CN114921374B - 产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌其应用和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种假单胞菌，并根据该假单胞菌提供其应用领域以及能够具体实施的应用方法。所述假单胞菌分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PY‑4B，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO:2022056；所述假单胞菌PY‑4B在培养基上，菌落为黄色，表面光滑、隆起，边缘规则；镜检结果为革兰氏阴性菌。本发明假单胞菌PY‑4B解决了人们长期渴望解决而始终未能很好解决的固体饲料多方面问题，尤其是豆粕的营养利用率不高、适口性差，导致实际豆粕饲喂效果较为有限的问题，大大提高了动物对豆粕的营养成分吸收利用效率，能够有效减少豆粕用量、提高豆粕饲喂效果，同步实现低成本化和高收益化改进。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，并根据该假单胞菌提供其应用领域以及能够具体实施的应用方法。
背景技术
随着我国水产养殖业的迅速发展，传统水产饲料的需求量急剧上升，考虑到养殖业的可持续发展，寻找可以替代鱼粉的优质蛋白源已成为人们关注的热点。豆粕中富含高质量的植物源蛋白质、微量矿物元素和维生素，且价格低廉，来源稳定，目前已经成为代替鱼粉的主要植物源蛋白质。
豆粕中存在多种抗营养因子如抗原蛋白和植酸等。在抗原蛋白组成和含量中，大豆球蛋白和β-大豆伴球蛋白是其主要成分，分别占抗原蛋白的52％和35％。抗原蛋白的存在对动物体内某些消化酶起抑制作用，是导致动物过敏反应引起腹泻和生长受阻的主要成分，也是豆粕代替鱼粉后鱼类消化率和肠道吸收率不高的主要原因。植酸中的磷难以被单胃动物消化利用，是植物性蛋白源的主要抗营养因子之一。它可与多种矿物质的阳离子螯合，也可与蛋白质等形成不溶性复合物，降低微量元素和氨基酸的利用率，也会影响蛋白质、淀粉、脂类物质的消化利用，限制了豆粕在饲料中的应用。同时，不同的抗营养因子之间存在复杂的协同抗营养作用，能够进一步抑制水产养殖动物的生长性能并降低动物对植物蛋白中营养物质的消化吸收利用能力。因此，目前的研究重点是如何有效消除或降低豆粕中的多种抗营养因子，提高动物对豆粕的消化利用能力，增加豆粕的适口性，让其发挥最佳的饲用价值。
目前消除豆粕中抗营养因子的主要方法包括微生物发酵法、酶制剂处理法、化学处理法、热处理法以及育种法。其中微生物发酵法安全、健康、高效，在适当的发酵条件下有效降解豆粕中的抗营养因子。相关研究表明，经发酵处理后的豆粕与普通豆粕相比，难消化的抗原蛋白降解为小分子蛋白质、游离氨基酸以及一些生长因子，提高了豆粕中磷的利用率、减轻对环境的污染，还可产生乳酸、维生素、益生菌等活性物质改善营养质量。已有大量研究表明，自然界中的部分霉菌、细菌及酵母菌等菌种，对豆粕中的抗营养因子具有一定的降解能力，有些菌株还具有同时降解豆粕中的植酸和抗原蛋白等多种抗营养因子的能力。任志青等以粗壮脉纹孢菌发酵豆粕为研究对象，豆粕粗蛋白含量从50.39g/100g上升至61.19g/100g,植酸含量从6.90g/100g减少至1.36g/100g，有效改善豆粕营养成分和降低抗营养因子含量。任志青,邓泽元,宋沥文,等.通过粗壮脉纹孢菌发酵改善豆粕营养结构的研究.食品工业科技,2016,37(12):222-225+249。但在具体的应用上仍存在一定的局限性。
发明内容
为解决现有的豆粕中抗营养因子过高，蛋白分子大、溶解难度高，且含有大量植酸难以降解，不利于豆粕的营养成分被吸收利用等问题，本发明提供了一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，且基于该假单胞菌提供了应用和及其具体方法。
本发明的目的在于：
1)有效分离筛选获得一种对固体饲料进行抗营养因子降解的菌株；
2)对分离筛选所得的菌株进行有效利用，降解固体饲料中的大分子蛋白和植酸，降低抗营养因子，提高固体饲料的营养价值。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，
所述假单胞菌分类命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)PY-4B，保藏单位为：CCTCC中国典型培养物保藏中心，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO:2022056，保藏日期为：2022年1月10日,保藏地址：中国武汉大学；
所述假单胞菌PY-4B形状及生理生化特征包括：
形状：在培养基上，菌落为黄色，表面光滑，隆起，边缘规则；
生理生化特征：菌体镜检结果为革兰氏阴性菌。
作为优选，
所述假单胞菌PY-4B具有蛋白酶活性和植酸酶活性。
作为优选，
所述假单胞菌PY-4B蛋白酶活性为403.3±17.8U/mL；
所述假单胞菌PY-4B植酸酶活性为62.9±2.9U/mL。
一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用，
所述假单胞菌PY-4B用于发酵固体饲料。
一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，
所述方法包括以下步骤：
1)将所述假单胞菌PY-4B挑单菌落于培养基中，于37±1℃条件下培养，培养至培养基中活菌数≥108CFU/mL；
2)将步骤1)培养所得菌液接种至固态发酵培养基中，固态发酵培养基由固体饲料和水配制，在37±1℃条件下发酵培养。
作为优选，
步骤1)所述培养的过程中控制摇床转速为160～200r/min；
步骤1)所述培养的过程持续≥24h。
作为优选，
步骤2)所述菌液以8～11％(v/v)的比例接种至固态发酵培养基中。
作为优选，
所述发酵培养时间为1～5d。
作为优选，
所述固态发酵培养基中，固体饲料和水的用量比为1g：(0.8～1.1)mL。
作为优选，
所述固体饲料为豆粕。
具体的，本发明技术方案是基于豆粕发酵进行研究的，但根据本发明所用的特有假单胞菌 PY-4B自身固有属性，不能够排除其具有用于其他可发酵的固体饲料进行发酵的功能，降解固体饲料内大分子蛋白和植酸，以降低饲料中抗营养因子的能力，且能够合理预期其在适当条件下均能够产生相类似的效果。
本发明的有益效果是：
1)本发明假单胞菌PY-4B解决了人们长期渴望解决而始终未能很好解决的固体饲料多方面问题，尤其是豆粕的营养利用率不高、适口性差，导致实际豆粕饲喂效果较为有限的问题，其大大提高了动物对豆粕的营养成分吸收利用效率，能够有效减少豆粕用量、提高豆粕饲喂效果，同步实现低成本化和高收益化改进；
2)分离所得的假单胞菌PY-4B对于固体饲料，尤其是豆粕中难溶的大分子蛋白和植酸均具有良好的分解、降解效果；
3)本发明假单胞菌PY-4B对环境适应性强，成本低，易分离、培养；
4)本发明具体对固体饲料的处理操作简洁高效，通过接种发酵数日即可快速实现豆粕的营养价值上升，使其被动物消化吸收利用的难度呈快速、显著的下降趋势。
附图说明
图1是本发明假单胞菌PY-4B在脱脂奶粉平板上的蛋白酶活力(A)和植酸钙平板上的植酸酶活力示意图(B)；
图2是本发明假单胞菌PY-4B的菌落形态；
图3是本发明假单胞菌PY-4B的16S rDNA序列构建的系统发育树；
图4是本发明假单胞菌PY-4B固态发酵豆粕SDS-PAGE胶图；
其中图4中，M：蛋白Marker；泳道1：未发酵豆粕；泳道2：PY-4B固态发酵豆粕12h；泳道3：PY-4B固态发酵豆粕24h；泳道4：PY-4B固态发酵豆粕36h；泳道5：PY-4B固态发酵豆粕48h；泳道6：PY-4B固态发酵豆粕60h样品。
具体实施方式
以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。
实施例1
假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)的分离、筛选及鉴定：
1-1)材料及培养基：
用于分离假单胞菌PY-4B的材料为浙江省杭州市钱塘区沿江湿地采集的土样；
用于产蛋白酶菌株分离所用的培养基为脱脂奶粉平板(配方为：脱脂乳粉50g/L，20g/L 琼脂，121℃，高压灭菌15min)；
用于产植酸酶菌株分离所用的培养基为植酸钙平板(配方为：葡萄糖30g/L，胰蛋白胨25g/L，植酸钙5g/L，琼脂20g/L，(NH4)2SO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO40.03g/L，KCl 0.5g/L， 121℃，高压灭菌15min)；
1-2)分离纯化：将上述步骤1-1)中的土壤装于采样袋中，带回实验室后分装晾干一周；晾干后的土样每份称取5g，分别加入含有45mL无菌水的锥形瓶中，锥形瓶中加入5粒无菌的玻璃珠，37℃摇床培养2h；吸取培养后的样品以10倍梯度稀释，分别取10-2、10-3、 10-4浓度稀释液200μL，涂布于脱脂奶粉固体平板上，37℃培养72h；待平板上长出的有明显水解圈的菌落，分别挑取单菌落，接种于新鲜平板上，37±1℃条件下纯化培养72h，获得纯化后的菌株；
1-3)产蛋白酶菌株和植酸酶菌株初筛：将步骤1-2)分离得到的菌株分别接种于LB液体培养基，37℃，180r/min条件下培养24h，活菌数约为108CFU/mL，采用牛津杯法初步检测菌株的蛋白酶活力，将菌液注入脱脂奶粉平板上的牛津杯中，37±1℃培养24h；将菌液注入植酸钙平板上的牛津杯中，37±1℃培养72h，观察并测量水解圈大小，初步筛选到一株同时具有较好的产蛋白酶和植酸酶功能的菌株Pseudomonas sp.PY-4B，PY-4B在脱脂奶粉平板上的水解圈为2.3±0.2cm(如图1A)，在植酸钙平板上的水解圈为1.2±0.1cm(如图1B)，表明筛选得到的菌株Pseudomonas sp.PY-4B具有良好的蛋白酶活性和植酸酶活性；
1-4)产蛋白酶菌株和植酸酶菌株复筛：复筛采用蛋白酶活测定法和植酸酶酶活测定法；
1-4-1)蛋白酶活测定法具体方法为：
配制液体发酵培养基：豆粕40g/L，CaCl21.5 g/L，葡萄糖4.1g/L，酵母浸粉9.4g/L，NaCl 3g/L，121℃，高压灭菌15min；
将初筛得到较大水解圈的菌株接种至LB液体培养基，37℃，180r/min条件下培养培养24h，使活菌数约为108CFU/mL，以4％的接种量转接至50mL所述液体发酵培养基中，37℃，180 r/min培养48h，培养结束后，7800r/min离心10min，取上清测定酶活力，根据SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法测定，在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位，重复3次试验，计算得出蛋白酶活力；
标准曲线的绘制：取6支试管分别吸取不同浓度酪氨酸1mL，各加入0.4mol碳酸钠5mL，再各加入已稀释的福林试剂1mL，摇匀置于水浴锅中，40℃保温发色20min在分光光度计进行测定(波长660nm)，一般测三次，取平均值，将1-6号管所测得的光密度(OD)减去1 号管(蒸馏水空白试验)所测得的光密度为净OD数，以净OD值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准曲线(或可求出每度OD所相当的酪氨酸量K)；
样品测定：取15×100mm试管3支，编号1，2，3，每管内加入上述发酵培养样品上清1mL，置于40℃水浴中预热2min，再各加入经同样预热的酪蛋白1mL，精确保温10min，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15×150mm试管3支，编号1，2，3，每管内加入滤液1mL，再加0.4mol碳酸钠5mL，已稀释的福林试剂1mL摇匀，40℃保温发色 20min后进行光密度(OD)测定。
空白试验也取试管3支，编号(1)、(2)、(3)，测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4mol 三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白，在40℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位；
样品蛋白酶活力计算公式如下：
式中：A为由样品测得OD值经查标准曲线得相当的酪氨酸微克数(或OD值*K)；N为酶液稀释的倍数；W为样品水分百分含量，所得蛋白酶活力单位为U/mL；
经本例的测定和计算结果表明，本实施例1分离所得的假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp. PY-4B)蛋白酶活力达到403.3±17.8U/mL；
1-4-2)植酸酶酶活测定法具体方法为：
配制液体发酵培养基：麸皮3％，(NH4)2SO45 g/L，蛋白胨3g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.018g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，pH 5.5，121℃，高压灭菌15min；
将初筛得到较大水解圈的菌株接种至LB液体培养基，37℃，180r/min条件下培养培养24h，使活菌数约为108CFU/mL，以4％的接种量转接至50mL发酵培养基中，28℃、180r/min 培养72h，培养结束后，7800r/min离心10min，取上清测定酶活力，采用FeSO4-钼蓝法测定植酸酶活性，在37℃下每分钟从植酸钠释放出1μmol无机磷所需要的酶量，定义为1 个植酸酶活力单位，重复3次试验，计算得出植酸酶活力；
标准曲线的绘制：取6支试管分别吸取不同浓度标准磷溶液2mL，各加入硫酸亚铁-钼酸铵显色液2mL，37℃温水浴10min，在分光光度计进行测定(波长750nm)，一般测三次，取平均值，以OD值为横坐标，磷的纳摩尔数为纵坐标，绘制成标准曲线；
样品测定：取小试管两支，分别加入0.3mL的酶液置于37℃水浴中预热2min，再加入0.7 mL的植酸钠溶液，摇匀后，37℃恒温水浴30min后，立即加入1mL 10％三氯乙酸溶液用以终止反应，并加入10％钼酸铵贮备液，显色后，在660nm处测定OD660值，结合标准磷曲线，计算植酸酶活力，
空白测定:另取小试管一支，加入0.3mL的稀释酶液置于37℃水浴中预热2min，立即加入 1mL 10％三氯乙酸溶液用以终止反应，再加入0.7mL的植酸钠溶液，其他操作同样品的测定，结合标准磷曲线，计算植酸酶活力，在37℃下每分钟从植酸钠释放出1μmol无机磷所需要的酶量，定义为1个植酸酶活力单位；
样品植酸酶活力计算公式如下：
式中：OD为样品在660nm下的吸光度，OD0为对照空白样品在660nm下的吸光度，N为酶液稀释的倍数，K为标准曲线斜率，T为酶促反应时间，所得植酸酶活力单位为U/mL；经本例的测定和计算结果表明，本实施例1分离所得的假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp. PY-4B)植酸酶活力达到62.9±2.6U/mL；
1-4-3)经上述的验证和鉴定，证明本发明分离筛选所得的假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp. PY-4B)具有良好的产蛋白酶和产植酸酶能力；
1-5)形态表征和生理生化特性：
本发明所述的PY-4B在LB固体培养基上培养时如图2所示其菌落为黄色，表面光滑，隆起，边缘规整；
生理生化特性如下表表1所示，通过表1与和图3所示的16S rDNA序列的比对结果，表明该菌株鉴定为假单胞菌[具体命名为假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)]，保存。
表1：PY-4B菌株的生理生化鉴定结果。
表中：+表示阳性，-表示阴性。
实施例2
通过实施例1分离筛选所得的假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)进行发酵豆粕，其具体方法如下：
2-1)菌种的活化培养：以实施例1培养保存的假单胞菌PY-4B(Pseudomonassp.PY-4B)挑单菌落于接入至LB液体培养基，在37±1℃条件下培养24h至得到浓度为1×108CFU/mL 的菌悬液，作为发酵接种液；
2-2)以豆粕和无菌水以100g：100mL的比例混合制为固体发酵培养基，取300mL三角瓶装入所配制的固体发酵培养基30g，利用步骤2-1)得到的发酵培养液以10％(v/v)的比例接种至固体发酵培养基中；
2-2-1)本例中分别发酵培养12h、24h、36h、48h、60h；
2-3)测定经步骤2-2)发酵后豆粕蛋白：至步骤2-2)发酵完毕，烘干、粉碎，分别取2.5 g发酵后的产物溶于50mL 0.03M Tris-HCl(pH 8.0)，超声提取30min，提取结束后，SDS-PAGE检测粗蛋白消化情况，样品静置5min，取40μl上清与10μl 5×蛋白上样缓冲液混合均匀，沸水浴6min，11000rpm离心3min，取30μl上清上样SDS-PAGE，电压100V， 1h，考马斯亮蓝染色30min，脱色30min后换脱色液脱色过夜。
结果如图4所示，图4中M泳道β伴大豆球蛋白α’亚基、α亚基、β亚基和大豆球蛋白酸性亚基、碱性亚基均明显染色，12～36h发酵组中至少还存在55kDa的β亚基存在明显染色，而至48h后β亚基几乎不显色且随着发酵时间的延长碱性亚基显色逐渐明显，表明发酵豆粕在48h时粗蛋白基本被降解，小分子蛋白显著增加。但同时需要注意的是，蛋白酶不但具有降解粗蛋白等大分子蛋白的能力，同样也具备降解小分子蛋白的能力，由M泳道、泳道 1和泳道2对比可以看出，随着发酵时间的延长实际碱性亚基显色变弱，表明实际小分子蛋白也被降解损耗，实际产生了蛋白损失。因此，发酵时长并未越久越好，需要进行严格的把控。
实施例3
假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)发酵豆粕蛋白测定；
具体步骤如下：
3-1)样品处理：精密称取0.2g发酵豆粕样品(具体发酵过程操作同实施例2中步骤2-1 至步骤2-2)，移入干燥的500mL定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，移入100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用；
3-1-1)取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白消化液做对比试验；
3-2)装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水；
3-3)向接收瓶内加入10mL2％硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0mL样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10mL水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞，将10mL40％氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min，移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下接收瓶，以0.05N硫酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点；
3-3-1)同时取步骤3-1-1)所得的10.0mL试剂空白消化液按照步骤3-3)处理进行对照；
3-4)计算样品中蛋白质的百分含量X，具体计算式如下所示：
式中：V1为样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，mL；V2为试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，mL；N为硫酸标准溶液的当量浓度；m为样品的质量(体积)，g(mL)，F为氮换算为蛋白质的系数；
3-5)水溶性蛋白质提取测定：参照GB/T 31785—015《大豆储存品质判定规则》中附录A 中水溶性蛋白质测定方法。
其中，步骤3-4)和步骤3-5)所得的计算和测定结果如下表表2所示。
表2：不同时间发酵豆粕的蛋白含量。
| 水分％ | 总蛋白％ | 水溶性蛋白％ | 氮溶指数％ | |
| 原豆粕 | 3.94 | 48.87 | 5.74 | 11.74 |
| 12h | 57.70 | 57.63 | 6.53 | 11.34 |
| 24h | 56.15 | 57.89 | 12.03 | 20.81 |
| 36h | 56.01 | 59.24 | 13.61 | 23.01 |
| 48h | 57.13 | 62.82 | 14.86 | 23.69 |
| 60h | 55.44 | 61.92 | 16.10 | 26.01 |
| 3d | 54.25 | 58.91 | 16.04 | 27.25 |
| 4d | 54.80 | 57.84 | 17.59 | 30.42 |
| 5d | 53.13 | 57.23 | 16.41 | 28.70 |
| 6d | 44.64 | 59.66 | 16.26 | 27.31 |
在本实施例中，总蛋白计算以凯氏定氮测量法进行。其以100g物质的干重中所含的蛋白质克数表示。总上表可以明显看出，随着发酵时间的延长，总蛋白含量呈现出先上升后下降的趋势，发酵时间仅为12h时其水溶性蛋白相较于原豆粕而言几乎没有提升，甚至在氮溶指数方面有所下降，但总蛋白含量有较为明显的提升。这主要是由于早期过程中本发明假单胞菌会使豆粕中的碳源转化为热量导致总重量减少，而氮源几乎不产生损耗，并且开始转化出微生物菌体蛋白，并少量降解大分子蛋白产生小分子蛋白，因此产生上表所呈现的结果。表明其在12h发酵后对于豆粕的营养价值提升并不显著。而随着发酵时间的进一步延长，总蛋白不断地累积，至发酵时间有24h时总蛋白和水溶性蛋白含量即已明显提高，且氮溶指数有明显的上升，总蛋白含量的峰值出现在48h发酵时间处，表明在该时间点时，蛋白累积达到峰值。更进一步延长发酵时间后，总蛋白含量产生了较为明显的下降趋势，这是由于部分小分子蛋白被蛋白酶彻底降解，开始产生损耗，但水溶性蛋白含量保持持续上升，表明实际部分蛋白是由菌株的蛋白酶补充的，进而使得总蛋白相较于原豆粕有较为显著的提升，水溶性蛋白峰值出现在发酵4d处，氮溶指数也达到最高，因此可视作该发酵时间能够产生最丰富且容易被动物消化利用的营养成分。
随着发酵时间延长到6d，可以看出其水溶性蛋白和氮溶指数均相较于第5d有明显的下降，但总蛋白含量有个逆向的上升、水分含量明显下降，表明该期间产生了大量的微生物菌体蛋白和蛋白酶，其也同样属于蛋白质，并且相较于豆粕自身的营养成分蛋白，其对于动物养殖而言其营养价值显著下降，同时大量的水分损失也会导致豆粕的硬度上升，适口性产生明显的下降，动物的摄入量减小，因而导致实际使用效果不佳。因此综合上述，最佳发酵时间区间应当在1～5d，而不应当进一步超过6d，否则容易导致抗营养因子含量上升，导致其实际营养价值产生下降。
实施例4
假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)发酵豆粕植酸测定；
具体步骤如下：
4-1)菌种的活化培养：以实施例1培养保存的假单胞菌PY-4B(Pseudomonassp.PY-4B)挑单菌落于接入至LB液体培养基，在37±1℃条件下培养24h至得到浓度为1×108CFU/mL 的菌悬液，作为发酵接种液；
4-2)以豆粕和无菌水以100g：100mL的比例混合制为固体发酵培养基，取300mL三角瓶装入所配制的固体发酵培养基30g，利用步骤2-1)得到的发酵培养液以10％(v/v)的比例接种至固体发酵培养基中进行发酵处理，根据GB5009.153—2016，采用三氯化铁比色法测定豆粕发酵过程中的植酸含量变化；
4-3)绘制标准曲线:准确吸取植酸标准溶液0.0mL、0.04mL、0.1mL、1.0mL、2.0mL、5.0 mL于6支10mL比色管中，分别用水稀释至5mL，制得含植酸0.0mg、0.004mg、0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.5mg的系列标准溶液，加入4mL反应溶液，混匀，静置20min后取部分清液倒入1cm比色皿中，于500nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，植酸的质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程；
4-4)空白测定：取2g过80目筛的大豆粉，加入50mL的1.2％HCl·10％Na2SO4溶液，加水定容到100mL，倒入三角瓶中，盖上瓶塞或者用保鲜膜包裹瓶口，置于震荡器中，震荡提取2h，提取结束后，将提取液进行离心，离心参数设置为4500r/min，10min。最后将离心后的上清液封存在冰箱(4℃)中，测定时，取低温保存的提取液5mL于试管中，加入2mL 15％的三氯乙酸，混匀后放置冰箱(4℃)中2h，然后在4500r/min离心10min，吸取离心液10mL，调节pH值到1.9，加水到25mL，混匀后取6mL于25mL比色管，加 4mL三氯化铁-磺基水杨酸显色剂，再加水至25mL，混匀静置20min，于500nm处测吸光度；
4-5)样品测定：取2g样品用硫酸钠-盐酸提取液定容到100mL后，其他操作同空白样品的测定，按照下面公式计算豆粕中植酸含量X：
式中：c为被测样液中植酸质量，g；m为样品的质量，g。
测试和计算结果显示，本发明假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)在发酵处理豆粕 4d后植酸降解率达到峰值，此时植酸降解率为61.02％。而在4d之前，随着发酵时间的延长，植酸降解率逐渐上升，而达到4d后，随着发酵时间的延长植酸降解率反而下降，这是因为植酸为肌醇六磷酸，植酸酶仅能够将其降解为肌醇衍生物并释放磷酸基团，而不能彻底降解为肌醇和磷酸，而随着发酵时间的延长、菌活性的下降，肌醇衍生物和磷酸基团或存在再次转化为磷酸的可能性，因此伴随而来的便是测定中表现出的植酸含量二次上升。因此，对于植酸的降解，实际最佳发酵时间应当在1～6d，而为与大分子蛋白降解的最佳效果进行适配，本发明假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)用于发酵豆粕的最佳发酵时间为1～5d。
发酵饲料饲喂试验
此外，除豆粕外，本发明假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)对于小麦麸饲料也具有良好的发酵处理效果，能够大大提高小麦麸饲料的营养价值。相较于豆粕，小麦麸饲料发酵时长应当控制在1～3d，因为本发明假单胞菌PY-4B(Pseudomonas sp.PY-4B)的发酵周期性规律大致是恒定的，但针对养分结构不同的固体饲料，其所用的发酵周期应当在合理范围内进行略微调整，但均不得少于1天(无法产生良好的发酵效果，假单胞菌自身仍在发育阶段)，且不得大于5天(蛋白质养分结构发生改变，微生物菌体蛋白和蛋白酶含量显著上升，且植酸含量二次上升，从而导致实际营养价值下降)。
通过实施例2所述发酵(3d)处理的豆粕饲料，替代原有的原豆粕饲料，用于大口黑鲈养殖，饲料投喂量下降25％的情况下，同周期内发酵豆粕饲喂的鱼苗增重相较于原豆粕饲料饲喂的鱼苗增重率上升22％，表明经过发酵处理的豆粕用于水产业养殖饲料使用时，能够产生非常优异的效果。养殖成本显著下降，且养殖营收能够得到显著的上升，可以大大提高水产养殖行业的利润率，且饲料的有效利用率得到非常明显的提升。
此外，通过发酵6d处理的豆粕饲料替代原有的原豆粕饲料，用于小规模大口黑鲈养殖，饲料投喂量下降25％的情况下，同周期内发酵豆粕饲喂的鱼苗增重相较于原豆粕饲料饲喂的余量增重率下降了2.2％，表明其能够实现减施、节省成本的效果，略微提高养殖效益，但实际对于提升养殖产品而言质量并未有所提升，甚至容易导致其下降。而在提高饲料利用率、提高养殖效益的同时，应当同时兼顾到养殖产品品质，因此实际6d发酵处理的发酵豆粕饲料实际使用效果远不及发酵1～5d的发酵豆粕饲料。
Claims (10)
1.一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，其特征在于，
所述假单胞菌分类命名为假单胞菌（Pseudomonas sp.）PY-4B，保藏单位为：CCTCC，保藏中心保藏编号为：CCTCC NO:2022056，保藏日期为：2022年1月10日；
所述假单胞菌PY-4B形状及生理生化特征包括：
形状：在培养基上，菌落为黄色，表面光滑，隆起，边缘规则；
生理生化特征：菌体镜检结果为革兰氏阴性菌。
2.根据权利要求1所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，其特征在于，
所述假单胞菌PY-4B具有蛋白酶活性和植酸酶活性。
3.根据权利要求2所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌，其特征在于，
所述假单胞菌PY-4B蛋白酶活性为403.3±17.8 U/mL；
所述假单胞菌PY-4B植酸酶活性为62.9±2.9 U/mL。
4.一种如权利要求1所述的产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用，其特征在于，
所述假单胞菌PY-4B用于发酵固体饲料。
5.一种如权利要求1所述的产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
1）将所述假单胞菌PY-4B挑单菌落于培养基中，于37±1℃条件下培养，培养至培养基中活菌数≥108 CFU/mL；
2）将步骤1）培养所得菌液接种至固态发酵培养基中，固态发酵培养基由固体饲料和水配制，在37±1℃条件下发酵培养。
6.根据权利要求5所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
步骤1）所述培养的过程中控制摇床转速为160～200 r/min；
步骤1）所述培养的过程持续≥24 h。
7.根据权利要求5所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
步骤2）所述菌液以8～11 %(v/v)的比例接种至固态发酵培养基中。
8.根据权利要求5或7所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
所述发酵培养时间为1～5 d。
9.根据权利要求5所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
所述固态发酵培养基中，固体饲料和水的用量比为1 g：（0.8～1.1）mL。
10.根据权利要求5或9所述的一种产蛋白酶及植酸酶的假单胞菌的应用方法，其特征在于，
所述固体饲料为豆粕。
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