BR112019015792A2

BR112019015792A2 - Células microbianas, métodos de sua produção e usos destas

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Publication number: BR112019015792A2
Application number: BR112019015792-1A
Authority: BR
Inventors: Scott DROUILLARD James; Caroline APERCE Celine; Rae HERREN Gina; Jo ELLERMAN Tara; Marie Scaletti Ciana; Van Jordan Katherine; Morris Lattimer James; BEYER Scott; Uwituze Solange; Lea Douthit Teresa; Denise Gunkel Christina
Original assignee: Kansas State University Research Foundation; Ms Biotech, Inc.
Priority date: 2017-01-31
Filing date: 2018-01-31
Publication date: 2020-03-17
Also published as: CN110475479A; JP2023075359A; US11492587B2; WO2018144653A1; EP3577213A4; CO2019008826A2; JP2020508696A; MX2023003789A; US20240018465A1; US20230128983A1; IL268354A; CL2019002135A1; PH12019501780A1; EP3577213A1; AU2018215216A1; US20230357706A1; US20200224151A1; CA3051249A1; AU2018215216B2; EP3577213B1

Abstract

a presente invenção está relacionada às células microbianas incluindo, sem limitação, células de bactérias aeróbicas e células de bactérias anaeróbicas, bem como células de levedura, e métodos para a produção das células, aditivos alimentares e composições que compreendem as células, e usos que envolvem a administração das células a animais.

Description

CÉLULAS MICROBIANAS, MÉTODOS DE SUA PRODUÇÃO E USOS DESTAS FUNDAMENTOS DA REVELAÇÃO

Campo da invenção [001] A presente invenção está relacionada às células de Megasphaera elsdenii, métodos para a produção de células de M. elsdenii, aditivos alimentares e composições que compreendem as células, e usos que envolvem a administração das células a animais incluindo, por exemplo, para desempenho de crescimento e/ou saúde aumentados. A presente invenção também está relacionada às células microbianas incluindo, sem limitação, bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e células de levedura, e métodos para a produção de células microbianas, aditivos alimentares e composições que compreendem as células microbianas, e usos que envolvem a administração das células microbianas a animais incluindo, por exemplo, para desempenho de crescimento e/ou saúde aumentados.

Fundamentos [002] Megasphaera elsdenii (ou seja, M. elsdenii) é um diplococo Gram-negativo não móvel, que utiliza lactato como uma fonte de carbono preferida e pode ajudar a evitar acidose, que é um distúrbio digestivo comum que afeta milhões de cabeças de gado de corte e leiteiro a cada ano.

[003] Quando gado e outros ruminantes ingerem grandes quantidades de alimentos ricos em amido (por exemplo, grãos de cereais) ou açúcares simples, micro-organismos oportunisticos no estômago podem fermentar rapidamente esses compostos em ácido lático. O ácido lático é um ácido orgânico potente e pode levar à acidose lática, que pode romper a atividade digestiva normal e causar danos extensos ao

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2/156 revestimento interno do trato digestivo em ruminantes. Os animais afetados possuem desempenho subótimo. E, a forma de acidose lática mais aguda pode causar danos irreversíveis aos sistemas digestivo e respiratório de um animal, bem como taxas de mortalidade aumentadas.

[004] M. elsdeníí pode ajudar a controlar a acidose lática pela habilidade da bactéria para converter ácido lático em ácidos graxos voláteis (VFA; por exemplo butirato, propionato e acetato), que são compostos orgânicos inócuos. Mas as populações de M. elsdeníí no trato gastrintestinal de ruminantes estão frequentemente em níveis muito baixos para evitar o risco de acidose. Consequentemente, uma cultura líquida de células vivas de uma cepa de M. elsdeníí, Lactipro®, foi desenvolvida para aumentar a taxa de colonização de M. elsdeníí no trato gastrintestinal de ruminantes. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.550.139. No entanto, há restrições práticas que limitaram o uso de produtos que contêm M. elsdeníí, incluindo a dificuldade de manutenção de produtos de M. elsdeníí sob as condições anaeróbicas necessárias pelo organismo e a dificuldade de transporte dos produtos de M. elsdeníí da instalação de produção até o local de uso final dentro de 14 dias já que, depois desse tempo, a viabilidade de M. elsdeníí no produto diminui significantemente.

[005] Embora a Patente U.S. N° 4.138.498 discuta de forma geral a liofilização potencial de M. elsdeníí, ela não fornece nenhum método para a produção de M. elsdeníí liofilizada que pudesse ser usado em uma escala comercial para superar as limitações comerciais existentes. Além disso, pelo menos um grupo relatou recentemente que a

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3/156 liofilização de micro-organismos, incluindo anaeróbios como, por exemplo, M. elsdeníí, não é comercialmente prática. Veja, por exemplo, WO 2017/015022.

[006] Portanto, há uma necessidade por células de Megasphaera, por exemplo, células de Megasphaera elsdeníí, incluindo métodos de produção das mesmas, que superem as limitações existentes. Há também uma necessidade por outras células microbianas, por exemplo, de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, Lactobacillus como, por exemplo, L. casei, Bacillus como, por exemplo, B. subtilis, Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae, incluindo métodos de produção das mesmas, que superem as limitações existentes.

BREVE SUMÁRIO DA REVELAÇÃO [007] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas que compreendem células de M. elsdeníí e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, sorbitol, manitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em

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4/156 que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.

[008] Em certas modalidades, as (pelo menos duas) fontes de carbono consistem em cerca de 50-90% de uma primeira fonte de carbono e cerca de 10-50% de uma segunda fonte de carbono, em que a segunda fonte de carbono é diferente da primeira fonte de carbono, e em que 100% das (pelo menos duas) fontes de carbono consistem na primeira fonte de carbono e na segunda fonte de carbono.

[009] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí, que compreende: (a) o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdeníí e um meio de crescimento, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas dentro de 12 horas após a cultura ter terminado sua fase de crescimento exponencial e antes da cultura ter começado sua fase de crescimento estacionária, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.

[010] Em certas modalidades, a coleta compreende pelo menos uma técnica selecionada do grupo que consiste em: centrifugação, filtração, diálise, osmose reversa, e combinações destas. Em certas modalidades, a filtração compreende filtração por fluxo tangencial.

[011] Em certas modalidades, a cultura compreende um líquido, e em que a coleta compreende a remoção de cerca de 60% até cerca de 100% do líquido.

[012] Em certas modalidades, o congelamento é em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C.

[013] A presente revelação é dirigida a um método de

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5/156 produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdenii, que compreende: (a) o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdenii e um meio de crescimento, (b) coleta das células, (c) congelamento das células em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C dentro de 5 horas da coleta, e (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdenii são produzidas.

[014] Em certas modalidades, o congelamento compreende o contato de um recipiente que compreende as células de M. elsdenii com nitrogênio liquido.

[015] Em certas modalidades, o congelamento compreende o contato das células com nitrogênio liquido.

[016] Em certas modalidades, o congelamento é em uma temperatura de cerca de -196°C e produz péletes congelados que compreendem as células, e em que o diâmetro dos péletes congelados é cerca de 0,19 até cerca de 0,5 pol (1,27 centímetro).

[017] Em certas modalidades, o pH da cultura de M. elsdenii antes da coleta está entre cerca de 4,5 até cerca de 7,0.

[018] Em certas modalidades, cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g das células liofilizadas de M. elsdenii são viáveis após armazenamento em uma temperatura de cerca de 25°C por pelo menos 2 semanas.

[019] Em certas modalidades, cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g das células liofilizadas de M. elsdenii são viáveis após armazenamento em torno de 4 °C por pelo menos 1 mês .

[020] Em certas modalidades, a cultura ainda compreende pelo menos um crioprotetor.

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6/156 [021] Em certas modalidades, o (pelo menos um) crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em: frutose, glicose, sacarose, leite em pó, fórmula infantil, leite desnatado, trehalose, maltodextrina, betaina, e combinações destes.

[022] Em certas modalidades, o (pelo menos um) crioprotetor está presente em uma quantidade cerca de 1% até cerca de 20% (p/v) da cultura.

[023] Em certas modalidades, a M. elsdeníí liofilizada é produzida em uma escala comercial.

[024] Em certas modalidades, o volume da cultura é pelo menos cerca de 50 litros.

[025] Em certas modalidades, cerca de 1 x 10³ até 1 x 10¹²CFU/g de células de M. elsdeníí são viáveis após liofilização.

[026] Em certas modalidades, as células na cultura consistem em células de M. elsdeníí.

[027] A presente revelação é dirigida a um aditivo alimentar sólido que compreende as células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por qualquer um dos métodos acima.

[028] Em certas modalidades, o aditivo alimentar sólido ainda compreende outro micro-organismo.

[029] Em certas modalidades, o aditivo alimentar sólido é selecionado do grupo que consiste em: um pó, um granulado, um particulado, um pélete, uma torta (cake), ou combinações destes.

[030] Em certas modalidades, o aditivo alimentar sólido é um probiótico.

[031] A presente revelação é dirigida a uma composição que compreende as células liofilizadas de M. elsdeníí

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7/156 produzidas por qualquer um dos métodos acima ou qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima.

[032] Em certas modalidades, a composição é uma cápsula.

[033] A presente revelação é dirigida a um kit que compreende as células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima.

[034] A presente revelação é dirigida a um método de administração de células de M. elsdeníí a um animal, que compreende a administração ao animal das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima.

[035] A presente revelação é dirigida a um método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima.

[036	] Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é
acidose.
[037	] Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é
acidose	ruminal.
[038	] Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é
doença respiratória	•
[039	] Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é

laminite.

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8/156 [040] Em certas modalidades, a condição ou distúrbio é uma infecção.

[041] Em certas modalidades, a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

[042] A presente revelação é dirigida a um método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdenii produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima.

[043] Em certas modalidades, o micro-organismo oportunistico é patogênico.

[044] Em certas modalidades, o micro-organismo oportunistico é Salmonella ou Campylobacter.

[045] A presente revelação é dirigida a um método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdenii produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima.

[046] A presente revelação é dirigida a um método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdenii produzidas por qualquer um dos métodos acima, qualquer um dos aditivos alimentares sólidos acima ou qualquer uma das composições acima, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal

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9/156 é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[047] Em certas modalidades, as células liofilizadas de M. elsdeníi, o aditivo alimentar sólido ou a composição é administrada antes, concomitantemente ou depois da alimentação do animal com um alimento.

[048] Em certas modalidades, o método ainda compreende a mistura das células liofilizadas de M. elsdeníi ou o aditivo alimentar sólido com um liquido antes da administração.

[049] Em certas modalidades, o liquido é administrado oralmente ou por pulverização do animal com o liquido.

[050] Em certas modalidades, a administração compreende uma única administração das células de M. elsdeníi, do aditivo alimentar ou da composição.

[051] Em certas modalidades, a administração compreende uma administração diária das células de M. elsdeníi, do aditivo alimentar ou da composição.

[052] Em certas modalidades, a administração compreende mais de uma administração das células de M. elsdeníi, do aditivo alimentar ou da composição em um único dia.

[053] Em certas modalidades, o animal é um ruminante.

[054] Em certas modalidades, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, carneiros, cabras, veados, búfalos e renas.

[055] Em certas modalidades, o animal é um não ruminante.

[056] Em certas modalidades, o não ruminante é selecionado do grupo que consiste em: equinos, aves

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domésticas e	suínos.
[057] Em doméstica.	certas	modalidades,	o animal	é uma ave
[ 058 ] Em	certas	modalidades,	a	ave	doméstica é
selecionada	do grupo	que consiste em	: uma	galinha, um ganso,
um pato, uma	codorna,	um peru ou um	pombo	•
[059] Em	certas	modalidades,	a	ave	doméstica é
selecionada	do grupo	que consiste em: um	frango, um galo e

uma poedeira.

[060]	Em	certas	modalidades	, a ave doméstica é uma
galinha.
[061]	Em	certas	modalidades,	o animal é um equino.
[062]	Em	certas	modalidades,	o equino é um cavalo, um

pônei, um asno ou uma mula.

[063] A presente revelação é dirigida a um método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de uma ave doméstica, que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí.

[064]	Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é
acidose.
[065]	Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é
doença respiratória	•
[066]	Em	certas	modalidades,	a	condição	ou	distúrbio	é

uma infecção.

[067] Em certas modalidades, a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

[068] A presente revelação é dirigida a um método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo

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11/156 oportunistico no trato gastrintestinal de uma ave doméstica, que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí.

[069] Em certas modalidades, o micro-organismo oportunistico é patogênico.

[070] Em certas modalidades, o micro-organismo oportunistico é Salmonella ou Campylobacter.

[071] A presente revelação é dirigida a um método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de uma ave doméstica, que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí.

[072] A presente revelação é dirigida a um método de aumento do desempenho de crescimento em uma ave doméstica, que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de ovos, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[073] Em certas modalidades, a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: uma galinha, um ganso, um pato, uma codorna, um peru ou um pombo.

[074] Em certas modalidades, a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: um frango, um galo e uma poedeira.

[075] Em certas modalidades, a ave doméstica é uma galinha.

[076] A presente revelação é dirigida a um método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio

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12/156 associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de um equino, que compreende a administração ao equino de

uma quantidade eficaz de células	de a	M. elsdenii.
[077]	Em	certas	modalidades,	condição ou	distúrbio	é
acidose.
[078]	Em	certas	modalidades,	a	condição ou	distúrbio	é

doença respiratória.

[079]	Em	certas	modalidades,	a condição	ou distúrbio	é
laminite.
[080]	Em	certas	modalidades,	a condição	ou distúrbio	é

uma infecção.

[081] Em certas modalidades, a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

[082] A presente revelação é dirigida a um método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um equino, que

compreende a administração ao equino de	uma	quantidade eficaz
de células de	M. elsdenii.
[ 083 ] Em	certas modalidades,	o	micro-organismo
oportunistico	é patogênico.
[ 084 ] Em	certas modalidades,	o	micro-organismo

oportunistico é Salmonella ou Campylobacter.

[085] A presente revelação é dirigida a um método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de um equino, que compreende a administração ao equino de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii.

[086] A presente revelação é dirigida a um método de aumento do desempenho de crescimento em um equino, que compreende a administração ao equino de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii, em que o desempenho de crescimento

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13/156 aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[087] Em certas modalidades, o equino é um cavalo, um pônei, um asno ou uma mula.

[088] Em certas modalidades, um aditivo alimentar compreende as células de M. elsdeníí.

[089] Em certas modalidades, o aditivo alimentar é um pó, granulado, particulado, pélete, torta, liquido, gel, ou combinações destes.

[090] Em certas modalidades, uma composição compreende as células de M. elsdeníí ou um aditivo alimentar que compreende as células.

[091] Em certas modalidades, a composição é uma cápsula.

[092] Em certas modalidades, as células de M. elsdeníí são células liofilizadas.

[093] Em certas modalidades, as células de M. elsdeníí são administradas em um liquido.

[094] Em certas modalidades, o método ainda compreende a reidratação de um aditivo alimentar ou células liofilizadas para produzir o liquido.

[095] Em certas modalidades, o liquido é administrado por gavagem oral ou por pulverização do animal com o liquido.

[096] Em certas modalidades, as células de M. elsdeníí são administradas antes, concomitantemente ou depois da alimentação do animal com um alimento.

[097] Em certas modalidades, a administração compreende uma única administração das células de M. elsdeníí.

[098] Em certas modalidades, a administração compreende

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14/156 uma administração diária das células de M. elsdeníí.

[099] Em certas modalidades, a administração compreende mais de uma administração das células de M. elsdeníí em um único dia.

[100] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas que compreendem células de Megasphaera e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas, (c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera são produzidas.

[101] Em certas modalidades, o método compreende a administração ao animal de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera.

[102] Em certas modalidades, o método de aumento do desempenho de crescimento em um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera.

[103] Em certas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no

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15/156 ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[104] Em certas modalidades, o método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera.

[105] Em certas modalidades, a composição compreende células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera.

[106] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais que compreendem células bacterianas anaeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹²CFU/g de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas são produzidas.

[107] Em certas modalidades, o método compreende a

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16/156 administração ao animal de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[108] Em certas modalidades, o método de aumento do desempenho de crescimento em um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[109] Em certas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[110] Em certas modalidades, o método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[111] Em certas modalidades, a composição compreende células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[112] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais que compreendem células bacterianas anaeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseina, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de

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17/156 soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais, (c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas são produzidas.

[113] Em certas modalidades, o método compreende a administração ao animal de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[114] Em certas modalidades, o método de aumento do desempenho de crescimento em um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[115] Em certas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[116] Em certas modalidades, o método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[117] Em certas modalidades, a composição compreende células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[118] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas

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18/156 liofilizadas, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições aeróbicas que compreende células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas e um meio de crescimento

que compreende pelo	menos duas	fontes de	carbono selecionadas
do grupo	que consiste em:	caseína,	lactato, dextrose,
frutose,	frutano,	glicose,	sacarose,	lactose, maltose,
acetato,	glicerol,	manitol,	sorbitol,	sacarose, xilose,

melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹²CFU/g de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas liofilizadas são produzidas.

[119] Em certas modalidades, o método compreende a administração ao animal de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas.

[120] Em certas modalidades, o método de aumento do desempenho de crescimento em um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas.

[121] Em certas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[122] Em certas modalidades, o método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo

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19/156 oportunistico no trato gastrintestinal de urn animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas.

[123] Em certas modalidades, a composição compreende células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas.

[124] A presente revelação é dirigida a um método de produção de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas, que compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições aeróbicas que compreende células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína,

lactato,	dextrose,	frutose,	frutano,	glicose,	sacarose,
lactose,	maltose,	acetato,	glicerol,	manitol,	sorbitol,
sacarose,	xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma
gordura,	um óleo,	glicerol,	acetato	de sódio,	arabinose,
proteína	de soja,	proteína	solúvel,	rafinose,	amilose,

amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições aeróbicas, (c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas são produzidas.

[125] Em certas modalidades, o método compreende a administração ao animal de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[126] Em certas modalidades, o método de aumento do

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20/156 desempenho de crescimento em um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[127] Em certas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

[128] Em certas modalidades, o método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um animal compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas.

[129] Em certas modalidades, a composição compreende células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS/FIGURAS [130] A FIG. 1 mostra o efeito da temperatura de armazenamento sobre a viabilidade de culturas liquidas de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 ao longo de um periodo de 28 dias em termos de rendimento de células de M. elsdeníí em unidades formadoras de colônia por mililitro (CFU/ml) em escala logaritmica (LoglO) .

[131] A FIG. 2 mostra a viabilidade de culturas liquidas de M. elsdeníí NCIMB 41125 após 0, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento em temperatura ambiente em termos de rendimento de células de M. elsdeníí em CFU/ml em escala

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LoglΟ .

[132] A FIG. 3 mostra uma representação esquemática de um sistema de filtração por fluxo tangencial (TFF).

[133] A FIG. 4 mostra o rendimento de células de M. elsdeníí em CFU/ml de retentado no eixo-y em escala LoglO após processamento através do sistema de TFF. 0 eixo-x indica uma redução de volume de 70%, 80% ou 90% pelo sistema. Alvo se refere à recuperação teórica de células de M. elsdeníí após processamento por TFF. Cone. se refere à recuperação real de células de M. elsdeníí no retentado, que é o volume de células concentradas que permanece após as reduções de volume anotadas.

[134] A FIG. 5 mostra a perda de células após congelamento de células a -80°C ou em nitrogênio liquido (LiqN) e liofilização de células usando um ciclo lento (38 horas a 135 mTorr) ou rápido (18,5 horas a 250 mTorr). As células eram de retentados após redução de volume de 70%, 80% ou 90% com TFF de culturas que possuem Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM) ou trehalose 8%/leite desnatado 15% (T/SM) como crioprotetores.

[135] A FIG. 6 mostra o rendimento de células de M. elsdeníí NCIMB 41125 após um congelamento inicial rápido (nitrogênio liquido) ou lento (-20°C), seguido por liofilização (na presença de maltodextrina 15% e trehalose 0% ou 7,5%.

[136] A FIG. 7 mostra a perda de células observada em células de M. elsdeníí NCIMB 41125 congeladas com ou sem trehalose 4% ou leite desnatado 7,5% a -80°C ou em nitrogênio liquido (LiqN).

[137] A FIG. 8 mostra a perda de células observada em

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22/156 amostras liofilizadas obtidas de retentado com redução de volume de 90%, misturado com trehalose 8%/leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM),

congeladas a -80°C	ou	em nitrogênio	liquido (LiqN)	r θ
liofilizadas usando	o	ciclo rápido	e	armazenadas	em
temperatura ambiente	ou	4°C sob condições	anaeróbicas	por

até 24 semanas.

[138] A FIG. 9 mostra a perda de células observada em amostras liofilizadas obtidas de retentado com redução de volume de 90%, misturado com trehalose 8%/leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM),

congeladas	a -80°C	ou	em	nitrogênio liquido (LiqN),	e
liofilizadas usando	o	ciclo	rápido e armazenadas	em
temperatura	ambiente	ou 4	°C	sob	condições anaeróbicas por	24
semanas.	Barras	sem		um	sobrescrito comum	são

estatisticamente diferentes, P < 0,02.

[139] A FIG. 10 mostra curvas de crescimento realizadas em produto não liofilizado ou liofilizado reidratado obtido de retentado com redução de volume de 90%, misturado com trehalose 8%/leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM), congelado em nitrogênio liquido (LiqN), e liofilizado usando o ciclo rápido após 12, 16, 20 ou 24 semanas de armazenamento sob condições anaeróbicas a 4 ou 25°C. A densidade óptica (OD) é mostrada a 600 nanômetros (nm) como medida de 0 hora até 20 horas. Linhas amarelas = não liofilizado, Linhas vermelhas = T/SM, Linhas azuis = M/SM, Linhas pontilhadas = armazenado a 4°C, e Linhas cheias = armazenado a 25°C.

[140] A FIG. 11 mostra M. elsdeníí em CFU por grama (CFU/g) em escala LoglO de frascos liofilizados

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23/156 armazenados a 4 °C por até 11 meses. Cada ponto de dados corresponde ao rendimento médio de 3 frascos de 2 rodadas de criodessecação diferentes (total de 6 frascos).

[141] A FIG. 12 mostra a concentração de M. elsdeníí (CFU/cabeça/dia) em produto liofilizado dado diariamente como um tratamento aplicado em cobertura (ou seja, um tratamento adicionado a uma ração animal por misturação do tratamento na ração ou colocação do tratamento em cima da ração). A semana da amostragem é mostrada no eixo-x, efeito da amostragem, P < 0,0001. A linha horizontal sólida representa a concentração-alvo de M. elsdeníí (CFU/cabeça/dia) a ser liberada diariamente.

[142] A FIG. 13 mostra a concentração de M. elsdeníí em milho moldo aplicado em cobertura com produto liofilizado e exposto por 0 a 4 horas às condições atmosféricas no laboratório em temperatura ambiente sem exposição direta ao sol (Interior) ou fora em temperaturas diárias médias de até 95 °F (35 °C) com exposição direta ao sol (Exterior). Efeito combinado do tempo de exposição e condições de armazenamento, P = 0,0007; Efeito do tempo de exposição, P < 0,0001; Efeito das condições de condições, P < 0,0001.

[143] A FIG. 14 mostra a concentração de endotoxina (EU/ml) em amostras de liquido do rúmen (medida como um indicador de Use bacteriana no rúmen) obtidas 26 horas após a primeira alimentação para cada grupo: Grupo de controle (não recebeu M. elsdeníí) , Grupo não liofilizado (recebeu 50 ml de cultura liquida de M. elsdeníí contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí), Grupo reidratado (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí) e Grupo de aplicação em

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24/156 cobertura (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníi, e também recebeu produto liofilizado de M. elsdeníí incorporado como uma aplicação em cobertura diária contendo 10⁸ CFU de M. elsdeníí). Efeito do tratamento, P = 0,3462 .

[144] A FIG. 15 mostra pH ruminal medido em intervalos de 1 hora para cada grupo: Grupo de controle (não recebeu M. elsdeníí), Grupo não liofilizado (recebeu 50 ml de cultura líquida de M. elsdeníí contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníi) _rGrupo reidratado (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí) e Grupo de aplicação em cobertura (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí, e recebeu produto liofilizado de M. elsdeníí incorporado como uma aplicação em cobertura diária contendo 10⁸ CFU de M. elsdeníí) . Efeito combinado de tratamento e dia, P < 0,001, Efeito do tratamento, P < 0,001, Efeito do dia, P < 0,001. Erro Padrão da Média (SEM) = 0,041.

[145] A FIG. 16 mostra alterações na densidade óptica a 600 nm de um meio semidefinido de lactato inoculado com líquido ruminal para cada grupo: Grupo de controle (não recebeu M. elsdeníí), Grupo não liofilizado (recebeu 50 ml de cultura líquida de M. elsdeníí contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí), Grupo reidratado (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí) e Grupo de aplicação em cobertura (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de

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M. elsdeníí, e também recebeu produto liofilizado de M. elsdeníí incorporado como uma aplicação em cobertura diária contendo 10⁸ CFU de M. elsdeníí) . Efeito combinado de tratamento e tempo, P < 0,02; Efeito do tratamento, P < 0,01; Efeito do tempo, P < 0,01. SEM = 0,04.

[146] A FIG. 17 mostra as alterações na concentração de L-lactato (mM) de um meio semidefinido de lactato inoculado com micróbios ruminais mistos para cada grupo: Grupo de controle (não recebeu M. elsdeníí), Grupo não liofilizado (recebeu 50 ml de cultura líquida de M. elsdeníí contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí), Grupo reidratado (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí) e Grupo de aplicação em cobertura (recebeu cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração, contendo 10¹⁰ CFU de M. elsdeníí, e também recebeu produto liofilizado de M. elsdeníí incorporado como uma aplicação em cobertura diária contendo 10⁸ CFU de M. elsdeníí). As barras a, b e c com sobrescritos diferentes são estatisticamente diferentes umas das outras, P < 0,05.

[147] A FIG. 18 mostra a atividade de fitase em células de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125. O eixo-x indica amostras de células retiradas de culturas de células de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 desde o início da cultura (0 hora) e em intervalos de 2 horas posteriormente, ou seja, em 2, 4, 6 e 8 horas após o início da cultura. A atividade de fitase é mostrada no eixo-y como a quantidade de fósforo inorgânico liberada de péletes de células das amostras em micromol por minuto (pmol de P liberado/min). Atividade de fitase em células cultivadas em meios contendo fosfato

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26/156 inorgânico (KH2PO4) é mostrada em cinza claro, enquanto a atividade de fitase em células cultivadas em meios contendo fitato é mostrada em cinza escuro.

[148] A FIG. 19 mostra o efeito de Megasphaera elsdeníí sobre a concentração de Salmonella em amostras cecais de frangos de corte com 15 dias de idade. 0 eixo-x indica tratamento sem Megasphaera elsdeníí (Controle), acesso livre ad libitum a alimentadores de garrafa contendo Megasphaera elsdeníí liquida (Ad Libitum), Megasphaera elsdeníí liofilizada diária (Liofilizada), ou uma gavagem oral de Megasphaera elsdeníí liquida no dia 0. O eixo-y indica a concentração de Salmonella em unidades formadoras de colônia por mililitro (CFU/ml) em escala LoglO para os grupos de tratamento.

[149] A FIG. 20 mostra a prevalência de Salmonella em amostras cecais de frangos de corte com 15 dias de idade. O eixo-x mostra os grupos de tratamento. O eixo-y indica a percentagem de amostras cecais que eram positivas para Salmonella.

[150] A FIG. 21 mostra a conversão alimentar (eixo-y) em frangos de corte com 18 dias de idade tratados sem Megasphaera (Controle) ou com Megasphaera elsdeníí (Liofilizada). A conversão alimentar é uma proporção da ração total consumida para o peso total ganho.

[151] A FIG. 22 mostra o pH em amostras cecais de cavalos tratados sem Megasphaera elsdeníí (Controle), um esguicho oral de Megasphaera elsdeníí (Esguicho) no dia 1 de cada periodo de tratamento de 7 dias, ou Megasphaera elsdeníí liofilizada diária (Liofilizada).

[152] A FIG. 23 mostra o crescimento de cepas de M.

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27/156 elsdeníí (NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262 e NCIMB 702410) em meios semidefinidos contendo lactato 70% e glicose 30%.

[153] A FIG. 24 mostra o crescimento de cepas de M. elsdeníí (NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262 e NCIMB 702410) em meios semidefinidos contendo lactato 60% e glicose 40%.

[154] A FIG. 25 mostra o crescimento de cepas de M. elsdeníí (NCIMB 41125, ATCC 25940, NCIMB 702261, NCIMB 702262 e NCIMB 702410) em meios semidefinidos contendo lactato 40% e glicose 60%.

[155] A FIG. 26 mostra a estabilidade de M. elsdeníí liofilizada encapsulada usando o método 2 e armazenada em temperatura ambiente em um ambiente aeróbico.

[156] A FIG. 27 mostra a estabilidade de M. elsdeníí liofilizada encapsulada usando o método 3 e armazenada em temperatura ambiente em um ambiente aeróbico.

[157] A FIG. 28 mostra a concentração de M. elsdeníí NCIMB 41125 (LoglO CFU/Bolsa) em produto liofilizado armazenado em bolsa de Mylar com (M.e. + Maltodextrina) ou sem maltodextrina (M.e.) a 4,44 ou 23,88°C.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [158] A presente invenção está relacionada às células de Megasphaera elsdeníí, métodos para a produção de células de M. elsdeníí, aditivos alimentares e composições que compreendem as células, e usos que envolvem a administração das células a animais incluindo, por exemplo, para o desempenho de crescimento e/ou saúde aumentados. A presente invenção também está relacionada às células microbianas incluindo, sem limitação, bactérias aeróbicas, bactérias

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28/156 anaeróbicas e leveduras e, por exemplo, Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici , Lactobacillus como, por exemplo, L. casei, Bacillus como, por exemplo, B. subtilis, Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae, e métodos para a produção de células microbianas, aditivos alimentares e composições que compreendem as células microbianas, e usos que envolvem a administração das células microbianas a animais incluindo, por exemplo, para o desempenho de crescimento e/ou saúde aumentados.

[159] Todas as publicações, patentes e outras referências mencionadas nesse relatório descritivo são incorporadas por referência em suas totalidades para todas as finalidades como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. Além disso, citação ou identificação de qualquer referência nesse pedido não deve ser considerada como uma admissão de que essa referência esteja disponível como técnica estabelecida para a presente invenção.

Terminologia [160] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem os mesmos significados como comumente subentendidos por aqueles habilitados na técnica à qual essa invenção pertence. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. Salvo quando exigido pelo contexto, termos no singular devem incluir pluralidades e

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29/156 termos no plural devem incluir o singular.

[161] Na medida em que cabeçalhos de seções sejam usados, eles não devem ser considerados como necessariamente limitantes.

[162] Como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular um, uma, o e a incluem referências no plural, salvo quando o contexto determinar claramente em contrário. Por exemplo, o termo um composto ou pelo menos um composto pode incluir diversos compostos, incluindo misturas destes. Os termos um, uma, o, a, um ou mais e pelo menos um, por exemplo, podem ser usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo.

[163] Como usado nesse relatório descritivo, o termo cerca de, quando usado para modificar uma quantidade relacionada à invenção, se refere à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, por meio de testagem e manipulação de rotina; por meio de erro inadvertido nessa testagem e manipulação; por meio de diferenças na fabricação, fonte ou pureza de ingredientes empregados na invenção; e semelhantes. Se modificadas ou não pelo termo cerca de, as reivindicações incluem equivalentes das quantidades citadas. Em algumas modalidades, o termo cerca de significa mais ou menos 10% do valor numérico relatado.

[164] Ao longo desse pedido, várias modalidades dessa invenção podem ser apresentadas em um formato de faixa. Deve ser subentendido que a descrição em formato de faixa é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser considerada como uma limitação inflexível do escopo da invenção. Consequentemente, a descrição de uma faixa deve

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30/156 ser considerada como tendo especificamente revelado todas as subfaixas possíveis, bem como valores numéricos individuais dentro daquela faixa. Por exemplo, a descrição de uma faixa, por exemplo, de 1 a 6, deve ser considerada como tendo revelado especificamente subfaixas como, por exemplo, de 1 a2, dela3, de 1 a 4, dela5, de2a3, de2a4, de 2 a5, de2a6, de3a4, de3a5, de3a6 etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.

[165] Os termos compreende, que compreende, inclui, que inclui, que possui e seus conjugados são intercambiáveis e significam que inclui, sem limitação. Subentende-se que sempre que são descritos nesse relatório descritivo aspectos com a linguagem que compreende, aspectos de outro modo análogos descritos em termos de que consiste em e/ou que consiste basicamente em também são fornecidos.

[166] O termo que consiste em significa que inclui e limitado a.

[167] O termo que consiste basicamente em significa o material especificado de uma composição, ou as etapas especificadas de um método, e aqueles materiais ou etapas adicionais que não afetam materialmente as características básicas do material ou método.

[168] O termo e/ou, quando usado nesse relatório descritivo, deve ser considerado como revelação específica de cada uma das duas características ou componentes especificadas, com ou sem a outra. Dessa forma, o termo e/ou, como usado em uma frase como, por exemplo, A e/ou

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B visa incluir nesse relatório descritivo A e B, A ou B, A (isoladamente), e B (isoladamente) . Da mesma forma, o termo e/ou, como usado em uma frase como, por exemplo, A, B e/ou C visa englobar cada um dos seguintes aspectos: A, B e C; A, B ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isoladamente); B (isoladamente); e C (isoladamente).

[169] Os termos cultura, para cultivar e cultivo, como usados nesse relatório descritivo, significam incubar células sob condições in vitro que permitem o crescimento ou divisão da célula ou manter as células em um estado vivo. 0 termo uma cultura também pode ser usado nesse relatório descritivo para se referir às células incubadas sob condições in vitro (por exemplo, células incubadas em um meio de crescimento liquido).

[170] O termo probiótico, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um ou mais micro-organismos vivos (bactérias e/ou leveduras) e pode ou não incluir outros ingredientes, que, quando administrados em quantidades adequadas, podem conferir um beneficio de saúde, digestivo e/ou de desempenho no animal ou indivíduo.

[171] O termo produto de aditivo microbiano, como usado nesse relatório descritivo, se refere a um produto que contém um ou mais micro-organismos vivos (bactérias e/ou leveduras) e pode ou não incluir outros ingredientes que podem ser administrados ao animal ou indivíduo em misturas de ração, bolos e/ou pastas orais e, quando administrados em quantidades adequadas, podem conferir um benefício para a saúde no animal ou indivíduo.

[172] O termo aditivo alimentar, como usado nesse

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32/156 relatório descritivo, se refere a um ou mais ingredientes, produtos ou substâncias (por exemplo, células), usados isoladamente ou juntos, em nutrição (por exemplo, para aumentar a qualidade de um alimento (por exemplo, uma ração animal), para aumentar o desempenho e saúde de um animal, e/ou para aumentar a digestibilidade de um alimento ou materiais dentro de um alimento). Um aditivo alimentar pode ser, por exemplo, um probiótico.

[173] Os termos meios de crescimento e meios de cultura, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma composição sólida (por exemplo, ágar), semi-sólida (por exemplo, ágar) ou liquida (por exemplo, caldo) que contém componentes para dar suporte ao crescimento de células.

[174] Os termos coletar e coleta, como usados nesse relatório descritivo, se referem à coleta de células de uma cultura, por exemplo, coleta de células em meios de crescimento da cultura, coleta de células por remoção de uma quantidade dos meios de crescimento das células (por exemplo, por concentração das células em uma cultura liquida ou separação das células dos meios de crescimento), ou interrupção do cultivo das células. Os termos incluem a coleta ou remoção de um volume de liquido que compreende as células de uma cultura liquida, incluindo um volume no qual as células foram concentradas.

[175] 0 termo isolado, como usado nesse relatório descritivo, não reflete necessariamente a extensão até a qual um isolado foi purificado, mas indica o isolamento ou separação de uma forma nativa ou ambiente nativo. Um isolado pode incluir, sem limitação, um micro-organismo isolado, uma

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33/156 biomassa isolada ou uma cultura isolada.

[176] 0 termo quantidade eficaz, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma quantidade que obtém um resultado desejado.

[177] Como usada nesse relatório descritivo, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade clinicamente eficaz se refere a uma quantidade que obtém um resultado terapêutico desejado incluindo, por exemplo, uma quantidade usada isoladamente ou em combinação com outros componentes. Um resultado terapêutico pode ser, por exemplo, redução de sintomas, sobrevida prolongada, mobilidade aumentada, e semelhantes. Um resultado terapêutico não precisa ser uma cura.

[178] Como usado nesse relatório descritivo, excipiente se refere a um componente, ou mistura de componentes, que é usado para gerar características desejadas a um aditivo alimentar, alimento ou composição como revelada nesse relatório descritivo. Um excipiente da presente invenção pode ser descrito como um excipiente farmaceuticamente aceitável quando adicionado a uma composição farmacêutica, o que significa que o excipiente é um composto, material, composição, sal e/ou forma de dosagem que é, dentro do escopo de uma avaliação médica sólida, adequada para contato com tecidos de animais (ou seja, humanos e animais não humanos) sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outras complicações problemáticas ao longo da duração de contato desejada compatível com uma proporção risco/benefício razoável.

[179] Os termos tratar, que trata e tratamento se referem tanto ao tratamento terapêutico quanto às medidas

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34/156 profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é evitar ou tornar mais lenta (reduzir) uma condição fisiológica indesejada, doença ou distúrbio, ou para obter resultados fisiológicos benéficos ou desejados (por exemplo, resultados clínicos, médicos e/ou veterinários) . Para as finalidades dessa invenção, resultados benéficos ou desejados incluem, sem limitação, alívio ou eliminação dos sinais ou sintomas associados a uma condição, doença ou distúrbio; diminuição da extensão de uma condição, doença ou distúrbio; estabilização de uma condição, doença ou distúrbio, (ou seja, quando a condição, doença ou distúrbio não piora); retardo no surgimento ou progressão da condição, doença ou distúrbio; melhora da condição, doença ou distúrbio; remissão (seja ela parcial ou total e detectável ou indetectável) da condição, doença ou distúrbio; ou melhoria ou aprimoramento de uma condição, doença ou distúrbio. Tratamento inclui a provocação de uma resposta fisiologicamente significante, sem efeitos colaterais excessivos. Tratamento também inclui o prolongamento da sobrevida, quando comparada com a sobrevida esperada se não recebe o tratamento.

[180] Como usados nesse relatório descritivo, os termos prevenir e prevenção se referem ao retardo parcial ou completo do surgimento de uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição; ao retardo parcial ou completo do surgimento de um ou mais sinais, sintomas, características ou manifestações (por exemplo, sinais clínicos ou fisiológicos, sintomas, características ou manifestações) de uma infecção, doença, distúrbio e/ou condição particular; ao retardo parcial ou completo da progressão de uma infecção, uma doença, distúrbio e/ou condição particular; e/ou à

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35/156 diminuição do risco de desenvolvimento de uma patologia associada com a infecção, a doença, distúrbio e/ou condição.

[181] Como usado nesse relatório descritivo, o termo rendimento se refere à quantidade de células vivas, ou viáveis, incluindo a quantidade em um volume particular (por exemplo, unidades formadoras de colônia por mililitro

(CFU/ml	) ) ou	. em um	peso (particular	por	exemplo,	CFU por
grama (	CFU/g	) ) ·
[182	] Como	usado	nesse relatório	descritivo,	o te rmo
viável	se refere a	um organismo ou	organismos vivos (por
exemplo,	uma	célula	microbiana que	está	viva ou	células

microbianas que estão vivas). Viabilidade se refere à habilidade para viver, especialmente sob certas condições.

[183] Como usados nesse relatório descritivo, os termos purificar, purificada e purificação significam tornar substancialmente puro ou limpar de componentes indesejados, materiais degradados, misturados ou com imperfeições.

[184] Os termos invenção e revelação podem ser usados de forma intercambiável quando na descrição ou são usados, por exemplo, nas frases a presente invenção ou a presente revelação.

[185] Os termos animal ou indivíduo se referem a qualquer organismo que pertence ao reino Animalia e incluem, sem limitação, animais aquáticos e animais terrestres como, por exemplo, peixes; peixes comerciais; peixes ornamentais; larvas de peixes; bivalvulados; moluscos; crustáceos; frutos do mar; camarão; camarão larval; artêmias; rotíferas; camarão de água salgada; coletores-filtradores; anfíbios; répteis; mamíferos; humanos; animais não humanos; animais domésticos; animais de criação; animais de zoológico;

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36/156 animais de esporte; animais de raça para reprodução; animais de corrida; animais de exibição; animais de herança; animais raros ou em extinção; animais de companhia; animais de estimação como, por exemplo, cães, gatos, porquinhos-daíndia, coelhos, ratos, camundongos ou cavalos; primatas como, por exemplo, macacos (por exemplo, macacos-prego, rhesus, macaco verde africano, macacos-pata, Cynomolgus e Cercopíthecus), gorilas, orangotangos, babuínos, gibões e chimpanzés; canídeos como, por exemplo, cães e lobos; felídeos como, por exemplo, gatos, leões e tigres; equídeos como, por exemplo, cavalos, pôneis, asnos, mulas e zebras; animais de produção como, por exemplo, vacas, búfalos, gado, porcos, aves domésticas e carneiros; ungulados como, por exemplo, veados e girafas; aves (ou seja, pássaros); aves domésticas como, por exemplo, galinhas, gansos, patos, codornas, perus, pombos, emas, avestruzes, e qualquer outro pássaro usado como um alimento ou animal de criação, incluindo frangos, galos e poedeiras; roedores como, por exemplo, camundongos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia; e assim por diante. Uma ração animal inclui, sem limitação, uma ração de aquacultura, uma ração doméstica, incluindo uma ração de animal de estimação, uma ração animal zoológica, uma ração de animal de trabalho, uma ração de animais de criação, e combinações destas. Um alimento inclui ração animal e alimento humano.

[186] Observa-se que certas características da invenção, que são descritas, para maior clareza, no contexto de modalidades separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma modalidade única. Inversamente, várias características da invenção, que são descritas, por

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37/156 brevidade, no contexto de uma modalidade única, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequado em qualquer outra modalidade descrita da invenção. Certas características descritas no contexto de várias modalidades não devem ser consideradas características essenciais daquelas modalidades, a menos que a modalidade seja inoperante sem aqueles elementos.

[187] Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos nesse relatório descritivo possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. Os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos, e não têm o objetivo de serem limitantes. Outras características e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações.

Megasphaera elsdenii [188] Células de Megasphaera elsdenii de qualquer cepa ou qualquer combinação de cepas podem ser usadas na invenção descrita nesse relatório descritivo.

[189] Uma cepa ou cepas de M. elsdenii podem ser selecionadas de uma coleção de culturas de estoque (por exemplo, coleção de culturas da American Type Culture Collection (ATCC®), National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria (NCIMB), National Collection of Type Cultures (NCTC), American Research Service (ARC) (ou seja, NRRL), coleção de culturas do National Institute of Animal Health (ΝΤΑΗ) ) , ou podem ser uma cepa que foi isolada de uma fonte natural (por exemplo, do trato gastrintestinal de um ruminante).

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38/156 [190] Exemplos de cepas de M. elsdeníí que podem ser selecionadas de uma coleção de culturas incluem, sem limitação, as cepas listadas por números de depósito na Tabela 1. Designações alternativas dos números de depósito também são indicadas.

Tabela 1. Exemplos de cepas de M. elsdeníí e fontes de cada cepa.

Número de depósito	Designações alternativas	Fonte da cepa
ATCC® 25940	NCIMB 8927; BE2-2083	Rúmen de carneiros
ATCC® 17752	B159; NCIMB 702409; NCD02409	N/A
ATCC® 17753	T81; NCIMB 702410; NCD02410	N/A
NCIMB 702261	A17-2; A12-2’; NCD02261	Fezes de adultos humanos
NCIMB 702262	S17-3; NCD02262	Fezes suínas juvenis
NCIMB 702264	LC1	N/A
NCIMB 702331	LC1; NCD02263; NCD02264; NCD02331;	N/A
NCIMB 41125		Rúmen de vaca leiteira
NCIMB 41787		Rúmen de vaca leiteira
NCIMB 41788		Rúmen de vaca leiteira
NRRL 18624		Rúmen de bovino
NIAH 1102		N/A

[191] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa que possui um número de depósito selecionado do grupo que consiste em: ATCC® 25940, ATCC® 17752, ATCC® 17753, NCIMB 702261, NCIMB 702262, NCIMB 702264, NCIMB 702331, NCIMB 702409, NCIMB 702410, NCIMB 41125, NCIMB 41787, NCIMB 41788, NRRL 18624, NIAH 1102, e combinações destes, incluindo qualquer uma das designações alternativas na

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Tabela 1.

[192] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa isolada de um ruminante (por exemplo, uma vaca). Veja, por exemplo, Patente U.S. N° 7.550.139.

[193] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa isolada de um não ruminante (por exemplo, um humano).

[194] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa selecionada quanto à utilização de lactato (por exemplo, uma cepa que utiliza lactato na presença de açúcares), resistência a antibióticos ionóforos, taxa de crescimento relativamente alta, capacidade para produzir predominantemente acetato, capacidade para proliferar em valores de pH abaixo de 5,0 e de apenas 4,5, produção de ácidos graxos voláteis (VFAs), atividade de fitase, e combinações destes. Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.550.139.

[195] Em algumas modalidades, uma cepa selecionada quanto à utilização de lactato utiliza lactato como uma fonte de carbono preferida na presença de um carboidrato solúvel (por exemplo, glicose e/ou maltose). A utilização de lactato pode ser determinada, por exemplo, com base no crescimento em um meio contendo lactato e desprovido de carboidratos solúveis, quando comparado com o mesmo meio suplementado com carboidratos solúveis.

[196] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa com uma taxa de crescimento alta, quando comparada com outras cepas. As taxas de crescimento de diferentes cepas podem ser determinadas, por exemplo, por cultivo das células em um meio liquido e monitoramento do

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40/156 aumento da densidade óptica ao longo do tempo.

[197] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa capaz de produção de VFAs, o que pode ser determinado, por exemplo, por cromatografia a gás. Em algumas modalidades, o VFA é um ácido graxo de 6 carbonos que é capaz de inibição do crescimento de Salmonella e/ou Campylobacter. Em algumas modalidades, o VFA é ácido capróico. Em algumas modalidades, a Salmonella é Salmonella enteríca e/ou Salmonella bongorí. Em algumas modalidades, o sorotipo de Salmonella é Salmonella Typhimuríum e/ou Entirítidís. Em algumas modalidades, o Campylobacter é Campylobacter jejuni ou Campylobacter coll.

[198] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de uma cepa com atividade de fitase.

[199] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41125. Essa cepa de Megasphaera elsdeníí possui uma taxa de crescimento especifico alta (0,94 gerações/hora), é capaz de crescimento em uma faixa de pH de 4,5 a 6,5 ou mais, usa D- e L-Lactato como seu substrato preferido, mas também possui a habilidade para utilizar glicose e outros carboidratos, e tolera ionóforos .

[200] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41787. Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41788.

[201] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são de Megasphaera elsdeníí cepa ATCC® 25940.

[202] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí são derivadas de uma cepa selecionada de uma coleção de

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41/156 culturas de estoque ou isoladas de uma fonte natural. Células que são derivadas de uma cepa podem ser um derivado natural ou artificial como, por exemplo, um subisolado, um mutante, uma variante ou uma cepa recombinante.

Preparação de uma cultura que compreende células anaeróbicas, aeróbicas e/ou de levedura [203] M. elsdenii é uma bactéria anaeróbica que deve ser cultivada sob condições anaeróbicas rigorosas a fim de obter rendimento e viabilidade máximos.

[204] Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de M. elsdenii e um meio de crescimento.

[205] Em algumas modalidades, a cultura compreende uma ou mais cepas de células de M. elsdenii. Em algumas modalidades, a cultura compreende uma única cepa de células de M. elsdenii. Em algumas modalidades, a cultura consiste em uma ou mais cepas de células de M. elsdenii (ou seja, as células na cultura consistem em células de M. elsdenii, por exemplo, uma ou mais cepas de células de M. elsdenii) . Em algumas modalidades, a cultura consiste em uma única cepa de células de M. elsdenii.

[206] Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de Megasphaera e um meio de crescimento.

[207] Em algumas modalidades, uma cultura compreende células bacterianas anaeróbicas e um meio de crescimento. Em algumas modalidades, a cultura compreende células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L.

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42/156 casei e um meio de crescimento.

[208] Em algumas modalidades, uma cultura compreende células bacterianas aeróbicas e um meio de crescimento. Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis e um meio de crescimento.

[209] Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de levedura e um meio de crescimento. Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae.

[210] Vários parâmetros de fermentação para inoculação, crescimento e coleta de células microbianas podem ser usados, incluindo fermentação continua (ou seja, cultura continua) ou fermentação de batelada (ou seja, cultura de batelada). Veja, por exemplo, a Patente U.S. N° 7.550.139.

[211] Os meios de crescimento para células microbianas podem ser um sólido, semi-sólido ou liquido. Um meio pode conter nutrientes que fornecem elementos essenciais e fatores específicos que permitem o crescimento. Diversos meios microbiológicos e variações são bem conhecidos na técnica. Meios podem ser adicionados a uma cultura em qualquer momento, incluindo no início da cultura, durante a cultura, ou intermitentemente/continuamente.

[212] Exemplos de meios de crescimento incluem, sem limitação: (1) meio semidefinido, que contém peptona, 3 g/1; levedura, 3 g/1; solução de vitamina, 2 ml/1; solução mineral, 25 ml/1; índigo-carmin (0,5%), 1 g/1; L-cisteína 12,5%, 2 g/1; sulfeto de sódio 12,5%, 2 g/1; e suplementado com Na-lactato (lactato semidefinido, SDL), glicose (glicose semidefinida, SDG) ou maltose (maltose semidefinida, SDM) ;

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43/156 (2) Meio de Ágar/Caldo de Clostrídio Reforçado Modificado (pré-reduzido), que contém peptona, 10 g/l; extrato de carne, 10 g/l; extrato de levedura, 3 g/l; dextrose 5 g/l; NaCl, 5 g/l; amido solúvel, 1 g/l; L-cisteína HC1, 0,5 g/l; acetato de sódio, 3 g/l; e resazurina (0,025%), 4 ml/1; (3) Ágar/caldo de tripticase de soja com sangue de carneiro desfibrinado; (4) meio semidefinido sem líquido do rúmen, que contém Na-lactato (70%), 10 g/l; Peptona, 2 g/l; KH2PO4 1 g/l; (NH₄)₂SO₄ 3 g/l; MgSO₄ 7H₂O 0,2 g/l; CaCl₂.2H₂O 0,06 g/l; Vitaminas (Cloridrato de piridoxol, 4 mg/1; Piridoxamina, 4 mg/1; Riboflavina, 4 mg/1; Cloreto de tiamínio, 4 mg/1; Nicotinamida, 4 mg/1; Ca-D-pantotenato, 4 mg/1; Ácido 4-aminobenzóico, 0,2 mg/1, Biotina, 0,2 mg/1, Ácido fólico, 0,1 mg/1 e Cianocobalamina, 0,02 mg/1); Na₂S.9H₂O(, 0,25 g/l; Cisteína, 0,25 g/l; Antiespumante, 0,07 ml/1 e Monensina, 10 mg/1; e que é preparado por adição do Na-lactato e solução mineral a uma garrafa de reservatório e autoclavagem por 60 minutos; dissolução da peptona em 300 ml de H₂O destilada e autoclavagem separadamente; esterilização por filtro da solução de vitamina e dois agentes redutores antecipadamente; a seguir, autoclavagem, gaseificação da garrafa de reservatório com gás anaeróbico de um dia para o outro; adição dos outros constituintes separadamente após resfriamento; e ajuste do pH até o valor desejado com 5 N HC1; e (5) meio de lactato do líquido do rúmen incubado (IRFL) , que contém 4 00 ml de líquido do rúmen incubado clarificado de carneiros lucerne-fed, 371 ml de água destilada, 2 g de peptona, 15 g de ágar, 100 ml de sódio-D 10% (p/v), solução de L-lactato, 100 ml de solução de púrpura bromocresol 0,04% (p/v) e 25 ml de solução mineral

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44/156 que contém 4 0 g/1 de KH2PO4; 12 0 g/1 de (NH4USCd; 8 g/1 de MgSO4.7H2O e 2,4 g/1 de CaC12.2H2O, em que ácido lático (90% p/v) é usado para ajustar o pH até 5,5 antes da autoclavagem a 121°C por 25 minutos, e depois resfriamento e um banhomaria a 50°C durante gaseificação com um mistura de gás anaeróbico, seguida por adição de dois mililitros de cada um de Na2S.9H2O (12,5% p/v) e cisteina.HCl.H2O (12,5% p/v) .

[213] Em algumas modalidades, a cultura compreende um meio de crescimento que compreende pelo menos uma fonte de carbono. Em algumas modalidades, a (pelo menos uma) fonte de carbono é selecionada do grupo que consiste em: caseína, amido (por exemplo, amido gelatinizado e/ou amido solúvel), lactato (ou seja, ácido lático), dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura e combinações destes.

[214] Em algumas modalidades, a cultura compreende um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono. Em algumas modalidades, as (pelo menos duas) fontes de carbono são selecionadas do grupo que consiste em: caseína, amido (por exemplo, amido gelatinizado e/ou amido

solúvel)	, lactato	(ou seja	, ácido	lático),	dextrose,
frutose,	frutano,	glicose,	sacarose,	lactose,	maltose,
acetato,	glicerol,	manitol,	sorbitol,	sacarose	, xilose,
melaço,	fucose, gli	cosamina, dextrana, uma gordura	, um óleo,
glicerol	, acetato	de sódio,	arabinose,	proteína	de soja,
proteína	solúvel,	rafinose,	amilose,	amido,	triptona,

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45/156 extrato de levedura e combinações destes.

[215] Em algumas modalidades, as (pelo menos duas) fontes de carbono consistem em cerca de 1-99% de uma primeira fonte de carbono (por exemplo, qualquer fonte de carbono descrita nesse relatório descritivo) e cerca de 1-99% de uma segunda fonte de carbono (por exemplo, qualquer fonte de carbono descrita nesse relatório descritivo que é diferente da primeira fonte de carbono), em que 100% das (pelo menos duas) fontes de carbono consistem na primeira fonte de carbono e na segunda fonte de carbono. Em algumas modalidades, as (pelo menos duas) fontes de carbono consistem em cerca de 50-60% da primeira fonte de carbono e cerca de 40-50% da segunda fonte de carbono, cerca de 50-70% da primeira fonte de carbono e cerca de 30-50% da segunda fonte de carbono, cerca de 50-80% da primeira fonte de carbono e cerca de 20-50% da segunda fonte de carbono, ou cerca de 50-90% da primeira fonte de carbono e cerca de 10-50% da segunda fonte de carbono. Em outras modalidades, as (pelo menos duas) fontes de carbono consistem em cerca de 65-75% da primeira fonte de carbono e cerca de 25-35% da segunda fonte de carbono. Em algumas modalidades, a primeira fonte de carbono é lactato.

	[216	] Em	algumas modalidades, as	células	de	M.	elsdenii
são	desenvolvidas em torno de 39°C	até cerca	de	40°C, em
torno de	35°	C, em torno de 36°C, em	torno de	37	°C,	em torno
de	38°C,	em	torno de 39°C, ou em torno de 40	°C.
	[217	] Em	algumas modalidades, as	células	microbianas são
desenvolvidas em torno de 15°C até	cerca de	45	°C,	em torno
de	20°C	até	40°C, 25°C até 35°C, 30	°C até 39°C	. Em algumas

modalidades, as células microbianas são desenvolvidas em torno de 30°C, cerca de 31°C, cerca de 32°C, cerca de 33°C,

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46/156 cerca de 34°C, cerca de 35°C, em torno de 36°C, em torno de

37°C, em torno de 38°C, em torno de	39°C,	ou em torno	de
40°C.
[218] Em algumas modalidades, as células	; microbianas	são
resfriadas até cerca de 18°C até	cerca de 25°C para
armazenamento.
[219] Em algumas modalidades, o	pH	da cultura	que
compreende as células de M. elsdeníí	(por	exemplo, durante

o cultivo e/ou no momento da coleta) está entre cerca de 4,5 até cerca de 7,0, entre cerca de 4,5 até cerca de 6,5, entre cerca de 4,5 até cerca de 6,0, entre cerca de 4,5 até cerca de 5,5, entre cerca de 4,5 até cerca de 5,0, entre cerca de 4,6 até cerca de 6,9, entre cerca de 4,7 até cerca de 6,8, entre cerca de 4,8 até cerca de 6,7, entre cerca de 4,9 até cerca de 6,6, entre cerca de 5,0 até cerca de 7,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 5,5, entre cerca de

5.1 até cerca de 6,9, entre cerca de 5,2 até cerca de 6,8, entre cerca de 5,3 até cerca de 6,7, entre cerca de 5,4 até cerca de 6,6, entre cerca de 5,5 até cerca de 7,0, entre cerca de 5,5 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,1 até cerca de 6,4, entre cerca de 5,2 até cerca de 6,3, entre cerca de

5,3 até cerca de 6,2, entre cerca de 5,4 até cerca de 6,1, entre cerca de 5,5 até cerca de 6,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,1, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,2, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,3, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,4, entre cerca de 5,1 até cerca de 6,5, entre cerca de

5.2 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,3 até cerca de 6,5, ou entre cerca de 5,4 até cerca de 6,5.

[220] Em algumas modalidades, o pH da cultura que

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47/156 compreende as células microbianas (por exemplo, durante o cultivo e/ou no momento da coleta) está entre cerca de 4,0 até cerca de 9,0, entre cerca de 4,5 até cerca de 8,5, entre cerca de 5,0 até cerca de 8,0, entre cerca de 5,5 até cerca de 7,5, entre cerca de 6,0 até cerca de 7,0.

[221] Para o cultivo de células microbianas, fermentadores de diferentes tamanhos e designs que mantêm as condições anaeróbicas podem ser usados. Um fermentador pode ser capaz, por exemplo, de fermentação de volumes de cultura suficientes para produção comercial de células de M. elsdeníí. Em algumas modalidades, o volume de cultura é cerca de 2 litros, cerca de 10 litros, cerca de 50 litros, cerca de 100 litros, cerca de 150 litros, cerca de 200 litros, cerca de 250 litros, cerca de 300 litros, cerca de 350 litros, cerca de 400 litros, cerca de 450 litros, cerca de 500 litros, cerca de 600 litros, cerca de 800 litros, cerca de 1.000 litros, cerca de 1.200 litros, cerca de 1.500 litros, cerca de 1.800 litros, cerca de 2.000 litros, cerca de 2.200 litros, cerca de 2.500 litros, cerca de 2.750 litros, cerca de 3.000 litros, cerca de 4.000 litros, cerca de 5.000 litros, cerca de 6.000 litros, cerca de 7.000 litros, cerca de 8.000 litros, cerca de 9.000 litros, cerca de 10.000 litros, pelo menos cerca de 20.000 litros, pelo menos cerca de 50.000 litros, ou pelo menos cerca de 75.000 litros. Em algumas modalidades, o volume de fermentação é cerca de 2 litros até cerca de 75.000 litros, cerca de 250 litros até cerca de 750 litros, cerca de 300 litros até cerca de 800 litros, cerca de 350 litros até cerca de 850 litros, cerca de 400 litros até cerca de 900 litros, cerca de 450 litros até cerca de 950 litros, cerca de 500 litros até cerca

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48/156 de 1.000 litros, cerca de 750 litros até cerca de 1.250 litros, cerca de 1.000 litros até cerca de 2.000 litros, cerca de 2.000 litros até cerca de 4.000 litros, cerca de 4.000 litros até cerca de 8.000 litros, cerca de 5.000 litros até cerca de 10.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 75.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 50.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 25.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 20.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 15.000 litros, cerca de 50 litros até cerca de 10.000 litros, cerca de 100 litros até cerca de 10.000 litros, cerca de 100 litros até cerca de 5.000 litros, cerca de 100 litros até cerca de 4.000 litros, cerca de 100 litros até cerca de 3.000 litros, cerca de 100 litros até cerca de 2.900 litros, cerca de 100 litros até cerca de 2.850 litros, cerca de 100 litros até cerca de 2.800 litros, cerca de 100 litros até cerca de 2.750 litros, cerca de 2 litros, cerca de 10 litros, cerca de 50 litros, cerca de 100 litros, cerca de 200 litros, cerca de 500 litros, cerca de 1.000 litros, cerca de 1.500 litros, cerca de 10.000 litros, cerca de 20.000 litros, cerca de 50.000 litros, ou cerca de 75.000 litros.

[222] Em algumas modalidades, uma cultura que compreende células de M. elsdeníí também compreende outro microorganismo (ou seja, uma célula microbiana que não é uma célula de M. elsdeníí) . Em algumas modalidades, uma cultura compreende células de M. elsdeníí e outro micro-organismo que é um anaeróbio obrigatório. Em algumas modalidades, a cultura compreende células de M. elsdeníí e outro microorganismo selecionado do grupo que consiste em: Lactobacillus, Megasphaera, Bifidobacterium, Escherichia_r

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Enterococcus, Bacillus, Propionibacterium, Streptococcus, Candida, Clostridium, Pediococcus, Aspergillus e Saccharomyces.

Células aeróbicas, anaeróbicas e de levedura liofilizadas [223] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí.

[224] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de M. elsdeníí.

[225] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[226] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera.

[227] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Megasphaera.

[228] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Megasphaera produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[229] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[230] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. anímalís subsp. lactís, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei.

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50/156 [231] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células bacterianas anaeróbicas liofilizadas.

[232] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei.

[233] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[234] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[235] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células bacterianas aeróbicas liofilizadas.

[236] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis.

[237] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células bacterianas aeróbicas liofilizadas.

[238] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Bacillus como, por exemplo, B.

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51/156 subtilis.

[239] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células bacterianas aeróbicas liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[240] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis, produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[241] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células de levedura liofilizadas.

[242] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de produção de células liofilizadas de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardíí e S. cerevisiae.

[243] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células de levedura liofilizadas.

[244] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardíí e S. cerevisiae.

[245] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células de levedura liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[246] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida às células liofilizadas de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardíí e S. cerevisiae, produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[247] Em outro aspecto, um método de produção de células liofilizadas de M. elsdeníí compreende: o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdeníí e um meio de crescimento; coleta das células; congelamento das células;

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52/156 e liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas. Em algumas modalidades, o método é realizado na ordem de preparação da cultura, e depois coleta das células (ou seja, coleta das células cultivadas), e depois congelamento das células (ou seja, congelamento das células coletadas), e depois liofilização das células (ou seja, liofilização das células congeladas).

[248] Em algumas modalidades, o método é realizado sob condições anaeróbicas. Em algumas modalidades, o método compreende a preparação da cultura, coleta das células, congelamento das células, liofilização das células, ou combinações destes sob condições anaeróbicas.

[249] 0 método pode compreender qualquer um dos métodos do preparo de uma cultura como descritos nesse relatório descritivo. Uma cultura do método também pode compreender qualquer uma das propriedades de uma cultura descritas nesse relatório descritivo.

[250] Em algumas modalidades, as células na cultura compreendem células de M. elsdeníí. Em algumas modalidades, as células na cultura consistem em células de M. elsdeníí.

[251] Em algumas modalidades, o meio de crescimento compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseina, lactato (ou seja, ácido lático), dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, e combinações destes.

[252] Em algumas modalidades, o método compreende a

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53/156 coleta das células dentro de 12 horas após a cultura ter terminado sua fase de crescimento exponencial e antes da cultura ter começado sua fase de crescimento estacionária. A cultura pode ser resfriada até a temperatura ambiente para interromper o crescimento no momento da coleta.

[253] Em algumas modalidades, a cultura compreende um liquido, e o método compreende a coleta das células de M. elsdenii (por exemplo, células concentradas de M. elsdenii) com uma percentagem do liquido. Em algumas modalidades, o método compreende a coleta das células com cerca de 1% até cerca de 40%, cerca de 1% até cerca de 35%, cerca de 1% até cerca de 30%, cerca de 1% até cerca de 25%, cerca de 1% até cerca de 20%, cerca de 1% até cerca de 15%, cerca de 1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 9%, cerca de 8%, cerca de 7%, cerca de 6%, cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, ou cerca de 1% do liquido. Em algumas modalidades, o método compreende a coleta das células com menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 35%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 25%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 15%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, menos do que cerca de 8%, menos do que cerca de 7%, menos do que cerca de 6%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3%, menos do que cerca de 2%, ou menos do que cerca de 1% do liquido.

[254] Em algumas modalidades, a cultura compreende um liquido, e o método compreende a coleta das células de M. elsdenii (por exemplo, células concentradas de M. elsdenii) por remoção de uma percentagem do liquido. Em algumas modalidades, a coleta das células compreende a remoção de

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54/156 cerca de 50% até cerca de 100% do liquido, cerca de 55% até cerca de 100%, cerca de 60% até cerca de 100%, cerca de 65% até cerca de 100%, cerca de 70% até cerca de 100%, cerca de 75% até cerca de 100%, cerca de 80% até cerca de 100%, cerca de 85% até cerca de 100%, cerca de 90% até cerca de 100%, ou cerca de 95% até cerca de 100% do liquido. Em algumas modalidades, a coleta das células compreende a remoção de pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos

cerca de	96%	, pelo menos	cerca de	97%, pelo	menos cerca	de
98%, pelo	menos cerca	de	99%, ou pelo menos cerca de 100%	do
liquido.
[255]	Em	algumas	modalidades,	o método	compreende	a

coleta das células de M. elsdeníí por concentração das células. Em algumas modalidades, a coleta das células compreende a concentração das células por pelo menos uma técnica selecionada do grupo que consiste em: centrifugação, filtração, diálise, osmose reversa, e combinações destas. Em algumas modalidades, a filtração compreende filtração em argila. Em algumas modalidades, a filtração compreende filtração por fluxo tangencial, também conhecida como filtração de fluxo cruzado.

[256] Em algumas modalidades, o pH da cultura que compreende as células de M. elsdeníí no momento da coleta está entre cerca de 4,5 até cerca de 7,0, entre cerca de 4,5 até cerca de 6,5, entre cerca de 4,5 até cerca de 6,0, entre

Petição 870190127258, de 03/12/2019, pág. 64/194

55/156 cerca de 4,5 até cerca de 5,5, entre cerca de 4,5 até cerca de 5,0, entre cerca de 4,6 até cerca de 6,9, entre cerca de 4,7 até cerca de 6,8, entre cerca de 4,8 até cerca de 6,7, entre cerca de 4,9 até cerca de 6,6, entre cerca de 5,0 até cerca de 7,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 5,5, entre cerca de 5,1 até cerca de 6,9, entre cerca de

5.2 até cerca de 6,8, entre cerca de 5,3 até cerca de 6,7, entre cerca de 5,4 até cerca de 6,6, entre cerca de 5,5 até cerca de 7,0, entre cerca de 5,5 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,1 até cerca de 6,4, entre cerca de 5,2 até cerca de 6,3, entre cerca de 5,3 até cerca de 6,2, entre cerca de

5,4 até cerca de 6,1, entre cerca de 5,5 até cerca de 6,0, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,1, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,2, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,3, entre cerca de 5,0 até cerca de 6,4, entre cerca de 5,1 até cerca de 6,5, entre cerca de 5,2 até cerca de 6,5, entre cerca de

5.3 até cerca de 6,5, ou entre cerca de 5,4 até cerca de 6,5.

[257] Em algumas modalidades, o método compreende a inoculação de meios de crescimento em um fermentador com um inóculo que compreende células de M. elsdenii para preparar uma cultura, e incubação da cultura em uma temperatura de cerca de 39°C até que o pH da cultura seja cerca de 6,0. Em algumas modalidades, o inóculo que compreende células de M. elsdenii é uma cultura em frasco de células de M. elsdenii ou uma porção desta. Em algumas modalidades, o método compreende a inoculação de meios de crescimento em um fermentador de um inóculo até uma proporção média de 1/50 até 1/4.000. Em algumas modalidades, a proporção média do

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56/156 inóculo é de 1/100.

[258] Em algumas modalidades, a cultura ainda compreende pelo menos um crioprotetor. Em algumas modalidades, o (pelo menos um) crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em: frutose, glicose, sacarose, leite em pó, fórmula infantil, leite desnatado, trehalose, maltodextrina, betaina, e combinações destes. Em algumas modalidades, o (pelo menos um) crioprotetor está presente em uma quantidade cerca de 1% até cerca de 50% (p/v) da cultura, cerca de 1% até cerca de 40% (p/v) da cultura, cerca de 1% até cerca de 30% (p/v) da cultura, cerca de 1% até cerca de 20% (p/v) da cultura, cerca de 1% até cerca de 10% (p/v) da cultura, cerca de 1% até cerca de 5% (p/v) da cultura, cerca de 10% até cerca de 20% (p/v) da cultura, cerca de 15% até cerca de 25% (p/v) da cultura, cerca de 20% até cerca de 30% (p/v) da cultura, cerca de 30% até cerca de 40% (p/v) da cultura, cerca de 40% até cerca de 50% (p/v) da cultura, cerca de 60% até cerca de 70% (p/v) da cultura, cerca de 70% até cerca de 80% (p/v) da cultura. Em algumas modalidades, o crioprotetor é adicionado por adição de um crioprotetor em pó diretamente às células concentradas de M. elsdeníí. Em algumas modalidades, o crioprotetor é adicionado por adição de uma solução de crioprotetor diretamente às células concentradas de M. elsdeníi em uma proporção de 1/1, em uma proporção de 1/5, ou em uma proporção de 1/10.

[259] Em algumas modalidades, o congelamento das células compreende a colocação das células em um congelador ou o contato das células com gelo seco, nitrogênio liquido, ou uma combinação destes. O congelamento das células inclui o congelamento das células enquanto elas estão dentro de um

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57/156 recipiente. 0 contato das células inclui o contato de um recipiente que compreende as células com um meio para congelamento das células. Um meio para congelamento das células inclui, sem limitação, um congelador, um banho de acetona-gelo seco, nitrogênio líquido, ou uma combinação destes.

[260] Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de 20°C até cerca de -210°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de -20°C até cerca de -80°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de -20°C até cerca de -196°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de 196°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de 20°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de 80°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células em uma temperatura de cerca de 196°C. Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células pelo contato das células com nitrogênio líquido.

[261] Em algumas modalidades, o método compreende o congelamento das células sob condições anaeróbicas.

[262] Em algumas modalidades, o congelamento produz péletes congelados que compreendem as células. Por exemplo,

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58/156 o congelamento pode ser obtido usando um congelador rápido (por exemplo, Modelo 250-S01 Crygran, IFQ Inc.).

[263] Em algumas modalidades, o diâmetro dos péletes

congelados é

cerca de 0,

001

pol

(0,003

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0, 01

pol

(0,025

cm

) até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0, 1

pol

(0,254

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0,2

pol

(0,508

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0,3

pol

(0,762

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0,4

pol

(1,016

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0,5

pol

(1,27

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0, 6

pol

(1,524

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0,7

pol

(1,778

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0, 8

pol

(2,032

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cm)

r

cerca

de

0, 9

pol

(2,286

cm)

até

cerca

de

1, 0

pol

(2,54

cnf

cerca

de

0,001 j

201 (0,

003

cm)

até cerca

de

0, 9

pol (

2,286

cm) ,

cerca de 0,

01 pol

(0,

025 cm) até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0, 01

pol

(0,254

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0, 1

pol

(0,508

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0,2

pol

(0,762

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0,3

pol

(1,016

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm

cerca

de 0,4

pol

(1,27

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0,5

pol

(1,524

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0, 6

pol

(1,778

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0,7

pol

(2,032

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286

cm)

r

cerca

de

0, 8

pol

(0,003

cm)

até

cerca

de

0,

9

pol

(2,286 cm)

, cerca

de 0

, 001

pol (

0,025 cm

) até

cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,01 pol (0,254 cm)

até	cerca	de	0,	8	pol	(2,	032	cm) ,	cerca	de	0,	1	pol	(0,	508	cm
até	cerca	de	0,	8	pol	(2,	032	cm) ,	cerca	de	0,	2	pol	(0,	762	cm
até	cerca	de	0,	8	pol	(2,	032	cm) ,	cerca	de	0,	3	pol	(1,	016	cm

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59/156 até cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,4 pol (1,27 cm) até cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,5 pol (1,524 cm) até cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,6 pol (1,778 cm) até cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,7 pol (1,778 cm) até cerca de 0,8 pol (2,032 cm), cerca de 0,001 pol (0,003 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,01 pol (0,025 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,1 pol (0,254 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,2 pio (0,508 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,3 pol (0,762 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,4 pol (1,016 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,5 pol (1,27 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,6 pol (1,524 cm) até cerca de 0,7 pol (1,778 cm), cerca de 0,001 pol (0,003 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,01 pol (0,025 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,1 pol (0,254 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,2 pol (0,508 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,3 pol (0,762 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,4 pol (1,016 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,5 pol (1,27 cm) até cerca de 0,6 pol (1,524 cm), cerca de 0,001 pol (0,003 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,01 pol (0,025 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,05 pol (0,127 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,1 (0,254 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,15 pol (0,381 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,2 pol (0,508 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), cerca de 0,3 pol (0,762 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm), ou cerca de 0,4 pol (1,016 cm) até cerca de 0,5 pol (1,27 cm) .

[264] As células congeladas de M. elsdenii podem ser armazenadas congeladas (por exemplo abaixo de 0°C) antes da

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60/156 liofilização ou podem ser imediatamente liofilizadas. Em algumas modalidades, as células congeladas de M. elsdeníí são armazenadas em uma temperatura abaixo de cerca de 0°C, abaixo de cerca de -10°C, abaixo de cerca de -20°C, abaixo de cerca de -50°C, abaixo de cerca de -80°C, ou abaixo de cerca de -196°C. Em algumas modalidades, as células congeladas de M. elsdeníí são armazenadas em uma temperatura de cerca de -20°C, cerca de -30°C, cerca de -40°C, cerca de -50°C, cerca de -60°C, cerca de -70°C, cerca de -80°C, cerca de -90°C, cerca de -100°C, cerca de -150°C, cerca de -196°C, ou cerca de -210°C.

[265] Em algumas modalidades, as células congeladas de M. elsdeníí são liofilizadas. Em algumas modalidades, as células congeladas de M. elsdeníí são liofilizadas. A liofilização envolve, por exemplo, a remoção de líquido de células congeladas.

[266] Em algumas modalidades, a liofilização das células de M. elsdeníí compreende a colocação das células congeladas em um liofilizador. Em algumas modalidades, a liofilização compreende a submissão das células congeladas à pressão reduzida, e o aquecimento gradual das células até a temperatura ambiente.

[267] Em algumas modalidades, o método compreende a liofilização das células sob condições anaeróbicas.

[268] Em algumas modalidades, a M. elsdeníí liofilizada é produzida em uma escala comercial.

[269] Em algumas modalidades, cerca de 1 x 10³ até 1 x 10¹² CFU/g de células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, cerca de 1 x 10³ até 1 x

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10¹² CFU/g de células de M. elsdeníí são viáveis após liofilização.

[270] Em um aspecto, um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí de acordo com a presente revelação compreende: (a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas que compreendem células de M. elsdeníí e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em:

caseina,	lactato (ou	seja, ácido lático)	, dextrose,	frutose,
frutano,	glicose,	sacarose, lactose,	maltose,	acetato,
glicerol,	manitol,	sorbitol, sacarose, xilose,	melaço,
fucose,	glicosamina	, dextrana, uma	gordura,	um óleo,
glicerol,	acetato de sódio, arabinose,	proteína	de soja,
proteína	solúvel,	rafinose, amilose,	amido,	triptona,

extrato de levedura e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.

[271] Em outro aspecto, um método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí de acordo com a presente revelação compreende: (a) o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdeníí e um meio de crescimento, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas dentro de 12 horas após a cultura ter terminado sua fase de crescimento exponencial e antes da cultura ter começado sua fase de crescimento estacionária, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.

[272] Em outro aspecto, um método de produção de células

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62/156 liofilizadas de Megasphaera elsdeníí de acordo com a presente revelação compreende: (a) o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdeníí e um meio de crescimento, (b) coleta das células, (c) congelamento das células em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C dentro de 5 horas da coleta, e (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.

[273] Em algumas modalidades, a quantidade de células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo e/ou a quantidade de células de M. elsdeníí que são viáveis após liofilização é cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³CFU/g até cerca de 1 x 10¹¹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁶ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10¹²CFU/g, cerca de 1 x 10⁸ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁹ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴ CFU/g até cerca de 1 x 10⁶ CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10⁸ CFU/g até cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g, cerca de 1 x 10⁹ CFU/g até cerca de 1 x 10¹¹ CFU/g, ou cerca de 1 x

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IO¹⁰ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g.

[274] Em algumas modalidades, as células liofilizadas de M. elsdeníí são viáveis por cerca de 14 dias até cerca de 24 meses em torno de -80°C, cerca de -20°C, cerca de 4°C, cerca de 25°C, ou combinações destes. Em algumas modalidades, as células liofilizadas de M. elsdeníí são viáveis por pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 1 mês, pelo menos cerca de 6 meses, pelo menos cerca de 8 meses, pelo menos cerca de 10 meses, pelo menos cerca de 12 meses, pelo menos cerca de 15 meses, pelo menos cerca de 18 meses, ou pelo menos cerca de 24 meses em torno de -80°C, cerca de -20°C, cerca de 4°C, cerca de 25°C, ou combinações destes.

[275] Em algumas modalidades, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1x1 O¹¹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/ml até cerca de 1 x 10¹⁰CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10³CFU/g até cerca de 1 x 10⁶ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 1 O¹²CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 1 O¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁸ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁹CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴ CFU/g até cerca de 1 x 10⁶CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸ CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10⁸

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CFU/g até cerca de 1 x IO¹⁰ CFU/g, cerca de 1 x 10⁹ CFU/g até cerca de 1 x IO¹¹ CFU/g, ou cerca de 1 x IO¹⁰ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g de células liofilizadas de M. elsdenii são viáveis após armazenamento em uma temperatura de cerca de 80°C, cerca de -20°C, cerca de 4°C, ou combinações destes por pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 1 mês,

pelo	menos	cerca	de	6	meses,	pelo	menos	cerca	de	8	meses,
pelo	menos	cerca	de	10	meses,	pelo	menos	cerca	de	12	meses,
pelo	menos	cerca	de	15	meses,	pelo	menos	cerca	de	18	meses,

ou pelo menos cerca de 24 meses.

[276] Em algumas modalidades, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹¹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10¹⁰CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10³CFU/g até cerca de 1 x 10⁶ CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 10¹²CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁸ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10⁹CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g até cerca de 1 x 10¹² CFU/g, cerca de 1 x 10³ CFU/g até cerca de 1 x 10⁵ CFU/g, cerca de 1 x 10⁴ CFU/g até cerca de 1 x 10⁶CFU/g, cerca de 1 x 10⁵ CFU/g até cerca de 1 x 10⁷ CFU/g, cerca de 1 x 10⁶ CFU/g até cerca de 1 x 10⁸ CFU/g, cerca de 1 x 10⁷ CFU/g até cerca de 1 x 10⁹ CFU/g, cerca de 1 x 10⁸CFU/g até cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g, cerca de 1 x 10⁹ CFU/g até cerca de 1 x IO¹¹ CFU/g, ou cerca de 1 x 10¹⁰ CFU/g até cerca

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65/156 de 1 x 10¹² CFU/g de células liofilizadas de M. elsdeníi são viáveis após armazenamento em uma temperatura de cerca de 25°C por pelo menos cerca de 14 dias, pelo menos cerca de 1

mês,	pelo menos	cerca	de	6	meses,	pelo	menos	cerca	de	8
meses	, pelo	menos	cerca	de	10	meses,	pelo	menos	cerca	de	12
meses	, pelo	menos	cerca	de	15	meses,	pelo	menos	cerca	de	18

meses, ou pelo menos cerca de 24 meses.

Aditivos alimentares, composições e kits [277] Em um aspecto, um aditivo alimentar compreende células de M. elsdeníí como reveladas nesse relatório descritivo.

[278] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de M. elsdeníí como reveladas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[279] Em um aspecto, um aditivo alimentar compreende células de Megasphaera como reveladas nesse relatório descritivo.

[280] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Megasphaera como reveladas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Megasphaera produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[281] Em um aspecto, um aditivo alimentar compreende células bacterianas anaeróbicas como reveladas nesse relatório descritivo. Em outro aspecto, um aditivo alimentar compreende células de Bifidobacterium como, por exemplo, B.

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66/156 breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. anímalís subsp. lactís, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici , células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei.

[282] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células bacterianas anaeróbicas liofilizadas como reveladas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[283] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. anímalís subsp. lactís, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. anímalís subsp. lactís, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[284] Em um aspecto, um aditivo alimentar compreende células bacterianas aeróbicas como reveladas nesse relatório descritivo. Em outro aspecto, um aditivo alimentar compreende células de Bacillus como, por exemplo, B.

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67/156 subtilis.

[285] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células bacterianas aeróbicas liofilizadas como reveladas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células bacterianas aeróbicas liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[286] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[287] Em um aspecto, um aditivo alimentar compreende células de levedura como reveladas nesse relatório descritivo. Em outro aspecto, um aditivo alimentar compreende células de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae.

[288] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células de levedura liofilizadas como reveladas nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células de levedura liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[289] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende células liofilizadas de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae produzidas por um método revelado

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68/156 nesse relatório descritivo.

[290] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é a sólido (ou seja, um aditivo alimentar sólido) ou um liquido (ou seja, aditivo alimentar liquido). Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é um semi-sólido ou um gel (ou seja, um aditivo alimentar semi-sólido ou em gel). Um aditivo alimentar em gel pode conter um absorvedor de oxigênio (por exemplo, ácido ascórbico).

[291] Em algumas modalidades, um aditivo alimentar sólido é um pó (por exemplo, um pó fluido), grânulo (ou seja, um granulado), partícula (ou seja, particulado), pélete, torta, concentrado hidrossolúvel, pasta, bolo, comprimido, poeira, um componente destes, ou combinações destes.

[292] Em algumas modalidades, um aditivo alimentar líquido é uma solução (por exemplo, uma solução aquosa, orgânica ou aquosa-orgânica), suspensão, emulsão, esguicho, spray, injetável, bebida (por exemplo, um substituto do leite), um componente destes, ou combinações destes.

[293] Em algumas modalidades, um aditivo alimentar em gel é um organogel. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar em gel é um gel oral (ou seja, um gel para administração oral).

[294] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é para uso como uma cobertura (ou seja, para adição à superfície de um alimento ou misturação com um alimento (por exemplo, uma ração animal)). Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é para administração como um líquido.

[295] Em algumas modalidades, células liofilizadas de M. elsdenii como reveladas nesse relatório descritivo podem ser usadas como um aditivo alimentar líquido por reidratação,

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69/156 dissolução, solubilização e/ou suspensão das células liofilizadas em um líquido.

[296] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende um carreador (ou seja, um ou mais carreadores) .

[297] Exemplos de carreadores adequados incluem, sem limitação, materiais de plantas (ou seja, plantas inteiras ou partes de plantas (por exemplo, sementes, caules, folhas, flores e/ou raízes, por exemplo), incluindo plantas ou partes de plantas secas ou processadas), grãos secos (por exemplo, grãos secos de destilaria), alfafa, farelo de milho, polpa cítrica, resíduos de fermentação, conchas de ostras moldas, argila atapulgita, farelo fino de trigo, solúveis de melaço, farelo de espiga de milho, substâncias vegetais comestíveis, farinha de soja debulhada torrada, ração de farelo de soja, Mycelis antibiótica, vermiculita, grãos de soja, soro do leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, calcário (carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco, silica aluminato de sódio, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, vaselina, óleos vegetais, polietileno glicóis, propileno glicol, lipossomos, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, tensoativos, ácido silícico, parafina viscosa, óleo de perfume, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácido graxo, ésteres de ácido graxo, hidroximetil-celulose, polivinilpirrolidona, e semelhantes, e combinações destes.

[298] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar compreende um excipiente (ou seja, um ou mais excipientes) incluindo, sem limitação, celulose microcristalina; lactose; citrato de sódio; carbonato de cálcio; fosfato de cálcio dibásico e glicina; desintegrantes como, por exemplo, amido,

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70/156 amido glicolato de sódio, croscarmelose sódica e certos silicatos complexos; aglutinantes de granulação como, por exemplo, polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), hidroxipropilcelulose (HPC), sacarose, gelatina e acácia; agentes de volume como, por exemplo, maltodextrina; absorvedores de umidade como, por exemplo, dióxido de silício; absorvedores de oxigênio como, por exemplo, ácido ascórbico; e/ou agentes lubrificantes como, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico, behenato de glicerila e talco.

[299] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é um grânulo que compreende: um núcleo que compreende as células de M. elsdeníí e/ou aditivo alimentar, e um revestimento sobre o núcleo. Em algumas modalidades, o revestimento é um sal de barreira hidratado. O revestimento de sal pode fornecer tolerância térmica aumentada, estabilidade no armazenamento aumentada e proteção contra outros componentes nos grânulos que podem, de outro modo, ter efeito adverso (por exemplo, sobre a estabilidade) das células de M. elsdeníí e/ou aditivo alimentar.

[300] Em algumas modalidades, a M. elsdeníí liofilizada é misturada com uma formulação seca de aditivos incluindo, sem limitação, substratos de crescimento, enzimas, açúcares, carboidratos, extratos e microingredientes promotores de crescimento. Os açúcares podem incluir, sem limitação, lactose, maltose, dextrose, maltodextrina, glicose, frutose, manose, tagatose, sorbose, rafinose, amilose, amido e galactose. Os açúcares podem variar de 50-95%, individualmente ou em combinação. Os extratos podem incluir, sem limitação, levedura ou solúveis de fermentação de

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71/156 levedura secos variando de 5-50%. Os substratos de crescimento podem incluir, sem limitação, tripticase, variando de 5-25%; lactato de sódio, variando de 5-30%; e Tween 80, variando de 1-5%. Os carboidratos podem incluir, sem limitação, manitol, sorbitol, adonitol e arabitol. Os carboidratos podem variar de 5-50% individualmente ou em combinação. Os microingredientes podem incluir, sem limitação, carbonato de cálcio, variando de 0,5-5,0%; cloreto de cálcio, variando de 0,5-5,0%; fosfato dipotássico, variando de 0,5-5,0%; fosfato de cálcio, variando de 0,5-5,0%; proteinato de manganês, variando de 0,25-1,00%; e manganês, variando de 0,25-1,00%.

[301] Em algumas modalidades, um aditivo alimentar de M. elsdenii é preparado por misturação (por exemplo, com um misturador) de células de M. elsdenii, incluindo uma cultura que compreende as células e/ou células liofilizadas, com quaisquer componentes adicionais do aditivo alimentar (por exemplo, um carreador e/ou um excipiente). Em algumas modalidades, os componentes são misturados para obter uma mistura uniforme.

[302] Em algumas modalidades, o aditivo alimentar é um aditivo de ração animal aplicado em cobertura que compreende células de M. elsdenii como reveladas nesse relatório descritivo (por exemplo, células liofilizadas) e um carreador. Em algumas modalidades, o carreador é selecionado do grupo gue consiste em: soro do leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, calcário (ou seja, carbonato de cálcio), cascas de arroz, cultura de levedura, amido seco, e silica aluminato de sódio, leite, água, e combinações destes.

[303] Em algumas modalidades, o aditivo de ração animal

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72/156 é um esguicho, spray, ou suplemento de um substituto do leite que compreende células de M. elsdeníí como reveladas nesse relatório descritivo (por exemplo, células liofilizadas) e um carreador hidrossolúvel. Em algumas modalidades, o carreador é selecionado do grupo que consiste em: soro do leite, maltodextrina, sacarose, dextrose, amido seco, silica aluminato de sódio, leite, água, e combinações destes.

[304] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um alimento (por exemplo, uma ração animal) que compreende células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas como reveladas nesse relatório descritivo, por exemplo, células liofilizadas produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo) e/ou um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo. Um produto alimentício é qualquer alimento para consumo animal (ou seja, animais não humanos ou humanos), e inclui composições tanto sólidas quanto liquidas. Alimentos incluem, sem limitação, alimentos comuns; produtos líquidos, incluindo águas, leites, bebidas, bebidas terapêuticas e bebidas nutricionais; alimentos funcionais; suplementos; nutracêuticos; fórmulas infantis (ou seja, incluindo bebês não humanos e humanos), incluindo fórmulas para bebês prematuros; alimentos para animais prenhos ou amamentando; alimentos para animais adultos; e alimentos geriátricos. Em algumas modalidades, o alimento inclui um líquido (por exemplo, uma bebida, por exemplo, água, leite, ou um substituto do leite) que compreende o aditivo alimentar.

[305] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição que compreende células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) e/ou um aditivo alimentar

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73/156 como revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a composição compreende células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo.

[306] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) e/ou um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo podem ainda ser quimicamente ou fisicamente modificadas ou processadas com base nos requisitos da composição por qualquer técnica conhecida.

[307] Uma composição da invenção pode incluir um ou mais excipientes. Em algumas modalidades, o excipiente pode ser, sem limitação, um agente alcalino, um estabilizante, um antioxidante, um agente de adesão, um agente de separação, um agente de revestimento, um componente da fase exterior, um componente de liberação controlada, um solvente, um tensoativo, um umectante, um agente de tamponamento, um enchimento, um emoliente, ou combinações destes. Excipientes além daqueles discutidos nesse relatório descritivo podem incluir excipientes listados em, sem limitação, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^a Edição (2005). A inclusão de um excipiente em uma classificação particular nesse relatório descritivo (por exemplo, solvente) visa ilustrar, e não limitar, o papel do excipiente. Um excipiente particular pode se enquadrar em várias classificações.

[308] Em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica (por exemplo, para o tratamento de animais não humanos ou humanos). Em algumas modalidades, a composição é um alimento médico (por exemplo, um alimento veterinário). Um alimento médico inclui um alimento que está

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74/156 em uma composição a ser consumida ou administrada externamente sob a supervisão de um médico (por exemplo, um veterinário) e que visa o manejo dietético específico de uma condição, para a qual exigências nutricionais distintas, com base em princípios científicos reconhecidos, são estabelecidas por avaliação médica. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o termo farmaceuticamente aceitável significa aprovado por um órgão regulador do governo federal ou estadual ou listado na U.S. Pharmacopeia ou em outra farmacopéia internacional geralmente reconhecida para uso em animais e, mais particularmente, em humanos.

[309] Para administração oral de uma composição, as células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) ou aditivo alimentar podem ser combinados com excipientes bem conhecidos na técnica. Esses carreadores, por exemplo, podem permitir que as células de M. elsdeníí ou aditivo alimentar da invenção sejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a ser tratado. Em algumas modalidades, a composição é um comprimido, pílula, drágea ou cápsula. Excipientes adequados incluem, sem limitação, enchimentos como, por exemplo, açúcares incluindo, sem limitação, lactose, sacarose, manitol e sorbitol; preparações de celulose, por exemplo, sem limitação, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil celulose, carboximetil celulose sódica e polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes

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75/156 desintegrantes podem ser adicionados, por exemplo, sem limitação, a polivinilpirrolidona reticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal deste como, por exemplo, alginato de sódio. Composições que podem ser usadas oralmente incluem, sem limitação, cápsulas feitas de gelatina, bem como as cápsulas macias, seladas, feitas de gelatina e um plastificante, por exemplo, glicerol ou sorbitol. Em algumas modalidades, a forma de dosagem é uma forma de dosagem vegetariana, na qual a forma de dosagem não é formada e não contém nenhum componente de uma fonte animal. Em algumas modalidades, a forma de dosagem vegetariana é uma cápsula vegetariana.

[310] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a uma cápsula que compreende células de M. elsdeníi (por exemplo, células liofilizadas) e/ou um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gelatina. Em algumas modalidades, a cápsula compreende células liofilizadas de M. elsdeníi produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo ou um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a cápsula é degradável. Em algumas modalidades, a cápsula é uma cápsula de gelatina degradável.

[311] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição liofilizada encapsulada que compreende células bacterianas anaeróbicas, em que o pó liofilizado é encapsulado por dispensa do pó liofilizado em óleo aquecido. Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a uma composição liofilizada encapsulada que compreende células de M. elsdeníi, em que o pó liofilizado é encapsulado por

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76/156 dispensa do pó liofilizado em óleo aquecido.

[312] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a kits ou embalagens que compreendem células de M. elsdenii, aditivos alimentares, alimentos e/ou composições como revelados nesse relatório descritivo. Kits ou embalagens podem incluir unidades de um aditivo alimentar, alimento, composição, ou combinações destes (por exemplo, uma ou mais unidades). Em algumas modalidades, o kit compreende células liofilizadas produzidas por um método revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo ou uma cápsula como revelada nesse relatório descritivo.

Métodos de administração de células bacterianas anaeróbicas, células bacterianas aeróbicas e/ou células de levedura a animais [313] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de M. elsdenii a um animal.

[314] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de Megasphaera a um animal.

[315] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células bacterianas anaeróbicas a um animal. Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. breve, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. plantarum, células de Bifidobacterium como, por exemplo, B. animalis subsp. lactis, células de Pediococcus como, por exemplo, P. acidilactici, células de Lactobacillus como, por exemplo, L. casei células a um

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77/156 animal.

[316] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células bacterianas aeróbicas a um animal. Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de Bacillus como, por exemplo, B. subtilis células a um animal.

[317] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de levedura a um animal. Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de administração de células de Saccharomyces como, por exemplo, S. boulardii e S. cerevisiae células a um animal.

[318] Em algumas modalidades, o método compreende a administração ao animal de células de M. elsdeníí, um aditivo alimentar, um alimento ou uma composição (por exemplo, uma cápsula) como descritos nesse relatório descritivo.

[319] A administração pode ser por qualquer via compatível incluindo, por exemplo, oralmente (ou seja, um líquido ou sólido ingerível, um esguicho oral, um aditivo alimentar, um alimento, uma composição ou uma cápsula), por pulverização sobre o corpo (ou seja, por pulverização de névoa) e/ou injeção.

[320] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de um sólido, um líquido ou um gel que compreende as células de M. elsdeníí.

[321] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de um aditivo alimentar sólido que compreende as células. Em algumas modalidades, o aditivo alimentar sólido é um pó (por exemplo, um pó fluido) , grânulo (ou seja, um granulado), partícula (ou seja, particulado), pélete, torta, concentrado hidrossolúvel, pasta, bolo, comprimido,

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78/156 poeira, um componente destes, ou combinações destes.

[322] Em algumas modalidades, o método compreende a administração de um aditivo alimentar liquido que compreende as células. Em algumas modalidades, o método compreende a administração das células em um liquido. Em algumas modalidades, o liquido é uma solução (por exemplo, uma solução aquosa, orgânica ou aquosa-orgânica) , suspensão, emulsão, esguicho, spray, injetável, bebida (por exemplo, um substituto do leite), um componente destes, ou combinações destes. Em algumas modalidades, o liquido é administrado oralmente ou por pulverização do animal com o liquido.

[323] Em algumas modalidades, o método compreende a combinação das células de M. elsdeníí ou do aditivo alimentar que compreende as células com outro aditivo de ração animal para formar um suplemento ou pré-mistura para adição a uma ração animal. Em algumas modalidades, o outro aditivo alimentar compreende células diferentes de M. elsdeníí.

[324] Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) podem ser adicionadas ao aditivo alimentar como um liquido (por exemplo, em um caldo ou equivalente de caldo que inclui, por exemplo, células liofilizadas reidratadas), pasta de células reconstituída, ou como células liofilizadas (por exemplo, liofilizados). Os micro-organismos, incluindo M. elsdeníí liofilizada, também podem ser encapsulados antes da adição ao aditivo alimentar. Também podem ser formadas formas de dosagem (por exemplo esguicho de volume predeterminado ou cápsulas) e, se desejado, os micro-organismos podem ser adicionados diretamente à ração animal, como por borrifamento de um caldo liquido e/ou células liofilizadas sobre a ração ou misturação

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79/156 na ração.

[325] Em algumas modalidades, o método compreende a reidratação de um aditivo alimentar sólido (por exemplo, um pó, granulado, particulado, pélete, torta, células liofilizadas, ou combinações destes) para produzir um líquido para administração.

[326] Em algumas modalidades, o método compreende a aplicação das células de M. elsdenii à ração animal por meio de um sistema de liberação que reidrata um aditivo alimentar sólido ou células liofilizadas, incluindo um modo de batelada para batelada. Por exemplo, um pó liofilizado pode ser dispensado por um funil de polivinil em um sistema de fluxo, que dilui o pó e o pulveriza na ração a ser misturada.

[327] Em algumas modalidades, o método compreende a aplicação das células de M. elsdenii à ração animal usando um dispositivo de medição volumétrica com uma caixa de armazenamento. Por exemplo, células liofilizadas (por exemplo, um pó que compreende as células) podem ser armazenadas na caixa de armazenamento e descarregadas em uma água ou banho aquoso imediatamente antes de serem pulverizadas sobre uma ração animal.

[328] Em um aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdenii produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse

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80/156 relatório descritivo, ou uma composição (por exemplo, uma cápsula) como revelada nesse relatório descritivo.

[329] Em algumas modalidades, a condição ou distúrbio é acidose. Em algumas modalidades, a condição ou distúrbio é acidose ruminal. Em algumas modalidades, a condição ou distúrbio é doença respiratória. Em algumas modalidades, a condição ou distúrbio é laminite. Em algumas modalidades, a condição ou distúrbio é uma infecção. Em algumas modalidades, a infecção é com Salmonella ou Campylobacter. Em algumas modalidades, a Salmonella é Salmonella enterica e/ou Salmonella bongori. Em algumas modalidades, o sorotipo de Salmonella é Salmonella Typhimurium e/ou Entiritidis. Em algumas modalidades, a Campylobacter é Campylobacter jejuni ou Campylobacter coll.

[330] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdenii produzidas por um método como reveladas nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo.

[331] Em algumas modalidades, o micro-organismo oportunistico é patogênico. Em algumas modalidades, o microorganismo oportunistico é Salmonella ou Campylobacter. Em algumas modalidades, a Salmonella é Salmonella enterica e/ou Salmonella bongori. Em algumas modalidades, o sorotipo de Salmonella é Salmonella Typhimurium e/ou Entiritidis. Em

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81/156 algumas modalidades, a Campylobacter é Campylobacter jejuni ou Campylobacter coll.

[332] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, as células de M. elsdeníí compreendem uma atividade de fitase. Em algumas modalidades, o método reduz os resíduos ambientais de fósforo resultantes da administração de uma dieta animal na ausência de células de M. elsdeníí.

[333] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na

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82/156 mineralização óssea, ou combinações destes.

[334] Em outro aspecto, a presente invenção é dirigida a um método de acidificação do trato gastrintestinal inferior de um animal, que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, o trato gastrintestinal inferior é o ceco de uma ave doméstica.

[335] Em algumas modalidades, células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo são administrados antes, concomitantemente ou depois da alimentação do animal com um alimento.

[336] Em algumas modalidades, o método ainda compreende a misturação de células liofilizadas de M. elsdeníí como reveladas nesse relatório descritivo, das células liofilizadas produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, ou de um aditivo alimentar sólido como revelado nesse relatório descritivo com um liquido antes da administração.

[337] Em algumas modalidades, um liquido é administrado oralmente (por exemplo, um esguicho oral) ou por pulverização

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83/156 (por exemplo, pulverização de névoa) do animal com o líquido.

[338] Em algumas modalidades, o método compreende uma única administração de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo.

[339] Em algumas modalidades, o método compreende uma administração diária de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a administração é de pelo menos uma vez ao dia, pelo menos duas vezes ao dia, pelo menos três vezes ao dia, ou mais do que três vezes ao dia. Em algumas modalidades, a administração é ad libitum (por exemplo, autoadministração ao beber um líquido disponível ou ao comer um alimento disponível que compreende as células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas), as células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, o aditivo alimentar ou a composição).

[340] Em algumas modalidades, o método compreende mais de uma administração em um único dia de células de M. elsdeníí (por exemplo, células liofilizadas) como reveladas nesse relatório descritivo, células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas por um método como revelado nesse relatório descritivo, um aditivo alimentar como revelado

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84/156 nesse relatório descritivo, ou uma composição como revelada nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, a administração é de duas, três, quatro, cinco, seis ou mais administrações em um único dia. Em algumas modalidades, o método compreende mais de uma administração em um único dia, seguido por um ou mais dias sem administração. Em algumas modalidades, os (um ou mais) dias sem administração é um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, uma semana, duas semanas, três semanas ou quatro semanas, um mês, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses ou seis meses sem administração.

[341] Em algumas modalidades, o animal é um ruminante. Em algumas modalidades, o ruminante pode ser, sem limitação, gado, búfalos, carneiros, cabras, veados, renas, alce americano, girafa, iaques e alce. Em algumas modalidades, o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, búfalos, carneiros, cabras, veados e renas.

[342] Em algumas modalidades, o animal é um não ruminante. Em algumas modalidades, o não ruminante pode ser, sem limitação, equinos, aves domésticas, suíno, cães e gatos. Em algumas modalidades, o não ruminante é selecionado do grupo que consiste em: equinos, aves domésticas, e suíno.

[343] Em algumas modalidades, o animal é um animal de zoológico.

[344] Em algumas modalidades, o animal é uma ave doméstica. Em algumas modalidades, a ave doméstica é uma ave (ou seja, pássaro) que é usada como um alimento animal incluindo, sem limitação, uma galinha, ganso, pato, codorna, peru, pombo, ema ou avestruz. Em algumas modalidades, a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: uma

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85/156 galinha, um ganso, um pato, uma codorna, um peru ou um pombo. Em algumas modalidades, a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: um frango, um galo e uma poedeira. Em algumas modalidades, a ave doméstica é uma galinha.

[345] Em algumas modalidades, o animal é um equino. Em algumas modalidades, o equino é um cavalo, um pônei, um asno ou uma mula.

EXEMPLOS [346] Será feita referência afora aos exemplos seguintes, os quais, juntos com as descrições acima, ilustram algumas modalidades da invenção de uma forma não limitante.

EXEMPLO 1

Efeito da temperatura sobre o rendimento de culturas líquidas de M. elsdeníí [347] Temperaturas de armazenamento de 4°C, 20°C e 39°C, foram testadas para avaliar a viabilidade de células em culturas líquidas de M. elsdeníí NCIMB 41125 (Lactipro®) após 0, 7, 14, 21 e 28 dias. Os resultados revelaram que o armazenamento do produto a 4 °C aumentou significantemente (P < 0,001) a viabilidade da cultura, comparado com o armazenamento a 20°C ou 39°C, independentemente do dia da amostragem. Após 28 dias, o produto armazenado a 4 °C tinha 3,98 x 10⁶ unidades formadoras de colônia por mililitro (CFU/ml), comparadas com 1,26 x 10⁶ e 6,3 x 10⁵ CFU/ml para o produto armazenado a 20°C ou 39°C, respectivamente (P < 0,01; FIG. 1). Dessa forma, os resultados mostram que uma temperatura de armazenamento diminuída aumenta a viabilidade de culturas líquidas de M. elsdeníí NCIMB 41125.

[348] Dados adicionais de um estudo separado mostram que o rendimento de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 em uma

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86/156 cultura liquida (Lactipro Advance®) diminui após 0, 7, 14, 21 e 28 dias de armazenamento em temperatura ambiente (FIG.

2) .

EXEMPLO 2

Uso de filtração por fluxo tangencial para concentração de culturas de M. elsdeníí [349] Filtração por fluxo tangencial (TFF) foi investigada como um método para concentração de grandes volumes de cultura em alto rendimento.

[350] Um sistema de escala-piloto de TFF (veja a FIG. 3) foi integrado na linha de produção para M. elsdeníí e testado em corridas de produção de 500 litros (1) para avaliar o sistema de escala-piloto nos níveis de redução de volume de 70%, 80% e 90%. Um Módulo de TFF com uma membrana RC de 100 kDa (altura do canal de 0,875 mm) foi usado. Três corridas de produção foram realizadas para cada nível de redução por um total de nove corridas. Foram coletadas amostras para cada corrida e foram analisadas quanto ao pH, densidade óptica (OD), presença ou ausência de contaminantes aeróbicos, osmolaridade, perfil de ácidos graxos voláteis, concentração de M. elsdeníí e características de crescimento. As amostras foram coletadas das nove culturas de M. elsdeníí (Não liofilizadas) antes do início da filtração, do permeado (Permeado), que é o volume removido pelo sistema, e do retentado (Retentado), que é o volume concentrado da cultura de M. elsdeníí que compreende as células que permanece após as reduções de volume.

[351] Amostras de permeado coletadas no começo, meio e fim do processo de concentração tiveram leituras de OD consistentes através dos níveis de redução de volume, todos

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87/156 abaixo de 0,045 (dados não mostrados). A quantidade de M. elsdenii recuperada no permeado aumentou ao longo da evolução do processo de concentração (P = 0,0006), mas ainda era desprezível (menos do que 3 x 10⁴ CFU/ml) em comparação com a quantidade de células coletada no retentado (< 0, 002%) . Os níveis de redução de volume não tiveram nenhum efeito sobre a concentração de M. elsdenii recuperada no permeado (P > 0,9; Tabela 2).

Tabela 2. Rendimento médio de M. elsdenii em amostras coletadas durante as nove corridas de produção realizadas para avaliar o sistema de escala-piloto de TFF em reduções de volume de 70%, 80% e 90%.

		CFU/ml, LoglO		Erropadrão	Valor-P do efeito do tratamento
Amostras	70%	80%	90%
Permeado	1, 19	1, 07	1, 12	0,40	0, 958
Retentado	8,99	9, 04	9, 25	0, 03	<0,0001

[352] O rendimento de M. elsdenii no retentado não foi diferente em bolsas coletadas no começo, meio ou fim de cada processo de ensacamento (P = 0,6088; dados não mostrados). O rendimento do retentado foi afetado por níveis de redução de volume (P < 0,0001; Tabela 2 e FIG. 4). O retentado com redução de volume de 90% teve rendimento maior do que o retentado com redução de volume de 70% e 80% (P < 0, 0001) . Mas, os retentados de 70% e 80% não foram diferentes entre eles (P > 0,09).

[353] O processo de filtração não afetou a capacidade de células de M. elsdenii para crescer quando inoculadas de voltas em meio SDL-20 (Tabela 3) . As inclinações da fase exponencial não foram afetadas pelo nível de redução de

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88/156 volume (P > 0,3), mas foram afetadas pelo tipo de amostra: Retentado versus Não liofilizadas (P < 0,001). O tempo de latência foi afetado tanto pelo nivel de redução de volume quanto pelo tipo de amostra (P < 0,001). O tempo de latência para o retentado diminuía com aumento da redução de volume, o que era representativo de concentração de células maior.

Tabela 3. Comparação da inclinação e tempo de latência entre M. elsdeníi inicial (pré-filtração = Não liofilizadas) e do retentado (pós-filtração) coletadas durante as diferentes rodadas por TFF de redução de volume.

	Tipo de amostra	Efeitos, valores-P
Não liofilizadas	Retentado	Tipo de amostra	Redução de volume	Interação
70%	80%	90%	70%	80%	90%
Inclinação	0,39	0,36	0,37	0, 44	0,42	0,43	<0,001	0,329	0, 979
Tempo de latência, h	1,42^a	1,10^b	1,07^b	0,32^c	0,29^c	0,24^c	0,001	<0,001	<0,001

EXEMPLO 3

Parâmetros de congelamento e liofilização para M. elsdeníi

A. Congelamento e liofilização de retentados [354] Retentados obtidos por meio de TFF foram usados para testar protocolos de congelamento, inclusão de crioprotetor e vários parâmetros de liofilização.

[355] Os retentados foram transferidos para garrafas de soro desgaseifiçadas estéreis e assepticamente misturados com as diferentes formulações crioprotetoras (p/v): sem crioprotetor (Ctrl), leite desnatado (SM), trehalose (T) e betaína. Retentados misturados com o crioprotetor apropriado tiveram amostras coletadas para determinar a concentração pré-liofilização de M. elsdeníi (ou seja, contagem de

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89/156 viabilidade). As misturas foram transferidas em frascos de 10 ml (4 ml/frasco) e congeladas rapidamente em nitrogênio liquido ou congeladas lentamente a -80°C de um dia para o outro. Os frascos foram transferidos para o liofilizador para serem liofilizados usando um ciclo lento ou um ciclo rápido. Após o término da liofilização, a sobrevida das bactérias foi determinada por ressuspensão do produto liofilizado na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, permitindo que ele reidratasse por 40 minutos em temperatura ambiente, e depois plaqueamento em ágar SDL20.

[356] A perda de células foi computada por subtração da concentração de M. elsdeníí recuperada pós-liofilização da concentração inicial de M. elsdeníí medida no retentado correspondente misturado ou não com crioprotetores. O software SAS® foi usado para computar os dados de perda de células por análise das interações entre os níveis de redução de volume (70%, 80% ou 90%), ciclo de liofilização (Lento versus Rápido), método de congelamento (-80°C versus Nitrogênio Líquido), crioprotetores (Nenhum, Betaína, Trehalose, Leite Desnatado, Maltodextrina, Trehalose/Leite Desnatado (T/SM) e Maltodextrina/Leite Desnatado (M/SM)).

[357] A perda de células observada no tratamento de controle (sem crioprotetores) independentemente de outros critérios foi de 5 Log (CFU/ml) ou maior. Da mesma forma, a perda de células observada no tratamento com betaína independentemente de outros critérios foi de 3,96 Log CFU/ml ou maior. O limite aceitável de perda de células foi definido em 1,6 log CFU/ml. Todos os retentados misturados com T/SM ou M/SM estavam abaixo daquele limiar independentemente do ciclo de liofilização ou do método de congelamento usado,

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90/156 com a exceção de T/SM congeladas a -80°C e liofilizadas usando o ciclo lento ou rápido (FIG. 5).

B. Efeitos das condições de liofilização sobre ο armazenamento [358] Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 foi concentrada lOx usando um dispositivo de filtração, e ensaios de liofilização foram realizados para testar diferentes características: congelamento inicial rápido ou lento (nitrogênio líquido versus -20°C), com ou sem trehalose (0%, 4%, 7,5% e 10%), e ciclos de liofilização suaves ou rápidos (38 h a 2 x 10~⁶ Torr versus 16 h a 135 x 10~⁶ Torr) . Todos os processos liofilizados testados resultaram em produtos

capazes de	reter viabilidade	suficiente	para	iniciar o
crescimento	da cultura	após reidratação,	até	mesmo após
armazenamento prolongado	de 4	a 12 meses	em	temperatura
ambiente.	No entanto,	foram	observadas	diferenças na

viabilidade das bactérias, dependendo das características de liofilização usadas (FIG. 6). Congelamento lento, incorporação de trehalose 7,5%, e etapas de liofilização suaves mantendo atividade de água final acima de 0,04 foram associados com sobrevida maior de Megasphaera elsdeníí.

C. Efeitos de crioprotetores sobre a viabilidade de M. elsdeníí líofílízada [359] Concentrados de células de M. elsdeníí NCIMB 41125 centrifugados foram ressuspensos em fórmula de leite infantil antes da liofilização, resultando em uma diminuição de apenas 1-log na viabilidade celular quando as células eram subsequentemente reidratadas. A adição de trehalose 4% e leite desnatado 7,5% ao concentrado de M. elsdeníí foi testada antes do congelamento lento a -80°C ou congelamento

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91/156 rápido em nitrogênio liquido para determinar a perda de células encontrada durante o processo de congelamento inicial. Como mostrado na FIG. 7, o congelamento rápido com trehalose 4% ou leite desnatado 7,5% gerou a maior recuperação de células viáveis (redução de 0,79 log na contagem de células viáveis). O produto sem adição de crioprotetores, independentemente da técnica de congelamento usada, perdeu entre 2,34 e 1,95 log CFU/ml de Megasphaera elsdeníí.

EXEMPLO 4

Efeitos das condições de armazenamento sobre o rendimento e estabilidade de M. elsdeníi liofilizada [360] Para determinar o efeito de protocolos de liofilização e condições de armazenamento sobre as características de crescimento e prazo de validade de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125, o retentado obtido de uma redução de volume de 90% foi misturado com trehalose 8%/Leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM), congeladas a -80°C ou em nitrogênio líquido (LiqN), e liofilizadas usando o ciclo rápido. As amostras de retentado foram então testadas quanto às características de crescimento bacteriano e sobrevida celular durante o armazenamento a 4 °C ou 25°C em condições aeróbicas ou anaeróbicas por 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 semanas usando análise da curva de crescimento e a técnica de plaqueamento profundo. Resumidamente, os produtos armazenados tiveram amostras coletadas, foram diluídos serialmente e plaqueados sobre uma placa de ágar SDL. Além disso, meio de crescimento (SDL) foi inoculado (1:100) com os produtos liofilizados reidratados e a densidade óptica (OD, 600 nm) registrada até

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92/156 que as culturas alcançassem fase estacionária. 0 experimento foi repetido em 3 dias diferentes e todos os tratamentos foram realizados em triplicata. As amostras liofilizadas reidratadas foram diluídas a fim de realizar curvas de crescimento, pois, sem diluição, a absorbância estava acima do limite em função da presença de leite desnatado. A fim de facilitar a comparação das curvas de crescimento, a mesma diluição foi realizada nas amostras não liofilizadas usadas como controle.

[361] RESULTADOS: Amostras foram liofilizadas e armazenadas em temperatura ambiente ou 4 °C sob condições aeróbicas ou anaeróbicas por 6 meses. Amostras armazenadas em condições aeróbicas, independentemente do tratamento, decaíram rapidamente com uma perda de células adicional em comparação com sua contraparte anaeróbica variando de 0,4 a 3,2 Log após somente 2 semanas de armazenamento. Com base naqueles resultados e para aumentar a clareza da figura, somente a perda de células observada em produtos liofilizados armazenados anaerobicamente é apresentada na FIG. 8. Durante o armazenamento em condições anaeróbicas, amostras armazenadas em temperatura ambiente decaíram mais rápido do que suas contrapartes armazenadas a 4 °C, com a exceção de amostras de T/SM congeladas em nitrogênio líquido. Amostras de T/SM congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em temperatura ambiente pós-liofilização não perderam estatisticamente mais células do que suas contrapartes armazenadas a 4 °C ao longo do período de armazenamento de 16 semanas (P > 0,1) . No entanto, as diferenças entre as amostras se tornaram significantes entre o armazenamento em temperatura ambiente e a 4 °C após 20 semanas de armazenamento

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93/156 (P = 0,0002), com uma diferença de 0,84 log após 20 semanas e uma diferença de 0,89 log após 24 semanas de armazenamento. Todas as amostras de M/SM decaíram mais rápido do que sua contraparte T/SM. Após 24 semanas de armazenamento (FIG. 9), a perda de células em amostras de T/SM congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a 4 °C sob condições anaeróbicas foi significantemente menor do que qualquer um dos outros tratamentos (P < 0,02) . Amostras de T/SM congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a 4 °C sob condições anaeróbicas tiveram uma perda de 2,16 log, comparada com a concentração de M. elsdeníí observada antes da liofilização, com uma perda de 0,82 log resultante do período de armazenamento de 24 semanas. Em cada dia de amostragem, foi realizado um experimento de curva de crescimento para comparar as características de crescimento dos produtos liofilizados com o produto não liofilizado. A FIG. 10 mostra as curvas de crescimento realizadas em amostras congeladas em nitrogênio líquido, liofilizadas com o ciclo rápido (18,5 horas a 250 mTorr), e armazenadas anaerobicamente a 4 °C ou em temperatura ambiente. As amostras não liofilizadas usadas para cada curva de crescimento eram frescas (no máximo 2 dias de idade). O produto liofilizado armazenado a 4 °C teve um tempo de latência mais curto do que o produto liofilizado armazenado em temperatura ambiente, o que é consistente com a diferença na concentração de M. elsdeníí observada nessas amostras (Tabela 4). Após 16 semanas de armazenamento, amostras de T/SM, independentemente da temperatura de armazenamento, tiveram um tempo de latência mais curto do que as amostras de M/SM.

Tabela 4. Tempo de latência observado em amostra não

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94/156 liofilizada ou liofilizada reidratada obtida de retentado com redução de volume de 90%, misturado com trehalose 8%/Leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM), congelada em nitrogênio liquido (LiqN), e liofilizada usando o ciclo rápido após 12, 16, 20 ou 24 semanas de armazenamento sob condições anaeróbicas a 4 ou 25°C.

	Tempo de latência (horas) após X semanas de armazenamento
	12	16	20	24	Média	Desviopadrão
Lactipro	2,50	2,75	3,75	1,75	2, 60	0,72
M/SM armazenadas a 25 °C	8,50	9, 00	10,00	11,75	9,81	1,24
T/SM armazenadas a 25 °C	6,50	6,75	7,25	8,00	7,13	0,57
M/SM armazenadas a 4°C	5,75	8,25	8,00	8,75	7, 69	1,15
T/SM armazenadas a 4°C	4,25	5,25	5,00	4,75	4, 81	0,37

[362] Inclinações para não liofilizadas e tratamento com MSM armazenadas a 25°C por 12 semanas e tratamento com MSM armazenadas a 20°C por 16 semanas estavam anormalmente baixas (Tabela 5) . Após 20 e 24 semanas de armazenamento, inclinações da fase exponencial de amostras liofilizadas não eram numericamente diferentes do controle não liofilizado.

Tabela 5. Inclinações da fase exponencial observadas em amostra não liofilizada ou liofilizada reidratada obtida de retentado com redução de volume de 90%, misturado com trehalose 8%/Leite desnatado 15% (T/SM) ou Maltodextrina 8%/Leite desnatado 15% (M/SM), congelada em nitrogênio liquido (LiqN), e liofilizada usando o ciclo rápido após 12, 16, 20 ou 24 semanas de armazenamento sob condições anaeróbicas a 4 ou 25°C.

Inclinações da fase exponencial após X semanas de armazenamento

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	12	16	20	24	Média	Desviopadrão
Lactipro	0,22	0,31	0,34	0,31	0,30	0, 04
M/SM armazenadas a 25 °C	0,24	0, 16	0,33	0,29	0,26	0, 05
T/SM armazenadas a 25 °C	0,31	0,30	0,34	0,32	0,32	0, 02
M/SM armazenadas a 4°C	0,30	0,33	0,30	0,30	0,31	0, 01
T/SM armazenadas a 4°C	0,32	0,31	0,33	0,32	0,32	0, 01

EXEMPLO 5

Eficácia e segurança de M. elsdenii liofilizada no gado

A. Preparação e prazo de validade de produto liofilizado.

[363] Os frascos usados nesse experimento como uma cultura reidratada inicial de M. elsdenii (para tratamentos Reidratadas e Aplicação por Cobertura) foram preparados 56 dias antes do início do experimento e foram armazenados no refrigerador a 4 °C enquanto era aguardado o uso. Cada frasco continha o equivalente de 5 ml de produto liofilizado. Os frascos foram liofilizados em 6 rodadas de liofilização diferentes. Para cada rodada, 3 frascos foram reidratados pós-liofilização e 3 frascos adicionais foram reidratados no dia do estudo para determinar a concentração de M. elsdenii por frasco (Tabela 6). Animais de cada Grupo reidratado e de aplicação em cobertura receberam o conteúdo de a frasco em esguicho, equivalente a 1,84 x 10¹⁰ CPU de M. elsdenii.

Tabela 6. Concentração de M. elsdenii pós-liofilização e no dia do estudo após 56 dias de armazenamento a 4°C.

	CFU por	frasco
Erasco-rodada de liofilização	Secagem pósliofilização	No dia do estudo
Rodada #1	2,37E+10	1,70E+10
Rodada #2	2,37E+10	1,97E+10
Rodada #3	3,31E+10	1,86E+10
Rodada #4	3,41E+10	1,81E+10

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96/156

Rodada #5	1,98E+10	1,57E+10
Rodada #6	2,34E+10	2,14E+10
Média	2,63E+10	1,84E+10

[364] Após o inicio do experimento, frascos extras das Rodadas # 5 e # 6 foram mantidos a 4 °C e 3 frascos de cada rodada dessas rodadas foram reidratados a cada mês (FIG. 11) .

[365] A concentração de M. elsdenii nos frascos mudou de 4,96 x 10¹⁰ CFU/g para 4,17 x 10¹⁰ CFU/g durante o armazenamento por 11 meses a 4 °C, representando uma perda de apenas 0,07 log no rendimento.

[366] Os produtos usados nesse experimento como uma cultura de M. elsdenii para aplicação em cobertura diária (tratamento em Cobertura) foram preparados cerca de 30 dias antes do inicio do experimento e foram armazenados no congelador em bolsas Polyfoil. Os produtos para aplicação em cobertura foram liofilizados em 6 rodadas de liofilização diferentes, embalados em 15 bolsas Polyfoil individuais (1 bolsa/dia na ração), depurados com nitrogênio, lacrados e armazenados a -80°C até o uso. Para cada rodada de liofilização, 3 embalagens foram reidratadas pósliofilização. A concentração média de M. elsdenii foi de 4 x 10¹⁰ CFU/embalagem. Três embalagens adicionais foram reidratadas no começo de cada semana e usadas para determinar a concentração de M. elsdenii dada aos animais diariamente por adição de solução de reidratação às células de M. elsdenii, deixando-se que as células repousassem por 40 minutos, diluindo as células e plaqueando as células (FIG. 12) . A análise estatística mostrou um aumento na concentração de células ao longo do tempo. Todo o produto foi preparado

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97/156 dias antes do começo do estudo, e o produto usado como cobertura tinha cerca de 80 dias de idade ao final do estudo. Os animais receberam na média 2,19 x 10⁸ CFU de M. elsdeníí diariamente (2,45 x 10¹⁰ CFU/embalagem).

B. Estudo no gado [367] Bois (n = 462; peso corporal inicial de 900 libras (408,23 quilogramas)) foram bloqueados por peso e aleatoriamente designados a um de quatro tratamentos, que consistem em: um Grupo de controle que não recebe Megasphaera elsdeníí (17 currais; 7 cabeças/curral) ) ; um Grupo não liofilizado que recebe antecipadamente 50 ml de produto de M. elsdeníí contendo 2 x 10⁸ CFU/ml (10¹⁰ CFU de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125) (16 currais; 7 cabeças/curral); um Grupo reidratado que recebe antecipadamente uma cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração (10¹⁰ CFU de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125) (16 currais; 7 cabeças/curral); e um Grupo de aplicação em cobertura que recebe antecipadamente uma cultura liofilizada que foi reidratada imediatamente antes da administração (10¹⁰CFU de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125) e um produto liofilizado que foi incorporado na dieta como uma aplicação em Cobertura diária pela duração do estudo (10⁸ CFU de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 diariamente; 17 currais; 7 cabeças/curral). Grupos de bois Não liofilizadas, Reidratadas e Aplicação em cobertura foram colocados em um programa escalonado de 10 dias após receberem seu esguicho antecipado de Megasphaera elsdeníí, enquanto o grupo de controle foi colocado em um programa escalonado de 21 dias. Líquido ruminal foi extraído por meio de ruminocentese 26 horas após a primeira ração ter sido alimentada. Amostras de

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98/156 líquido ruminal foram analisadas quanto ao pH, concentrações de ácido graxo volátil, níveis de endotoxina e capacidade para utilização de ácido lático em um ensaio de desaparecimento in vitro. Para o ensaio de desaparecimento de lactato, dez tubos de 10 ml contendo meio semidefinido de lactato foram inoculados com 0,1 ml de líquido ruminal. A densidade óptica foi medida em duplicata a cada 6 horas por um período de 24 horas para avaliar a capacidade para crescimento com ácido lático como o substrato primário. Os tubos foram colocados no congelador imediatamente após a densidade óptica ter sido observada para determinação subsequente da concentração de ácido lático. Um boi por curral foi equipado com um bolo de radiofrequência contínuo, para rastrear as medições de pH ao longo do estudo de 56 dias. Os bois foram pesados no dia 0, 28 e 56 para determinar o ganho diário médio, ingesta de matéria seca e eficiência da ração.

[368] Para avaliar M. elsdeníí viável ingerida pelos animais, os produtos liofilizados foram aplicados em cobertura sobre milho moldo esterilizado em panelas de alumínio e amostras coletadas após 0, 1, 2 e 4 horas de exposição à atmosfera ambiente no laboratório ou no exterior no sol. Esse experimento foi repetido 4 vezes ao longo dos meses de julho e agosto de 2016 (FIG. 13) . A análise estatística revelou uma interação do tempo de exposição por condições de armazenamento (P = 0,0007), um efeito do tempo de exposição (P < 0, 0001) e um efeito das condições de armazenamento (P < 0, 0001) . A concentração de M. elsdeníí no produto liofilizado misturado com milho moldo e exposto à atmosfera no laboratório diminuiu numericamente durante a

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99/156 exposição de 4 horas, mas não era significantemente diferente da sua concentração inicial. A concentração de M. elsdeníí nas amostras expostas às condições externas diminuiu bem mais rápido. Após 1 hora de exposição, somente 6,4% da M. elsdeníí inicialmente presentes foram recuperados. A concentração de M. elsdeníí nas amostras expostas às condições externas foi significantemente diferente da concentração inicial e de sua contraparte mantida em temperatura ambiente após exposição de 2 e 4 horas. As concentrações de M. elsdeníí nessas amostras foram muito variáveis de um experimento para o outro, como mostrado pelo grande desvio-padrão. Isso talvez seja atribuível às diferenças nas condições externas (calor e umidade), mas também diferenças no produto liofilizado usado, que pode ter sido mais ou menos resistente ao calor e à umidade. Durante o estudo animal, o produto liofilizado foi misturado com milho moldo logo antes da alimentação e foi então prontamente aplicado em cobertura à medida que a ração era colocada no beliche. Os animais correram para o milho moldo e, consequentemente, o produto liofilizado provavelmente foi ingerido menos de 1 hora após a misturação. Supondo que o produto foi ingerido dentro de uma hora, os animais devem ter recebido cerca de 1,4 x 10⁷ CFU/cabeça/dia de células viáveis (6,4% da concentração média no produto de aplicação em cobertura, 2,2 x 10⁸ CFU/cabeça/dia).

[369] 0 escalonamento acelerado dos bois tratados com M. elsdeníí resultou em peso corporal de 28 dias (P = 0,53; Tabela 7), ganho diário médio (P = 0,71) e eficiência da ração (P = 0,69) similares. O tratamento em Cobertura teve menor ingesta de matéria seca do que o controle (P = 0,05).

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O desempenho do confinamento ao longo dos primeiros 56 dias de alimentação produziu resultados similares entre os tratamentos (P > 0,10). Com o controle que recebe um período de escalonamento conservador de 21 dias, essas similaridades entre tratamentos indicam que programas escalonados acelerados podem ser implementados usando qualquer uma das

três formas	de	tratamentos com M.	elsdeníi sem afetar	de
forma adversa	a saúde	do gado	ou o desempenho	do
confinamento.
[370] 0	pH	do líquido	ruminal	(extraído 26 horas após
alimentação	da	primeira	dieta)	foi similar entre	os
tratamentos	(P	> 0,10; Tabela 8).	Houve uma diferença	na

concentração de VFA total, com o tratamento em Cobertura sendo significantemente maior do que os outros tratamentos (P < 0,01) . O tratamento em Cobertura teve concentração de acetato maior do que o tratamento Reidratadas (P = 0,02). Embora tenha havido uma diferença significante na concentração de acetato, a proporção acetato/proprionato foi similar entre os tratamentos (P = 0,96). Outros VFAs foram similares entre os tratamentos (P > 0,18).

[371] A concentração de endotoxina no líquido ruminal (extraído 26 horas após alimentação da primeira dieta) foi similar entre os tratamentos (P = 0,3462; FIG. 14). Os níveis de endotoxina foram medidos como um indicador de lise bacteriana no rúmen. Foi relatado que animais que sofrem de acidose possuem níveis de endotoxina maiores do que 150.000 EU/ml. Os níveis de endotoxina medidos nesse estudo estavam todos abaixo daquele limiar, independentemente do tratamento.

[372] Um boi em cada um dos 32 currais foi equipado com

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101/156 uma sonda instalada de pH ruminal (8 bois/tratamento) que registrava medições do pH ruminal a cada hora ao longo do estudo de 56 dias (FIG. 15). As medições médias do pH ruminal para cada tratamento são registradas em intervalos de 1 hora na FIG. 15. Uma interação de tratamento por dia (P < 0,01) foi detectada para o pH ruminal. Também houve efeitos de tratamento (P < 0,01) e dia de alimentação (P < 0,01) sobre o pH ruminal. O escalonamento acelerado dos tratamentos com M. elsdeníí não fez com que o pH ruminal médio diminuísse para um estado de acidose clínica. À medida que os dias em ração aumentam, os tratamentos liofilizados (Reidratado e Por Cobertura) mantêm um pH ruminal maior do que aquele de tratamentos de Controle e Não liofilizadas.

Tabela 7. Desempenho do confinamento.

Item	Controle	Não liofilizadas	Reidratadas	Aplicação em cobertura	SEM	Valor- P
Peso corporal inicial, kg	409,14	407,32	408,23	408,23	5,53	0,31
Dias 1-28
Ganho diário médio, kg	2,53	2,49	2,41	2,44	0,08	0,32
Ingesta de matéria seca, kg¹	9,95^a	9,76^a'^b	9, 66^a,b	9,37^b	0,17	0,02
Ganho: ração	0,2559	0,2596	0,2489	0,2594	0,007	0, 69
Peso corporal no Dia 28, kg	480,35	477,63	476,27	476,72	5, 94	0,24
Dias 1-56

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102/156

Ganho diário médio, kg	2,13	2,15	2,11	2,09	0,04	0,36
Ingesta de matéria seca, kg	10,36	10,53	10,31	10, 45	0,15	0,29
Ganho: ração	0,2076	0,2047	0,2061	0,2006	0,006	0,76
Peso corporal no Dia 56, kg	534,33	533,87	532,97	531,15	5,76	0,340

¹ Médias dentro de uma fileira sem uma letra sobrescrita comum são diferentes, P<0,05

Tabela 8. Características do liquido ruminal 26 horas após alimentação com dietas iniciais.

Item	Controle	Não liofilizadas	Reidratadas	Aplicação em cobertura	SEM	Valor-P
pH	6,21	6, 03	6, 13	6, 00	0, 13	0,33
Ácido graxo volátil, mM¹
Total	86,3^a	88, I^a	81, I^a	93,5^b	3, 97	<0,01
Acetato	54, l^a'^b	54, 9^a,b	50,8^a	58,4^b	2,40	0,02
Propionato	20,4	21,2	19, 6	22, 6	1,47	0,18
Butirato	10,3	10, 6	9, 4	10, 8	0,73	0,44
Isobutirato	0,24	0,15	0,09	0,21	0,08	0,20
Valerato	0,58	0,67	0,64	0,64	0, 10	0,93
Isovalerato	0,67	0,61	0,50	0, 66	0,11	0,23
Caproato	0,00	0,05	0,00	0,02	0, 02	0,28
Acetato: propionato	2,74	2,67	2,68	2,72	0,11	0,96

¹ Médias dentro de uma fileira sem uma letra sobrescrita comum são diferentes, P<0,01.

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103/156 [373] Medições da densidade óptica foram observadas em intervalos de 6 horas ao longo de um período de 24 horas para determinar as curvas de crescimento de micróbios ruminais mistos inoculados em um meio semidefinido de lactato; esses dados estão apresentados na FIG. 16. Houve uma interação detectada entre tratamento e tempo (P < 0,02). Também foram encontrados efeitos de tratamento (P < 0,01) e tempo (P < 0,01) individuais. Nenhuma diferença entre os tratamentos foi detectada até 12 horas, quando o grupo de Liofilizado reidratado foi maior do que o grupo Liofilizado diariamente (P < 0,02) e controle (P = 0,007). Em 24 horas, não havia diferenças entre os tratamentos com M. elsdeníí (P > 0,10), mas o tratamento de controle teve significantemente menos crescimento microbiano do que todos os tratamentos com M. elsdeníí (P < 0,01) .

[374] A FIG. 17 ilustra o desaparecimento de L-lactato de meio semidefinido de lactato inoculado com micróbios ruminais mistos e incubado por 0, 6, 12, 18 ou 24 horas. Foi detectada uma interação entre tratamento e tempo (P = 0,007), juntamente com efeitos de tratamento (P = 0,01) e tempo de incubação (P < 0, 0001) . O tratamento Não liofilizadas continha menos L-lactato do que outros tratamentos na hora 0 (P = 0,04) . As concentrações de L-lactato foram análogas entre os tratamentos ao longo dos pontos do tempo de 6, 12 e 18 horas (P > 0,10) . Similar aos resultados da densidade óptica mencionados acima, os micróbios ruminais de bois de controle utilizaram menos lactato (P < 0,003) do que os tratamentos com M. elsdeníí coletivamente em 24 horas de incubação, enquanto não foram detectadas diferenças entre os tratamentos com M. elsdeníí (P > 0,10) . Esses dados ilustram

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104/156 que micróbios ruminais de bois tratados com M. elsdenii cresceram mais eficientemente em um meio semidefinido de lactato do que aqueles de bois de controle, sugerindo maior capacidade para utilização de ácido lático nesses tratamentos. Além disso, os tratamentos com Megasphaera foram similares com relação à capacidade para utilização de ácido L-lático.

[375] As concentrações de VFA foram medidas nas amostras usadas para os ensaios de densidade óptica e desaparecimento de lactato e são apresentadas na Tabela 9. Houve uma interação detectada de tratamento por hora para as concentrações de VFA total (P = 0, 002) , acetato (P = 0, 0002) , isobutirato (P = 0,04), butirato (P < 0,0001), isovalerato (P = 0, 0007), e valerato (P < 0, 0001), bem como para a proporção acetato/propionato (P = 0,02). Foram encontrados efeitos do tempo para VFA total e todos os VFAs individuais (P < 0,0001). Foram encontradas diferenças entre os tratamentos para isobutirato (P = 0,02), butirato (P = 0, 0004) e valerato (P = 0,001) . As concentrações de isobutirato foram menores em 18 horas para os Grupos de tratamento Não liofilizadas e Aplicação em cobertura (P < 0,005 e P < 0,004 respectivamente), quando comparadas com o controle e Reidratadas. No ponto do tempo de 24 horas Aplicação em cobertura tinha menos isobutirato (P = 0,002) do que os tratamentos Não liofilizadas e Reidratadas, mas era similar ao controle (P > 0,10). As concentrações de butirato das amostras Reidratadas foram maiores do que aquela da Aplicação em cobertura (P = 0,02) após 18 horas de incubação. O tratamento de controle produziu menos butirato em 24 horas do que os tratamentos com M. elsdenii

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105/156 (P < 0,0001). Também foram detectadas diferenças em butirato entre os tratamentos com Megasphaera nesse ponto do tempo, com as amostras Não liofilizadas contendo concentração maior do que o tratamento Reidratadas (P = 0,01) . Em 18 horas, foram reveladas concentração de valerato menores para o tratamento Reidratadas, quando comparado com os outros tratamentos (P = 0,01). Foram feitas observações similares para a concentração de valerato e butirato em 24 horas de incubação. Controles continham menos valerato do que todos os tratamentos com M. elsdeníí (P < 0,0001), enquanto as concentrações eram maiores em amostras Não liofilizadas do que em Reidratadas (P = 0,03) . Nenhum efeito principal do tratamento foi detectado para outros VFAs (P > 0,05). Concentrações desprezíveis de isocaproato, caproato e heptanoato foram medidas. Uma interação tratamento x tempo (P = 0,02) foi encontrada para a proporção acetato/propionato, bem como um efeito do tempo (P > 0, 0001), mas era similar entre os tratamentos (P = 0,57).

Tabela 9. Alterações no perfil de VFA de um meio semidefinido de lactato inoculado com micróbios ruminais mistos.

Item	Tratamentos	SEM	Valores-P
Controle	Não liofilizadas	Reidratadas	Aplicação em cobertura	Trt	Hora	Tratamento X hora
VFA total, mM						0,36	<0,00 01	0,002
0 h¹	3, 61	3,35	3,52	3,55	5,16
6 h¹	6,41	7,17	7,79	6, 62	5,16
12 h²	7, 64	8,58	17,27	7,80	5,16
18 h³	63,01	49, 48	56,45	53,73	5,16
2 4 h⁴	46,23	78,35	67,22	74,77	5,16

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Acetato , mM						0, 98	<0,00 01	0,0002
0 h¹	3,07	3, 02	3,07	2, 92	2,15
6 h^1,2	4, 92	5,56	5,78	5,13	2,15
12 h²	5,77	6,31	9, 17	6,27	2,15
18 h³	33,47	21, 96	22,75	23,97	2,15
2 4 h⁴	17,25	25,43	22,82	26,05	2,15
Propionato, mM						0,24	<0,00 01	0, 08
0 h¹	0,01			0	2,44
6 h¹'²	1,21	1,29	1, 69	1,21	2,44
12 h²	1, 69	2,00	6, 45	1,47	2,44
18 h³	23,29	20, 84	23,53	24,00	2,44
2 4 h⁴	20,85	33, 61	28,77	32,58	2,44
Isobutirato, mM						0,02	<0,00 01	0, 04
0 h¹	0,03	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 03
6 h¹	0,01	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 03
12 h¹	Despre- zível	Despre- zível	0, 02	0,00	0,03
18 h²	0,14^a	0,01^b	0,15^a	0, 01^b	0,03
2 4 h³	0,15^a,b	0,22^a	0,22^a	0, 08^b	0,03
Butirato, mM						0, 00 04	<0,00 01	<0,0001
0 h¹	0,08	0, 06	0,08	0,09	0,52
6 h¹	0,15	0,20	0,19	0,16	0,52
12 h¹	0,18	0,25	0, 90	0,16	0,52
18 h²	2,71^a'^b	3,24^a'^b	4,36^a	2,75^b	0,52
2 4 h³	3,46^a	8,80^b	7,06^c	7,4 6^b,c	0,52
Isovalerato,						0,9	<0,00 01	0,0007

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mM
0 h¹	0,07	0, 01	0,01	0,03	0,10
6 h¹	0,03	0, 01	0,02	0,03	0,10
12 h¹	Despre- zível	Despre- zível	0, 11	Desprezí- vel	0, 10
18 h²	0,52	0,29	0,75	0,26	0,10
2 4 h³	0,72	1,24	1,06	0, 93	0,10
Valera to, mM						0, 00 1	<0,00 01	<0,0001
0 h¹	0,14	0, 10	0,16	0,17	0,54
6 h¹	0,05	0, 07	0,08	0,06	0,54
12 h¹	Despre- zível	0,03	0, 63	Desprezí- vel	0,54
18 h²	2,63^a	2,91^a	4,63^b	2,53^a	0,54
2 4 h³	3,75^a	8,12^b	7,23^c	7,5 6^b,c	0,54
Isocaproato, mM						0,26	<0,00 01	0, 09
0 h¹	0,10	0, 07	0,09	0,12	0,02
12 h³	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 02
18 h⁴	0,25	0,20	0,21	0,20	0,02
2 4 h⁵	0,03	0,01	Desprez ivel	0, 01	0,02
Caproato, nM						0,07	<0,00 01	0,003
0 h	0,09	0,09	0, 11	0,14	0,02
6 h	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 02
12 h	Despre- zível	0,02	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 02
18 h	Despre- zível	0,14	0,08	Desprezí- vel	0, 02
24 h	0,02	0,11	0,07	0,10	0,02
Hepta-						0,09	<0,00	0,01

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noato, mM							01
0 h	0,02	0, 06	0,00	0,02	0,01
6 h	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel
12 h	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel
18 h	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel
24 h	Despre- zível	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel
A/P						0,57	<0,00 01	0, 02
0 h¹	0,06	Despre- zível	Despre- zível	Desprezí- vel	0, 18
6 h^1,2	4,01	4, 44	4,24	4,00	0,18
12 h²	3,98	4,60	4,17	4,60	0,18
18 h³	2,14	1,91	1,77	1, 91	0,18
2 4 h⁴	1,12	0,82	0, 91	0, 91	0,18

1,2,3,4 Pontos do tempo sem um número sobrescrito comum são diferentes, P<0,01 a,b,_c Médias dentro de uma fileira sem uma letra sobrescrita comum são diferentes, P<0,05

EXEMPLO 6

Atividade de fitase de Megasphaera elsdeníí [376] A atividade de fitase in vitro de células de M. elsdeníí foi avaliada.

[377] Células de Megasphaera elsdeníí NCIMB 41125 foram cultivadas sob condições anaeróbicas como descrito nesse relatório descritivo em meios semidefinidos de lactato contendo fosfato inorgânico (KH2PO4) ou fitato como uma fonte de fósforo. Em intervalos de 2 horas desde o início da cultura (0 hora) até 8 horas, amostras de 1 mililitro (ml)

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109/156 foram removidas da cultura e centrifugadas para formar um pélete de células. A atividade de fitase nos péletes de células foi então determinada usando o método de azul de Molibdato. Veja Yanke e cols., Microbiol. 144: 1.565-1.573 (1998) . Resumidamente, fosfato inorgânico liberado por divagem enzimática dentro de 30 minutos de incubação a 37 °C em pH 5,0 foi quantificado por espectrof otometria a 700 nanômetros (nm) e comparado com uma curva-padrão. A atividade de fitase foi determinada como a quantidade de fósforo inorgânico liberada do pélete de células por minuto sob as condições de teste.

[378] A FIG. 18 mostra que o crescimento das células de Megasphaera elsdenii na presença ou ausência de fitato resultou em atividade de fitase significante, o que confirma que: (1) células de Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 produzem fitase, (2) a produção de fitase não é inibida pela presença de fósforo nos meios, e (3) a produção de fitase por Megasphaera elsdenii parece ser maios na presença de fitato nos meios.

EXEMPLO 7

Efeito de Megasphaera elsdenii sobre a concentração e prevalência de Salmonella [379] Frangos de corte com um dia de idade (n = 384) foram alocados aleatoriamente a quatro grupos de tratamento diferentes: 1) um grupo de controle que não recebe Megasphaera, 2) um grupo ad libitum que possui acesso livre aos alimentadores de garrafa contendo Megasphaera elsdenii liquida NCIMB 41125, 3) um grupo Liofilizadas que recebe Megasphaera elsdenii liofilizada NCIMB 41125 diariamente em sua ração, e 4) um grupo de gavagem oral que recebe

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Megasphaera elsdeníí liquida NCIMB 41125 no dia 0.

[380] Cada um dos quatro tratamentos foi representado por 16 gaiolas contendo 6 pássaros cada. Os pesos dos animais, consumo de ração e conversão alimentar foram registrados ao longo do período do experimento de 15 dias. Após um período de alimentação de 15 dias, 2 animais por gaiola foram selecionados aleatoriamente, abatidos, e os cecos foram recuperados para determinar a prevalência de Salmonella. Resumidamente, os cecos foram recuperados, colocados em bolsas Ziploc, e armazenados no gelo. Os cecos foram então lavados com etanol 70% e manualmente massageados para extrair o conteúdo. Um mililitro do conteúdo recuperado foi diluído serialmente em solução salina com tampão fosfato (PBS) e plaqueado em ágar verde brilhante (BGA) . As placas de BGA foram incubadas por 24 h a 37°C. Supostas colônias de Salmonella (colônias de cor rosa) foram contadas e confirmadas como Salmonella usando o teste de látex de Salmonella Oxoid FT0203 (Oxoid-Thermo Scientific, Hampshire, UK). Adicionalmente, um mililitro de amostra de conteúdo do ceco foi adicionado a 9 ml de Rappaport-Vassiliadis (RV) para enriquecimento seletivo. Se nenhum crescimento de Salmonella detectável fosse observado em placas de BGA, enriquecimento de RV era plaqueado sobre placas de BGA, incubado por 24 h a 37 °C, e avaliado quanto à presença de Salmonella. Às amostras sem crescimento com plaqueamento direto, mas crescimento positivo com enriquecimento de RV, foi dada uma contagem arbitrária de 9 (1 abaixo do limite de detecção teorético) e amostras sem crescimento nem no plaqueamento direto nem com enriquecimento RV receberam uma contagem de 0.

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111/156 [381] Os resultados indicaram que pássaros que recebem o material liofilizado tinham menor concentração cecal de Salmonella no número de unidades formadoras de colônia por mililitro (CFU/ml) por uma diferença de -1 Log, comparado com o grupo de controle. Veja a FIG. 19. A prevalência de Salmonella em amostras do grupo Liofilizadas também foi diminuída por 13%, quando comparado com o grupo de controle. Veja a FIG. 20.

EXEMPLO 8

Efeito de Megasphaera elsdeníí sobre o desempenho do crescimento e características cecais de frangos de corte

A. Design experimental e tratamentos [382] Vinte e quatro réplicas de três tratamentos em um design randomizado de bloqueio completo usando machos de um dia de idade foram realizadas usando frangos de corte Cobb 500 que tinham um dia de idade no início do tratamento (CobbVantress em Siloam Springs, Arkansas) . Os tratamentos consistiram em cepa de M. elsdeníí NCIMB 41125 (MS-Biotec, Wamego, Kansas) administrada como uma gavagem oral ou uma névoa aerossolizada aplicada à superfície corpórea dos pássaros, e um controle (sem M. elsdeníí) . Os pássaros foram abrigados em 72 currais, com cada curral contendo 35 pássaros no início do experimento (2.520 pássaros no total).

[383] Antes da administração de M. elsdeníí, bolsas de folha metálica de 5 litros de cultura fresca foram vigorosamente agitadas para homogeneizar o conteúdo. Tubulação de Tygon foi usada para conectar um dispositivo de dosagem operado manualmente à bolsa. O reservatório do dispositivo de dosagem foi repetidamente preenchido e dispensado várias vezes para evacuar ar. O conteúdo era

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112/156 considerado livre de ar ambiente quando a cultura, que contém um indicador de oxigênio, retinha sua cor normal.

[384] Os pintos foram alocados em grupos de 35, e o peso de cada grupo foi registrado. Os grupos de pássaros foram processados por bloqueio, com tratamentos experimentais sendo atribuídos aleatoriamente dentro de cada bloco.

[385] Vinte e quatro currais (35 pássaros/curral; 840 pássaros no total) foram dosados por gavagem oral com 0,2 ml de uma cultura fresca contendo 1,97 x 10⁹ CFU/ml de cepa de M. elsdenii NCIMB 41125 usando uma seringa de autopreenchimento Scorex Classic 173.05005 (Ecublens, Suíça). Os técnicos contiveram os pássaros usando o polegar e o dedo indicador para manter o bico aberto enquanto o conteúdo da seringa era descartado diretamente nas cavidades orais dos pássaros.

[386] Vinte e quatro currais (35 pássaros/curral; 840 pássaros no total) foram dosados por névoa aerossolizada de uma cultura fresca contendo 1,97 x 10⁹ CFU/ml de cepa de M. elsdenii NCIMB 41125 aplicada por dispositivo de esguicho pneumático adaptado com um bico de atomização. Os pássaros foram colocados em um tonel plástico (50 cm x 35 cm x 40 cm) e a cultura foi aplicada às suas superfícies corporais como uma névoa atomizada em um volume de 60 ml por curral (aproximadamente 1,7 ml/pássaro).

[387] Vinte e quatro currais (35 pássaros/curral; 840 pássaros no total) não tiveram contato com M. elsdenii e serviram como controles. Para evitar contaminação cruzada com pássaros tratados, pássaros de controle foram manipulados somente por funcionários designados que não tiveram contato com pássaros tratados e colocados em

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113/156 transportadores designados para serem pesados e transferidos para currais. Em um caso os pássaros foram contados erroneamente e curral 51 recebeu 33 pássaros ao invés de 35 pássaros em função de um erro de um técnico.

B. Alimentação e fornecimento de água [388] Água fresca foi oferecida ad libitum por meio de bebedores (6 bebedores/curral) suspensos de uma linha de abastecimento de água. A altura do bebedor foi ajustada ao longo do experimento para acomodar o crescimento dos pássaros. A Tabela 10, abaixo, mostra as dietas usadas no experimento. Todas as dietas foram alimentadas em alimentadores por gravidade suspensos no centro do curral. Ração foi adicionada como necessário para assegurar acesso ad libitum por toda a duração do estudo. Cinco kg de dieta inicial foram colocados em alimentadores por gravidade antes da colocação dos pássaros em currais.

Tabela 10. Composições de dietas.

	Fase dietética¹
Ingrediente	Inicial	De crescimento	De terminação
Milho moldo	55,26	59, 74	65, 06
Farelo de soja debulhada	37,15	32, 60	27,90
Óleo de soja	3, 10	3,35	3, 10
Calcário moldo	1,45	1,40	1,25
Sal	0,37	0,37	0,37
Biofos, 21%	1,7	1, 6	1,4
Bicarbonate de sódio	0,22	0, 19	0, 17
Pré-mistura Nutrablend Poultry VTM	0,25	0,25	0,25

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Cloridrato de L- lisina	0,33	0,30	0, 17
L- Metionina	0, 13	0, 15	0,28
L-Treonina	0, 04	0, 05	0, 07

¹ As dietas foram peletizadas através de um molde de 3 mm, resfriadas, esfareladas e dispensadas em sacos de papel para armazenamento até a alimentação.

[389] A dieta inicial foi removida dos currais no d 16 do estudo. Ração residual foi pesada, removida de cada alimentador, e colocada em caixas numeradas que correspondiam ao número do curral. Os alimentadores foram enchidos novamente com a dieta de crescimento. Esse processo foi repetido no dia 30 do estudo, dessa vez substituindo a dieta de crescimento com a dieta de terminação. No dia 36 o experimento foi terminado, e a dieta de terminação residual foi pesada e registrada para cada curral.

[390] O consumo de ração total por curral para cada fase (inicial, de crescimento e de terminação) foi calculado como: Ração total consumida/[contagem diária de cabeças no curral x dias totais na ração]

C. Pesos dos pássaros [391] Os pesos nos currais foram registrados ao final de cada período de alimentação (Inicial, de crescimento, De terminação). Ao final do período inicial (dia 16), todos os pássaros em cada curral foram colocados em um tonel (50 cm x 35 cm x 40 cm) e pesados. O peso do tonel foi subtraído do peso total para determinar o peso dos pássaros no curral. Ao final do período de crescimento (dia 30) todos os pássaros em cada curral foram colocados em 2 tonéis de peso igual (cada um de 103 cm x 55 cm x 41 cm) , pesados, e os pesos

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115/156 adicionados juntos. 0 peso de cada tonel (medido antes dos pássaros serem colocados neles) foi subtraído do peso total para determinar o peso dos pássaros no curral. Ao final do período de terminação (dia 36) , todos os pássaros em cada curral foram colocados em 2 tonéis de peso igual (cada um de 103 cm x 55 cm x 41 cm) e pesados. Nesse momento, a balança foi tarada com os tonéis no lugar. Os pesos dos pássaros em cada tonel foram então adicionados para determinar o peso total do curral. A balança era tarada novamente entre currais para levar em conta o acúmulo fecal. Em cada um dos períodos de pesagem, foi realizada uma verificação da contagem de cabeças à medida que os pássaros eram colocados em tonéis.

D. Procedimentos de amostragem [392] A cada semana (dias 7, 14, 21, 28 e 35), 1 a 3 pássaros foram selecionados aleatoriamente de cada curral e sacrificados por deslocamento cervical. O conteúdo cecal (0,5 g) foi coletado e misturado com água deionizada (2 ml) em um frasco de cintilação HDPE de 20 ml (Fisher Sei.; 03337-23B) usando um misturador por turbilhonamento. Um medidor de pH portátil (medidor de pH portátil Orion 3-Star Thermo Scientific, Waltham, MA) foi usado para determinar o pH. Quatro partes da mistura cecal foram adicionadas a 1 parte uma solução a 25% p/v de ácido metafosfórico e homogeneizadas usando um misturador por turbilhonamento. A amostra foi então transferida para 2 tubos de microcentrífuga em alíquotas de 1 ml e congelada a -18 °C até aguardar a análise de ácidos graxos voláteis (VFAs).

[393] Nos dias 7 e 21, o conteúdo cecal foi dividido em 2 alíquotas. Uma alíquota foi usada para análise de VFA e preparada como explicado acima. A outra (0,5 g) foi colocada

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116/156 diretamente em um frasco de cintilação HDPE de 20 ml separado (Fisher Sci.; 03-337-23B) e congelada (80°C) para quantificação de números bacterianos usando, PCR em tempo real, quantitativa.

E. Análise do pH cecal e ácidos graxos voláteis [394] Amostras cecais previamente diluídas e acidificadas foram descongeladas, homogeneizadas usando um misturador por turbilhonamento e centrifugadas a 24 x g por 18 min. O sobrenadante aquoso foi transferido para frascos de cromatografia a gás. Os ácidos graxos voláteis foram medidos usando um cromatógrafo a gás Agilent 7890 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado com uma coluna capilar DB-WAX (espessura de filme de 30 m x 0,53 mm x 0,5 mm; Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e detector de ionização de chama. Hélio foi usado como um gás carreador em uma taxa de fluxo de 22 cm/s, com uma divisão de injeção de 1 μΐ e uma divisão de fluxo de 50:1. A temperatura inicial do forno foi de 80°C e a temperatura foi aumentada a 10°C/min até 220°C. As temperaturas da entrada e do detector foram de 250°C. Ácidos graxos voláteis foram quantificados por comparação com padrões conhecidos (Supelco Volatile Fatty Acid Standard Mix; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contendo acetato, propionato, isobutirato, butirato, isovalerato, valerato, isocaproato, caproato e heptanoato.

F. Medições de carcaças [395] Os pássaros foram abatidos em 5 semanas de idade para determinar as medições das carcaças. A alimentação foi suspensa aproximadamente 4 h antes do abate. Cinco pássaros de tamanho médio foram selecionados de cada curral e colocados em caixas de captura para transporte até a área de

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117/156 processamento. Os 5 pássaros foram pesados por curral para determinar o peso vivo imediatamente antes do abate por atordoamento e exsanguinação. Os pássaros foram sangrados por 2 min e depois colocados em um escaldador rotário a 63°C por aproximadamente 30 s. Os pássaros foram transferidos para um arrancador mecânico de cilindro rotatório por 30 s para remoção das penas. Os pés, cabeça e canelas foram removidos e as carcaças evisceradas através de uma incisão em torno do respiradouro. As carcaças foram então pesadas por curral para determinar o rendimento de carcaça quente.

G. Analise estatística [396] Os dados foram analisados usando o procedimento misto do software SAS® Versão 9.4. O modelo incluiu efeito do tratamento fixo, efeito de bloqueio aleatório e curral como a unidade experimental. Significância foi declarada em P < 0,05. Diferenças entre médias de quadrados-mínimos foram determinadas usando a opção PDiff do software SAS®.

H. Resultados [397] Os frangos demonstraram ingestão alimentar, eficiência da ração e ganho diário médio similares através de tratamentos. Os pesos e mortalidades dos pássaros também não foram afetados por tratamento. No entanto, o rendimento de cobertura foi menor para pássaros que receberam M. elsdenii como uma gavagem oral, comparado com aquele de pássaros de controle ou pássaros que receberam M. elsdenii como uma névoa aerossolizada.

[398] O pH cecal foi menor em pássaros que receberam M. elsdenii por névoa ou aplicação oral, comparado com aquele de pássaros de controle (P < 0,01; Tabela 11).

Tabela 11. Efeito de Megasphaera elsdenii sobre o pH cecal

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118/156 e concentrações de VFA.

						Valor-P
Item*	Di a	Controle¹	Névoa²	Oral³	SEM	Tratamento	Contraste'
pH	7	6, 87^Aa	6, 85^Aac	6,8 l^Aa	0, 103	T, D	0, 01
	14	6, 67^	6,25^Bb	6, ll^Bb
	21	6, 15^Aa	6, 12^a13	6,25^a13
	28	6, 8 3^Aab	6, 8 l^Aa	6, 67^Aac
	35	7,2 6^Ac	7,10^Ac	7,15^Ad
Acetato	7	53,53^Aa	58, 66^Aa	5 8,4 2^Aa	3, 604	D, I	0, 91
	14	61,7 9^Aa	6 6,2 0^ABa	7 4,0 0^Bb
	21	61,48^	47, 66^Bb	46, 4^Bc
	28	40,42^°	3 8,8 3^a13	42,36^Acd
	35	39, 13^	41,8 3^a13	3 6,2 2^Ad
Propio- nato					0, 608	D, I	0,51
	7	1,8 2^{A a}	1,4 8^Aa	1,52^Aa
	14	2,35^Aab	2,10^Aa	2 , 6 9^Aab
	21	6,3 6^Ac	4,01^Bb	3, 63^Bbc
	28	3,7₃λμ	4,0 8^a13	4,2 l^Ac
	35	4,5 8^Ad	5,8 8^Ac	5,96^Ad
Acetato : propionato	7	31, 96^Aa	41,33^{B a}	42,03^Ba	2,168	T, D, I	0, 003
	14	2 9, 8 0^Aa	40,44^Ba	33, 69^a13
	21	12,3 6^Ac	13,62^⁵³⁰	13,57^Ac
	28	13,2 5^Ac	12,9 6^Acd	14,3 0^Ac
	35	9, 8 l^Ac	8,33^Ad	7,8 0^Ad
Butirato	7	5,60^Aa	5,5 4^Aa	5,73^Aa	1, 094	D, I	0,73
	14	9, 45^a3	10, 95^ABb	13,40^Bb
	21	17,7 9^Ac	11,77^Bb	13,45^Bb
	28	6, 67^{A ab}	7,02^Aac	7,35^Aac
	35	8,15^a13	9,7 0^Aab	8, 4 0^Aac
Isobuti- rato	7	0,3 9^Aa	0,3 6^Aa	0,34^Aa	0, 055	D	0, 04
	14	0,37^Aa	0,35^Aa	0,45^Aa

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	21	0,38^Aa	0,17^Bb	0,15^Bb
	28	0,05^	0,00^Ac	0,00^
	35	0,37A^a	0,37^Aad	0,34^Aa
Valerato	7	0,2 9^Aa	0,31^Aa	0,2 9^Aa	0, 078	D	0,89
	14	0, 68^°	0,71^	0,90^Bb
	21	1,13^Ac	0, 91^Bb	0, 9 6^ABb
	28	0,32^Aac	0,2 8^Ac	0,34^Aa
	35	0, 63^	0,7 9^a15	0,68^Ac
Isovale- rato	7	0,317^Aa	0,2 92^Aa	0,314^Aa	0,0592	D	0, 96
	14	0,375^Aa	0,35 7^Aab	0,505^
	21	0,419^Aa	0,39 6^ABb	0,257^ABa
	28	0,038^	0, 0 4 0^Ac	0,05 0^Ac
	35	0,325^Aa	0,39 6^Aab	0,355^Aab
Caproato	7	0,15 0^Aa	0, 168^Aa	0,14 4^Aa	0,0208	T, D, I	0,13
	14	0,15 0^Aa	0, 161^Aa	0,292^Bb
	21	0,000^°	0,000^	0,001^Ac
	28	0,0 0 0^Ac	0,000^	0,001^Ac
	35	0,0 0 0^Ac	0,000^	0,001^Ac
Isoca- proato	7	0,125^Aa	0, 116^Aa	0,142^Aa	0,0148	D	0,79
	14	0,085^	0, 101^Aa	0,078^
	21	0,0 0 0^Ac	0,001^	0,001^Ac
	28	0,0 0 0^Ac	0,001^	0,001^Ac
	35	0,000^a	0,001^	0,001^Ac
Hepta- noato					0,0239	D	0, 88
	7	0,177^Aa	0, 18 6^Aa	0,14 6^a
	14	0,104^	0, 082^Bb	0,103^AB
	21	0,0 0 0^Ac	0, 0 02^Ac	0,003^a
	28	0,0 0 0^Ac	0, 001^Ac	0,003^a
	35	0,000^Ac	0, 001^Ac	0,053^a
VFA total					4,806	D, I	0,79
	7	62,4 0^Aa	67,10^Aa	67,01^Aa
	14	75,34^	81,0 0^ABb	92,3 9^Bb

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21	87,57^	64, 90^Ba	64,82^Bad
28	51,2 3^Aa	50,25^Ac	5 4,2 9^Aac
35	53, 18^Aa	58, 98^Ac	51, 97^Ad

* concentração de VFA relatada em mM ¹ Pássaros de controle não tiveram contato com M. elsdeníí ² Pássaros que receberam M. elsdeníí como uma névoa aerossolizada aplicada à sua superfície corpórea em uma taxa de aproximadamente 1,7 ml/pássaro ³ Pássaros receberam 0,2 ml de M. elsdeníí como uma gavagem oral ^τ T = Efeito do tratamento; D = Efeito do dia de amostragem;

I = Interação entre tratamento e dia de amostragem; P<0,05 ^ττ Contraste M. elsdeníí vs. Controle ^A'^B Médias dentro de uma fileira sem um sobrescrito comum são diferentes em P<0,05 ^a'^b Médias dentro de uma coluna sem um sobrescrito comum são diferentes em P<0,05

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121/156 [399] 0 pH cecal médio para os tratamentos de controle, por névoa aerossolizada e por gavagem oral foram de 6,76, 6,63 e 6,60, respectivamente. Uma interação de tratamento por dia foi detectada para acetato (P < 0,01), propionato (P = 0,03), butirato (P < 0,01), proporção acetato/propionato (P = 0,01; proporção A/P), caproato (P = 0,002) e concentrações de VFA total (P < 0,01) cecais (Tabela 4) . Acetato aumentou desde o dia 7 até 14, com pico no dia 14. O conteúdo cecal de pássaros que receberam M. elsdeníí como uma gavagem oral continham concentrações maiores de acetato, butirato e caproato do que aquelas de pássaros de controle no dia 14 (P < 0,01). Por volta do dia 21, a concentração de acetato diminuiu através de todos os tratamentos; no entanto, a concentração de acetato nos cecos foi maior em pássaros de controle, quando comparados com pássaros tratados com névoa aerossolizada ou gavagem oral (P < 0,01) . As concentrações de propionato e butirato também eram maiores no conteúdo cecal de pássaros de controle do que aquelas de pássaros tratados com M. elsdeníí no dia 21 (P 0,01) . A concentração de propionato alcançou o pico no dia 21 em todos os tratamentos e permaneceu elevada até o dia 35, mas elas não diferiram através de tratamentos desde o dia 28 até o dia 35 (P > 0,05). A proporção A/P foi maior no conteúdo cecal de pássaros tratados com M. elsdeníí, comparados com controles no dia 7 (P < 0,01), com uma proporção A/P de 31,96, 41,33 e 42,03 para o controle, névoa aerossolizada e gavagem oral, respectivamente. No dia 14, a proporção A/P cecal de pássaros tratados com uma névoa aerossolizada de M. elsdeníí (40,44 mM) era maior do que aquela de pássaros de controle (29,80 mM) ou daqueles que receberam uma gavagem oral de M. elsdeníí

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122/156 (33,69; P < 0,03). A proporção A/P cecal não foi diferente através de tratamentos no dia 21 até 35 (P > 0,05) . As concentrações de isobutirato, valerato, isovalerato, isocaproato e heptanoato no conteúdo cecal não foram afetadas por tratamento (P > 0,10). A concentração de VFA cecal total foi maior em pássaros que receberam gavagem oral, comparados com pássaros de controle no dia 14 (P < 0,001) . No entanto, a concentração de VFA total foi menor (P < 0,05) no conteúdo cecal de pássaros que receberam M. elsdeníí como uma névoa aerossolizada ou uma gavagem oral (64,90 mM e 64,82 mM, respectivamente) do que aquela de controles (87,57 mM) no dia 21. As concentrações cecais totais de VFA foram similares através de tratamentos para os dias 7, 28 e 35 (P > 0,30).

EXEMPLO 9

Efeito de Megasphaera elsdeníí sobre o desempenho do crescimento de frangos de corte

A. Design experimental e Tratamentos - Estudo 1 [400] Dezoito réplicas de seis tratamentos, bloqueados por batería e por nível foram realizadas usando frangos de corte Cobb 500 (Cobb-Vantress em Siloam Springs, Arkansas) que tinham um dia de idade no início do tratamento. Os tratamentos consistiram em um controle (sem probiótico), Lactipro Advance® (cultura líquida não liofilizada de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41125, MS Biotec, Wamego, Kansas) administrado como uma gavagem oral, cultura de Megasphaera elsdeníí cepa KS 249 administrada como uma gavagem oral, Megasphaera elsdeníí cepa ATCC® 25940 administrada como uma gavagem oral, Lactipro Advance® (cultura líquida não liofilizada de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41125 MS Biotec, Wamego, Kansas) aplicado à

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superfície	corpórea de	pássaros	como	um aerossol,	e
Megasphaera	elsdeníí cepa NCIMB	41125	diariamente	(MS
Biotec, Wamego, Kansas).	Os pássaros	foram	abrigados em	108
currais, e	cada curral	continha 8	pássaros no início	do

experimento (1.152 pássaros no total).

[401] Os pássaros foram contados em grupos de 8, e o peso de cada grupo foi registrado. Os grupos de pássaros foram processados como blocos, e tratamentos experimentais foram designados aleatoriamente aos currais dentro de cada bloco.

[402] Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) foram dosados oralmente (gavagem) com 0,2 ml de Lactipro Advance® contendo 1,97 x 10⁹ CFU/ml de cultura 41125. Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) foram dosados oralmente (gavagem) com 0,2 ml de uma cultura fresca contendo uma concentração desconhecida de Megasphaera elsdeníí cepa KS 249. Tentativas de avaliar a CFU/ml para essa cepa não tiveram sucesso. Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) foram dosados oralmente (gavagem) com 0,2 ml de uma cultura fresca contendo 1,06 x 10⁹ CFU/ml de Megasphaera elsdeníí cepa ATCC® 25940. Os pássaros dosados com todos os tratamentos orais foram contidos na palma da mão de um técnico, o bico foi mantido aberto usado o polegar e o dedo indicador, e a cultura foi descarregada diretamente na cavidade oral usando uma pipeta repetidora Eppendorf® Reference (Hamburgo, Alemanha).

[403] Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) foram aspergidos com 15 ml por curral de Lactipro Advance® contendo 1,97 x 10⁹ CFU/ml de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41125 (aproximadamente 1,88 ml/pássaro). Os pássaros foram colocados em um tonel plástico (50 cm de

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124/156 comprimento x 35 cm de largura, x 40 cm de profundidade), e a cultura foi aplicada à superfície corpórea de pássaros como uma névoa atomizada com o uso de um dispositivo de esguicho pneumático adaptado com um bico de atomização. Os pássaros aspergidos foram manipulados por funcionários designados e colocados em transportadores designados para pesagem, aplicação e transferência para currais para minimizar contaminação cruzada.

[404] Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) receberam uma cobertura (mistura de dieta e Megasphaera elsdenii) contendo 1,18 x 10⁷ CFU/g de Megasphaera elsdenii cepa NCIMB 41125 em uma taxa de um quarto de colher de chá por pássaro. O tratamento foi adicionado diretamente através de alimentadores a cada dia às 13:00 h começando no dia 10 do estudo.

[405] Os dezoito currais restantes (8 pássaros/curral; total de 144 pássaros) serviram como controles e não tiveram contato com o produto probiótico. Os pássaros de controle foram manipulados por funcionários designados e colocados em transportadores designados para pesagem e transferência para currais para minimizar contaminação cruzada por pássaros tratados.

B. Design experimental e Tratamentos - Estudo 2 [406] Dezoito réplicas de dois tratamentos, bloqueadas por bateria e por nível foram realizadas usando frangos de corte Cobb 500 de um dia de idade (Cobb-Vantress em Siloam Springs, Arkansas) . Os tratamentos consistiram em um controle (sem probiótico) ou Megasphaera elsdenii cepa NCIMB 41125 (MS Biotec, Wamego, Kansas). Os pássaros foram abrigados em 108 currais, e cada curral continha 8 pássaros

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125/156 no inicio do experimento (1.152 pássaros no total).

[407] Os pássaros foram contados em grupos de 8, e o peso de cada grupo foi registrado. Os pássaros foram processados como blocos, e os tratamentos experimentais foram designados aleatoriamente aos currais dentro de cada bloco. Dezoito currais (8 pássaros/curral; 144 pássaros no total) receberam uma cobertura (mistura de dieta e Megasphaera elsdeníí) contendo 1,18 x 10⁷ CFU/g de Megasphaera elsdeníí cepa NCIMB 41125 em uma taxa de um quarto de colher de chá por pássaro. O tratamento foi adicionado diretamente através dos alimentadores a cada dia às 13:00 horas, começando no dia 10 do estudo.

[408] Os 18 currais restantes (8 pássaros/curral; total de 144 pássaros) serviram como controles, e não tiveram contato com o produto probiótico. Os pássaros de controle foram manipulados por funcionários designados e colocados em transportadores designados para pesagem e transferência para currais para minimizar contaminação cruzada por pássaros tratados.

C. Alimentação e fornecimento de água - Estudos 1 e 2 [409] Água fresca ficou disponível ad libitum. Antes da colocação dos pássaros nos currais, 9,5 kg de uma dieta inicial comum (Tabela 12) foram colocados em alimentadores ao longo de cada curral.

Tabela 12. Composição da dieta experimental.*

Ingrediente
Milho moldo	55,26
Farelo de soja (47% CP)	37,15
Óleo de soja	3, 10
Calcário moldo	1,45

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Biofos 21%	1,70
Sal	0,37
Bicarbonate de sódio	0,22
Pré-mistura de vitamina para aves domésticas	0,25
Cloridrato de L-lisina	0,33
L-Metionina	0, 13
L-Treonina	0, 04

* As dietas foram peletizadas através de um molde de 3 mm, resfriadas e esfareladas [410] A ração foi reabastecida como necessário para assegurar acesso ad libitum por todo o estudo. Após o término (dia 18) do experimento, ração não consumida foi removida de cada alimentador, pesada e registrada. A ração consumida total pelo curral foi calculada como a diferença entre quantidades adicionadas e recuperadas dos alimentadores. A ingestão alimentar diária por pássaro foi calculada como: Ração consumida total -e [contagem diária de cabeças no curral x dias totais em ração]

D. Pesos corporais - Estudos 1 e 2 [411] Ao término do estudo, todos os pássaros no curral foram colocados em um tonel (50 cm de comprimento x 35 cm de largura, x 40 cm de profundidade) e pesados. O peso do tonel foi medido antes dos pássaros serem colocados nele e foi subtraído do peso total para verificar o peso dos pássaros no curral. A verificação da contagem de cabeças também foi feita nesse momento.

E. Análise estatística - Estudos 1 e 2 [412] Os dados foram analisados usando o procedimento misto do software SAS® 9.4. O modelo incluiu efeito do tratamento fixo, efeito de bloqueio aleatório e curral como a unidade experimental. Significância foi declarada em P <

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0,05. Diferenças entre médias de padrados-minimos foram determinadas usando a opção PDiff do software SAS®.

F. Resultados - Estudos 1 e 2 [413] Para o Estudo 1, frangos através de todos os grupos de tratamento mostraram ingestão alimentar diária, ganho diário médio, ganho/ração e mortalidade similares.

[414] No entanto, como mostrado na Tabela 13, o Estudo 2 mostrou que o ganho diário médio (P = 0,02) e ganho/ração (P = 0,04) eram, ambos, maiores em pássaros que recebem a Megasphaera elsdenii, quando comparados com os pássaros de controle. Veja também a FIG. 21, que mostra a proporção ração/ganho. A ingesta de ração e a mortalidade não foram diferentes entre os grupos de tratamento.

Tabela 13. Efeito de Megasphaera elsdenii sobre o desempenho do frango (Estudo 2).

Item	Controle⁺	Liofilizadas⁺⁺	SEM²	Vai or-p+⁺⁺⁺
N° de currais	18	18	-	-
ADO^{1 2}, g	27, 6^a	29, 0^b	0,43	0, 02
Ingesta de ração, g/d	36, 2	36, 5	0,54	0,70
Ganho/ração	0,7 6^a	0, 8 0^b	0, 01	0, 04
Mortalidades, %	2,08	0, 69	0, 93	0,31

¹ Ganho diário médio ² Erro padrão da média ⁺ Tratamento de controle, sem probiótico ⁺⁺ Megasphaera elsdenii liofilizada foi administrada na forma de uma cobertura ⁺⁺⁺⁺ Valor-P para teste-F modelo global

Médias dentro de uma fileira com sobrescritos diferentes são diferentes em P < 0,05

EXEMPLO 10

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128/156

Efeito de Megasphaera elsdeníi sobre a fermentação Cecal equina

A. Design experimental e Tratamentos [415] Oito cavalos quarto-de-milha, 4 garanhões e 4 castrados (peso corporal médio = 540 kg; SEM = 75 kg) , previamente adaptados com cânulas cecais (Beard e cols., JAS 89 (8): 2.425-2.429 (2011)), foram usados em um Quadrado Latino incompleto 3x3 (tratamento x cavalo) replicado ao longo de 3 períodos de tratamento. Cada período de tratamento

foi separado	por	um	período de	washout	de 2 8	dias. Os
tratamentos foram	(D	um	controle	negativo	(sem M.	elsdeníi;
Controle), (2)	i 50	ml	de	cultura	fresca contendo	1,97 x 10⁹

CFU/ml de cepa de M. elsdeníi NCIMB 41125 (Lactipro Advance®, MS Biotec, Wamego, Kansas) administrados por meio de esguicho oral (Esguicho), e (3) 0,40 g de uma cultura liofilizada contendo 7,02 x 10⁸ CFU/ml de cepa de M. elsdeníí NCIMB 41125 (MS Biotec, Wamego, Kansas) administrado por meio de 2 guloseimas para cavalos à base de melaço (lioflizadas) . Os cavalos foram designados aleatoriamente aos tratamentos (Tabela 14) .

Tabela 14. Alocações de tratamento.

ID. do cavalo	Período de TRT 1	Período de TRT 2	Período de TRT 3
0	Liofilizada³	Controle¹	Cobertura2
1	Controle	Cobertura	Liofilizada
2	Cobertura	Liofilizada	Controle
3	Controle	Cobertura	Liofilizada
4	Cobertura	Controle	Liofilizada
6	Cobertura	Liofilizada	Controle
7	Liofilizada	Cobertura	Controle
10	Liofilizada	Controle	Cobertura

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129/156 ¹ Controle - não tratado com M. elsdeníí ² Esguicho - os cavalos receberam 50 ml de M. elsdeníí como uma gavagem oral (1,97 x 10⁹ CFU/ml) no início de cada período de tratamento ³ Liofilizada - os cavalos receberam M. elsdeníí diariamente como um pó liofilizado na média com 7,02 x 10⁸ CFU/ml dentro de 2 guloseimas à base de melaço [416] Os cavalos foram abrigados em estábulos individuais (3, 05 x 3, 66 m) dentro de um único galpão e forrados com raspas de pinho. Os cavalos foram designados aleatoriamente a estábulos diferentes para cada período de tratamento para levar em conta qualquer variação possível na ventilação ou temperatura com base na localização no galpão. Os cavalos foram andaram diariamente para exercitar durante os períodos de tratamento.

[417] Cavalos que recebem o esguicho oral foram dosados imediatamente antes de alimentação no dia 1 de cada período de tratamento com 50 ml de cultura fresca contendo 1,97 x 10⁹ CFU/ml da cepa de M. elsdeníí NCIMB 41125 usando um dispositivo de dosagem operado manualmente (Variable Automatic Drencher MKIII de 60 ml, NJ Phillips, NSW, Austrália). Antes da administração da cultura de probiótico, uma bolsa de 5 litros de cultura fresca foi agitada vigorosamente para homogeneizar o conteúdo. Um dispositivo de dosagem operado manualmente foi anexado à bolsa usando uma tubulação de Tygon e o reservatório foi preenchido. Aproximadamente 100 a 200 ml da cultura foram descartados em um recipiente de descarte para assegurar que tanto a tubulação quanto o dispositivo estariam desprovidos de oxigênio.

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130/156 [418] Aos cavalos no grupo de tratamento com probiótico liofilizado foram oferecidas 2 guloseimas à base de milho e melaço contendo o produto liofilizado antes da ração da manhã a cada dia. A cepa de M. elsdeníí NCIMB 41125 foi liofilizada antes do estudo e embalada em embalagens lacradas a vácuo, cada uma contendo cerca de 0,40 g da bactéria liofilizada com uma média de 7,02 x 10⁸ CFU/ml de M. elsdeníí . Uma amostra foi plaqueada a cada dia para assegurar viabilidade bacteriana consistente ao longo de cada periodo de tratamento. Se o cavalo recusasse o tratamento, o produto liofilizado era administrado manualmente como um bolo.

[419] Os cavalos restantes não foram expostos ao probiótico durante o periodo no qual serviram como controles.

B. Ração e fornecimento de água [420] Durante os períodos de tratamento, os cavalos foram alimentados duas vezes ao dia com feno e concentrado divididos igualmente entre as duas alimentações. Cada cavalo foi alimentado com 1% de sua matéria natural do peso corporal em forragem de gramíneas por dia (Tabela 15).

Tabela 15. Análise de nutrientes dietéticos.

Componentes
Base de matéria seca (DM), %	Forragem de gramíneas I^a	Forragem de gramíneas 2^b	Concentrado⁰
DM	90,5	92	87, 9
Proteína bruta (CP)	8,2	8,4	14,5
Fibra detergente ácida (ADF)	39, 2	42,2	8, 1
Fibra detergente neutra de amilase (aNDF)	63, 9	68,9	15, 8
Gordura bruta	2,5	2,1	-
Amido	1, 6	0, 8	-

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131/156

Cinzas	7,27	6, 93	-
Energia digerível (DE) Mcal/kg	2,05	0, 87	1, 6
Cálcio	0,38	0,3	0, 87
Fósforo	0, 15	0,22	0,74
Magnésio	0, 17	0,16	0, 17
Potássio	1,50	1,74	0, 88

^a Alimentada em uma taxa de 1% de matéria natural do peso corporal/dia durante períodos de tratamento ^b Alimentada ad libitum durante período de washout ^c Alimentada em quantidades crescentes de 0,2% de matéria natural do peso corporal/dia até um máximo de 1% de matéria natural do peso corporal durante períodos de tratamento [421] Cada cavalo foi escalonado até 1% de seu peso corporal em concentrado texturizado (análise na Tabela 15, acima, composição na Tabela 16, abaixo) em uma taxa de 0,2% de seu peso corporal por dia no dia 1 até o dia 5, e depois mantido a 1% de BW AF em grãos para o dia 5 até o dia 7. Todos os materiais recusados foram pesados e registrados. Os estábulos foram equipados com bebedores automáticos a fim de oferecer água fresca, ad libitum. Os bebedouros eram limpos e verificados quanto ao funcionamento adequado várias vezes por dia.

Tabela 16. Composição do Concentrado Experimental. ^a

Ingrediente, % da dieta	Nível de inclusão
Milho	20, 00
Aveia	61, 67
Melaço	10, 00
Farelo de soja, 48%	5, 22
Calcário	1,25%
Sal	0,50%

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132/156

Cálcio mono	1, 02%
Vitamina A 30.000	0, 01%
Vitamina D 30.000	0, 00%
Vitamina E 20.000	0,25%
Sulfato de Cu	0, 01%
Óxido de Zn	0, 01%
Selenito de Na	0, 06

^a Alimentado durante períodos de tratamento em quantidades crescentes de 0,2% de matéria natural do peso corporal até um máximo de 1% de matéria natural do peso corporal.

[422] Durante os períodos de washout, os cavalos foram abrigados em um terreno seco e mantidos em uma dieta de forragem de gramíneas ad libitum (Tabela **) . Os cavalos foram pesados ao término de cada período de washout para assegurar o cálculo preciso da quantidade de ração oferecida durante os períodos de tratamento.

C. Procedimentos de amostragem [423] Amostras cecais foram coletadas por meio de cânulas cecais a cada 4 horas durante cada período de tratamento de 7 dias. Os cavalos foram alimentados às 10:00 horas e 22:00 horas a cada dia e foram coletadas amostras em 4, 8 e 12 horas pós-alimentação antes da alimentação seguinte. No dia 0 de cada período de tratamento, foram coletadas amostras antes da dosagem ou alimentação para estabelecer valores basais de pH, VFA e populações de M. elsdenii no intestino posterior.

[424] Foram coletadas amostras por remoção das tampas das cânulas e captura do conteúdo cecal à medida que ele fluía para fora das cânulas. O liquido cecal foi tensionado através de quatro camadas de gaze de algodão, e depois colocado em um frasco de amostra de 100 ml. Quando uma amostra suficiente

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133/156 não era coletada por meio de fluxo por gravidade, uma bomba manual era usada para extrair conteúdo cecal. Às 10:00 horas nos dias 0, 1, 3 e 7 foram coletadas amostras cecais adicionais para análise por PCR. Durante o primeiro período de tratamento, amostras não filtradas foram coletadas em frascos de cintilação HDPE de 20 ml (Fischer Sei.; 03-33723B) . Essas amostras não filtradas representam um desafio na separação de amostras para extração de DNA e, portanto, para os 2 períodos de tratamento restantes, líquido cecal tensionado foi coletado em tubos de centrífuga cônicos de Falcon de 50 ml (Corning Inc. 352070; Corning, NY) e imediatamente congelado a -80°C para aguardar a análise por PCR. Os técnicos trocavam de luvas entre cada cavalo.

D. Análise do pH cecal e ácidos graxos voláteis [425] O pH do líquido cecal tensionado era medido imediatamente após a coleta usando um medidor de Ph portátil (medidor de Ph portátil Orion 3 Star Thermo Scientific, Waltham, MA; sonda Accumet). Após o pH ter sido registrado, a amostra era transferida em alíquotas de 1 ml para 2 tubos de microcentrifuga e misturada com 0,25 ml de ácido metafosfórico 25% para desproteinização. As amostras foram congeladas a -18°C por pelo menos 24 horas antes da análise de VFA.

[426] As amostras cecais acidificadas e congeladas foram descongeladas e homogeneizadas usando um misturador por turbilhonamento e centrifugadas a 24 x g por 18 minutos. O sobrenadante aquoso foi então transferido para frascos de cromatografia a gás. Os ácidos graxos voláteis foram medidos usando um cromatógrafo a gás Agilent 7890 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado com uma coluna

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134/156 capilar DB-WAX (espessura de filme de 10 mm x 0,10 mm x 0,1 mm; colunas Agilent e J&W, Santa Clara, CA) e detector de ionização de chama. Hidrogênio foi usado como um gás carreador em uma taxa de fluxo de 4 6 cm/segundo, com uma divisão de injeção de 1 μΐ e uma divisão de fluxo 50:1. A temperatura inicial do forno foi de 70°C e a temperatura foi aumentada por 15°C/minuto até 130°C, e depois aumentada a 60°C/minuto até 220°C e mantida por 2 minutos. As temperaturas da entrada e do detector foram de 260°C e 300°C respectivamente. Ácidos graxos voláteis foram quantificados por comparação de padrões conhecidos (Supelco Volatile Fatty Acid Standard Mix; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) contendo acetato, propionato, isobutirato, butirato, isovalerato, valerato, isocaproato, caproato e heptanoato.

E. Análise estatística [427] Os dados foram analisados usando o procedimento Glimmix do software SAS® Versão 9.4. O modelo incluiu ο efeito do tratamento fixo e efeitos aleatórios de cavalo, período e tratamento por interação de período. Cavalo serviu como a unidade experimental. O efeito do tratamento por hora dentro do dia não foi significante para qualquer parâmetro e, portanto, foi excluído do modelo. Significância foi declarada em P < 0,05, e uma tendência foi considerada como sendo 0,05 < P < 0,10. Diferenças entre médias de quadradosmínimos foram determinadas usando a opção PDiff do software SAS®.

F. Resultados [428] O pH cecal tendeu a ser maior em cavalos tratados com M. elsdeníí, comparado com controles à medida que a inclusão de grãos na dieta aumentava. Veja a FIG. 22. 0 pH

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135/156 cecal de cavalos administrados com M. elsdeníí como um esguicho oral estava elevado acima dos controles no dia 5 (7,00 e 7,19, respectivamente; P = 0,09), o primeiro dia no qual o lote de grãos completo foi alimentado. No dia 7, os cavalos que recebem M. elsdeníí como um tratamento liofilizado tendiam a ter um pH cecal maior (7,19) do que os controles (6,99; P = 0,09) .

[429] A Tabela 17 mostra o perfil de VFA dos grupos de tratamento.

Tabela 17. Efeito de M. elsdeníí sobre o perfil de VFA cecal equino.

					Valor-P
Item*	Dia	Contro- le¹	Cobertu- ra²	Liofili- zadas³	SEM	Tratamento¹	Contras- te
Acetato					5,928	D	0,55
	0	47,02^A'^a	43,03^a'^ab	45,73^A'^a
	5	43,72^A'^a	40,88^A'^b	40,08^A'^a
	6	39,41^A'^b	38,53^a'^ab	35,54^A'^b
	7	38,3 6^A,b	36, 63^a'^a	36,39^A'^b
Propionato					3,078	D	0,54
	0	14,8 6^A'^a	14 12^Afac<^	15,81^a'^abc
	5	19, 2 2^A'^ab	18,80^A'^bc	18,25^A'^b
	6	17 8 4^A'^abc	17,67^A'^C	15,08^A'^c
	7	16,7 8^a'^c	15,24^A'^d	14,5 4^a'^c
Acetato:
Propio-					0,252	D	0,55
nato
	0	3,5 0^A'^a	3,3 6^A'^a	3,47^A'^a
	5	2,37^A'^b	2,32^A'^b	2,32^A'^b

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136/156

	6	2,33^A,b	2,2 9^A,b	2,4 6^A'^b
	7	2,41^A'^b	2, 60^a'^c	2,83^B'^C
Butirato					0,900	D	0,45
	0	5,10^A'^a	4,2 6^a' ^ab	4,5 8^A'^ab
	5	4,7 0^A'^a	4,18^A'^a	4,22^A'^b
	6	4,15^A'^a	3, 67^a'^ab	3, 8 I^a' ^ab
	7	3,53^A,b	3,3 6^A'^b	3,57^A'^a
Isobutirato					0,051	I	0,25
	0	-0,01^A'^a	-0,01^AB'^ab	0,12^B'^a
	5	0, 0 I^a' ^a	0, 02^A'^b	0,07^A'^a
	6	0, 0 0^A'^a	0,05^a'^ab	0, 03^A'^b
	7	0, 0 0^A'^a	0, 05^A'^a	0,04^A'^b
Valerato					0,096	I	0,31
	0	0, 16^A'^a	0, 0 4^A'^a	0,1 0^a' ^ab
	5	0, 14^A'^a	0, 05^B'^a	0,08^A'^b
	6	0, 12^A'^a	0, 07^A'^a	0,13^a'^ab
	7	0, 04^A,b	0, 07^A'^a	0,15^B'^a
Caproato					0,0120	--	0,57
	0	0,000	0,000	0,007
	5	0,000	0,000	0,000
	6	0,000	0,000	0,007
	7	0,000	0,000	0,015
VFA total					9,487	D	0,54
	0	67,14^A'^ab	61,4 6^A'^ab	66, 44^A'^a
	5	67,82^A,b	63,97^A'^b	62,73^A'^a
	6	61,53^A'^a	60,0 6^A'^ab	54, 60^A'^b
	7	58,73^A'^a	55,43^A'^a	54,69^A'^b

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137/156 * Concentração de VFA relatada em mM ¹ Controle - não tratado com M. elsdenii ² Esguicho - cavalos receberam 50 ml de M. elsdenii como uma gavagem oral (1,97 x 10⁹ CFU/ml) no início de cada período de tratamento ³ Liofilizadas - cavalos receberam M. elsdenii diariamente como um pó liofilizado em média com 7,02 x 10⁸ CFU/ml dentro de 2 guloseimas à base de melaço ^τ T = Efeito do tratamento; D = Efeito do dia de amostragem; I = Interação entre tratamento e dia de amostragem; P<0,05 ^ττ Contraste M. elsdenii vs. Controle ^A'^B Médias dentro de uma fileira sem um sobrescrito comum são diferentes em P<0,05 ^a'^b Médias dentro de uma coluna sem um sobrescrito comum são diferentes em P<0,05 [430] A suplementação de M. elsdenii não teve nenhum efeito sobre as concentrações de acetato ou propionato no ceco (P > 0,10; Tabela **) . No entanto, foi detectada uma interação de tratamento por dia na proporção acetato: propionato (A:P) (P < 0,05) . A proporção A:P cecal foi maior no dia 7 em cavalos que receberam M. elsdenii liofilizada (2,83) do que aquela de cavalos que não receberam M. elsdenii (2,41) ou daqueles que receberam M. elsdenii como um esguicho oral (2,60; P < 0,05). O valerato cecal foi maior no dia 7 em cavalos que receberam M. elsdenii liofilizada (0,15 mM) do que em animais de controle (0,04 mM) ou naqueles que receberam um esguicho oral de M. elsdenii (0,07 mM; P < 0,02). O valerato cecal estava menor em cavalos que receberam esguicho no dia 5 do que nos animais de controle (P < 0,01); no entanto, ele era similar àquele de

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138/156 cavalos tratados com M. elsdenii liofilizada (P > 0,10) . As concentrações de heptanoato e isocaproato eram desprezíveis, e nenhum efeito do tratamento ou de interação foi detectado e, portanto, esses VFAs foram excluídos da Tabela **.

[431] O pH cecal e produtos de fermentação foram os mais afetados por suplementação com M. elsdenii desde o dia 5 até o dia 7, os dias nos quais a quantidade máxima de grãos foi consumida.

EXEMPLO 11

Avaliação da aplicação de cultura líquida de Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 (Lactipro®) em frangos de corte [432] Um estudo-piloto de desempenho de frangos foi realizado na Virginia Diversified Research Corporation para avaliar os efeitos de Megasphaera elsdenii NCIMB 41125 em névoa ou em gavagem sobre o desempenho do crescimento de frangos de corte.

[433] Frangos de corte de um dia de idade (n = 720) vacinados por pulverização com Coccivac-B no dia 0 foram alocados aleatoriamente a 6 tratamentos diferentes: (1) um grupo de controle negativo que não recebe Megasphaera (nCON), (2) um grupo de névoa que recebe M. elsdenii NCIMB 41125 no dia 0 por névoa (1-2 ml/pássaro) quando em seus engradados incubatórios (dO Névoa), (3) um grupo de gavagem do dia 7 que recebe 2 ml de M. elsdenii NCIMB 41125 no dia 7 por gavagem oral após um jejum de ração de 2 h e um jejum de água de 1 h (d7 GAV), (4) um grupo de gavagem do dia 14 que recebe 5 ml de M. elsdenii NCIMB 41125 no dia 14 por gavagem oral após um jejum de ração de 2 h e um jejum de água de 1 h (dl4 GAV), (5) um grupo de gavagem do dia 21 que recebe 10 ml de M. elsdenii NCIMB 41125 no dia 21 por gavagem oral

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139/156 após um jejum de ração de 2 h e um jejum de água de 1 h (d21 GAV) , e 6) um grupo de controle positivo (pCON) que não recebe Megasphaera _r mas que recebe ração de inicio e de crescimento tratadas com BMD (50 g/t) e ração de terminação tratada com Stafac (20 g/t).

[434] Cada tratamento foi representado por 4 gaiolas contendo 30 pássaros cada. As dietas fornecidas aos pássaros foram as seguintes: ração de inicio desde o dia 0-18, ração de crescimento desde o dia 1835 d, e ração de terminação desde o dia 35-39. Os pesos, consumo de ração e conversão alimentar dos animais foram registrados ao longo do periodo do experimento de 39 dias.

Tabela 18: Desempenho de frangos de corte medido após 25 e dias em ração.

	nCON	pCON	DO Névoa	d7 GAV	dl4 GAV	d21 GAV
	2,288^a	2,288^a	2,237^ab	2,160^b	2,212^ab	2,188^b
Peso vivo dia	(1,037	(1,037	(1,014	(0,979	(1,003	(0,992
25, ibs	kg)	kg)	kg)	kg)	kg)	kg)
FCR, dia 1-25	1,531^a	1,516^a	1,4 3 0^b	1,555^a	1,531^a	1,571^a
Mortalidade dia	0,00^a	0,00^a	0, 00^a	0,83^ab	0,00^a	1, 67^b
25, %
	4,713^a	5,100^a	4, 886^a	4,880^a	5,121^a	4,907^a
Peso vivo dia	(2,137	(2,313	(2,216	(2,213	(2,322	(2,225
39, Ibs	kg)	kg)	kg)	kg)	kg)	kg)
FCR, dia 1-39	1,814^b	1,754^ab	1,739^ab	1,771^ab	1,715^ab	1,674^a
Mortalidade dia	0,017^a	0, 00^a	0, 83^a	1, 67^a	1, 67^a	3,33^a
39, %

^a'^b Médias dentro de uma fileira com sobrescrito diferente são diferentes em P<0,05.

[435] Os resultados são apresentados na Tabela 18. A

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140/156 mortalidade global não foi diferente através de tratamentos (Tabela 18). A conversão alimentar para o grupo Névoa dO foi significantemente menor do que todos os outros tratamentos no dia 25, com um aumento de 5,3% em relação ao pCON e um aumento de 6,5% em relação ao nCON. Após 39 dias em ração, a conversão alimentar dos grupos tratados com Megasphaera elsdeníí não era significantemente diferente do pCON, mas tendeu a ser numericamente menor, com exceção de d7 GAV. A conversão alimentar para o grupo d21 GAV foi significantemente menor do que do nCON, com um aumento de 7,7% na conversão alimentar.

EXEMPLO 12

Crescimento de diferentes cepas de M. elsdeníi em meios de crescimento semidefinidos suplementados com duas fontes de carbono

A. Design experimental [436] As seguintes cepas bacterianas foram usadas nesse Exemplo: (1) Megasphaera elsdeníi NCIMB 41125, (2) Megasphaera elsdeníi ATCC 25940, (3) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702261, (4) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702262 e (5) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702410.

[437] Todas as cepas foram desenvolvidas em garrafas de soro em meios de crescimento semidefinidos de lactato. As culturas resultantes foram então usadas para inocular placas de 96 poços contendo meios de crescimento semidefinidos suplementados com duas fontes de carbono: Na-lactato e glicose, que consiste em 60% de lactato e 40% de glicose, 70% de lactato e 30% de glicose, ou 40% de lactato e 60% de glicose.

[438] As placas de 96 poços foram então incubadas a 39°C

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141/156 sob condições anaeróbicas e as densidades ópticas (600 nm) foram automaticamente registradas em intervalos de 15 minutos.

B. Análise das características de crescimento de cepas de M. elsdeníi em vários meios de dois carbonos [439] As curvas de crescimento resultantes nos diferentes meios semidefinidos e com as diferentes cepas de M. elsdeníi foram tabuladas, com tempo de incubação no eixo-x e leitura da densidade óptica no eixo-y, a fim de comparar as características de crescimento (FIGS. 23-25).

[440] Todas as cepas de M. elsdeníi testadas nesse experimento exibiram características de crescimento similares guando desenvolvidas em meios semidefinidos que consistem em 60% de lactato e 40% de glicose, 70% de lactato e 30% de glicose, ou 40% de lactato e 60% de glicose.

EXEMPLO 13

Crescimento de diferentes cepas M. elsdeníi em meios de crescimento semidefinidos suplementados com duas fontes de carbono, seguido por liofilização das células

A. Design experimental [441] As seguintes cepas bacterianas foram usadas nesse Exemplo: (1) Megasphaera elsdeníi NCIMB 41125, (2) Megasphaera elsdeníi ATCC 25940, (3) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702261, (4) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702262 e (5) Megasphaera elsdeníi NCIMB 702410.

[442] Todas as cepas foram desenvolvidas em garrafas de soro em meios de crescimento semidefinidos de lactato. As culturas resultantes foram então usadas para inocular vasos de fermentadores de 5 litros contendo meios de crescimento semidefinidos suplementados com duas fontes de carbono: Na

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142/156 lactato e glicose que consiste em 60% de lactato e 40% de glicose ou 70% de lactato e 30% de glicose.

[443] Uma amostra das culturas foi coletada após 8, 10, 12, 14 e 16 horas de crescimento, resfriada até a temperatura ambiente e as células foram assepticamente e anaerobicamente coletadas por remoção de 99% do líquido. Os retentados foram misturados com uma solução de crioprotetor (sacarose) em uma proporção de 1/5, sob condições assépticas e anaeróbicas, para obter uma concentração de sacarose final de 5% p/v. A mistura teve amostras coletadas para determinar a concentração pré-liofilização de M. elsdeníí (ou seja, contagem de viabilidade).

[444] Alíquotas da mistura resultante foram transferidas para frascos de 10 ml (4 ml/frasco) e congeladas rapidamente em nitrogênio líquido. Os frascos foram transferidos para o liofilizador para serem liofilizados seguindo um ciclo rápido. Após o término da liofilização, a sobrevida das bactérias foi determinada por ressuspensão do produto liofilizado na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, permitindo que ele reidratasse por 40 minutos em temperatura ambiente, e depois plaqueamento sobre ágar de lactato semidefinido (ou seja, contagem de viabilidade).

[445] A perda de células foi computada por subtração da concentração de M. elsdeníí recuperada pós-liofilização da concentração inicial (pré-liofilização) de M. elsdeníí.

B. Comparação da perda de células pós-liofilização de diferentes cepas de M. elsdeníí desenvolvidas em vários meios semídefínídos, coletadas e liofilizadas em vários momentos durante o crescimento.

[446] Todas as cepas de M. elsdeníí testadas nesse

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143/156 experimento resultaram em células viáveis pós-liofilização. 0 limite aceitável de perda de células foi definido em 1,6 log CFU/ml. As perdas de células encontradas durante criodessecação de células desenvolvidas em meios semidefinidos contendo 70% de lactato e 30% de glicose (Tabela 19), independentemente da cepa ou do tempo de coleta estavam, todas, abaixo do limite aceitável e variaram de 0,3 a 1,3 log.

Tabela 19: Perda de células (Log CFU/ml) observada pósliofilização em cepas de M. elsdeníí desenvolvidas em meios semidefinidos que consistem em 70% de lactato e 30% de glicose, coletadas e liofilizadas após 8, 10, 12, 14 ou 16 horas de incubação.

	Tempo de coleta, horas
Cepa	8	10	12	14	16
NCIMB 41125	-	0,41	0,46	0, 60	0,42
ATCC 25940	0, 61	0,56	0, 64	0, 80	0, 61
NCIMB 702261	0,76	0, 85	1, 09	0, 81	1,29
NCIMB 702262	0, 65	0, 98	1, 01	0, 96	0, 99
NCIMB 702410	0, 81	0, 83	1, 00	1, 02	1,20

[447] As perdas de células encontradas durante a criodessecação de células desenvolvidas em meios semidefinidos contendo 60% de lactato e 40% de glicose (Tabela 20) foram mais afetadas pelo tempo de coleta, mas todas as cepas ainda resultaram em perdas de células que estavam abaixo do limite aceitável para pelo menos três dos tempos de coleta. A otimização do tempo de coleta précriodessecação pode resultar em um aumento adicional da recuperação pós-liofilização.

Tabela 20: Perda de células (Log CFU/ml) observada pósPetição 870190127258, de 03/12/2019, pág. 153/194

144/156 liofilização em cepas de M. elsdenii desenvolvidas em meios semidefinidos que consistem em 60% de lactato e 40% de glicose, coletadas e liofilizadas após 8, 10, 12, 14 ou 16 horas de incubação.

	Tempo de coleta, horas
Cepa	8	10	12	14	16
NCIMB 41125	0,34	0,28	0,34	0,37	0,33
ATCC 25940	0,72	1,46	2,01	1, 80	1,47
NCIMB 02261	0,74	1,26	1,28	1,48	1,45
NCIMB 02262	0,58	1, 19	1,74	1,32	1, 80
NCIMB 02410	-	0,70	1, 12	1,37	1, 19

[448] No geral, o método descrito nesse relatório descritivo resultou em produto liofilizado contendo células viáveis, independentemente da cepa de Megasphaera elsdenii usada.

EXEMPLO 14 Encapsulação de M. elsdenii liofilizada e Determinação de sua estabilidade [449] Retentados de M. elsdenii NCIMB 41125 obtidos por meio de TFF foram misturados assepticamente com solução crioprotetora (sacarose) em uma proporção de 1/5 para obter uma concentração final de sacarose de 5% (p/v). A mistura foi congelada rapidamente em nitrogênio líquido e transferida para o liofilizador para ser liofilizada usando um ciclo rápido. Após o término da liofilização, a sobrevida das bactérias foi determinada por ressuspensão do produto liofilizado na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, permitindo que ele reidratasse por 40 minutos em temperatura ambiente e, a seguir, plaqueamento em ágar semidefinido de lactato.

[450] 0 pó de M. elsdenii liofilizada resultante foi

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145/156 então misturado com um carreador (agente de volume) e encapsulado por dispensa do pó em destilado de azeite de dendê aquecido ou ácido esteárico. A mistura foi então rapidamente resfriada e o produto resultante teve uma amostra coletada para determinar a sobrevida das bactérias. As amostras foram ressuspensas na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, misturadas por 15 segundos, e foi permitido gue se reidratassem por 40 minutos em temperatura ambiente, antes de serem plaqueadas em ágar semidefinido de lactato. Esse experimento foi repetido três vezes usando temperaturas de aquecimento diferentes e diferentes tipos de óleo (método 1, 2 e 3) . O Método 1 usa uma temperatura de aquecimento de 110°C e um destilado de azeite de dendê como o material de encapsulação. O Método 2 usa uma temperatura de aquecimento de 52 °C e uma mistura de mono- e diglicerídeos de ácidos palmítico, esteárico, oléico, linoléico e linolênico como o material de encapsulação. O Método 3 usa uma temperatura de aquecimento de 65°C e uma mistura de monoe diglicerídeos de ácidos palmítico, esteárico, oléico, linoléico e linolênico como o material de encapsulação.

[451] A perda percentual foi computada por subtração da concentração de M. elsdeníí recuperada pós-encapsulação da concentração recuperada pós-liofilização e sua divisão pela concentração recuperada pós-liofilização.

[452] Amostras adicionais foram coletadas de produto encapsulado, usando o método 2 e o método 3, e armazenadas em temperatura ambiente sob condições aeróbicas por um período de 4 meses para avaliar a estabilidade do produto. As amostras foram ressuspensas na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, misturadas por 15 segundos, e foi

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146/156 permitido que se reidratassem por 40 minutos em temperatura ambiente, antes de serem plaqueadas em ágar semidefinido de lactato. As FIG. 26 e 27 mostram que a estabilidade da M. elsdeníí liofilizada encapsulada usando o método 2 ou 3 só perdeu aproximadamente 1 log CFU/g.

Tabela 21: Perda percentual observada pós-encapsulação de M.

elsdeníí liofilizada usando o método 1, 2 ou 3.

	Perda percentual da encapsulação
Método 1	83,4%
Método 2	24,5%
Método 3	32,1%

[453] Os Métodos 2 e 3 usados para encapsular M. elsdeníí liofilizada resultaram em uma recuperação de células maior do que 67,9% (Tabela 21) .

[454] Além disso, amostras liofilizadas encapsuladas seguindo o método 2 ou o método 3 resultaram em uma redução de 1 log na viabilidade celular durante armazenamento em temperatura ambiente sob condições normais de oxigênio e umidade por até 4 meses.

[455] A encapsulação de M. elsdeníí liofilizada seguindo os métodos 2 e 3 forneceu proteção adicional às bactérias contra oxigênio e umidade. Esse processo permitiría armazenar M. elsdeníí liofilizada encapsulada em temperatura ambiente, sem nenhuma embalagem específica, e permitiría a adição do produto na ração.

EXEMPLO 15

Prazo de validade de M. elsdeníí liofilizada produzida em uma escala-piloto.

A. Design experimental

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147/156 [456] Uma batelada de 600 litros de meios semidefinidos que consistem em 70% de lactato e 30% de glicose foi usada nesse experimento para crescer M. elsdenii NCIMB 41125. Após incubação de 14 horas a 39°C, a cultura resultante foi resfriada até a temperatura ambiente e as células coletadas usando um sistema de filtração por fluxo tangencial, como descrito no Exemplo 2. Noventas e nove por cento do volume do líquido foram removidos da cultura e o retentado foi então ressuspenso em uma solução crioprotetora de sacarose em uma proporção de 1:5 para obter uma concentração final de sacarose de 5% p/v.

[457] A mistura foi então congelada em nitrogênio líquido, os péletes congelados transferidos para o liofilizador e liofilizados seguindo um ciclo rápido. Após o término da criodessecação, pó liofilizado foi coletado e embalado (Tabela 22) sob condições anaeróbicas em bolsas de Mylar isoladamente (M.e.) ou com maltodextrina como um agente de volume (M.e. + Maltodextrina).

Tabela 22: Enchimento da bolsa de Mylar.

	Pó liofilizado	Maltodextrina	Peso total na bolsa
M.e.	0, 15 g	-	0, 15 g
M.e. + Maltodextrina	0, 15 g	2,34 g	2,50 g

[458] A concentração de M. elsdenii no produto liofilizado (3 amostras por tratamento) foi determinada por ressuspensão do produto liofilizado na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, permitindo que ele reidratasse por 40 minutos em temperatura ambiente, e depois plaqueamento em ágar semidefinido de lactato (ou seja, contagem de

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148/156 viabilidade). A concentração de M. elsdeníi foi expressa como CFU/Bolsa e log-transformada.

B. Estudo de prazo de validade [459] Bolsas de Mylar contendo os diferentes tratamentos foram armazenadas em temperatura ambiente (75°F (23, 88°C); 25°C) ou a 40°F (4°C) . Amostras adicionais foram obtidas após 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 meses de armazenamento e processadas da mesma forma previamente descrita (3 amostras por tratamento por ponto do tempo) para determinar o prazo de validade do produto. A concentração de M. elsdeníi foi expressa como CFU/Bolsa e log-transformada.

[460] Os dados do prazo de validade são apresentados na

FIG. 28. A concentração de M. elsdeníi ao longo do tempo foi afetada pela temperatura de armazenamento. Após 6 meses de armazenamento, amostras armazenadas a 40°F (4,4°C) eram estáveis, independentemente da presença ou ausência de maltodextrina, enquanto amostras armazenadas a 75°F (23,9°C) perderam quase 1,6 log para o tratamento M.e. e cerca de 0,8 log para o tratamento M.e. + Maltodextrina.

EXEMPLO 16

Crescimento de célula microbiana, meio, temperatura e pH [461] As bactérias anaeróbicas podem ser divididas em três categorias, (1) anaeróbios obrigatórios; (2) anaeróbios aerotolerantes; e (3) anaeróbios facultativos. Anaeróbios obrigatórios são bactérias que não sobrevivem em concentrações atmosféricas normais de oxigênio. Alguns anaeróbios obrigatórios podem sobreviver em até 8% de oxigênio, enquanto outros não sobrevivem, a menos que a concentração de oxigênio seja menor do que 0,5%. Anaeróbios aerotolerantes podem sobreviver na presença de oxigênio, mas

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149/156 não utilizam oxigênio para o crescimento. Anaeróbios facultativos são capazes de usar oxigênio para respiração aeróbica, mas também podem usar respiração anaeróbica caso oxigênio não esteja presente.

[462] Similarmente, as bactérias aeróbicas podem ser divididas em duas categorias: (1) aeróbios obrigatórios; e (2) microaeróflios. Aeróbios obrigatórios necessitam de oxigênio para realizar respiração celular e podem sobreviver em concentrações atmosféricas normais de oxigênio. Microaerófilos necessitam de oxigênio para o crescimento celular, mas são danificados em concentrações atmosféricas normais de oxigênio.

[463] Leveduras são micro-organismos eucarióticos de célula única, que são classificados como um membro do reino dos fungos. Leveduras podem ser aeróbios obrigatórios ou anaeróbios facultativos.

[464] Megasphaera, por exemplo, M. elsdenii e Bifidobacterium, por exemplo, B. breve, são espécies representativas de anaeróbios obrigatórios. Lactobacillus, por exemplo, L. plantarum e Bifidobacterium, por exemplo, B. animalis subsp. lactis são espécies representativas de anaeróbios aerotolerantes. Pediococcus, por exemplo, P. acidilactici e Lactobacillus, por exemplo, L. casei, são espécies representativas de anaeróbios facultativos. Bacillus, por exemplo, B. subtilis é uma espécie representativa de um aeróbio obrigatório. Saccharomyces, por

exemplo,	S. boulardii e	s.	cerevisiae ,	são espécies
representativas de leveduras	•
[465]	Bactérias aeróbicas,	bactérias	anaeróbicas e
leveduras	são desenvolvidas	em	um meio que	compreende pelo

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150/156 menos uma fonte de carbono selecionada do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura e combinações destes Além disso, bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras são desenvolvidas em um meio que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura e combinações destes. As bactérias anaeróbicas são desenvolvidas sob condições anaeróbicas ou com condições de oxigênio necessárias para facilitar o crescimento da célula bacteriana anaeróbica, e as bactérias aeróbicas e leveduras são desenvolvidas sob condições de oxigênio apropriadas com um meio que compreende pelo menos duas fontes de carbono das citadas acima e em uma temperatura entre 15°C a 45°C para L. plantarum e 20°C a 45°C para B. breve, B. animalis subsp. lactis, P. acidilactici, L. casei, S. boulardii e B. subtilis. A temperatura ótima para essas cepas é 37°C, exceto para S. cerevisiae, que prefere 30°C. O pH do meio é entre 4,0 e 9, mais especificamente entre pH 4,0 a 4,5, 4,5 a 5,5,

5,5 a 6,5, 6,5 a 7,5, 7,5 a 8,5 ou 8,5 a 9,0. Os micróbios são desenvolvidos até que a fase de crescimento exponencial

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151/156 tenha terminado, ou seja, pelo menos 1 hora a 6 horas, 6 horas a 12 horas, 12 horas a 24 horas, 24 horas a 36 horas, 36 horas a 48 horas, 48 horas a 72 horas, 72 horas a 96 horas ou 96 horas a 120 horas.

[466] Após o meio conter pelo menos 1 x 10³ CFU/g, os micróbios são coletados sob condições apropriadas e os micróbios são liofilizados e/ou encapsulados para uso em formulações de ração animal.

EXEMPLO 17

Uso de filtração por fluxo tangencial para concentração de culturas de bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras [467] Os métodos apresentados no Exemplo 2 são usados nesse Exemplo com as bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras reveladas no Exemplo 16 e usando o meio apropriado para permitir o crescimento ótimo da célula microbiana. Similar à Megasphaera elsdeníí, o uso de filtração por fluxo tangencial em bactérias aeróbicas (Bacillus subtílís), bactérias anaeróbicas (Bifidobacterium breve, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium anímalís subsp. lactís, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus casei) e leveduras (Saccharomyces boulardíí e cerevísíae) gera resultados similares com relação à quantidade de micróbios viáveis recuperados no permeado e retentado ao longo da evolução do processo de concentração. Adicionalmente, o processo de filtração não possui efeitos sobre a capacidade de sobrevivência microbiana ou sobre a habilidade do micróbio para crescer após ser filtrado. Dessa forma, os micróbios são desenvolvidos em um caldo líquido, filtrados e são preparados para congelamento, liofilização

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152/156 e/ou encapsulação.

EXEMPLO 18

Parâmetros de congelamento e liofilização para bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras [468] Para determinar o efeito de vários parâmetros de congelamento e de liofilização em diferentes tipos de bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras, é realizado um Exemplo de acordo com o Exemplo 17. Similar ao Exemplo 3, o limite aceitável de perda de células é definido em 1,6 log CFU/ml.

[469] Retentados de Bifidobacterium breve, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium animalis subsp. lactis, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus casei, Bacillus subtilis, Saccharomyces boulardii e Saccharomyces cerevisiae são ressuspensos em soluções crioprotetoras que não contêm crioprotetor, leite desnatado, trehalose, sacarose, ou uma combinação destes, antes da liofilização. Cada mistura é então transferida para frascos e lentamente congelada a 80°C ou congelada rapidamente em nitrogênio liquido, antes de ser colocada no liofilizador para ser liofilizada usando um ciclo rápido ou lento.

[470] Todos os retentados não misturados com crioprotetor têm perda de células maior do que retentados misturados com soluções crioprotetoras e uma perda de células maior do que o limiar, independentemente do ciclo de liofilização ou do método de congelamento.

[471] Adicionalmente, todos os processos de liofilização que são testados resultam em produtos que são capazes de reter viabilidade suficiente para iniciar o crescimento da cultura após reidratação, até mesmo após armazenamento

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153/156 prolongado de 4 a 12 meses em temperatura ambiente ou pelo menos 4 °C.

EXEMPLO 19

Efeitos das condições de armazenamento sobre o rendimento e estabilidade de bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras liofilizadas [472] Os métodos de testagem para sobrevida celular e características de crescimento microbiano apresentados no Exemplo 4 são usados nesse Exemplo com bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras reveladas no Exemplo 16 e usando o meio apropriado para permitir o crescimento ótimo da célula microbiana.

[473] Para determinar o efeito de protocolos de liofilização e das condições de armazenamento sobre as características de crescimento e prazo de validade de Bifidobacterium breve, Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium anímalís subsp. lactís, Pediococcus acidilactici, Lactobacillus casei, Bacillus subtilis, Saccharomyces boulardii e Saccharomyces cerevisiae, culturas liofilizadas produzidas como no Exemplo 18 são então testadas quanto às características de crescimento microbiano e sobrevida celular durante armazenamento a 4 °C ou 25°C em condições aeróbicas ou anaeróbicas por 0, 2, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 semanas usando análise da curva de crescimento e técnica de plaqueamento profundo.

[474] As amostras de bactérias anaeróbicas liofilizadas que são armazenadas em condições aeróbicas, independentemente do tratamento, decaem mais rapidamente com perda de células adicional em comparação com sua contraparte anaeróbica armazenada.

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154/156 [475] As amostras que são armazenadas a 25°C decaem mais rápido do que suas contrapartes armazenadas a 4 °C.

[476] As amostras que são congeladas em nitrogênio líquido e são armazenadas a 25°C pós-liofilização não perdem mais células do que suas contrapartes armazenadas a 4 °C ao longo do período de armazenamento de 16 semanas; no entanto, diferenças entre amostras são significantes entre o armazenamento a 25°C e a 4°C após 20 e/ou 24 semanas de armazenamento.

[477] Em cada dia de amostragem, um experimento de curva de crescimento é realizado para comparar as características de crescimento do produto liofilizado com o produto não liofilizado. As amostras não liofilizadas que são usadas para cada curva de crescimento são frescas (no máximo 2 dias de idade). Os produtos liofilizados armazenados a 4°C possuem um tempo de latência mais curto do que os produtos liofilizados armazenados a 25°C. Após 16 semanas de armazenamento, todas as amostras de bactérias anaeróbicas que contêm um crioprotetor, congeladas em nitrogênio líquido, liofilizadas e armazenadas sob condições anaeróbicas que são revividas, são viáveis novamente. Similarmente, todas as amostras de bactérias aeróbicas e leveduras que contêm um crioprotetor, congeladas em nitrogênio líquido e liofilizadas que são revividas, também são viáveis novamente.

EXEMPLO 20

Efeitos das condições de armazenamento sobre o rendimento e estabilidade de bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras liofilizadas encapsuladas [478] 0 congelamento e a liofilização de retentados de

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155/156 várias bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras são realizados como descrito nos Exemplos 16-19. Após liofilização, as bactérias anaeróbicas são misturadas com um carreador (agente de volume) e são encapsuladas por dispensa do pó liofilizado em óleo aquecido como descrito no Exemplo 14. A mistura é então rapidamente resfriada e o produto resultante tem uma amostra coletada para determinar a sobrevida dos micróbios. Amostras microbianas anaeróbicas são ressuspensas na câmara anaeróbica com diluente anaeróbico, são misturadas por 15 segundos, e é permitido que se reidratem por 40 minutos em temperatura ambiente antes de serem plaqueadas em ágar semidefinido de lactato. Amostras microbianas aeróbicas são ressuspensas nas concentrações atmosféricas normais de oxigênio com um diluente, são misturadas por 15 segundos, e é permitido que se reidratem por 40 minutos em temperatura ambiente antes de serem plaqueadas em ágar semidefinido de lactato. Esse experimento é repetido três vezes usando diferentes temperaturas de aquecimento e diferentes tipos de óleos (método 1, 2 e 3) . O Método 1 usa uma temperatura de aquecimento de 110°C e um destilado de azeite de dendê como o material de encapsulação. O Método 2 usa uma temperatura de aquecimento de 52 °C e uma mistura de mono- e diglicerideos de ácidos palmitico, esteárico, oléico, linoléico e linolênico como o material de encapsulação. O Método 3 usa uma temperatura de aquecimento de 65°C e uma mistura de mono- e diglicerideos de ácidos palmitico, esteárico, oléico, linoléico e linolênico como o material de encapsulação.

[479] A perda percentual de células decorrente da encapsulação é menor do que 40% usando o método 2 ou 3. Após

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156/156 encapsulação das várias bactérias aeróbicas, bactérias anaeróbicas e leveduras, os micróbios encapsulados que são armazenados em temperatura ambiente sob condições atmosféricas normais de oxigênio possuem apenas uma ligeira redução na viabilidade celular ao longo do periodo de armazenamento (por exemplo, uma diminuição de 0,5 a 2 log na viabilidade celular).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas que compreendem células de M. elsdeníí e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono

selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, , manitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja,

proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10^{* 3} até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células liofilizadas de M. elsdeníí são produzidas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as (pelo menos duas) fontes de carbono consistem em cerca de 50-90% de uma primeira fonte de carbono e cerca de 10-50% de uma segunda fonte de carbono, em que a segunda fonte de carbono é diferente da primeira fonte de carbono, e em que 100% das (pelo menos duas) fontes de carbono consistem na primeira fonte de carbono e na segunda fonte de carbono.
3. Método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníí, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura que compreende células de M. elsdeníí e um meio de crescimento,

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2/22 (b) coleta das células sob condições anaeróbicas dentro

de 12 horas após a cultura ter terminado sua fase de crescimento exponencial e antes da cultura ter começado sua fase de crescimento estacionária, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdenii são

produzidas.
4 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 3, caracterizado pelo fato de que a coleta compreende pelo menos uma técnica selecionada do grupo que consiste em: centrifugação, filtração, diálise, osmose reversa, e combinações destas.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a filtração compreende filtração por fluxo tangencial.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cultura compreende um líquido, e em que a coleta compreende a remoção de cerca de 60% até cerca de 100% do líquido.
7 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 6, caracterizado pelo fato de que o congelamento é em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C.
8. Método de produção de células liofilizadas de Megasphaera elsdeníi, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura que compreende células de

M. elsdenii e um meio de crescimento, (b) coleta das células, (c) congelamento das células em uma temperatura de cerca de -80°C até cerca de -210°C dentro de 5 horas da coleta, e

Petição 870190073305, de 31/07/2019, pág. 40/61

3/22 (d) liofilização das células, em que células liofilizadas de M. elsdenii são produzidas.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o congelamento compreende o contato de um recipiente que compreende as células de M. elsdenii com nitrogênio liquido.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o congelamento compreende o contato das células com nitrogênio liquido.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o congelamento é em uma temperatura de cerca de -196°C e produz péletes congelados que compreendem as células, e em que o diâmetro dos péletes congelados é cerca de 0,19 até cerca de 1,27 centímetros.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o pH da cultura de M. elsdenii antes da coleta está entre cerca de 4,5 até cerca de 7,0.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g das células liofilizadas de M. elsdenii são viáveis após armazenamento em uma temperatura de cerca de 25°C por pelo menos 2 semanas.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g das células liofilizadas de M. elsdenii são viáveis após armazenamento em torno de

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4°C por pelo menos 1 mês.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a cultura compreende ainda pelo menos um crioprotetor.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o (pelo menos um) crioprotetor é selecionado do grupo que consiste em: frutose, glicose, sacarose, leite em pó, fórmula infantil, leite desnatado, trehalose, maltodextrina, betaína, e combinações destes.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o (pelo menos um) crioprotetor está presente em uma quantidade de cerca de 1% até cerca de 20% (p/v) da cultura.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a M. elsdeníí liofilizada é produzida em uma escala comercial.

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que o volume da cultura é pelo menos cerca de 50 litros. 20 . Método, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 3 a 19, caracterizado pelo fato de que cerca de 1 x 10³ até 1 x 10¹² UFC/g de células de M. elsdeníí são viáveis após liofilização.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que as células na cultura consistem em células de M. elsdeníí.

22. Aditivo alimentar sólido, caracterizado por compreender as células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

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23. Aditivo alimentar sólido, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o aditivo alimentar sólido compreende ainda outro micro-organismo.

24. Aditivo alimentar sólido, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado pelo fato de que o aditivo alimentar sólido é selecionado do grupo que consiste em: um pó, um granulado, um particulado, um pélete, uma torta, ou combinações destes.

25. Aditivo alimentar sólido, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, caracterizado pelo fato de que o aditivo alimentar sólido é um probiótico.

26. Composição caracterizada por compreender as células liofilizadas de M. elsdenii produzidas pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, ou o aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a composição é uma cápsula.

28. Kit caracterizado por compreender as células liofilizadas de M. elsdenii produzidas pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, o aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou a composição, conforme definida na reivindicação 26 ou 27.

29. Método de administração de células de M. elsdenii a um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal das células liofilizadas de M. elsdenii produzidas pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou da

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6/22 composição, conforme definida na reivindicação 26 ou 27.

30. Método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas pelo método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou da composição, conforme definida na reivindicação 26 ou 27 .

31. Método, de acordo com a reivindicação 30,

caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é acidose. 32. Método, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é

acidose ruminal.

33. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é doença respiratória.

34 . Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é laminite. 35. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é uma infecção. 36. Método, de acordo com a reivindicação 35,

caracterizado pelo fato de que a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

37. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento

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7/22 de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas pelos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou da composição, conforme definida na reivindicação 26 ou 27.

38. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo oportunístico é patogênico.

39. Método, de acordo com a reivindicação 37 ou 38, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo oportunístico é Salmonella ou Campylobacter.

40. Método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas pelos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou da composição, conforme definida na reivindicação 26 ou 27.

41. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal de uma quantidade eficaz das células liofilizadas de M. elsdeníí produzidas pelos métodos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, do aditivo alimentar sólido, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 25, ou da composição, conforme definida na reivindicação 2 6 ou 27, em que o desempenho de crescimento aumentado no

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8/22 animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário

médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de

carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite,

na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização

óssea, ou combinações destes.

42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 41, caracterizado pelo fato de que as células liofilizadas de M. elsdeníí, o aditivo alimentar

sólido ou a composição é administrada antes, concomitantemente ou depois da alimentação do animal com um alimento.

43. Método, de acordo com a reivindicação de qualquer uma das reivindicações 29 a 41, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a mistura das células liofilizadas de M. elsdeníí ou do aditivo alimentar sólido com um líquido antes da administração.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43,

caracterizado pelo fato de que o líquido é administrado

oralmente ou por pulverização do animal com o líquido.

45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 44, caracterizado por compreender uma única administração das células de M. elsdeníí, do aditivo

alimentar ou da composição.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 45, caracterizado por compreender uma administração diária das células de M. elsdeníí, do aditivo

alimentar ou da composição.

47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 46, caracterizado por compreender mais de uma administração das células de M. elsdeníí, do aditivo

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9/22 alimentar ou da composição em um único dia.

48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 9 a 47, caracterizado pelo fato de que o animal é um ruminante.

49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o ruminante é selecionado do grupo que consiste em: gado, carneiros, cabras, veados, búfalos e renas.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 9 a 47, caracterizado pelo fato de que o animal é um não ruminante.

51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o não ruminante é selecionado do grupo que consiste em: equinos, aves domésticas e suínos.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 33, 35 a 47, 50, ou 51, caracterizado pelo fato de que o animal é uma ave doméstica.

53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: uma galinha, um ganso, um pato, uma codorna, um peru ou um pombo.

54. Método, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, caracterizado pelo fato de que a ave doméstica é selecionada do grupo que consiste em: um frango, um galo e uma poedeira.

55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizado pelo fato de que a ave doméstica é uma galinha • 56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29 a 47, 50, ou 51, caracterizado pelo fato de que o animal é um equino.

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57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o equino é um cavalo, um pônei, um asno ou uma mula.

58. Método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de uma ave doméstica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é acidose.

60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é doença respiratória.

61. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é uma infecção. 62 . Método, de acordo com a reivindicação 61,

caracterizado pelo fato de que a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

63. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de uma ave doméstica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdenii.

64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo oportunístico é patogênico.

65. Método, de acordo com a reivindicação 63 ou 64,

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11/22 caracterizado pelo fato de que o micro-organismo oportunístico é Salmonella ou Campylobacter.

66. Método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de uma ave doméstica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí.

67. Método de aumento do desempenho de crescimento em uma ave doméstica, caracterizado pelo fato de que compreende a administração às aves domésticas de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de ovos, na mineralização óssea, ou combinações destes.

68. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 67, caracterizado pelo fato de que a ave doméstica é selecionada do grupo < gue consiste em: uma galinha, um ganso, um pato, uma codorna, um peru ou um pombo. 69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 68, caracterizado pelo fato de que a ave

doméstica é selecionada do grupo que consiste em: um frango, um galo e uma poedeira.

70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 69, caracterizado pelo fato de que a ave doméstica é uma galinha.

71. Método para o tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio associado à produção de ácido lático no trato gastrintestinal de um equino, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao equino de uma

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quantidade eficaz de células de M. elsdeníi. 72 . Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é acidose. 73. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é

doença respiratória.

74 . Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é laminite. 75 . Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a condição ou distúrbio é uma infecção. 76. Método, de acordo com a reivindicação 75,

caracterizado pelo fato de que a infecção é com Salmonella ou Campylobacter.

77. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um equino, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao equino de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníi.

78. Método, de acordo com a reivindicação 77,

caracterizado pelo fato de que o micro-organismo oportunistico é patogênico. 79. Método , de acordo com a reivindicação 77 ou 78, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo

oportunistico é Salmonella ou Campylobacter.

80. Método de aumento da biodisponibilidade de fósforo derivado de plantas na dieta de um equino, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao equino de uma

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13/22 quantidade eficaz de células de M. elsdeníí.

81. Método de aumento do desempenho de crescimento em um equino, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao equino de uma quantidade eficaz de células de M. elsdeníí, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite, na mineralização óssea, ou combinações destes.

82 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 81, caracterizado pelo fato de que o equino é um cavalo , um pônei, um asno ou uma mula • 83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 82, caracterizado pelo fato de que um aditivo alimentar compreende as células de M. elsdeníí. 84 . Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o aditivo alimentar é um PÓ, granulado, particulado, pélete, torta , líquido, gel, ou combinações destes 85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 84, caracterizado j Delo fato de que uma composição compreende as células de M. elsdeníí ou um aditivo alimentar que compreende : as células. 86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a compos ição é uma cápsula. 87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 86, caracterizado pelo fato de que as

células de M. elsdeníí são células liofilizadas.

88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 85, caracterizado pelo fato de que as

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14/22 células de M. elsdenii são administradas em um líquido.

89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda a reidratação de um aditivo alimentar ou células liofilizadas para produzir o líquido.

90. Método, de acordo com a reivindicação 88 ou 89, caracterizado pelo fato de que o líquido é administrado por gavagem oral ou por pulverização do animal com o líquido.

91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 90, caracterizado pelo fato de que as células de M. elsdenii são administradas antes, concomitantemente ou depois da alimentação do animal com um alimento.

92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 91, caracterizado por compreender uma única administração das células de M. elsdenii.

93. Método, reivindicações 58 a administração diária

94 . Método, reivindicações 58 a de uma administração de acordo com

91, caracterizado das células de M.

de acordo com 93, caracterizado das células de M.

qualquer uma das por compreender uma elsdenii.

qualquer uma das por compreender mais elsdenii em um único

95. Método de produção de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas que compreendem células de Megasphaera e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose,

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15/22 maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrans, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas,

(c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera são

produzidas .

96. Método de administração de células de Megasphaera a um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal das células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 95.

97. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 95, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

98 . Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal

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16/22 de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 95.

99. Composição caracterizada por compreender células encapsuladas liofilizadas de Megasphaera produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 95.

100. Método de produção de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais que compreendem células bacterianas anaeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do

grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona,

extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas são produzidas.

101. Método de administração de células bacterianas anaeróbicas a um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na

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17/22 reivindicação 100.

102. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 100, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

103. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunistico no trato gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 100.

104. Composição caracterizada por compreender células bacterianas anaeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 100.

105. Método de produção de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais que compreendem células bacterianas anaeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseina, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço,

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18/22 fucose, glicosamina, dextrans, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições anaeróbicas ou condições anaeróbicas parciais,

(c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas são produzidas. 106 Método de administração de células bacterianas

anaeróbicas a um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 105.

107. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 105, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

108. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato

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19/22 gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 105 .

109. Composição caracterizada por compreender células bacterianas anaeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 105.

110. Método de produção de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas liofilizadas, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições aeróbicas que compreende células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células, (c) congelamento das células, e (d) liofilização das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas liofilizadas são produzidas.

111. Método de administração de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas a um animal, caracterizado por

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20/22 compreender a administração ao animal de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 110.

112. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 110, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

113. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 110.

114. Composição caracterizada por compreender células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 110 .

115. Método de produção de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas, caracterizado por compreender:

(a) o preparo de uma cultura sob condições aeróbicas que compreende células bacterianas e/ou células de levedura

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21/22 aeróbicas e um meio de crescimento que compreende pelo menos duas fontes de carbono selecionadas do grupo que consiste em: caseína, lactato, dextrose, frutose, frutano, glicose, sacarose, lactose, maltose, acetato, glicerol, manitol, sorbitol, sacarose, xilose, melaço, fucose, glicosamina, dextrana, uma gordura, um óleo, glicerol, acetato de sódio, arabinose, proteína de soja, proteína solúvel, rafinose, amilose, amido, triptona, extrato de levedura, e combinações destes, (b) coleta das células sob condições aeróbicas,

(c) congelamento das células, (d) liofilização das células, e (e) encapsulação das células, em que cerca de 1 x 10³ até cerca de 1 x 10¹² UFC/g de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas

encapsuladas liofilizadas são produzidas.

116. Método de administração de células bacterianas e/ou de levedura aeróbicas a um animal, caracterizado por compreender a administração ao animal de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas conforme definida na reivindicação 115.

117. Método de aumento do desempenho de crescimento em um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 115, em que o desempenho de crescimento aumentado no animal é um aumento: na ingestão alimentar, no ganho diário médio, na proporção de conversão alimentar, no ganho de carcaça, na produção de leite em um animal produtor

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22/22 de leite, na produção de ovos em aves domésticas, na mineralização óssea, ou combinações destes.

118. Método para a prevenção ou diminuição do crescimento de um micro-organismo oportunístico no trato gastrintestinal de um animal, caracterizado pelo fato de que compreende a administração ao animal de uma quantidade eficaz de células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 115.

119. Composição caracterizada por compreender células bacterianas e/ou células de levedura aeróbicas encapsuladas liofilizadas produzidas pelo método, conforme definido na reivindicação 115.