不同的，以P<0.05
a,b在一列内的没有共同上标的平均值是不同的，以P<0.05
关于对照、气溶胶化喷雾剂和经口管饲处理的平均盲肠pH分别为6.76、6.63和6.60。对于盲肠乙酸盐(P<0.01)、丙酸盐(P＝0.03)、丁酸盐(P<0.01)、乙酸盐:丙酸盐比例(P＝0.01；A:P比例)、己酸盐(P＝0.002)和总VFA(P<0.01)浓度检测到处理与天数的相互作用(表4)。乙酸盐从第7至14天增加，其中在第14天达到峰值。在第14天，接受了作为经口管饲的埃氏巨球形菌的鸟的盲肠内容物包含比对照鸟大的乙酸盐、丁酸盐和己酸盐浓度(P<0.01)。至第21天，乙酸盐浓度在所有处理中下降；但是，当与用气溶胶化喷雾剂或经口管饲进行处理的鸟相比较时，在盲肠中的乙酸盐浓度在对照鸟中是更大的(P<0.01)。在第21天，丙酸盐和丁酸盐浓度在对照鸟的盲肠内容物中也比用埃氏巨球形菌进行处理的鸟大(P<0.01)。丙酸盐浓度在第21天在所有处理中达到峰值并保持高水平直至第35天，但是从第28天至第35天在处理之间它们没有不同(P>0.05)。在第7天，相比于对照而言，A:P比例在用埃氏巨球形菌进行处理的鸟的盲肠内容物中是更大的(P<0.01)，其中关于对照、气溶胶化喷雾剂和经口管饲，A:P比例分别为31.96、41.33和42.03。在第14天，用埃氏巨球形菌的气溶胶化喷雾剂进行处理的鸟的盲肠A:P比例(40.44mM)比对照鸟(29.80mM)或者接受了埃氏巨球形菌的经口管饲的鸟(33.69mM)大(P<0.03)。在第21至35天，盲肠A:P比例在处理之间并无差异(P>0.05)。在盲肠内容物中的异丁酸盐、戊酸盐、异戊酸盐、异己酸盐和庚酸盐浓度不受处理的影响(P>0.10)。在第14天，相比于对照鸟而言，总的盲肠VFA浓度在经历经口管饲的鸟中是更大的(P<0.001)。但是，在第21天，在接受了作为气溶胶化喷雾剂或经口管饲的埃氏巨球形菌的鸟的盲肠内容物中的总VFA浓度(分别为64.90mM和64.82mM)低于对照(87.57mM)(P<0.05)。对于第7、28和35天，总的盲肠VFA浓度在处理之间是相似的(P>0.30)。
实施例9
埃氏巨球形菌对于烤焙用鸡的生长性能的影响
A.实验设计和处理–研究1
使用在处理开始时为一日龄的Cobb 500烤焙用鸡(Cobb-Vantress in SiloamSprings,Arkansas)来进行按照鸡笼和按照笼层划分区组的六种处理的18次重复。处理为对照(无益生菌)、作为经口管饲进行施加的Lactipro(未冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的液体培养物，MS Biotec,Wamego,Kansas)、作为经口管饲进行施用的埃氏巨球形菌菌株KS 249、作为经口管饲进行施用的埃氏巨球形菌菌株25940、作为气溶胶施加至鸟的身体表面的Lactipro(未冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的液体培养物，MS Biotec,Wamego,Kansas)和经冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125(MS Biotec,Wamego,Kansas)。将鸟收容在108个围栏中，并且每个围栏在实验开始时包含8只鸟(总共1,152只鸟)。
将鸟计数分入具有8只的组中，并且记录每个组的重量。将鸟组作为区组进行加工，并且在每个区组内将实验处理随机分派至围栏。
用0.2mL的包含1.97×109CFU/mL的未冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的液体培养物的Lactipro给18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)经口(管饲)按剂量给药。用0.2mL的包含未知浓度的埃氏巨球形菌菌株KS 249的新鲜培养物给18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)经口(管饲)按剂量给药。评估关于该菌株的CFU/mL的尝试是不成功的。用0.2mL的包含1.06×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株25940的新鲜培养物给18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)经口(管饲)按剂量给药。将用所有经口处理进行按剂量给药的鸟束缚在技术员的手掌中，使用拇指和食指将鸟喙撑开，并且使用Reference复式移液器(repeater pipette)(Hamburg,Germany)来将培养物直接卸料到口腔中。
用15mL/栏的包含1.97×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的Lactipro对18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)进行喷雾(～1.88mL/鸟)。将鸟放置在塑料盆(50cm长x 35cm宽x 40cm深)中，并且通过使用安装有雾化尖头的气动灌服装置将培养物作为雾化喷雾剂施加至鸟的身体表面。经喷雾的鸟由指定人员来进行操作并且放置在指定运送器中以用于称重、施加和转移至围栏，以便使交叉污染最小化。
以每只鸟四分之一茶匙的比率，给予18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)包含1.18×107CFU/g的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的表施物(膳食和经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的混合物)。从研究的第10天开始每天在13:00点将处理直接添加到槽式喂食器中。
其余的18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)充当对照，并且不与益生产品相接触。对照鸟由指定人员来进行操作，并且放置在指定运送器中以用于称重和转移至围栏，以便使被经处理的鸟交叉污染最小化。
B.实验设计和处理–研究2
使用一日龄的Cobb 500烤焙用鸡(Cobb-Vantress in Siloam Springs,Arkansas)来进行按照鸡笼和按照笼层划分区组的两种处理的18次重复。处理为对照(无益生菌)或者经冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125(MS Biotec,Wamego,Kansas)。将鸟收容在108个围栏中，并且每个围栏在实验开始时包含8只鸟(总共1,152只鸟)。
将鸟计数分入具有8只的组中，并且记录每个组的重量。将鸟作为区组进行加工，并且在每个区组内将实验处理随机分派至围栏。以每只鸟四分之一茶匙的比率，给予18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)包含1.18×107CFU/g的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的表施物(膳食和经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的混合物)。从研究的第10天开始每天在13:00点将处理直接添加到槽式喂食器中。
其余的18个围栏(8只鸟/栏；共144只鸟)充当对照，并且不与益生产品相接触。对照鸟由指定人员来进行操作，并且放置在指定运送器中以用于称重和转移至围栏，以便使被经处理的鸟交叉污染最小化。
C.饲喂和给水–研究1和2
新鲜水是随意可得的。在将鸟放置在围栏中之前，将9.5kg的普通幼雏膳食(表12)放置到沿靠着每个围栏的槽式喂食器中。
表12.实验膳食的组成
在需要时重新补足饲料以确保在整个研究中随意获取。在实验结束之时(第18天)，将未消耗的饲料从每个喂食器中移除、称重并记录。将按照围栏所消耗的总饲料计算为向喂食器添加的量和从喂食器中回收的量之间的差。如下来计算每只鸟的日饲料摄入量：总的所消耗的饲料÷[围栏中的每日头计数x总饲喂天数]。
D.鸟重量–研究1和2
在研究结束时，将围栏中的所有鸟放置到盆(50cm长x 35cm宽x 40cm深)中并称重。在将鸟放置到盆中之前获取盆重量，并将其从总重量中减去以查明在围栏中的鸟的重量。在该时间还进行头计数验证。
E.统计学分析–研究1和2
通过使用软件9.4版的混合程序来分析数据。模型包括固定的处理的效应、随机的区组的效应和作为实验单元的围栏。以P<0.05宣告了显著性。使用软件的PDiff选项来测定在最小二乘方平均值之间的差异。
F.结果–研究1和2
对于研究1，在所有处理组中烤焙用鸡都显示出相似的日饲料摄入量、平均日增重、增重:饲料和死亡率。
但是，如在表13中所显示的，研究2显示，当与对照鸟相比较时，平均日增重(P＝0.02)和增重:饲料(P＝0.04)在接受经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的鸟中均更大。还可参见图21，其显示了饲料:增重比例。饲料摄入量和死亡率在处理组之间没有差异。
表13.埃氏巨球形菌对于烤焙用鸡性能的影响(研究2)
实施例10
埃氏巨球形菌对于马科动物盲肠发酵的影响
A.实验设计和处理
在3个处理期内重复的3x 3(处理x马)不完全拉丁方之中使用事先安装有盲肠插管的八匹Quarter马，4匹母马和4匹阉马(平均体重＝540kg；SEM＝75kg)(Beard等人,JAS89(8):2425-2429(2011))。每个处理期被28-天清出(washout)期隔开。处理为(1)阴性对照(无埃氏巨球形菌；“对照”)，(2)50mL的通过经口灌服进行施用的包含1.97×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125(LactiproMS Biotec,Wamego,Kansas)的新鲜培养物(“灌服”)，和(3)0.40g的通过2个基于糖蜜的马特餐(treat)进行施用的包含7.02×108CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125(MS Biotec,Wamego,Kansas)的经冷冻干燥的培养物(“经冷冻干燥的”)。将马随机分派至处理(表14)。
表14.处理分配
1对照–未用埃氏巨球形菌进行处理
2灌服–马在每个处理期开始时接受50mL的作为经口管饲的埃氏巨球形菌(1.97×109CFU/mL)
3经冷冻干燥的–马在2个基于糖蜜的特餐内每日接受作为经冷冻干燥的粉末的埃氏巨球形菌(平均7.02×108CFU/mL)
将马收容在处于单个畜舍内并铺有松树刨花的独个马厩(3.05x 3.66m)中。对于每个处理期，将马随机分派至不同的马厩以解释基于在畜舍中的位置的通风或温度的任何可能的变化。在处理期期间，每日遛马以进行锻炼。
在每个处理期的第1天刚好在饲喂之前，通过使用手工操作的按剂量给药装置(60mL Variable Automatic Drencher MKIII,NJ Phillips,NSW,Australia)，用50mL的包含1.97×109CFU/mL的埃氏巨球形菌菌株NCIMB 41125的新鲜培养物对接受经口灌服的马进行按剂量给药。在施用该益生培养物之前，剧烈摇晃新鲜培养物的5L袋以使内容物均质化。通过使用Tygon管道系统来将手工操作的按剂量给药装置附接至所述袋，并且将储库填满。将大约100至200mL的培养物丢弃到废物容器中以确保所述管道系统和所述装置都没有氧气。
在每天早晨饲喂之前，给在经冷冻干燥的益生菌处理组中的马提供2个基于玉米和糖蜜的特餐，其包含经冷冻干燥的产品。在研究之前冷冻干燥埃氏巨球形菌菌株NCIMB41125，并且包装在真空密封的小包中，每个包含大约0.40g的经冷冻干燥的细菌，其中具有平均7.02×108CFU/mL的埃氏巨球形菌。每天将一个样品进行铺板以确保在每个处理期之中一致的细菌生存力。如果马拒绝了特餐，那么就以大丸剂用手施用经冷冻干燥的产品。
其余的马在该时间段期间不暴露于该益生菌，在该时间段中它们充当对照。
B.饲喂和给水
在处理期期间，每日两次用干草和浓缩物(其在两次饲喂之间平分)饲喂马。每匹马每天用雀麦草干草以所喂养的其体重的1％进行饲喂(表15)。
表15.膳食营养物分析
a在处理期期间以1％所喂养的体重/天的比率进行饲喂
b在清出期间随意进行饲喂
c在处理期期间以0.2％所喂养的体重/天的增加量直至1％所喂养的体重的最大值进行饲喂
在第1天至第5天，以其体重的0.2％/天的速率，使每匹马递升至其体重的1％的组织化浓缩物(在上面表15中的分析，在下面表16中的组成)，然后在第5天至第7天以1％BWAF的谷粒进行维持。对所有拒绝进行称重并记录。给马厩配备自动饮水器以便提供新鲜的、随意的水。对饮水器每天多次进行清洁并且就正确的功能进行检查。
表16.实验浓缩物a的组成
a在处理期期间以0.2％所喂养的体重/天的增加量直至1％
所喂养的体重的最大值进行饲喂
在清出期期间，将马收容在干畜栏中并且以随意雀麦草干草膳食进行维持(表**)。在每个清出期结束时对马进行称重，以确保准确计算在处理期期间所提供的饲料的量。
C.取样程序
在每个7天处理期期间每4个小时通过盲肠插管收集盲肠样品。每天在10:00和22:00饲喂马，并且在下一次饲喂之前在饲喂后4、8和12小时收集样品。在每个处理期的第0天，在按剂量给药或饲喂之前收集样品以建立在后肠中的pH、VFA和埃氏巨球形菌菌群的基线值。
通过移开插管帽并在盲肠内容物流出插管时接住它们来收集样品。通过四层干酪包布滤出盲肠液，然后放置到100-mL样本杯中。如果通过重力流动未收集到足够的样品，那么就使用手持式泵来提取盲肠内容物。在第0、1、3和7天在10:00，收集另外的盲肠样品以用于PCR分析。在第一个处理期期间，将未过滤的样品收集在20-mL HDPE闪烁管(FischerSci.；03-337-23B)中。这些未过滤的样品在分开样品以用于DNA提取中构成了挑战，因此对于其余的2个处理期，将滤出的盲肠液收集在50-mL Falcon锥形离心管(CorningInc.352070；Corning,NY)中并且立即在-80℃下进行冷冻以等待PCR分析。技术员在每匹马之间更换手套。
D.盲肠pH和挥发性脂肪酸的分析
在收集后立即使用便携式pH计(Thermo Scientific Orion 3Star便携式pH计,Waltham,MA；Accumet探针)来测量滤出的盲肠液的pH。在记录pH后，将样品以1mL等分试样转移到2个微量离心管中，并且与0.25mL的25％偏磷酸相混合以去蛋白质。在VFA分析之前，将样品在-18℃下冷冻至少24小时。
将经酸化和冷冻的盲肠样品解冻并使用涡旋混合器来均质化，并且以24x g离心18分钟。然后，将水性上清液转移至气相色谱法瓶。使用配备有DB-WAX毛细管柱(10mm x0.10mm x 0.1mm薄膜厚度；Agilent and J&W柱,Santa Clara,CA)和火焰离子化检测器的Agilent 7890气相色谱仪(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)来测量挥发性脂肪酸。使用氢气作为载气，以46cm/秒的流速，具有1-μL的分流进样和50:1的分流。初始炉温度为70℃，并且使温度以15℃/分钟增加至130℃，然后以60℃/分钟增加至220℃并保持2分钟。进口和检测器温度分别为260℃和300℃。通过与包含乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、丁酸盐、异戊酸盐、戊酸盐、异己酸盐、己酸盐和庚酸盐的已知标准物(Supelco Volatile FattyAcid Standard Mix；Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)进行比较来定量挥发性脂肪酸。
E.统计学分析
通过使用软件9.4版的Glimmix程序来分析数据。模型包括固定的处理的效应和随机的马的效应，时期，以及处理与时期的相互作用。马充当实验单元。在一天内的“处理x小时”效应对于任何参数来说不是显著的，并因此被从该模型中排除。以P<0.05宣告了显著性，并且趋势被认为是0.05<P<0.10。使用软件的PDiff选项来测定在最小二乘方平均值之间的差异。
F.结果
随着在膳食中谷粒的包括增加，盲肠pH倾向于在用埃氏巨球形菌进行处理的马中更大，相比于对照而言。参见图22。在第5天，即其中饲喂谷粒完全配给的第一天，施用了作为经口灌服的埃氏巨球形菌的马的盲肠pH上升到对照之上(分别为7.00和7.19；P＝0.09)。在第7天，接受作为经冷冻干燥的特餐的埃氏巨球形菌的马倾向于具有比对照(6.99)大的盲肠pH(7.19)(P＝0.09)。
表17显示了处理组的VFA特性谱。
表17.埃氏巨球形菌对于马科动物盲肠VFA特性谱的影响
*以mM报告的VFA浓度
1对照–未用埃氏巨球形菌进行处理
2灌服–马在每个处理期开始时接受了50mL的作为经口管饲的埃氏巨球形菌(1.97×109CFU/mL)
3冷冻干燥–马在2个基于糖蜜的特餐内每日接受了作为经冷冻干燥的粉末的埃氏巨球形菌(平均7.02×108CFU/mL)
τT＝处理的效应；D＝取样日的效应；I＝在处理和取样日之间的相互作用；P<0.05
ττ对比‘埃氏巨球形菌vs对照’
A,B在一行内的没有共同上标的平均值是不同的，以P<0.05
a,b在一列内的没有共同上标的平均值是不同的，以P<0.05
埃氏巨球形菌补充对于在盲肠中的乙酸盐或丙酸盐浓度没有影响(P>0.10；表**)。但是，在乙酸盐:丙酸盐(A:P)比例中检测到处理与天数的相互作用(P<0.05)。在第7天，盲肠A:P比例在接受了经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的马中(2.83)比未接受埃氏巨球形菌的马(2.41)或者接受了作为经口灌服的埃氏巨球形菌的马(2.60)大(P<0.05)。在第7天，盲肠戊酸盐在接受了经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的马中(0.15mM)比在对照动物(0.04mM)或者接受了埃氏巨球形菌的经口灌服的马(0.07mM)中大(P<0.02)。在第5天，盲肠戊酸盐在经灌服的马中比对照动物少(P<0.01)；但是，它与用经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行处理的马的盲肠戊酸盐相似(P>0.10)。庚酸盐和异己酸盐浓度是可忽略的，并且未检测到处理或相互作用效应，因此这些VFA被从表**中排除。
在第5天至第7天，即其中消耗了最大量的谷粒的那些天，盲肠pH和发酵产物受到埃氏巨球形菌补充的影响最大。
实施例11
在烤焙用鸡中评价埃氏巨球形菌NCIMB 41125液体培养物的施加
在Virginia Diversified Research Corporation进行试验性烤焙用鸡性能研究，以评价喷雾的或管饲的埃氏巨球形菌NCIMB 41125对于烤焙用鸡的生长性能的影响。
将在第0天用Coccivac-B喷淋疫苗接种的一日龄烤焙用鸡(n＝720)随机分配至6种不同的处理：(1)阴性对照组(nCON)，其不接受巨球形菌属细菌，(2)喷雾组(d0 Mist)，其当在它们的孵化箱中时在第0天通过喷雾(1-2mL/鸟)接受埃氏巨球形菌NCIMB 41125，(3)第7天管饲组(d7 GAV)，其在第7天在2小时禁饲料和1小时禁水后通过经口管饲接受2mL的埃氏巨球形菌NCIMB 41125，(4)第14天管饲组(d14 GAV)，其在第14天在2小时禁饲料和1小时禁水后通过经口管饲接受5mL的埃氏巨球形菌NCIMB 41125，(5)第21天管饲组(d21GAV)，其在第21天在2小时禁饲料和1小时禁水后通过经口管饲接受10mL的埃氏巨球形菌NCIMB 41125，和6)阳性对照组(pCON)，其不接受巨球形菌属细菌，但接受用BMD(50g/t)进行处理的幼雏和中雏饲料以及用Stafac(20g/t)进行处理的肥育饲料。
每种处理由4个笼子(每个笼子包含30只鸟)代表。提供给鸟的膳食如下：第0-18天，幼雏饲料；第18-35天，中雏饲料；和第35-39天，肥育饲料。在39-天试验期内，记录动物重量、饲料消耗和饲料转化。
表18：在饲喂25和39天后测量的烤焙用鸡性能
a,b在一行内的具有不同上标的平均值是不同的，以P<0.05。
结果呈现在表18中。在处理之间，总死亡率没有差异(表18)。在第25天，关于d0Mist组的饲料转化显著地低于所有其他处理，其中具有超过pCON的5.3％的改善和超过nCON的6.5％的改善。在饲喂39天后，经埃氏巨球形菌处理的组的饲料转化并不显著地不同于pCON，但是倾向于在数字上更低，除了d7 GAV。关于d21 GAV组的饲料转化显著地低于nCON，其中具有7.7％的饲料转化的改善。
实施例12
使不同的埃氏巨球形菌菌株在补充有两种碳源的半合成生长培养基上进行生长
A.实验设计
在该实施例中使用下面的细菌菌株:(1)埃氏巨球形菌NCIMB 41125，(2)埃氏巨球形菌ATCC 25940，(3)埃氏巨球形菌NCIMB 702261，(4)埃氏巨球形菌NCIMB 702262，和(5)埃氏巨球形菌NCIMB 702410。
使所有菌株在血清瓶中在半合成乳酸盐生长培养基上进行生长。然后，将所得的培养物用于接种包含补充有两种碳源的半合成生长培养基的96-孔平板：乳酸钠和葡萄糖，其由60％的乳酸盐和40％的葡萄糖，70％的乳酸盐和30％的葡萄糖，或者40％的乳酸盐和60％的葡萄糖组成。
然后，将96-孔平板在厌氧条件下在39℃下进行温育，并且以15分钟间隔自动记录光密度(600nm)。
B.埃氏巨球形菌菌株在各种二碳培养基上的生长特征的分析
绘制在不同的半合成培养基上和用不同的埃氏巨球形菌菌株的所得的生长曲线，其中在x-轴上为温育时间和在y-轴上为光密度读数，以便比较生长特征(图23-25)。
当在由60％的乳酸盐和40％的葡萄糖、70％的乳酸盐和30％的葡萄糖或者40％的乳酸盐和60％的葡萄糖组成的半合成培养基上进行生长时，在该实验中所测试的所有埃氏巨球形菌菌株展示出相似的生长特征。
实施例13
使不同的埃氏巨球形菌菌株在补充有两种碳源的半合成生长培养基上进行生长，随后为冷冻干燥所述细胞
A.实验设计
在该实施例中使用下面的细菌菌株:(1)埃氏巨球形菌NCIMB 41125，(2)埃氏巨球形菌ATCC 25940，(3)埃氏巨球形菌NCIMB 702261，(4)埃氏巨球形菌NCIMB 702262，和(5)埃氏巨球形菌NCIMB 702410。
使所有菌株在血清瓶中在半合成乳酸盐生长培养基上进行生长。然后，将所得的培养物用于接种包含补充有两种碳源的半合成生长培养基的5-L发酵容器：乳酸钠和葡萄糖，其由60％的乳酸盐和40％的葡萄糖或者70％的乳酸盐和30％的葡萄糖组成。
在8、10、12、14和16小时的生长后收集培养物的样品，冷却至室温，并且通过去除99％的液体来无菌地和厌氧地收获细胞。将截留物与冷冻保护剂(蔗糖)的溶液以1/5比例在无菌和厌氧条件下相混合，以获得5％w/v的最终蔗糖浓度。对所述混合物进行取样以测定冷冻干燥前的埃氏巨球形菌浓度(即，生存力计数)。
将所得的混合物的等分试样转移到10mL小瓶(4mL/小瓶)中并在液氮中迅猛地进行冷冻。将小瓶转移至冷冻干燥器以便依照急速循环来进行冻干。一旦冷冻干燥完成，就通过下述方式来测定细菌的存活：用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮经冻干的产品，允许它在室温下再水化40分钟，然后铺板到半合成乳酸盐琼脂上(即，生存力计数)。
通过从埃氏巨球形菌的初始(冷冻干燥前)浓度中减去在冷冻干燥后回收的埃氏巨球形菌的浓度来计算细胞损失。
B.比较在各种半合成培养基上进行生长、在生长期间的各种时间处收获并冷冻干燥的不同埃氏巨球形菌菌株的在冷冻干燥后的细胞损失
在该实验中所测试的所有埃氏巨球形菌菌株均导致在冷冻干燥后有生存力的细胞。将可接受的细胞损失极限设置在1.6log CFU/mL。在包含70％的乳酸盐和30％的葡萄糖的半合成培养基上进行生长的细胞的在冷冻干燥期间所遇到的细胞损失(表19)均低于可接受的极限并且在0.3至1.3log的范围内变动，不论菌株或收获时间为何。
表19：对于在由70％的乳酸盐和30％的葡萄糖组成的半合成培养基上进行生长、在8、10、12、14或16小时的温育后收获并冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株，在冷冻干燥后观察到的细胞损失(Log CFU/mL)
在包含60％的乳酸盐和40％的葡萄糖的半合成培养基上进行生长的细胞的在冷冻干燥期间所遇到的细胞损失(表20)更多地受到收获时间的影响，但是所有菌株仍导致低于可接受的极限的细胞损失，对于收获时间中的至少三个。冷冻干燥前收获时间的优化可以导致冷冻干燥后的回收的进一步改善。
表20：对于在由60％的乳酸盐和40％的葡萄糖组成的半合成培养基上进行生长、在8、10、12、14或16小时的温育后收获并冷冻干燥的埃氏巨球形菌菌株，在冷冻干燥后观察到的细胞损失(Log CFU/mL)
总之，在本文中所描述的方法导致包含有生存力的细胞的经冷冻干燥的产品，不论所使用的埃氏巨球形菌菌株为何。
实施例14
对经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行包囊并测定其稳定性
将通过TFF而获得的的埃氏巨球形菌NCIMB 41125截留物与冷冻保护剂溶液(蔗糖)以1/5比例无菌地相混合，以获得5％蔗糖(w/v)的最终浓度。将混合物在液氮中迅猛地进行冷冻，并且转移至冷冻干燥器以便通过使用急速循环来进行冻干。一旦冷冻干燥完成，就通过下述方式来测定细菌的存活：用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮经冻干的产品，允许它在室温下再水化40分钟，然后铺板到半合成乳酸盐琼脂上。
然后，将所得的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌粉末与载体(填充剂)相混合，并且通过将所述粉末分配到经加热的棕榈油馏出液或硬脂酸中来进行包囊。然后，将所述混合物急速冷却，并且对所得的产品进行取样以测定细菌的存活。用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮样品，混合15秒，并且在铺板到在半合成乳酸盐琼脂上之前允许其在室温下再水化40分钟。使用不同的加热温度和不同类型的油(方法1、2和3)重复该实验三次。方法1使用110℃的加热温度，和使用棕榈油馏出液作为包囊材料。方法2使用52℃的加热温度，和使用棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物作为包囊材料。方法3使用65℃的加热温度，和使用棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物作为包囊材料。
通过从在冷冻干燥后回收的埃氏巨球形菌浓度中减去在包囊后回收的埃氏巨球形菌浓度并将它除以在冷冻干燥后回收的埃氏巨球形菌浓度来计算损失百分比。
从通过使用方法2和方法3进行包囊的产品中收集另外的样品，并将其在有氧条件下在室温下贮存4个月的时间段以评估该产品的稳定性。用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮样品，混合15秒，并且在铺板到半合成乳酸盐琼脂上之前允许其在室温下再水化40分钟。图26和27显示，使用方法2或3的经包囊的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的稳定性仅损失大约1log CFU/g。
表21：使用方法1、2或3，经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的在包囊后观察到的损失百分比
用于对经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行包囊的方法2和3导致大于67.9％的细胞回收(表21)。
另外，依照方法2或方法3进行包囊的经冷冻干燥的样品导致在正常氧和湿度条件下在室温下贮存直至4个月期间细胞生存力的1log下降。
依照方法2和3对经冷冻干燥的埃氏巨球形菌进行包囊为所述细菌提供了针对氧和水分的进一步保护。该工序将会允许在室温下贮存经包囊的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌而无需任何特殊的包装，并且将会允许将该产品添加到饲料中。
实施例15
以试验性规模产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌的保存期限
A.实验设计
在该实验中使用600-升批次的由70％的乳酸盐和30％的葡萄糖组成的半合成培养基来使埃氏巨球形菌NCIMB 41125进行生长。在39℃下14小时温育后，将所得的培养物冷却至室温，并且使用在实施例2中所描述的切向流过滤系统来收获细胞。从培养物中去除百分之九十九的液体体积，然后将截留物以1:5比例重悬浮在蔗糖冷冻保护剂溶液中以获得5％w/v的最终蔗糖浓度。
然后，将所述混合物在液氮中进行冷冻，将经冷冻的丸粒转移至冷冻干燥器，并且依照急速循环进行冻干。一旦冷冻干燥完成，就收集经冻干的粉末并且在厌氧条件下单独地(“M.e.”)或者与作为填充剂的麦芽糖糊精一起(“M.e.+麦芽糖糊精”)包装到Mylar小袋中(表22)。
表22：Mylar小袋填充物
通过下述方式来测定在经冷冻干燥的产品中的埃氏巨球形菌浓度(3个样品/处理)：用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮经冻干的产品，允许它在室温下再水化40分钟，然后铺板到半合成乳酸盐琼脂上(即，生存力计数)。将埃氏巨球形菌浓度表示为“CFU/小袋”并进行log转化。
B.保存期限研究
将包含不同处理的Mylar小袋贮存在室温(75°F；25℃)下或在40°F(4℃)下。在0.5、1、2、3、4和6个月的贮存后获得另外的样品，并且以与前面所描述的相同的方式进行加工(3个样品/处理/时间点)以测定产品保存期限。将埃氏巨球形菌浓度表示为“CFU/小袋”并进行log转化。
保存期限数据呈现在图28中。随时间的埃氏巨球形菌浓度受到贮存温度的影响。在6个月的贮存后，在40°F(4.4℃)下贮存的样品是稳定的，不论麦芽糖糊精存在还是不存在，而在75°F(23.9℃)下贮存的样品损失大约1.6log(对于“M.e.”处理)和大约0.8log(对于“M.e.+麦芽糖糊精”处理)。
实施例16
微生物细胞生长、培养基、温度和pH
可以将厌氧细菌分为三个类别：(1)专性厌氧菌；(2)耐氧厌氧菌；和(3)兼性厌氧菌。专性厌氧菌是在正常的大气氧浓度下不能存活的细菌。一些专性厌氧菌可以在直至8％的氧中存活，而其他则不能存活，除非氧浓度低于0.5％。耐氧厌氧菌可以在氧存在下存活，但是不利用氧进行生长。兼性厌氧菌能够使用氧用于需氧呼吸，但是如果不存在氧，也可以使用厌氧呼吸。
类似地，需氧细菌可以分为两个类别：(1)专性需氧菌；和(2)微需氧菌。专性需氧菌需要氧来进行细胞呼吸，并且可以在正常的大气氧浓度下存活。微需氧菌需要氧用于细胞生长，但是被正常的大气氧浓度伤害。
酵母是单细胞的真核微生物，其被归类为真菌界的一员。酵母可以是专性需氧菌或兼性厌氧菌。
巨球形菌属例如埃氏巨球形菌和双歧杆菌属例如短双歧杆菌是专性厌氧菌的代表性物种。乳杆菌属例如植物乳杆菌和双歧杆菌属例如动物双歧杆菌乳亚种是耐氧厌氧菌的代表性物种。片球菌属例如乳酸片球菌和乳杆菌属例如干酪乳杆菌是兼性厌氧菌的代表性物种。芽孢杆菌属例如枯草芽孢杆菌是专性需氧菌的代表性物种。糖酵母属例如布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母是酵母的代表性物种。
使需氧细菌、厌氧细菌和酵母在包含至少一种从由下列各项组成的组中选择的碳源的培养基上进行生长：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合。此外，还使需氧细菌、厌氧细菌和酵母在包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源的培养基上进行生长：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合。使厌氧细菌在厌氧条件下或以所需的氧条件进行生长以有助于厌氧细菌细胞生长，和使需氧细菌和酵母在合适的氧条件下用包含至少两种选自上面的碳源的培养基进行生长，其中对于植物乳杆菌在15℃至45℃的温度下，和对于短双歧杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、乳酸片球菌、干酪乳杆菌、布拉尔氏糖酵母和枯草芽孢杆菌在20℃至45℃的温度下。对于这些菌株的最佳温度为37℃，除了酿酒糖酵母，其更喜欢30℃。培养基的pH在4.0和9之间，更特别地，pH 4.0至4.5、4.5至5.5、5.5至6.5、6.5至7.5、7.5至8.5或8.5至9.0。使微生物进行生长直至指数生长期结束，即至少1小时至6小时，6小时至12小时，12小时至24小时，24小时至36小时，36小时至48小时，48小时至72小时，72小时至96小时，或者96小时至120小时。
一旦培养基包含至少1×103CFU/g，就在合适的条件下收获微生物并且对微生物进行冷冻干燥和/或包囊以用于在动物饲料制剂中使用。
实施例17
使用切向流过滤来浓缩需氧细菌、厌氧细菌和酵母的培养物
在本实施例中使用在实施例2中所呈现的方法，其中采用在实施例16中所公开的需氧细菌、厌氧细菌和酵母，和使用合适的培养基以允许最佳的微生物细胞生长。与埃氏巨球形菌相似，对于需氧细菌(枯草芽孢杆菌)、厌氧细菌(短双歧杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、乳酸片球菌和干酪乳杆菌)和酵母(布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母)使用切向流过滤产生相似的结果，关于在浓缩工序过程中在渗透物和截留物中回收的有生存力的微生物的量。另外，过滤工序对于微生物存活能力或对于微生物在过滤后进行生长的能力没有影响。因此，使微生物在液体肉汤中进行生长，过滤，和制备用于冷冻、冷冻干燥和/或包囊。
实施例18
用于需氧细菌、厌氧细菌和酵母的冷冻和冷冻干燥参数
为了测定各种冷冻和冷冻干燥参数对于不同类型的需氧细菌、厌氧细菌和酵母的影响，施行根据实施例17的实施例。与实施例3相似，将可接受的细胞损失极限设置在1.6log CFU/mL。
在冻干之前，将短双歧杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、乳酸片球菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母的截留物重悬浮在包含无冷冻保护剂、脱脂乳、海藻糖、蔗糖或其组合的冷冻保护剂溶液中。然后，将每种混合物转移至小瓶并且在-80℃下缓慢地进行冷冻或在液氮中迅猛地进行冷冻，之后放置在冷冻干燥器中以通过使用急速或缓慢循环来进行冻干。
未与冷冻保护剂相混合的截留物都具有比与冷冻保护剂溶液相混合的截留物大的细胞损失和比阈值大的细胞损失，不论冷冻干燥循环或冷冻方法为何。
另外，所有经测试的冷冻干燥工序都导致这样的产品，其能够保留足够的生存力以在再水化后，甚至在室温或至少4℃下进行4至12个月的延长贮存后发动培养物的生长。
实施例19
贮存条件对于经冷冻干燥的需氧细菌、厌氧细菌和酵母的产量和稳定性的影响
在本实施例中使用在实施例4中所呈现的用于细胞存活和微生物生长特征的测试方法，其中采用在实施例16中所公开的需氧细菌、厌氧细菌和酵母，和使用合适的培养基以允许最佳的微生物细胞生长。
为了测定冷冻干燥规划方案和贮存条件对于短双歧杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、乳酸片球菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、布拉尔氏糖酵母和酿酒糖酵母的生长特征和保存期限的影响，那么通过使用生长曲线分析和涂布铺板技术，就微生物生长特征和在有氧或厌氧条件下在4℃或25℃下贮存0、2、4、8、12、16、20和24周期间的细胞存活来测试如在实施例18中那样所产生的经冷冻干燥的培养物。
不论处理为何，来自在有氧条件下进行贮存的经冷冻干燥的厌氧细菌的样品相比于其厌氧贮存的对应物而言更急速地腐败，具有额外的细胞损失。
在25℃下贮存的样品比在4℃下贮存的其对应物腐败得更快。
在16-周贮存期内，在液氮中进行冷冻并且在冷冻干燥后在25℃下贮存的样品不比在4℃下贮存的其对应物损失更多的细胞；但是，在20和/或24周的贮存后，在25℃和4℃贮存之间，样品间的差异是显著的。
在每个取样日，进行生长曲线实验以比较经冷冻干燥的产品与未冷冻干燥的产品的生长特征。用于每个生长曲线的未冷冻干燥的样品是“新鲜的”(不超过2日龄)。在4℃下贮存的经冷冻干燥的产品具有比在25℃下贮存的经冷冻干燥的产品更短的滞后时间。在16周的贮存后，所有来自被复活的包含冷冻保护剂、在液氮中进行冷冻、进行冷冻干燥并在厌氧条件下进行贮存的厌氧细菌的样品都再次是有生存力的。相似地，所有来自被复活的包含冷冻保护剂、在液氮中进行冷冻并进行冷冻干燥的需氧细菌和酵母的样品都也再次是有生存力的。
实施例20
贮存条件对于经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌、厌氧细菌和酵母的产量和稳定性的影响
如在实施例16-19中所描述的那样制作各种需氧细菌、厌氧细菌和酵母的冷冻和冷冻干燥截留物。在冷冻干燥后，将厌氧细菌与载体(填充剂)相混合，并且通过将经冷冻干燥的粉末分配到经加热的油中来进行包囊，如在实施例14中所描述的那样。然后，将所述混合物急速冷却，并且对所得的产品进行取样以测定微生物的存活。用无氧稀释剂在厌氧室中重悬浮厌氧微生物样品，混合15秒，并且在铺板到在半合成乳酸盐琼脂上之前允许其在室温下再水化40分钟。用稀释剂在正常的大气氧浓度下重悬浮需氧微生物样品，混合15秒，并且在铺板到在半合成乳酸盐琼脂上之前允许其在室温下再水化40分钟。使用不同的加热温度和不同类型的油(方法1、2和3)重复该实验三次。方法1使用110℃的加热温度，和使用棕榈油馏出液作为包囊材料。方法2使用52℃的加热温度，和使用棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物作为包囊材料。方法3使用65℃的加热温度，和使用棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的单甘油酯和二甘油酯的混合物作为包囊材料。
使用方法2或3，因包囊的细胞损失百分比小于40％。在对各种需氧细菌、厌氧细菌和酵母进行包囊后，在正常的大气氧条件下在室温下进行贮存的经包囊的微生物在贮存过程中仅具有轻微的细胞生存力下降(例如，细胞生存力的0.5至2-log降低)。

Claims (119)

1.一种产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌(Megasphaera elsdenii)细胞的方法，其包括：
(a)在厌氧条件下制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉及其组合，
(b)在厌氧条件下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，和
(d)冷冻干燥所述细胞，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少两种碳源由大约50-90％的第一碳源和大约10-50％的第二碳源组成，其中所述第二碳源不同于所述第一碳源，并且其中100％的所述至少两种碳源由所述第一碳源和所述第二碳源组成。
3.一种产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括：
(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，
(b)在所述培养物结束其指数生长期后12小时之内并且在所述培养物开始其稳定生长期之前，在厌氧条件下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，和
(d)冷冻干燥所述细胞，
其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述收获包括至少一种从由下列各项组成的组中选择的技术：离心、过滤、透析、反渗透及其组合。
5.权利要求4所述的方法，其中所述过滤包括切向流过滤。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述培养物包含液体，并且其中所述收获包括去除大约60％至大约100％的所述液体。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述冷冻处于大约-80℃至大约-210℃的温度。
8.一种产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括：
(a)制备包含埃氏巨球形菌细胞和生长培养基的培养物，
(b)收获所述细胞，
(c)在收获的5小时之内在大约-80℃至大约-210℃的温度下冷冻所述细胞，和
(d)冷冻干燥所述细胞，
其中产生经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述冷冻包括使包含所述埃氏巨球形菌细胞的容器与液氮相接触。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述冷冻包括使所述细胞与液氮相接触。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述冷冻处于大约-196℃的温度并且产生包含所述细胞的经冷冻的丸粒，其中所述经冷冻的丸粒的直径为大约0.001至大约0.5英寸。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中在收获之前所述埃氏巨球形菌培养物的pH为大约4.5至大约7.0。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中大约1×103至大约1×1012CFU/g的所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约25℃的温度下贮存至少2周后是有生存力的。
14.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中大约1×103到大约1×1012CFU/g的所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞在大约4℃下贮存至少1个月后是有生存力的。
15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述培养物进一步包含至少一种冷冻保护剂。
16.权利要求15所述的方法，其中所述至少一种冷冻保护剂选自由下列各项组成的组：果糖、葡萄糖、蔗糖、奶粉、婴儿配方奶粉、脱脂乳、海藻糖、麦芽糖糊精、甜菜碱及其组合。
17.权利要求15或16所述的方法，其中所述至少一种冷冻保护剂以所述培养物的大约1％至大约20％(w/v)的量存在。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌以商业规模产生。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述培养物的体积为至少大约50升。
20.权利要求3至19中任一项所述的方法，其中大约1×103至1×1012CFU/g的埃氏巨球形菌细胞在冷冻干燥后是有生存力的。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中在所述培养物中的细胞由埃氏巨球形菌细胞组成。
22.一种固体饲料添加剂，其包含通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞。
23.权利要求22所述的固体饲料添加剂，其中所述固体饲料添加剂进一步包含另一种微生物。
24.权利要求22或23所述的固体饲料添加剂，其中所述固体饲料添加剂选自由下列各项组成的组：粉末、颗粒、微粒、丸粒、块状物或其组合。
25.权利要求22至24中任一项所述的固体饲料添加剂，其中所述固体饲料添加剂为益生菌。
26.一种组合物，其包含通过权利要求1-21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞或者权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂。
27.权利要求26所述的组合物，其中所述组合物为胶囊。
28.一种试剂盒，其包含通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27所述的组合物。
29.一种向动物施用埃氏巨球形菌细胞的方法，其包括向所述动物施用通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27所述的组合物。
30.一种用于治疗或预防与在动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27的组合物。
31.权利要求30所述的方法，其中所述状况或病症为酸中毒。
32.权利要求30或31所述的方法，其中所述状况或病症为瘤胃酸中毒。
33.权利要求30所述的方法，其中所述状况或病症为呼吸系统疾病。
34.权利要求30所述的方法，其中所述状况或病症为蹄叶炎。
35.权利要求30所述的方法，其中所述状况或病症为感染。
36.权利要求35所述的方法，其中所述感染为沙门氏菌属(Salmonella)或弯曲杆菌属(Campylobacter)感染。
37.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27的组合物。
38.权利要求37所述的方法，其中所述机会微生物是致病性的。
39.权利要求37或38所述的方法，其中所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
40.一种改善在动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27的组合物。
41.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求1至21中任一项所述的方法而产生的经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、权利要求22至25中任一项所述的固体饲料添加剂或者权利要求26或27的组合物，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
42.权利要求29至41中任一项所述的方法，其中在用食物饲喂所述动物之前、与用食物饲喂所述动物相伴地或在用食物饲喂所述动物之后，施用所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞、所述固体饲料添加剂或所述组合物。
43.权利要求29至41中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在施用之前将所述经冷冻干燥的埃氏巨球形菌细胞或所述固体饲料添加剂与液体相混合。
44.权利要求43所述的方法，其中所述液体以口服方式或者通过用所述液体喷淋所述动物来进行施用。
45.权利要求29至44中任一项所述的方法，其包括单次施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
46.权利要求29至45中任一项所述的方法，其包括每日施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
47.权利要求29至46中任一项所述的方法，其包括在单日内超过一次施用所述埃氏巨球形菌细胞、饲料添加剂或组合物。
48.权利要求29至47中任一项所述的方法，其中所述动物为反刍动物。
49.权利要求48所述的方法，其中所述反刍动物选自由下列各项组成的组：牛、绵羊、山羊、鹿、水牛和驯鹿。
50.权利要求29至47中任一项所述的方法，其中所述动物为非反刍动物。
51.权利要求50所述的方法，其中所述非反刍动物选自由下列各项组成的组：马科动物、家禽和猪。
52.权利要求29至33、35至47、50或51中任一项所述的方法，其中所述动物为家禽动物。
53.权利要求52所述的方法，其中所述家禽动物选自由下列各项组成的组：鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡或鸽子。
54.权利要求52或53所述的方法，其中所述家禽动物选自由下列各项组成的组：烤焙用鸡、烤焙用鸡种鸡和产蛋用鸡。
55.权利要求52至54中任一项所述的方法，其中所述家禽动物为鸡。
56.权利要求29至47、50或51中任一项所述的方法，其中所述动物为马科动物。
57.权利要求56所述的方法，其中所述马科动物为马、矮种马、驴或骡。
58.一种用于治疗或预防与在家禽动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
59.权利要求58所述的方法，其中所述状况或病症为酸中毒。
60.权利要求58所述的方法，其中所述状况或病症为呼吸系统疾病。
61.权利要求58所述的方法，其中所述状况或病症为感染。
62.权利要求61所述的方法，其中所述感染为沙门氏菌属或弯曲杆菌属感染。
63.一种用于防止或减少在家禽动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
64.权利要求63所述的方法，其中所述机会微生物是致病性的。
65.权利要求63或64所述的方法，其中所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
66.一种改善在家禽动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
67.一种在家禽动物中改善生长性能的方法，其包括向所述家禽动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、蛋产量、骨矿化或其组合。
68.权利要求58至67中任一项所述的方法，其中所述家禽动物选自由下列各项组成的组：鸡、鹅、鸭、鹌鹑、火鸡或鸽子。
69.权利要求58至68中任一项所述的方法，其中所述家禽动物选自由下列各项组成的组：烤焙用鸡、烤焙用鸡种鸡和产蛋用鸡。
70.权利要求58至69中任一项所述的方法，其中所述家禽动物为鸡。
71.一种用于治疗或预防与在马科动物胃肠道中的乳酸产生相关的状况或病症的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
72.权利要求71所述的方法，其中所述状况或病症为酸中毒。
73.权利要求71所述的方法，其中所述状况或病症为呼吸系统疾病。
74.权利要求71所述的方法，其中所述状况或病症为蹄叶炎。
75.权利要求71所述的方法，其中所述状况或病症为感染。
76.权利要求75所述的方法，其中所述感染为沙门氏菌属或弯曲杆菌属感染。
77.一种用于防止或减少在马科动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
78.权利要求77所述的方法，其中所述机会微生物是致病性的。
79.权利要求77或78所述的方法，其中所述机会微生物为沙门氏菌属或弯曲杆菌属。
80.一种改善在马科动物膳食中的植物来源的磷的生物利用率的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞。
81.一种在马科动物中改善生长性能的方法，其包括向所述马科动物施用有效量的埃氏巨球形菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、奶产量、骨矿化或其组合。
82.权利要求71至81中任一项所述的方法，其中所述马科动物为马、矮种马、驴或骡。
83.权利要求58至82中任一项所述的方法，其中饲料添加剂包含所述埃氏巨球形菌细胞。
84.权利要求83所述的方法，其中所述饲料添加剂为粉末、颗粒、微粒、丸粒、块状物、液体、凝胶或其组合。
85.权利要求58至84中任一项所述的方法，其中组合物包含所述埃氏巨球形菌细胞或含有所述细胞的饲料添加剂。
86.权利要求85所述的方法，其中所述组合物为胶囊。
87.权利要求58至86中任一项所述的方法，其中所述埃氏巨球形菌细胞为经冷冻干燥的细胞。
88.权利要求58至85中任一项所述的方法，其中所述埃氏巨球形菌细胞在液体中进行施用。
89.权利要求88所述的方法，其中所述方法进一步包括再水化饲料添加剂或经冷冻干燥的细胞以产生所述液体。
90.权利要求88或89所述的方法，其中所述液体通过经口管饲法或者通过用所述液体喷淋所述动物来进行施用。
91.权利要求58至90中任一项所述的方法，其中在用食物饲喂所述动物之前、与用食物饲喂所述动物相伴地或在用食物饲喂所述动物之后，施用所述埃氏巨球形菌细胞。
92.权利要求58至91中任一项所述的方法，其包括单次施用所述埃氏巨球形菌细胞。
93.权利要求58至91中任一项所述的方法，其包括每日施用所述埃氏巨球形菌细胞。
94.权利要求58至93中任一项所述的方法，其包括在单日内超过一次施用所述埃氏巨球形菌细胞。
95.一种产生经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属(Megasphaera)细胞的方法，其包括：
(a)在厌氧条件下制备包含巨球形菌属细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，
(b)在厌氧条件下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，
(d)冷冻干燥所述细胞，和
(e)对所述细胞进行包囊，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
96.一种向动物施用巨球型菌属细胞的方法，其包括向所述动物施用通过权利要求95所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
97.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求95所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
98.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求95所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
99.一种组合物，其包含通过权利要求95所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的巨球形菌属细胞。
100.一种产生经冷冻干燥的厌氧细菌细胞的方法，其包括：
(a)在厌氧条件或部分厌氧条件下制备包含厌氧细菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，
(b)在厌氧条件或部分厌氧下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，和
(d)冷冻干燥所述细胞，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
101.一种向动物施用厌氧细菌细胞的方法，其包括向所述动物施用通过权利要求100所述的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
102.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求100所述的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
103.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求100所述的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
104.一种组合物，其包含通过权利要求100所述的方法而产生的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
105.一种产生经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞的方法，其包括：
(a)在厌氧条件或部分厌氧条件下制备包含厌氧细菌细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，
(b)在厌氧条件或部分厌氧下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，
(d)冷冻干燥所述细胞，和
(e)对所述细胞进行包囊，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
106.一种向动物施用厌氧细菌细胞的方法，其包括向所述动物施用通过权利要求105所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
107.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求105所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
108.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求105所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
109.一种组合物，其包含通过权利要求105所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的厌氧细菌细胞。
110.一种产生经冷冻干燥的需氧细菌和/或酵母细胞的方法，其包括：
(a)在有氧条件下制备包含需氧细菌细胞和/或酵母细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，
(b)收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，和
(d)冷冻干燥所述细胞，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经冷冻干燥的需氧细菌和/或酵母细胞。
111.一种向动物施用需氧细菌和/或酵母细胞的方法，其包括向所述动物施用通过权利要求110所述的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
112.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求110所述的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
113.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求110所述的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
114.一种组合物，其包含通过权利要求110所述的方法而产生的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
115.一种产生经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞的方法，其包括：
(a)在有氧条件下制备包含需氧细菌细胞和/或酵母细胞和生长培养基的培养物，所述生长培养基包含至少两种从由下列各项组成的组中选择的碳源：酪蛋白、乳酸盐、右旋糖、果糖、果聚糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、乙酸盐、甘油、甘露醇、山梨醇、蔗糖、木糖、糖蜜、岩藻糖、葡糖胺、右旋糖酐、脂肪、油、甘油、乙酸钠、阿拉伯糖、大豆蛋白、可溶性蛋白质、棉子糖、直链淀粉、淀粉、胰蛋白胨、酵母提取物及其组合，
(b)在有氧条件下收获所述细胞，
(c)冷冻所述细胞，
(d)冷冻干燥所述细胞，和
(e)对所述细胞进行包囊，
其中产生大约1×103至大约1×1012CFU/g的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
116.一种向动物施用需氧细菌和/或酵母细胞的方法，其包括向所述动物施用权利要求115所述的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
117.一种在动物中改善生长性能的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求115所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞，其中在所述动物中的经改善的生长性能为在下述方面的改善：饲料摄入量、平均日增重、饲料转化率、屠体增重、产奶动物中的奶产量、家禽中的蛋产量、骨矿化或其组合。
118.一种用于防止或减少在动物胃肠道中的机会微生物生长的方法，其包括向所述动物施用有效量的通过权利要求115所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
119.一种组合物，其包含通过权利要求115所述的方法而产生的经包囊的经冷冻干燥的需氧细菌细胞和/或酵母细胞。
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