CN1529755A - 新的细菌植酸酶及其生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的细菌植酸酶，以及有关的生产方法。更具体地说，本发明涉及从酸孢菌(Acidocella)属的细菌获得的新植酸酶，以及编码所述植酸酶的多核苷酸。本发明还涉及含有所述多核苷酸的载体，以及在其组织中表达所述植酸酶的转化的宿主生物。本发明进一步涉及含有至少一种植酸酶活性的新细菌提取物。

Description

新的细菌植酸酶及其生产方法
本发明涉及细菌来源的新植酸酶，以及有关的生产方法。本发明更具体地涉及衍生自酸孢菌(Acidocella)属细菌的新植酸酶，以及编码这些植酸酶的多核苷酸。本发明还涉及含有这些多核苷酸的载体，以及在其组织内表达所述植酸酶的转化的宿主生物。本发明还涉及包含至少一种植酸酶活性的新细菌提取物。
具体而言，本发明的细菌提取物和植酸酶特别适合用于动物营养物的饲料组合物。该适合性与它们的特性有关，具体的是，在与制备所述组合物的条件以及在动物的消化系统中遇到的条件相对应的温度和pH条件下它们的活性。
磷是所有生物的生存所必需的元素。具体地说，对于家畜的饲养者确保他们的动物摄取足够量的磷以使它们得到最佳生长和发育是至关重要的。大多数家畜饲喂以植物为基础的饲料组合物。这些植物含有大量的磷酸盐，它们将这些磷酸盐以储藏化合物—植酸的形式贮存在它们的组织中。按平均值，植酸含有50-70％存在于植物中的磷酸盐。植酸自然流动，其所含有的磷酸盐在大多数家畜中释放，特别是反刍动物。然而，植酸不能被单胃的动物所代谢，例如猪和家禽。因此，在这些动物中，包含在其摄入食物中的植酸随粪便排除，饲养者不得不用无机磷酸盐补充所述的摄入量，以使动物摄取足够量的磷酸盐。这一策略造成饲养者额外的花费并产生来自排放到环境中的非-同化植酸的污染。在密集的饲养区域更增加了这种污染。
还已知植酸是包含于摄取的食物中的重要营养元素的螯合剂，例如，镁、钙、锌或铁。这一特性导致食物摄取的营养质量下降，给予植酸抗营养剂的特性。
为了对与单胃的动物缺乏植酸的同化作用有关的各种缺点作出反应，设想将一种酶——植酸酶引入这些家畜摄取的食物中。植酸酶水解植酸，释放肌醇和无机磷酸盐。植酸酶，和编码这些植酸酶的基因已从很多生物中分离得到。植酸酶主要是从真菌中分离得到(Howson和Davis，1983，Enzyme Microb.Technol.5，377-382；Wyss等，1999，Appl.Environ.Microbiol.，65(2)，359-366)。在产生植酸酶的真菌中，将涉及曲霉属(Aspergillus)，具体是无花果曲霉(A.ficuum)(Ullah和Gibson，1987，Preparative Biochemistry17(1)，63-91；Ullah和Dischinger，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.，192(2)，747-753)，土曲霉(A.terreus)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(部分1)，245-252)，黑曲霉(A.niger)(Dvorakova等，1997，FoliaMicrobiol(Praha)，42(4)，349-352)，烟熏曲霉(A.fumigatus)(Pasamontes等，1997，Appl.Environ.Microbiol，63(5)，1696-1700)，在青霉属Penicillium中，具体是乳酶青霉(P.caseicolum)，在菌丝霉属(Myceliophthora)中，具体是嗜热菌丝霉(M.thermophila)(Mitchell等，1997，Microbiology，143(部分1)，245-252)，在蓝霉属(Talaromyces)中，具体是嗜热蓝霉(T.thermophilus)，在脉孢菌属(Neurospora)中，具体是粗糙脉孢菌(N.crassa)和好食脉孢菌(N.sitophila)，在茶毒菌属(Thermomyces)中，具体是绒状荷毒菌(T.lanuginosus)(Berka等，1998，Appl.Environ.Microbiol.，64(11)，4423-4427)，或者在红曲霉属(Monascus)中，具体是安卡细曲霉(M.anka)。还在细菌中发现植酸酶。通过实施例，将涉及芽胞杆菌属(Bacillus)的细菌，具体是枯草杆菌(B.subtilis)(Powar和Jagannathan，1982，J.Bacteriol.151(3)，102-1108；Shimizu，1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269；Keruvo等，1998，Appl.Environ.Microbiol.，64(6)，2079-2085)，假单胞菌属(Pseudomonas)(Cosgrove，1970，Austral.J.Biol.Sci.23，1207-1220)，埃希氏菌属(Escherichia)，具体是大肠杆菌(Golovan等，2000，Can.J.Microbiol.46，59-71)，肠杆菌属(Enterobacter)(Yoon等，1996，Enzyme and Microbiol.Technol.；18，449-454)，或链霉菌属(Streptomyces)。还分离了酵母植酸酶(Dvorakova，1998，Folia Microbiol.43(4)，323-338)，例如许旺酵母(Schwaniiomyces occidentalis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。最后，在植物中发现植酸酶，具体是在大豆中(Ullah和Gibson，1988，Arch.Biochem.Biophys，260(2)，514-20)，在玉米中(Maugenest等，1997，Biochem J.，322(部分2)，511-7)；Maugenest等，1999，Plant Mol.Biol.，39(3)，503-14)，或在拟南芥菜属(Arabidopsis)(Mullaney和Ullah，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.，251(1)，252-5)。
可以表征植酸酶的特性包括植酸的米氏常数(Km)，活性的最适pH和最适温度，以及在给定的pH和温度下该活性的稳定性。也可使用有关植酸酶结构的数据，例如分子量(MW)，等电点(pI)或肽序列。由于可以将它们用于动物营养物中，植酸酶必须具有与用于这种营养物的饲料成分进行的加工不矛盾的特性。具体的是，必须保持使用的植酸酶的活性，如果可能，在制备这些饲料的过程温度和pH的条件下植酸酶的活性必须是最佳的，并且存在于动物消化道中的植酸酶吸收这些饲料的营养成分。这些限制引导人们主要去寻找具有活性的植酸酶，该活性耐受高温条件，例如在制备饲料组合物的过程中使用的温度条件，并且它还耐受酸性pH条件，例如家畜消化道中存在的pH条件。
为了满足这些标准，人们在生物中寻找植酸酶，具体的是微生物，它们在符合这些标准的温度和pH条件的环境中发育。该策略使之可以分离耐受高温的植酸酶，例如，描述于专利申请WO 97/35016或EP 0 684 313中的那些植酸酶，以及具有低Km的植酸酶，例如，描述于专利申请EP 0 960 934的那些植酸酶。为了赋予其优越的特性，另一个策略是通过定点诱变人工改变已知植酸酶的序列。这一策略具体描述于专利申请WO 99/48380，EP0 897 985和EP 0897 010。
只鉴别了几种在低的最适pH下具有活性的植酸酶。这种植酸酶具体鉴别于真菌中，例如描述于专利申请JP 7067635的乳酪青霉的植酸酶和描述于专利申请WO 98/13480的安卡红曲霉的植酸酶，以及在酵母中，例如描述于专利申请EP 699 762的许旺酵母(Schwaniiomyces occidentalis)的植酸酶。然而，到目前为止，没有分离和鉴别导致具有低的最适pH的植酸酶，具体是最适pH小于4。
附图的描述
图1：解氨酸孢菌(Acidocella aminolytica)ATCC 51361的植酸酶的活性作为温度的函数。相对活性的值100％对应于给定温度下植酸酶的最适活性。
图2：解氨酸孢菌ATCC 51361的植酸酶的活性作为pH的函数。相对活性的值100％对应于给定pH的植酸酶的最适活性。
图3：速生酸孢菌(Acidocella facilis)ATCC 35904的植酸酶的活性作为温度的函数。相对活性的值100％对应于给定温度下植酸酶的最适活性。
图4：速生酸孢菌ATCC 35904的植酸酶的活性作为pH的函数。相对活性的值100％对应于给定pH的植酸酶的最适活性。
图5：包含于在实施例5.5中纯化的并由OFR281编码的片段中的植酸酶的活性作为温度的函数。相对活性的值100％对应于给定温度下植酸酶的最适活性。
图6：包含于在实施例5.5中纯化的并由OFR281编码的片段中的植酸酶的活性作为pH的函数。相对活性的值100％对应于给定pH的植酸酶的最适活性。
详细描述
本发明涉及分离编码由序列标识SEQ ID NO：2描述的植酸酶的多核苷酸。该植酸酶和编码它的多核苷酸也显示出它们起源于酸孢菌属细菌菌株的特征。
根据本发明，术语“多核苷酸”是指由天然或人工序列基础组成的核酸分子，它可以是DNA或RNA型的，较佳是DNA型，具体是双链的。当所述的多核苷酸是天然的，可清楚地理解本发明不包括其自然环境中的这种多核苷酸，而包括从天然发现这种多核苷酸的活生物的基因组中分离和纯化的相同的多核苷酸。该核苷酸可通过提取或纯化直接获得，或通过拷贝间接获得。然而，当多核苷酸人工整合入活生物的基因组而不是其天然存在的基因组时，或者当它作为生物的基因组中的一个或多个拷贝再人工引入其起源的活生物时，本发明包括所述的多核苷酸。当该多核苷酸是探针时，它通常是单链的。
因此，本发明包括编码由序列标识SEQ ID NO：2描述的植酸酶的肽序列的多核苷酸。本领域熟练的技术人员熟知该定义包括编码同一氨基酸序列，因此编码同一植酸酶的、由序列标识SEQ ID NO：2表示的所有多核苷酸，尽管包含由于遗传密码的简并而造成不同的核苷酸序列。
本发明还包括与上述多核苷酸同源的多核苷酸，所述同源多核苷酸编码与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶同源的植酸酶。根据本发明，术语“同源”是指编码植酸酶的多核苷酸，该多核苷酸的序列相对于由序列标识SEQ IDNO：2表示的编码植酸酶的多核苷酸发生了改变。同源的多核苷酸通过与编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸的同一性程度进行表征。通过比较它们的序列得到两个同源多核苷酸之间的同一性程度，通常用这些序列之间相同核苷酸的百分比表达。通过给定的序列长度测定同一性程度，通过比较较短的序列确定序列的长度测定同源序列的同一性程度。因此，本发明包括相对于编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸具有一个或多个序列改变的多核苷酸，并且编码植酸酶，该植酸酶的特性与由序列标识SEQID NO：2表示的植酸酶的特性相同。
根据本发明，表达“相同的植酸酶”或“具有相同特性的植酸酶”主要是指具有植酸酶活性的蛋白质，与它们的内在特性无关，如Km、对于活性最适的pH或对于活性最适的温度。植酸酶活性水平可以通过表征植酸酶活性的任何方法测定。术语“植酸酶”是指一种酶，该酶的催化活性在于水解植酸以释放肌醇和无机磷酸盐。然而，既然大多数的植酸酶不能完全水解植酸(含有6个磷酸盐)，根据本发明植酸酶的催化活性可导致无机磷酸盐和肌醇磷酸盐酯的释放，根据植酸酶的水解能力，所述的酯可以是肌醇单-、二-、三-、四-或五-磷酸盐酯。通过实施例，可根据Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)的方法测定植酸酶的活性，具体如实施例2所描述。然而，表征植酸酶活性的任何方法，或者是通过测定底物量的减少或者是通过测定来自酶促反应的产物的积累，可用于测定植酸酶的活性。具体的是，相似的方法，例如使用另一种底物或其它试剂可测定所述植酸酶的活性。
在同源多核苷酸中存在的序列改变可以是核苷酸的增加、缺失或取代，该核苷酸可以是天然的或通过常规的诱变技术获得的。已知编码具有相同功能的蛋白质的这种同源多核苷酸天然存在于不同的活种的基因组中，甚至存在于不同品种、变种或菌株的基因组中。因此，对于本领域熟练的技术人员，使用讲授的编码由根据本发明的序列标识SEQ ID NO：2表示的肽序列的多核苷酸，使用熟知的分子杂交技术来分离这种同源多核苷酸是容易的(Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Nolan C.编，纽约：Cold Spring HarborLaboratory Press)。
分子杂交是一种成对反应，该反应发生于在其核苷酸序列间具有一定程度的同一性的多核苷酸互补链之间。因此，杂交使之可以使用编码由序列标识SEQID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸来鉴定与这些多核苷酸同源的多核苷酸，在活生物基因组中而不是其所衍生的生物的基因组中，例如其它细菌，具体的是Acidocella的其它菌株，并编码与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶具有相同特性的植酸酶。多核苷酸间的序列同一性越大，在所述的多核苷酸间的杂交可能性越大也越容易，这些多核苷酸编码具有相同特性的蛋白质的概率越大。杂交多核苷酸的方法广泛描述于文献中(Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Nolan C.编，纽约：Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，并为本领域熟练的技术人员所熟知。例如，它们是基于筛选从活生物或从该生物的组织建立的基因组或cDNA文库。使用由已知多核苷酸或其片段组成的探针进行筛选，以在这些文库中鉴定与所述探针同源的多核苷酸，该探针将与所述多核苷酸杂交。根据本发明，探针由编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸或其片段组成。为了鉴别与探针杂交的多核苷酸，标记所述探针，例如，用放射性元素，如32P。也可使用本领域熟练的技术人员所熟知的市售可得的非放射性标记。
因此，本发明还包括能够选择性地与一种编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸或其片段杂交的多核苷酸。应理解，如果这些多核苷酸编码与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶等价的植酸酶，那么它们仅仅是本发明的一部分。根据本发明，因此表达“能够选择性杂交的多核苷酸”是指通过一种常规的分子杂交方法(Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Nolan C.编，纽约：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，在大于所述探针与其它相对非同源的多核苷酸非特异性杂交的水平上，与编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的一种多核苷酸或其片段组成的标记探针杂交，具体地说是其它cDNA，如果标记的多核苷酸是从cDNA文库得来的。杂交水平根据探针标记产生的信号测定。能够选择性杂交的多核苷酸和探针间的相互反应产生的信号水平通常比由探针与其它产生“背景噪声”的多核苷酸间的相互反应产生的信号水平强10倍，较佳是100倍。通常使用正常的，较佳是严格的或非常严格的杂交和洗涤条件获得选择性杂交(例如使用含有至少5×SSC和1％SDS的缓冲液，在约50℃-60℃下杂交，用0.1％的SDS连续洗涤并SSC的浓度逐渐从2×SSC下降至0.4×SSC而温度从20℃增加到50℃)。本领域熟练的技术人员将可调节杂交条件，例如，必要地调节用于杂交步骤和洗涤步骤的温度和缓冲液的盐浓度。这些条件应具体地以使用探针的长度和存在于用这种探针筛选的文库中的多核苷酸的同一性程度的的函数进行调整。为了优化由杂交的同源序列产生的信号，同时使背景噪声最小化，调整杂交条件是必需的。
能够与根据本发明多核苷酸选择性杂交的多核苷酸可以从基因组文库或产生的cDNA文库分离，例如从细菌菌株，具体的从酸孢菌属的菌株。可使用标准杂交技术分离这种多核苷酸(Sambrook等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Nolan C.编，纽约：Cold Spring Harbor Laboratory Press)，使用编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸及这些多核苷酸的片段，或与之互补的多核苷酸作为探针。当通过这些技术分离得到一个多核苷酸时，必须确定其序列并鉴定由该多核苷酸编码的蛋白质的特性，具体的是检验该蛋白质是一种与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶相等的植酸酶。
因此，上述杂交技术可以分离与编码由序列标识SEQ ID NO：2描述的植酸酶的多核苷酸同源的多核苷酸。这种多核苷酸以及它们编码的植酸酶可被在生物技术领域中掌握标准分子生物学技术的熟练的技术人员容易地鉴别。因此，本发明包含与编码由序列标识SEQ ID No.2描述的植酸酶的多核苷酸同源的多核苷酸。优选地，同源多核苷酸的同一性程度相对于编码由序列标识SEQ IDNO：2表示的植酸酶的多核苷酸至少为50％，较佳是至少为70％，80％，更佳是至少90％，和更佳是至少95％。测定和鉴别序列间同一性程度的方法是本领域熟练的技术人员所熟知的。例如，可使用PILEUP、BLAST程序(具体是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10)，或BestFit程序(Wisconsin Sequence Analysis Package，Unix第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711，使用Applied Mathematics中描述的Smith和Waterman算法，1981，第2期，482-489)。
这种同源的多核苷酸也可通过常规诱变技术人工获得。
一种较佳地编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的多核苷酸是用序列标识SEQ ID NO：1表示的。
根据本发明具体的实施例，上述编码植酸酶的多核苷酸来源于酸孢菌属的细菌。
优选地，根据本发明多核苷酸编码植酸酶的最适pH活性为小于或等于4。表达“活性的最适pH”是指根据本发明在该pH值下植酸酶的活性最大，使用上述方法测定该活性，相当于植酸降解和无机磷酸产生的量。
根据本发明具体的实施例，根据本发明编码植酸酶的多核苷酸具有如下特征：
(a)最适温度＝65℃
(b)最适pH＝3.5
根据本发明另一个具体的实施例，根据本发明编码植酸酶的多核苷酸具有如下特征：
(a)最适温度＝70℃
(b)最适pH＝4
根据本发明另一个具体的实施例，根据本发明编码植酸酶的多核苷酸具有如下特征：
(a)最适温度＝60℃
(b)最适pH＝3.5
较佳地，根据本发明编码植酸酶的多核苷酸来自解氨酸孢菌的细胞菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或来自速生酸孢菌的细菌菌株，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本发明还涉及上述多核苷酸的片段。术语“片段”具体是指至少20个核苷酸的片段，具体的是至少50个核苷酸，较佳是至少100个核苷酸。这种片段通常被称作寡核苷酸。它们可用做杂交探针来鉴别同源多核苷酸，或作为引物通过PCR(聚合酶链反应)技术来鉴定和扩增这种同源多核苷酸，该PCR技术描述于Ausubel等，(1987)《新编分子生物学实验指南》(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley和Sons，6.3-6.4节)。
术语“片段”也指根据本发明编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶片段、或与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶同源或相等的植酸酶的片段的多核苷酸的片段。
本发明还涉及含有至少一个上述多核苷酸的多核苷酸。
上述所有的多核苷酸或者编码由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶，或者是同源的植酸酶，或者这些植酸酶的活性片段。因此，本发明扩展为由所有这些多核苷酸编码的全部植酸酶。该定义包括由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶，与该植酸酶同源的植酸酶以及这些植酸酶的活性片段。
根据本发明较佳地实施例，植酸酶是一种至少包含由序列标识SEQ ID NO：2表示的肽序列的蛋白质。较佳地，由序列标识SEQ ID NO：2描述的肽序列表示的植酸酶水解存在于植酸酶分子上的6个磷酸盐中的5个。
因此本发明还包括与由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶同源的植酸酶。根据本发明，术语“同源植酸酶”是指相对于由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶，其序列发生改变的植酸酶。与同源多核苷酸相似，同源植酸酶是其肽序列显示一定程度同一性的植酸酶，其同一性程度通常用相同氨基酸的百分比表达。因此本发明包括相对于由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶具有一个或多个序列修饰的植酸酶，并且其特性与由序列标识SEQ ID NO：2描述的植酸酶的特性相同。这些修饰可以是天然地或通过常规的诱变技术得到的氨基酸的增加、缺失或取代。优选地，同源植酸酶的同一性程度相对于由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶至少为60％，较佳是至少70％，至少80％，更佳是至少90％，和更佳是至少95％。测定和鉴别序列间同一性程度的方法是本领域熟练的技术人员所熟知的。例如，可使用PILEUP、BLAST程序(具体是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36：290-300；Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-10)，或BestFit程序(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Unix第8版，Genetics Computer Group，University Research Park，575 Science Drive，Madison，WI 53711，使用应用数学(Applied Mathematics)中描述的Smith和Waterman算法，1981，第2期，482-489)。
根据本发明具体的实施例，本发明植酸酶来源于酸孢菌属的细菌。
优选地，根据本发明植酸酶具有适合其活性的小于或等于4的最适pH。表达“适合其活性的最适pH”是指根据本发明在该pH值时植酸酶的活性最大，该活性可使用上述方法进行测定并对应于植酸降解和产生无机磷酸盐的量。
根据本发明具体的实施例，植酸酶具有如下特性：
(a)最适温度＝65℃
(b)最适pH＝3.5
根据本发明另一个具体的实施例，植酸酶具有如下特性：
(a)最适温度＝70℃
(b)最适pH＝4
根据本发明另一个具体的实施例，植酸酶具有如下特性：
(a)最适温度＝60℃
(b)最适pH＝3.5
根据本发明另一个具体的实施例，本发明的植酸酶来源于解氨酸孢菌细菌的菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或者来源于速生酸孢菌的菌株，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本发明还扩展到由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶的片段以及同源植酸酶的片段。术语“片段”主要是指生物活性片段，即具有与完整的植酸酶的活性相同的植酸酶活性的片段，如实施例2中描述的通过分析，或类似的分析测定。
本发明还涉及嵌合基因，该嵌合基因包括功能性地相互连接，在宿主生物中发挥功能的至少一个启动子，编码根据本发明的植酸酶的多核苷酸，以及在同一宿主生物中发挥功能的终止子元件。一个嵌合基因可含有的各种元件是，首先，调节转录、翻译和蛋白质成熟的元件，例如启动子，编码信号肽或转运肽的序列，或组成聚腺苷酸化信号的终止子元件，其次，编码蛋白质的多核苷酸。表达“功能性地相互连接”指所述嵌合基因的元件以这样的方式相互连接，即这些元件中某一元件的功能受到另一个元件的功能影响。通过实施例，当启动子能够影响所述编码序列的表达时它与编码序列功能性地连接。根据本发明嵌合基因的构建及其各种元件装配可使用本领域熟练的技术人员熟知的技术进行，具体地描述于Sambrook等，(1989，分子克隆：实验室手册，Nolan C.编，纽约：Cold Spring Harbor Laboratory Press)。组成嵌合基因的调节元件的选择主要取决于它们必须发挥功能的宿主生物，本领域熟练的技术人员能够选择在给定的宿主生物中发挥功能的调节元件。术语“功能性的”是指在给定的宿主生物中能够发挥功能。
根据本发明嵌合基因包含的启动子或是组成型的或是诱导型的。通过实施例，在细菌中用于表达的启动子可选自如下启动子。在大肠杆菌中用于表达的启动子由lac、trp、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、lpp-lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、T7、λPL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4基因32、nprM-lac、VHB和蛋白质A启动子(Makrides，1996，Microbiol.Rev.60：512-538；Current Opinions in Biotechnology，1996，7；Weickert等，1996，Current Opinions in Biotechnology 7：494-499)或其它Ptrp启动子(WO 99/64607)组成。用于在革兰氏阳性菌如棒杆菌或链霉菌中表达的由PtipA(Holmes等，1993，EMBO J.12：3183-3191)或PS1和PS2(FR91/09870)启动子或在专利申请EP0629699A2中描述的启动子组成。用于在酵母和真菌表达的乳酸克鲁维酵母由(K.lactis)PLAC4启动子(Van den Berg等，1990，Bio/Technology 8：135-139)或乳酸克鲁维酵母Ppgk启动子(专利申请FR91/05294)、木霉tef1或cbh1启动子(WO 94/04673)、青霉his，csl或apf启动子(WO00/68401)和曲霉gla启动子(Gwynne等，1987，Bio/Technology5：713-719)。
嵌合基因还可含有编码信号肽或转移运的亚细胞定向序列。这种序列位于编码植酸酶的多核苷酸的上游或下游，使之可以指引所述植酸酶特异性地进入宿主生物的细胞区室，或引导它释放进入细胞外空间。例如，嵌合基因可含有编码信号肽或转运肽的序列，用于引导植酸酶进入具体的细胞质的区室，例如线粒体、质体、内质网或液泡。较佳地，编码信号肽的定向序列指引植酸酶进入非原质体或细胞外基质。
根据本发明的一个实施例，转运肽可以是叶绿体、液泡或线粒体的定向信号，然后它在叶绿体、液泡或线粒体中被切割。这种肽广泛描述于文献中：Neuhaus和Rodgers，1998，Plant Molecular Biology 38：127-144；EPSPS转运肽描述于专利USP 5188642；核酮糖二羧化酶/加氧酶小亚基转运肽(EP189707)。
根据另一个实施例，转运肽可由用于指引进入细菌外周质的信号肽组成，例如pac(Schumacher等，1986，Nucl.Acids.Res.14：5713-5727)，ompA(Bowden和Georgiou，1990，J.Biol.Chem.265：16761-16766)和phoA(Chang等，1986，Gene 44：121-124)基因的信号肽，或细菌表面锚定肽的信号肽，例如PS1和PS2基因的信号肽(FR91/09870)。
转运肽可以是单肽或双肽。双转运肽通过中间序列任选地分离。通过叶绿体转运肽的实施例，将提及在转录方向上双转运肽包括编码植物基因的转运肽的序列，该植物基因编码位于质体中的酶，来自编码位于质体中的酶的植物基因的成熟N-末端部分的一部分序列，和编码植物基因的次级转运肽的序列，该植物基因编码位于质体中的酶。这种双叶绿体转运肽，例如描述于专利申请EP0 508 909中。
根据一个实施例，转运肽可包括用于增加释放进入培养基的感兴趣的蛋白质的量的各种元件。因此将提及由载体蛋白和与感兴趣的蛋白质融合的蛋白水解酶切位点的组合(USP 6130063)。
根据本发明，嵌合基因还可包括其它调节序列，这些序列位于启动子和编码序列之间，例如转录激活剂(增强子)。
本发明还涉及含有根据本发明的嵌合基因的克隆和/或表达载体。根据本发明该载体用于转化宿主生物和在该生物中表达植酸酶。该载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。较佳地，根据本发明的转化载体是质粒。通常，该载体的主要特性应是在宿主生物的细胞中自我保持和自我复制的能力，具体是依靠复制起始的存在，和表达其中的植酸酶。为了宿主生物稳定转化的目的，载体也可整合进入基因组。然后载体的组成限于在宿主中合成植酸酶所需的元件。这种载体的选择，以及根据本发明将嵌合基因插入该载体的技术完整地描述于Sambrook等(1989，分子克隆：实验室手册，第二版，Nolan C.编，纽约：ColdSpring Harbor Laboratory Press)，也是本领域熟练的技术人员一般知识的一部分。优选地，除了依据本发明的嵌合基因，本发明使用的载体还包括编码选择性标记的嵌合基因。该选择性标记使之可以选择有效转化的宿主生物，即掺入载体的宿主生物。根据本发明具体的实施例，转化的宿主生物是一种植物或真菌。在可使用的选择性标记中，将提及由包含抵抗抗生素或杀真菌剂的基因的标记物组成，例如，潮霉素磷酸转移酶基因(Gritz等，1983，Gene25：179-188；Punt等，1987；Gene 56：117-24)，链丝菌素乙酰转移酶，编码具有腐草霉素抗性的多肽，具有苯菌灵抗性的突变的β-微管蛋白(Gold等，1994，Gene 142：225-30)，或双丙氨酰膦(bialaphos)乙酰转移酶(Avalos等，1989，Curr Genet，16：369-72)。其它标记物可以是补充营养缺陷型的基因，例如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(Buxton和Radford，1983，Mol.Gen.Genet.190：403-405)，arg4、argB(Berse等，1983，Gene 25：109-117)和trpC(Goosen等.，1989，Mol.Gen.Genet.219：282-88)基因，钼蝶呤(molybdopterin)合酶基因(Appleyard等，1998，J Biol Chem 273：14869-76；Unkles等，1999；J BiolChem，274：19286-93)或乙酰胺酶(Beri和Turner，1987，Curr Genet，11：639-41)。另一类选择性标记物由耐受除草剂的基因组成，例如耐受双丙氨酰膦的bar基因(White等，NAR 18：1062，1990)，耐受草甘膦的EPSPS基因(US5,188,642)，耐受异恶唑的HPPD基因(WO 96/38567)，或草甘膦氧化还原酶基因(US5463175)。还将提及由编码易于鉴别的酶如GUS酶的基因，或在转化的细胞中编码色素或调节色素生产的酶的基因组成。这种选择性标记基因具体地描述于专利申请WO 91/02071，WO 95/06128，WO 96/38567和WO 97/04103。
本发明还涉及含有依据本发明的至少一个嵌合基因的转化的宿主生物，或整合进入其基因组或者在染色体外的遗传因子上携带，例如质粒。术语“宿主生物”是指为了产生依据本发明的植酸酶可将依据本发明的嵌合基因引入任何低等或高等单细胞或多细胞生物。较佳地，宿主生物是一种微生物，具体的是真菌，例如青霉属、曲霉属、金孢子菌属(Chrysosporium)或木霉属，细菌，例如，埃希氏菌属，具体的是大肠杆菌，棒杆菌属，或链霉菌属，酵母，具体的是酵母菌属、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)或毕赤酵母菌属(Pichia)，杆状病毒，或植物细胞。宿主生物也可以是植物或植物的一部分。
表达“转化的宿主生物”是指已掺入其基因组的宿主生物，或在染色体外的遗传因子中，例如质粒，依据本发明的至少一个嵌合基因，从而在其组织中或在培养基中产生植酸酶。为了获得依据本发明的宿主生物，本领域熟练的技术人员可使用许多已知的转化方法中的一种。
其中一种方法是使欲转化的宿主生物的细胞或组织与聚乙二醇(PEG)和依据本发明的载体接触(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一种方法，该方法是将欲转化的细胞或组织和本发明的载体置于电场中(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一个方法是使用微注射直接将载体注射入细胞或组织中(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。优选地，可使用“生物弹道(“biolistic”)方法。该方法是用在吸附有本发明的载体上的颗粒轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology 10(3)，286-291；美国专利No.4,945,050)。
文献中描述了用于大肠杆菌和其它革兰氏阴性菌的转化细菌的一些方法(Ausubel等，1995，《精编分子生物学实验指南》，John Wiley和Sons，纽约；Inoue等，1990，Gene 96：23-28；Chung等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2172-2175)。还可使用接合作用(Cameron等，1989，J.Bacteriol，171：547-557)。对于革兰氏阳性菌以及原生质体的转化，可使用电穿孔，具体的是用于链霉菌属的细菌(Bonamy等，1990，FEMS Microbio.Lett 66：263-270；Hopwood等，1985，《链霉菌的遗传操作：实验室手册》(Genetic Manipulationof Streptomyces：a Laboratory Manual.John Innes Foundation，Norwich)。
文献中也描述了转化真菌的一些方法(Talbot，2001，《丝状真菌的分子和细胞生物学》(Molecular and cellular biology of filamentous fungi，牛津大学出版社，纽约)。对于曲霉菌用PEG进行原生质体的转化描述于EP0260762，在WO 00/36120中描述了该方法适用索状青霉(Penicilliumfuniculosum)。还已知通过限制性内切酶介导的整合作用或REMI进行转化(Sanchez等，1998，Mol.Gen.Genet.258：89-94)，正如使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌的原生质体的转化(de Groot等，1998，NatureBiotechnology 16：839-842)。文献中还描述了转化酵母的技术，具体的是在Ausubel等(1995，《精编分子生物学实验指南》，John Wiley和Sons，纽约)和Van den Berg等(1990，Bio/Technology 8：135-139)中。
在具体的情况下，当欲转化的宿主生物起源于植物时，优选地使用农杆菌属的细菌转化植物细胞或组织，较佳地用根癌农杆菌(A.tumefaciens)感染所述植物细胞或组织(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)：315-330)或者发根农杆菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)。优选地，根据Ishida等(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)描述的方法进行根癌农杆菌的植物细胞或组织的转化。本领域熟练的技术人员将依据欲转化的宿主生物的特性选择适当的方法。
本发明还涉及含有至少一种植酸酶活性的新细菌提取物，该提取物的特征为它源自酸孢菌属的细菌。根据本发明，术语“细菌提取物”是指可水溶的或在水溶液中可溶解的部分，所述部分来自粉碎的或离心分离的细菌，这样细菌成分释放进入固体部分和液体部分，该液体部分含有全部溶解的细菌成分。植酸酶的活性与植酸降解的量相符，并通常使用由酶反应释放的无机磷酸盐定量测定。具体地说，依据Shimizu(1992，Biosci.Biotech.Biochem，56(8)，1266-1269)的方法测定植酸酶的活性，具体如下面实施例2所描述。然而，表征植酸酶活性的任何方法，或者是通过测定底物量的减少或者通过测定来自酶反应的产物的积累，都可用于测定依据本发明的细菌提取物的植酸酶的活性。
依据本发明的细菌提取物的以源自酸孢菌属的细菌为特征。Kishimoto等描述了酸孢菌属细菌的特征(1995，System.Appl.Microbiol.18，85-91)。
较佳地，依据本发明的细菌提取物表达植酸酶活性，其活性的最适pH小于或等于4。该活性的最适pH与在依据本发明的的细菌提取物中测定的植酸酶活性最大时的pH一致。
根据本发明具体的实施例，含有植酸酶活性的细菌提取物具有如下特性：
(a)最适温度＝65℃
(b)最适pH＝3.5
根据本发明另一个具体的实施例，含有植酸酶活性的细菌提取物具有如下特性：
(a)最适温度＝70℃
(b)最适pH＝4
根据本发明另一个具体的实施例，含有植酸酶活性的细菌提取物具有如下特性：
(a)最适温度＝60℃
(b)最适pH＝3.5
术语“最适温度”和“最适pH”是指在该温度和pH下，在依据
本发明的细菌提取物中测定的植酸酶活性最大。
根据本发明的具体的实施例，依据本发明的细菌提取物源自解氨酸孢菌的细菌菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或源自速生酸孢菌的细菌菌株，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本发明还涉及制备所述细菌提取物的方法。该方法的特征在于包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液
依据本方法，酸孢菌属的菌株培养于可使该细菌繁殖的合适的培养基中，该培养基的pH调整到所述菌株发育的自然环境的pH条件。文献描述了细菌的多种培养基，本领域熟练的技术人员可以选择它们并调整其pH条件。通过实施例，一种嗜酸菌的培养基，具体是酸孢菌属，描述于Kishimoto等，1995，System.Appl.Microbiol.18，85-91)。
培养后，浓缩得到的细菌。可使用很多方法浓缩细菌，具体地通过离心或过滤。浓缩后，粉碎细菌。细菌的粉碎在于使细菌细胞破裂。可使用本领域熟练的技术人员已知的各种方法进行。较佳地，通过将细菌暴露于超声波场进行粉碎。然后离心粉碎的细菌物质以分离不溶的细胞碎片，然后回收含有可溶的细胞成分的离心上清液，具体的是表示植酸酶活性的酶。
根据本发明具体的实施例，依据本发明的方法使用的菌株是解氨酸孢菌的菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的菌株，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本发明还涉及生产依据本发明的植酸酶的方法。根据本发明的实施例，该方法的特征在于包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶
该方法的步骤(a)到(e)与上述制备细菌提取物的方法的步骤
(a)到(e)相同。制备依据本发明植酸酶的本方法的步骤(f)是纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶。植酸酶的纯化可使用任何蛋白质分离技术进行，具体的是本领域熟练的技术人员熟知的电泳和层析技术。为了得到纯化的植酸酶，本领域熟练的技术人员可使用上述测定植酸酶活性的方法，以鉴别含有所述植酸酶的纯化部分。
较佳地，依据本发明的方法中使用的菌株是解氨酸孢菌的菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的菌株，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
根据本发明另一个实施例，具体地当依据本发明的植酸酶释放到培养基中时，该方法的特征在于包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)通过除去细菌回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶
根据这一方法，通过除去细菌回收培养基的步骤可使用分离包含
于液体部分中的固体部分的任何方法进行。具体的是，过滤和离心是进行该步骤的合适的方法。
根据本发明的另一个实施例，生产依据本发明的植酸酶的方法使用依据本发明的转化的宿主生物，并特征在于包括如下步骤：
(a)培养依据本发明的转化的宿主生物
(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物
(c)粉碎步骤(b)中分离的转化的宿主生物
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶
生产根据本发明实施例的植酸酶的本方法的步骤(f)是纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶。植酸酶的纯化可使用任何蛋白质分离技术进行，具体地是本领域熟练的技术人员熟知的电泳和层析技术。为了得到纯化的植酸酶，本领域熟练的技术人员可使用上述测定植酸酶活性的方法，以鉴别含有所述植酸酶的纯化部分。
较佳地，本方法中使用的转化的宿主生物是微生物。具体而言，所述的微生物可以是真菌，例如青霉属，曲霉属，金孢子菌属或木霉属，细菌，例如，埃希氏菌属，具体的是大肠杆菌，棒杆菌属或链霉菌属，酵母，具体的是酵母菌属、克鲁维酵母菌属或毕赤酵母菌属，杆状病毒或植物细胞。
根据本发明另一个实施例，具体地当依据本发明的植酸酶释放到培养基中时，该方法特征在于包括如下步骤：
(a)培养依据本发明的转化的宿主生物
(b)通过除去所述转化的宿主生物回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶
根据本方法，通过除去转化的宿主生物回收培养基的步骤可使
用分离包含于液体部分中的固体部分的任何方法进行。具体的是，过滤和离心是进行该步骤合适的方法。
本发明还涉及至少含有依据本发明的[空隙(lacuna)]植酸酶的酶组合物。根据具体的实施例，依据本发明的酶组合物含有本发明的细菌提取物。
术语“酶组合物”是指至少含有依据本发明的[空隙(lacuna)]植酸酶的组合物，该植酸酶与促进其稳定性和保守性的多样的佐剂结合。依据本发明的酶组合物可以是液体形式，所述组合物及其包含的植酸酶存在于水溶液中，或是固体形式，所述组合物及其包含的植酸酶冻干成粉末形式。
根据本发明具体的实施例，除了依据本发明的植酸酶，酶组合物包括至少一种额外的酶。该额外的酶可具有植酸酶活性，或具有不同于植酸酶活性的活性。当这种额外的酶具有植酸酶活性时，所述植酸酶活性较佳地区别于和互补于依据本发明的植酸酶的植酸酶活性。当这种额外的酶具有不同于植酸酶活性的活性时，例如，它可具有木聚糖酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶、阿魏酸酯酶、支链淀粉酶、酰胺酶、磷酸酶或甘露聚糖酶活性。
较佳地，将所述酶组合物掺入家畜的饲料中，具体的是单胃的动物，较佳地是猪或家禽。
本发明还涉及至少含有依据本发明的[空隙(lacuna)]植酸酶的饲料组合物。
术语“饲料组合物”主要是指用于家畜的饲料，具体的是用于单胃动物的饲料，较佳地是猪或家禽。添加了本发明酶组合物的依据本发明的饲料组合物理论上是一种用于家畜的饲料。因此，该依据本发明的饲料组合物是用于家畜的饲料，其中加入了至少一种依据本发明的酶组合物，所述饲料和所述酶组合物混合以得到所述饲料组合物。
根据本发明具体的实施例，所述饲料组合物含有至少一种依据本发明的转化的宿主生物。根据本发明另一个具体的实施例，所述饲料组合物含有至少一种酸孢菌属的细菌。优选地，酸孢菌属的细菌是解氨酸孢菌的细菌，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的细菌，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
本发明还涉及包含至少一种依据本发明的细菌提取物或植酸酶的饲料组合物。
优选地，依据本发明的饲料组合物将用于单胃动物的营养物。根据本发明具体的实施例，所述饲料组合物用于猪的营养物。根据本发明的另一个具体的实施例，所述饲料组合物用于家禽的营养物。
本发明的目的还包括生产上述饲料组合物的方法。
根据本发明具体的实施例，所述方法是培养依据本发明的宿主生物或酸孢菌属的细菌，使用本领域熟练的技术人员已知的任何浓缩方法浓缩所述宿主生物或所述细菌，具体的是过滤或离心，然后将浓缩的所述细菌的宿主生物掺入饲料组合物。优选地，当依据本发明的方法使用酸孢菌属的细菌时，它是解氨酸孢菌的菌株，具体的是菌株解氨酸孢菌ATCC 51361，或速生酸孢菌的细菌，具体的是菌株速生酸孢菌ATCC 35904。
根据本发明另一个具体的实施例，所述方法在于使用上述制备所述提取物的方法分离依据本发明的细菌提取物，然后将在所述方法的步骤(e)中产生的上清液掺入饲料组合物。
根据本发明另一个实施例，所述方法在于使用上述生产所述植酸酶的方法之一生产依据本发明的植酸酶。然后将生产的所述植酸酶掺入饲料组合物。
本发明还涉及增加包含于单胃动物以植物为基础的饲料的植酸酶中无机磷酸盐的同化的方法，其特征在于依据本发明的植酸酶或酶组合物掺入所述动物的营养物中。较佳地，所述方法特征在于用依据本发明的饲料组合物饲喂所述单胃动物。
本发明还涉及减少单胃动物营养物中磷添加的方法，其特征在于用依据本发明的饲料组合物饲喂所述动物。
本发明还涉及降低来自单胃动物营养物消耗的方法，其特征在于用依据本发明的饲料组合物饲喂所述动物。
以下实施例可说明本发明，而不限定本发明的范围。
实施例1：培养酸孢菌属的细菌
酸孢菌属的细菌是革兰氏阴性嗜酸细菌，该细菌在酸性pH的培养基中生长。通过实施例，菌株解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904的细菌可用于实施本发明。这些细菌可依据相似的方法培养。具体地说，它们培养于含有蛋白胨和葡萄糖的培养基中，在30℃和pH4的有氧条件下培养。一种标准的培养基是，例如，描述于Kishimoto和Tano(1987，J.Gen.Appl.Microbiol.33，11-25)。用于表达植酸酶的培养基不含无机磷酸盐并添加了植酸(0.4％)和CaCl2(2.2g/l)。
实施例2：植酸酶活性的测定
在液体培养基中测定植酸酶活性。它在细菌培养物的样品上或依据本发明的细菌提取物上，或依据本发明的植酸酶上进行。它基于Shimizu的方法(1992，Biosci.Biotech.Biochem.56(8)，1266-1269)。该方法的原理是测定在植酸酶与其底物(1％植酸钠溶液)酶促反应的过程中释放的无机磷酸盐的量。通过其与显色试剂(1体积的10.8％硫酸铁与4体积的0.012M钼酸铵H2SO4即时混合)的反应测定释放的无机磷酸盐的量。在高度酸性的培养基中，该反应导致染色的磷钼酸盐复合物的形成(Fe2+存在时)，形成复合物的量在分光光度计上定量测定，染色的溶液在700nm处产生吸光率。
两种不同的反应使之可以测定活性：第一次测定是在样品与底物接触时(时间T0)进行，第二次测定是在培养60分钟后(时间T60)进行。时间T0和T60之间的吸光率的变化(比较由缓冲液代替样品组成的各自的空白试验)与酶促反应过程中释放的无机磷酸盐的量成比例。
通过在具有250μl的TCA的所需缓冲液中，以0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、4mM的浓度混合250μl的KH2PO4溶液并用450μl的显色试剂显示制备参考标准范围。一个酶促单位定义为每分钟释放1微摩尔无机磷酸盐的酶量(在给定的温度和pH下)。
实施例3：含有植酸酶活性的细菌提取物的分离
培养后，酸孢菌属的细菌通过在5000g、4℃离心15分钟进行浓缩。除去上清液，然后浓缩的细菌在pH3.5的甲酸盐(100mM)-CaCl2(1mM)缓冲液中重悬浮，以使它们相对于在培养基中的初始浓度浓缩约100倍。然后使用“细胞破碎器”(Cell-d)装置在2.5千巴的压力下以一个流动中通过两次的速率粉碎浓缩的细菌。然后粉碎的细菌物质以5000g、4℃离心15分钟，回收构成细菌提取物的上清液，并测定其植酸酶活性。
实施例4：依据本发明分离的植酸酶的特征
4.1植酸酶活性作为温度的函数
在各种温度下测定依据本发明的植酸酶的活性。给出细菌解氨酸孢菌ATCC 51361(图1)和速生酸孢菌ATCC 35904(图3)的测定结果。对于细菌解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904活性的最适温度分别为70℃和60℃。
4.2植酸酶活性作为pH的函数
在各种pH条件下测定依据本发明的植酸酶的活性。给出细菌解氨酸孢菌ATCC 51361(图2)和速生酸孢菌ATCC 35904(图4)的测定结果。对于细菌解氨酸孢菌ATCC 51361和速生酸孢菌ATCC 35904活性的最适pH分别为4和3.5。
实施例5：依据本发明的植酸酶的纯化
5.1.粗提物的制备
离心酸孢菌属菌株的细胞，然后在pH6.5、含有1mM CaCl2的MES缓冲液(25mM)中洗涤3次以除去来自培养基的植酸和无机磷酸盐(生长过程中累积的)。然后这样得到的细胞悬浮液在“细胞破碎器”(1.5千巴)中破碎，接着其pH下降到5.5(通过加入3.7％的盐酸)。
这样得到的提取物以20,000g离心1小时。然后该上清液通过具有0.45μm孔隙度的膜过滤。
5.2.阴离子交换层析
上清液通过POROS 20 HQ型层析柱(4.6/100mm：1.7ml凝胶)。使用pH5.5、含有1mM CaCl2和1M NaCl的MES缓冲液(25mM)进行洗脱。
在死体积部分中发现植酸酶活性(注入活性的50％)。
5.3.疏水作用层析
阴离子交换层析结束时回收的部分加入1.5M(NH4)2SO4。然后将该溶液装载到用pH5.5、含有1mM CaCl2和1.5M(NH4)2SO4的MES缓冲液(25mM)预平衡的POROS 20 HP2型(HQ 4.6/100mm：1.7ml凝胶)层析柱上。然后在20个柱体积中用1.5到0M的(NH4)2SO4梯度洗脱蛋白质。
在3个2ml的部分中以0.95M(NH4)2SO4洗脱植酸酶活性。合并这些部分，然后通过pH5.5、含有1mM CaCl2的5升MES缓冲液(20mM)4℃透析过夜。
5.4.阳离子交换层析
透析的溶液注入用pH5.5、含有1mM CaCl2的MES缓冲液(20mM)预平衡的POROS 20 HS型(4.6/100mm：1.7ml凝胶)层析柱上。在20个柱体积中用0到1M的NaCl梯度洗脱蛋白质。
以0.35M的NaCl浓度洗脱具有植酸酶活性的蛋白质。
5.5.凝胶过滤
合并前面步骤中得到的部分，浓缩并装载到用pH5.5、含有1M CaCl2和0.1M NaCl的MES缓冲液(25mM)预平衡的SUPEROSE 12hr 10/30层析柱(24mlPharmacia)上。用24ml的缓冲液以0.5ml/min的流速洗脱蛋白质。收集0.5ml部分。在14和15ml的洗脱缓冲液之间的3个部分中检测到植酸酶活性(表1)。
表1：凝胶过滤步骤后感兴趣的部分中的活性
    部分     荧光试验“MUFp”(RFU/min)
    12345     02240269011340
浓缩显示植酸酶活性的3个部分并装载到14.4％的凝胶上用于SDS-PAGE。该凝胶显示了约63kDa的主带。
实施例6：内部肽的微量测序
感兴趣的带(约63kDa)直接从聚丙烯酰胺凝胶上切去。在pH8.6的50％乙腈/50mM Tris-HCl中洗涤2次部分除去凝胶中含有的染料。聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在400μl的50mM Tris-HCl缓冲液、pH8.6/0.03％SDS中，存在0.4μg内溶素-C的情况下，35℃消化18小时(测序组，来自Roche)。
通过HPLC在直径为2.1mm的DEAE-C18联机柱上分离得到的肽。分离梯度是具有2-45％的乙腈/0.1％TFA的梯度。
纯化了4种肽，然后使用Applied Biosystems 473A测序仪通过Edman方法测序。
表2：得到的内部肽的序列
肽 序列
肽1肽2肽3肽4  KVINFLMRQPDWKKNTAIIITYDDSDGGYKHLVIIYGENVSFDHYKMEGQNIGDLLNAK
实施例7：编码植酸酶的基因的克隆
7.1.探针的确定
在内部肽序列的基础上，为了通过PCR扩增感兴趣的基因片段，合成了几个简并的寡核苷酸。
寡核苷酸10：ATDATDATNGCNGTRTTYTT
寡核苷酸12：TCRTCRTASGTGATGATGATSGCSGTRTTYTT
寡核苷酸22：AARATGGARGGNCARAAYATHGG
寡核苷酸23：ATGGAAGGCCAGAAYATCGGCGA
寡核苷酸25：ATCGGCGAYCTBCTBAAYGCCAA
检测了引物寡核苷酸10和寡核苷酸12与寡核苷酸22、23和25的3个引物的组合，引物对寡核苷酸12和寡核苷酸22使之可以分离来自酸孢菌属菌株的基因组DNA的500bp的片段。纯化后，测定该DNA片段的序列。
该序列的分析可以证实，在该片段中具有编码肽1的核酸序列，表明有效测序的PCR产物与作为微量测序的对象感兴趣的蛋白质一致。
基于从约500bp的PCR产物得到的序列，确定了进一步的引物寡核苷酸29和寡核苷酸30，以获得对感兴趣的基/因具有特异性的一组非简并的引物。
寡核苷酸29：TTCATGGGTGGCTTCGATC
寡核苷酸30：GCTGCCGCATCAGGAAGTTG
7.2.DNA印迹法
通过引物寡核苷酸12和寡核苷酸22的扩增得到约500bp的PCR产物在DNA印迹试验中用作探针。
为了标记探针，使用Q-BIOgeme标记试剂盒通过随机引发标记10mg纯化的PCR产物。
分别用Eco RI、Sac II或Bam HI消化10μg基因组DNA，然后装载到1％的琼脂糖凝胶上。迁移后，通过毛细作用将DNA转移到尼龙膜上(BIODYNEPlus膜，Pall Gelman)。
用5×SSC、5×Denhardt’s、1％SDS和100μg/ml变性的鱼DNA的缓冲液，在60℃进行预杂交4小时。
然后用含有10ml预杂交缓冲液和10ng的4.08×108cpm/μg的探针(在干燥闪烁计数器上计数，也就是在缺乏闪烁体时)的缓冲液，在60℃进行杂交16小时。
随后进行几次洗涤：
2次洗涤：2×SCC+0.1％SDS在20℃进行3分钟
2次洗涤：0.5×SCC+0.1％SDS在20℃进行3分钟
2次洗涤：0.4×SCC+0.1％SDS在50℃进行15分钟
在-80℃暴露24小时后，在薄膜上显示凝胶。
这些试验可显示Sac II在用作探针的基因部分切割，但是在这一序列中没有Eco RI或Bam HI位点。Eco RI和Bam HI消化分别释放约4kb的片段和大于9kb的片段，靶序列与这些片段杂交。
尽管根据生化研究已知感兴趣的蛋白质应由约1.6kb的基因编码，构建了具有完整Eco RI消化的基因组DNA文库。
7.3.基因组文库的构建
用Eco RI消化酸孢菌属菌株的约30μg基因组DNA。在0.7％的琼脂糖凝胶上迁移后，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化3和4kb大小间的片段并脱盐(microbio spin 6，Biorad)。还纯化了大小在2.5和3kb间的片段以及大小在4和5kb间的片段。
使用T4 DNA连接酶(QBIOgene)将纯化的片段插入载体pBlueScriptKS(II+)。用大小在3和4kb间的片段进行连接的产物用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MC 1061。转化后，在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上生长之前，细胞溶解于SOC(2％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl2、20mM葡萄糖)并在37℃放置1小时。然后培养皿在37℃培养过夜。
7.4.基因组文库的筛选
然后使用寡核苷酸29和寡核苷酸30的引物组通过PCR筛选383个不同的菌落。
在这些克隆中，4个可得到约400bp的PCR产物。允许期望大小的片段扩增的克隆中有2个用于准备质粒小量制备(使用Qiagen试剂盒)。
7.5.基因组插入片段的测序
鉴定的两个质粒用Eco RI和Eco RV消化。其插入片段的测序显示这两个质粒携带相同的插入片段。序列的分析可以证实1665pb的开放读框相应于554个氨基酸的蛋白质。另外，在该读框中发现实施例6中测序的编码4个内部肽的序列。
实施例8：鉴定的基因的亚克隆
含有实施例7中在克隆的基因组插入片段中鉴定的开放读框(称做ORF281)的序列用寡核苷酸5’ORF281和3’ORF281通过PCR扩增。
5’ORF281  5’TAA CGA TAA  CAT ATG AAT ATC CGC CGG GCT CT 3’
3’ORF281  5’ATA TCT GAT  AAG CTT TTA TTC GGC GTG CGC GGC 3’
纯化PCR产物并用Nde I和Hind III限制性内切酶消化，然后克隆入用相同的酶消化的载体pETCm中。得到的载体称为pETCm281。ORF281插入片段进行测序以证实克隆的序列与从前面克隆的基因组插入片段测定的序列是相同的。
载体pETCm含有氯霉素抗性基因。因此使用氯霉素抗性作为选择性标记，允许在大肠杆菌的卡那霉素抗性菌株中体内表达：菌株BL21 appA(植酸酶-)。
实施例9：大肠杆菌中基因亚克隆的表达
9.1.重组大肠杆菌菌株的制备
在大肠杆菌菌株BL21 appA中进行体内表达试验。由于在编码大肠杆菌植酸酶的appA基因中卡那霉素抗性基因的插入，该菌株不再表达内源性植酸酶。还用编码大肠杆菌β-内酰胺酶的TEM基因制备控制载体。TEM基因也在载体pETCm中克隆，得到的载体称为pETCmTEM。
用载体pETCmTEM或pETCm281转化大肠杆菌菌株BL21 appA。分离的菌落在添加了60mg/L的卡那霉素和添加20mg/L的氯霉素的LB培养基上挑选。各个类型的一个菌落在添加卡那霉素和添加相同浓度的氯霉素的LB培养基中培养。这些培养物用于制备甘油(1体积的细胞/体积40％的甘油)，接种用于进行表达试验的该原液培养物。这些甘油原液贮藏在-80℃。
9.2.表达试验
大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281培养于M98培养基中(修饰的Terrific肉汤培养基(用葡萄糖修饰)每升含有12g细菌用胰蛋白胨、24g酵母提取物、9.4g K2HPO4和2.2g KH2PO4、pH7.2、高压灭菌，使用前每升培养基加入20mL的葡萄糖(50％))与大肠杆菌菌株BL 21 appA pETCmTEM平行。通过加入0.25mM的IPTG诱导表达，并在两种温度下进行：30和37℃。
诱导3个小时后，离心培养物。测定重悬浮于甲酸盐缓冲液中的各个沉淀的植酸酶活性以得到最终浓度为5mg/mL的干细胞。无论在怎样的培养条件下，在含有pETCm281的菌株和含有pETCmTEM的菌株中都未发现植酸酶活性。
然后含有pETCm281的诱导和未诱导的培养物的等分试样用超声处理，接着离心。上清液代表可溶的蛋白质部分，沉淀代表不溶的蛋白质。这两个部分装载到变性的SDS-PAGE凝胶上。
MW 63 kDa的蛋白质带在由IPTG诱导的大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281的不溶部分中非常明显。在未诱导的负控制中没有发现相应的带。因此，ORF281在大肠杆菌中明显表达。然而，相应的蛋白质是不溶解的，并在这种形式下可能无活性。
9.3.包含体的增溶和复性
进行了一系列目的在于增溶和复性由ORF281编码的蛋白质的步骤，以确定该蛋白质是否具有植酸酶活性。
大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281在M98培养基中培养，然后当600nm处的OD值达到0.4时用0.25mM的IPTG诱导。诱导3个小时后，离心培养物(最终的OD在区域1中)。沉淀以每100mL培养物中4mL的比例溶解于pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液中。细胞在4℃超声处理：以500W的功率超声处理10秒4次。OD600从14下降到3。悬浮液以16,000g离心10分钟，然后除去上清液。
每100ml的培养物的沉淀重悬浮于5ml的增溶缓冲液中：20mM Tris-HCl，pH8、8M尿素、0.5M NaCl、1mM 2-巯基乙醇。悬浮液在500W的功率下以10秒4次的速率超声处理，然后在室温搅拌1小时。接着30ml的该悬浮液在4℃对3升的pH6.5、含有0.5M NaCl和1mM的巯基乙醇的25mM MES复性缓冲液透析16小时(切下10kDa)。对3升的pH5.5、含有0.5M NaCl和1mM巯基乙醇25mM的MES复性缓冲液进行第二次透析5小时(切下10kDa)。然后该悬浮液以16,000g离心10分钟，酶活分析前在4℃贮存。
相同的培养、增溶和复性的方法应用于大肠杆菌菌株BL21 appA pETCmTEM。
9.4.包含体的活性
由大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281和pETCmTEM产生的
复性蛋白质的悬浮液在NanosepTM 10K Omega(Pall)上浓缩10倍。根据标准方法测定这些浓缩溶液的植酸酶活性(在pH3.5)。该试验重复进行。
    活性mU/ml
    大肠杆菌BL21 appA pET-TEM.试验1     0
    大肠杆菌BL21 appA pET-TEM.试验2     0
    大肠杆菌BL21 appA pET281.试验1     100
    大肠杆菌BL21 appA pET281.试验2     100
仅在大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281中检测到植酸酶活性。使用pMUF试验证实该活性。使用该荧光方法在大肠杆菌菌株BL21 appA pETCmTEM中未检测到活性，尽管这一方法比通常使用的比色法敏感5倍。
9.5.包含体的纯化
大肠杆菌菌株BL21 appA pETCm281的再增溶的包含体部分装载到用pH5.5、含有1mM CaCl2的20mM MES缓冲液预平衡的POROS 20 HS层析柱(HQ4.6/100mm：1.7ml凝胶)上。蛋白质在20个柱体积中以0到1M的NaCl梯度洗脱。
植酸酶活性以0.35M的NaCl浓度洗脱。该结果与实施例5.4中天然植酸酶得到的所有方面相同。
平行的，大肠杆菌菌株BL21 appA pETCmTEM的全部提取物(溶解的和不溶的蛋白质)装载到相同的柱上，并在相同的条件下洗脱蛋白质。在0.15和0.45MNaCl间洗脱的部分中未能检测到植酸酶活性。
9.6.SDS-PAGE凝胶
从阳离子交换层析柱得到的显示植酸酶活性的部分在
NanosepTM上浓缩10倍后装载到SDS-PAGE凝胶(10％丙烯酰胺)上。大肠杆菌BL21 appA pETCm281和大肠杆菌BL21 appA pETCmTEM的细胞的裂解物(由IPTG诱导的)也装载到相同的凝胶上。
再一次清楚地显示仅大肠杆菌BL21 appA pETCm281裂解物包含MW 63 kDa的带。在显示植酸酶活性的柱-纯化的部分中存在MW 61-63 kDa的主带。
因此这些结果显示，在大肠杆菌BL21 appA中亚克隆后ORF281明显地编码植酸酶。
实施例10：纯化的重组植酸酶的特征
10.1.植酸酶活性作为温度的函数
在各种温度下测定在实施例5.5中纯化并由ORF281编码的部分
中含有的植酸酶的活性。这些测定的结果在图5中给出。测定活性的最适温度是60℃。试验在pH3进行。
10.2.植酸酶活性作为pH的函数
在各种pH下也测定了在实施例5.5中纯化并由ORF281编码的
部分中含有的植酸酶的活性。这些测定的结果在图5中给出。活性的最适pH是3.5。试验在60℃进行，使用如下演替的缓冲液：甘氨酸-HCl(pH2-2.5)，甲酸盐(pH2.5-4)，乙酸盐(pH4-5)和MES(pH5-6)。
实施例11：同源序列研究
实施例7中在克隆的基因组片段中鉴定的含有开放读框的序列用作探针以寻找酸孢菌和嗜酸菌(Acidiphilium)属的微生物中的同源序列。
测试的菌株属于解氨酸孢菌、速生酸孢菌、狭小嗜酸菌(Acidiphiliumangustrum)和多嗜嗜酸菌(Acidiphilium multivorum)。
使用Q-BIOgene标记试剂盒通过随机引发标记10ng纯化的PCR产物。分别用Eco RI或Eco RV消化测定的各个菌株的10μg基因组DNA，然后装载到两个1％琼脂糖凝胶上。迁移后，通过毛细作用将DNA转移到两个尼龙膜(BIODYNEPlus膜，Pall Gelman)上。
用5×SSC、5×Denhardt’s、1％SDS和100μg/ml的变性的鱼DNA的缓冲液在60℃进行预杂交4小时。
然后用含有10ml预杂交缓冲液和对于膜1(Eco RI)和膜2(Eco RV)分别为7×108和9×108cpm/μg的探针的10ng缓冲液在60℃进行杂交16小时(在干燥闪烁计数器上计数，也就是，在缺乏闪烁体时)。
随后进行几次洗涤：
2次洗涤：2×SCC+0.1％SDS在20℃进行3分钟
2次洗涤：0.5×SCC+0.1％SDS在20℃进行3分钟
2次洗涤：0.4×SCC+0.1％SDS在50℃进行15分钟
在-80℃暴露65小时后，在薄膜上显示膜。
两个放射自显影间没有观察到显著差别。
该结果显示在检测的所有酸孢菌属的菌株中，存在实施例7中鉴定的具有开放读框的探针的选择性杂交。该结果表明，在酸孢菌属的细菌的基因和鉴定的编码植酸酶的开放读框之间存在重要的序列同源。另外，它们有力地表明这些基因也编码植酸酶。
另一方面，用嗜酸菌属的微生物中的探针没有得到杂交。这一观察结果与在这一属的微生物中使用微生物方法没有检测到植酸酶的活性是一致的。
                            序列表
<110>埃迪塞欧法国联合股份有限公司(ADISSEO FRANCE S.A.S.)
<120>新的细菌植酸酶及其生产方法
<130>PM 00080
<140>
<141>
<150>FR 0014448
<151>2000-11-10
<160>11
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>1665
<212>DNA
<213>酸孢菌(g.Acidocella)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1665)
<400>1
atg aat atc cgc cgg gct ctt ttg tgc gcc tcc atg atg gtc tcg tcg          48
Met Asn Ile Arg Arg Ala Leu Leu Cys Ala Ser Met Met Val Ser Ser
1               5                   10                  15
atc acc ccc gcg gcg gcg cag acc gcc agc ctc ggc gcc acc gcg ccc          96
Ile Thr Pro Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Ala Pro
            20                  25                  30
gcc tcc gcc agc gcc gca gct tcc tac acc gac gcg ctg ccg acc gcg         144
Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Thr Asp Ala Leu Pro Thr Ala
        35                  40                 45
acg ccg atc aag cat ctg gtc atc atc tat ggc gaa aac gtc tcc ttc         192
Thr Pro Ile Lys His Leu Val Ile Ile Tyr Gly Glu Asn Val Ser Phe
    50                  55                  60
gac cat tat ttc gcc acc tac ccg aag gcc acc aac ccg gcc ggt gag         240
Asp His Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Lys Ala Thr Asn Pro Ala Gly Glu
65                  70                  75                  80
ccg gcc ttc cat ggc agc ctg cat ggc cag aaa atc gat aac ctg gtc         288
Pro Ala Phe His Gly Ser Leu His Gly Gln Lys Ile Asp Asn Leu Val
                85                  90                  95
acc gcc aat ctg ctg agc aat aac ccg aac ttc acc aac gag aaa aac      336
Thr Ala Asn Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Phe Thr Asn Glu Lys Asn
            100                 105                 110
ggc gcc ggg gcc gcc aac ccg ttc cgg ctg gac cgc acc cag gcc gcc      384
Gly Ala Gly Ala Ala Asn Pro Phe Arg Leu Asp Arg Thr Gln Ala Ala
        115                 120                 125
acc gcc gac cag aac cat gcc tac aag ccc gag cag gaa gcc tac gat      432
Thr Ala Asp Gln Asn His Ala Tyr Lys Pro Glu Gln Glu Ala Tyr Asp
    130                 135                 140
aac ggc aag atg gac ctg ttc ccc aaa tat acc ggc aag gcc agc gcc      480
Asn Gly Lys Met Asp Leu Phe Pro Lys Tyr Thr Gly Lys Ala Ser Ala
145                 150                 155                 160
ggc ggc gcc ggc gcc ttc ggc acc aag ggc cag gtg atg ggc tat ttc      528
Gly Gly Ala Gly Ala Phe Gly Thr Lys Gly Gln Val Met Gly Tyr Phe
                165                 170                 175
gac ggc aac acc gtc acc gcc ctc tgg aac tac gcc cag ggc tac gcg      576
Asp Gly Asn Thr Val Thr Ala Leu Trp Asn Tyr Ala Gln Gly Tyr Ala
            180                 185                 190
atg agc gac aat gcc tgg acc gac acc tac ggc ccc tcc acc ccc ggc      624
Met Ser Asp Asn Ala Trp Thr Asp Thr Tyr Gly Pro Ser Thr Pro Gly
        195                 200                 205
gcg ctg gcg gtg gtc tcc ggc cag acc aac ggc gcc gtg ccg gtg ctc      672
Ala Leu Ala Val Val Ser Gly Gln Thr Asn Gly Ala Val Pro Val Leu
    210                 215                 220
ggc acc tcg ccc aac ctg aac ccg gac ggc cag ggc ggc ttc acc gat      720
Gly Thr Ser Pro Asn Leu Asn Pro Asp Gly Gln Gly Gly Phe Thr Asp
225                 230                 235                 240
gac ggc gat atc gac ccc gcc tac gat gtc tgc tcc agc aag aag gtc      768
Asp Gly Asp Ile Asp Pro Ala Tyr Asp Val Cys Ser Ser Lys Lys Val
                245                 250                 255
acc ttc aag atg gag ggc cag aat atc ggc gat ctg ctg aac gcc aag      816
Thr Phe Lys Met Glu Gly Gln Asn Ile Gly Asp Leu Leu Asn Ala Lys
            260                 265                 270
aaa gtc acc tgg ggc ggt ttc atg ggt ggc ttc gat ctc ggc ctc acc      864
Lys Val Thr Trp Gly Gly Phe Met Gly Gly Phe Asp Leu Gly Leu Thr
        275                 280                 285
aac ccc aac ggc acc acc ggc tgc aag cgc tcc agc ttc gcc acc gcg     912
Asn Pro Asn Gly Thr Thr Gly Cys Lys Arg Ser Ser Phe Ala Thr Ala
    290                 295                 300
gtc gat gcc ccc acc gcc gac tat atc ccg cac cat aac tgg ttc cag     960
Val Asp Ala Pro Thr Ala Asp Tyr Ile Pro His His Asn Trp Phe Gln
305                 310                 315                 320
tat tac gcc tcc acc gcc aac tac acc cat gcc cgc ccg gcg gcg ctg    1008
Tyr Tyr Ala Ser Thr Ala Asn Tyr Thr His Ala Arg Pro Ala Ala Leu
                325                 330                 335
gac gat atc ggc tac agc ttc gcg cca tcc ggc gcc gcc gat ccg gcc    1056
Asp Asp Ile Gly Tyr Ser Phe Ala Pro Ser Gly Ala Ala Asp Pro Ala
            340                 345                 350
aac cat gaa tat gat ctg aag gat ttc gag gcg gcg gtg agc aag ggt    1104
Asn His Glu Tyr Asp Leu Lys Asp Phe Glu Ala Ala Val Ser Lys Gly
        355                 360                 365
gtg tat ccg gcc gtc tcc tat ctg aag ctg atc gcg gcc cag gat gcc    1152
Val Tyr Pro Ala Val Ser Tyr Leu Lys Leu Ile Ala Ala Gln Asp Ala
    370                 375                 380
cat gcc ggc tat tcc gac ccg ctg gac gag cag gaa ggc gtg gtc aag    1200
His Ala Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Glu Gln Glu Gly Val Val Lys
385                 390                 395                 400
gtc atc aac ttc ctg atg cgg cag ccg gat tgg aag aac acc gcc atc    1248
Val Ile Asn Phe Leu Met Arg Gln Pro Asp Trp Lys Asn Thr Ala Ile
                405                 410                 415
atc atc acc tat gat gat tcc gat ggc tgg tac gat cat gcc ttc gtg    1296
Ile Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Asp Gly Trp Tyr Asp His Ala Phe Val
            420                 425                 430
acc ccg acc acc tcc tcc ttc agc ccg atg gac gcg ctg aac ggc aag    1344
Thr Pro Thr Thr Ser Ser Phe Ser Pro Met Asp Ala Leu Asn Gly Lys
        435                 440                 445
ggg gtc tgc ggg gcc ggc acc gaa ccg atg ggc ctg gcc ggc aag ccg    1392
Gly Val Cys Gly Ala Gly Thr Glu Pro Met Gly Leu Ala Gly Lys Pro
    450                 455                 460
gtg cac ggg ctc tgc ggc ccc ggc acg cgc atc ccc ttc atg gtg atc    1440
Val His Gly Leu Cys Gly Pro Gly Thr Arg Ile Pro Phe Met Val Ile
465                 470                 475                 480
tcg ccc tac gcg aag aaa ggt ttc atc gcc cat acg ctg atc agc cag    1488
Ser Pro Tyr Ala Lys Lys Gly Phe Ile Ala His Thr Leu Ile Ser Gln
                485                 490                 495
gcg tcg gtg gtg aaa ttc atc gag gat aac tgg ctg ggc ggt gcc cgc    1536
Ala Ser Val Val Lys Phe Ile Glu Asp Asn Trp Leu Gly Gly Ala Arg
            500                 505                 510
ctg ggc ggc ggc tcc ttc gat gcc aat gcc ggc tcg atc atg gat atg    1584
Leu Gly Gly Gly Ser Phe Asp Ala Asn Ala Gly Ser Ile Met Asp Met
        515                 520                 525
ttc gat ttc aag acc gcg ccg aag ggc cgt gat gtg atg ctg ctg gat    1632
Phe Asp Phe Lys Thr Ala Pro Lys Gly Arg Asp Val Met Leu Leu Asp
    530                 535                 540
gcc gat acc ggc acc gcc gcg cac gcc gaa taa                        1665
Ala Asp Thr Gly Thr Ala Ala His Ala Glu
545                 550                 555
<210>2
<211>554
<212>PRT
<213>酸孢菌(g.Acidocella)
<400>2
Met Asn Ile Arg Arg Ala Leu Leu Cys Ala Ser Met Met Val Ser Ser
1               5                   10                  15
Ile Thr Pro Ala Ala Ala Gln Thr Ala Ser Leu Gly Ala Thr Ala Pro
            20                  25                  30
Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ser Tyr Thr Asp Ala Leu Pro Thr Ala
        35                  40                  45
Thr Pro Ile Lys His Leu Val Ile Ile Tyr Gly Glu Asn Val Ser Phe
    50                  55                  60
Asp His Tyr Phe Ala Thr Tyr Pro Lys Ala Thr Asn Pro Ala Gly Glu
65                  70                  75              80
Pro Ala Phe His Gly Ser Leu His Gly Gln Lys Ile Asp Asn Leu Val
                85                  90                  95
Thr Ala Asn Leu Leu Ser Asn Asn Pro Asn Phe Thr Asn Glu Lys Asn
            100                 105                 110
Gly Ala Gly Ala Ala Asn Pro Phe Arg Leu Asp Arg Thr Gln Ala Ala
        115                 120                 125
Thr Ala Asp Gln Asn His Ala Tyr Lys Pro Glu Gln Glu Ala Tyr Asp
    130                 135                 140
Asn Gly Lys Met Asp Leu Phe Pro Lys Tyr Thr Gly Lys Ala Ser Ala
145                 150                 155                 160
Gly Gly Ala Gly Ala Phe Gly Thr Lys Gly Gln Val Met Gly Tyr Phe
                165                 170                 175
Asp Gly Asn Thr Val Thr Ala Leu Trp Asn Tyr Ala Gln Gly Tyr Ala
            180                 185                 190
Met Ser Asp Asn Ala Trp Thr Asp Thr Tyr Gly Pro Ser Thr Pro Gly
        195                 200                 205
Ala Leu Ala Val Val Ser Gly Gln Thr Asn Gly Ala Val Pro Val Leu
    210                 215                 220
Gly Thr Ser Pro Asn Leu Asn Pro Asp Gly Gln Gly Gly Phe Thr Asp
225                 230                 235                 240
Asp Gly Asp Ile Asp Pro Ala Tyr Asp Val Cys Ser Ser Lys Lys Val
                245                 250                 255
Thr Phe Lys Met Glu Gly Gln Asn Ile Gly Asp Leu Leu Asn Ala Lys
            260                 265                 270
Lys Val Thr Trp Gly Gly Phe Met Gly Gly Phe Asp Leu Gly Leu Thr
         275                280                 285
Asn Pro Asn Gly Thr Thr Gly Cys Lys Arg Ser Ser Phe Ala Thr Ala
    290                 295                 300
Val Asp Ala Pro Thr Ala Asp Tyr Ile Pro His His Asn Trp Phe Gln
305                 310                 315                 320
Tyr Tyr Ala Ser Thr Ala Asn Tyr Thr His Ala Arg Pro Ala Ala Leu
                325                 330                 335
Asp Asp Ile Gly Tyr Ser Phe Ala Pro Ser Gly Ala Ala Asp Pro Ala
            340                 345                 350
Asn His Glu Tyr Asp Leu Lys Asp Phe Glu Ala Ala Val Ser Lys Gly
        355                 360                 365
Val Tyr Pro Ala Val Ser Tyr Leu Lys Leu Ile Ala Ala Gln Asp Ala
    370                 375                 380
His Ala Gly Tyr Ser Asp Pro Leu Asp Glu Gln Glu Gly Val Val Lys
385                 390                 395                 400
Val Ile Asn Phe Leu Met Arg Gln Pro Asp Trp Lys Asn Thr Ala Ile
                405                 410                 415
Ile Ile Thr Tyr Asp Asp Ser Asp Gly Trp Tyr Asp His Ala Phe Val
            420                 425                 430
Thr Pro Thr Thr Ser Ser Phe Ser Pro Met Asp Ala Leu Asn Gly Lys
        435                 440                 445
Gly Val Cys Gly Ala Gly Thr Glu Pro Met Gly Leu Ala Gly Lys Pro
    450                 455                 460
Val His Gly Leu Cys Gly Pro Gly Thr Arg Ile Pro Phe Met Val Ile
465                 470                 475                 480
Ser Pro Tyr Ala Lys Lys Gly Phe Ile Ala His Thr Leu Ile Ser Gln
                485                 490                 495
Ala Ser Val Val Lys Phe Ile Glu Asp Asn Trp Leu Gly Gly Ala Arg
            500                 505                 510
Leu Gly Gly Gly Ser Phe Asp Ala Asn Ala Gly Ser Ile Met Asp Met
        515                 520                 525
Phe Asp Phe Lys Thr Ala Pro Lys Gly Arg Asp Val Met Leu Leu Asp
    530                 535                 540
Ala Asp Thr Gly Thr Ala Ala His Ala Glu
545                 550
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述
<400>3
atdatdatng cngtrttytt                          20
<210>4
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo12
<400>4
tcrtcrtasg tgatgatgat sgcsgtrtty tt            32
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo22
<400>5
aaratggarg gncaraayat hgg                      23
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo23
<400>6
atggaaggcc agaayatcgg cga                      23
<210>7
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo25
<400>7
atcggcgayc tbctbaaygc caa                      23
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo29
<400>8
ttcatgggtg gcttcgatc                           19
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：Oligo30
<400>9
gctgccgcat caggaagttg                          20
<210>10
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：5’ORF281
<400>10
taacgataac atatgaatat ccgccgggct ct            32
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：3’ORF281
<400>11
atatctgata agcttttatt cggcgtgcgc ggc                33

Claims (51)

1.一种编码植酸酶的分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸选自：
(a)一种编码由序列标识SEQ ID NO：2描述的植酸酶的分离的多核苷酸，
(b)一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸与如(a)所述的多核苷酸杂交
(c)一种与如(a)所述多核苷酸同源的分离的多核苷酸
(d)如(a)、(b)或(c)所述多核苷酸的片段。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，它以序列标识SEQ ID NO：1表示。
3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，它源自酸孢菌属的细菌。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，它编码活性的最适pH小于或等于4的植酸酶。
5.一种含有如权利要求1-4任一所述多核苷酸的分离的多核苷酸。
6.一种植酸酶，其特征在于，它由如权利要求1-5之一所述多核苷酸编码。
7.如权利要求6所述的植酸酶，其特征在于，它选自：
(a)由序列标识SEQ ID NO：2表示的植酸酶
(b)与如(a)所述植酸酶50％同源的植酸酶
(c)如(a)或(b)所述植酸酶的片段
8.如权利要求6或7所述的植酸酶，其特征在于，它源自酸孢菌属的细菌。
9.如权利要求8所述的植酸酶，其特征在于，其活性的最适pH小于或等于4。
10.一种嵌合基因，其特征在于，它至少包括功能上相互连接的：
(a)在宿主生物中发挥作用的启动子
(b)如权利要求1-5之一所述的多核苷酸
(c)在宿主生物中发挥作用的终止子元件
11.如权利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，它还包括在所述宿主生物中发挥作用的信号肽或转运肽。
12.一种含有如权利要求10或11所述的嵌合基因的表达或转化载体。
13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，它是质粒、噬菌体或病毒。
14.一种含有如权利要求10或11所述的嵌合基因的转化的宿主生物。
15.如权利要求14所述的宿主生物，其特征在于，它是微生物。
16.如权利要求15所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物选自细菌、真菌、酵母和病毒。
17.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物选自棒杆菌属、链霉菌属和埃希氏菌属，具体是大肠杆菌。
18.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物选自青霉属、曲霉属、金孢子菌属或木霉属的真菌。
19.如权利要求16所述的宿主生物，其特征在于，所述微生物选自酵母菌属、克鲁维酵母菌属和毕赤酵母菌属的酵母。
20.如权利要求14所述的宿主生物，其特征在于，它是植物细胞、植物或植物的一部分。
21.一种含有至少一种植酸酶活性的细菌提取物，其特征在于，它源自酸孢菌属的细菌。
22.如权利要求21所述的细菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性的活性最适pH小于或等于4。
23.如权利要求21或22所述的细菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性：
(a)最适温度＝65℃
(b)最适pH＝3.5。
24.如权利要求21或22所述的细菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性：
(a)最适温度＝70℃
(b)最适pH＝4。
25.如权利要求21或22所述的细菌提取物，其特征在于，所述植酸酶活性具有如下特性：
(a)最适温度＝60℃
(b)最适pH＝3.5。
26.一种制备如权利要求21-25之一所述的细菌提取物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液。
27.一种生产如权利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶。
28.一种生产如权利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)通过除去细菌回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶。
29.一种生产如权利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养如权利要求14-20之一所述的转化的宿主生物
(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物
(c)粉碎步骤(b)中分离的转化的宿主生物
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收步骤(d)中得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶。
30.一种生产如权利要求6-9之一所述的植酸酶的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养如权利要求14-20之一所述的转化的宿主生物
(b)通过除去所述转化的宿主生物回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶。
31.一种酶组合物，其特征在于，它含有至少一种如权利要求21-25之一所述的细菌提取物。
32.一种酶组合物，其特征在于，它含有至少一种如权利要求6-9之一所述的植酸酶。
33.一种饲料组合物，其特征在于，它含有至少一种如权利要求14-20之一所述的转化的宿主生物。
34.一种饲料组合物，其特征在于，它含有至少一种酸孢菌属的细菌。
35.如权利要求34所述的饲料组合物，其特征在于，所述细菌选自解氨酸孢菌和速生酸孢菌。
36.一种饲料组合物，其特征在于，它含有至少一种如权利要求21-25之一所述的细菌提取物。
37.一种饲料组合物，其特征在于，它含有至少一种如权利要求6-9之一所述的植酸酶。
38.如权利要求33-37之一所述的饲料组合物在单胃动物营养物中的应用。
39.如权利要求38所述的饲料组合物的应用，其特征在于，它用于猪的营养物。
40.如权利要求38所述的饲料组合物的应用，其特征在于，它用于家禽的营养物。
41.一种生产如权利要求33所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养如权利要求14-20之一所述的宿主生物
(b)浓缩步骤(a)中培养的宿主生物
(c)将步骤(b)中分离的宿主生物掺入所述饲料组合物。
42.一种生产如权利要求34或35所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)缩步骤(a)中培养的细菌
(c)将步骤(b)中分离的细菌掺入所述饲料组合物。
43.一种生产如权利要求36所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收从步骤(d)得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)步骤(e)中回收的上清液掺入所述饲料组合物
44.一种生产如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)浓缩步骤(a)中培养的细菌
(c)粉碎步骤(b)中分离的细菌
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收从步骤(d)得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶
(g)将步骤(f)中纯化的植酸酶掺入所述饲料组合物
45.一种生产如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养酸孢菌属的菌株
(b)通过除去细菌回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶
(d)将步骤(c)中纯化的植酸酶掺入所述饲料组合物。
46.一种生产如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养如权利要求14-20之一所述的转化的宿主生物
(b)浓缩步骤(a)中培养的转化的宿主生物
(c)粉碎步骤(b)中分离的转化的宿主生物
(d)离心步骤(c)中得到的粉碎的物质
(e)回收从步骤(d)得到的具有植酸酶活性的上清液
(f)纯化步骤(e)中回收的上清液中的植酸酶
(g)将步骤(f)中纯化的植酸酶掺入所述饲料组合物。
47.一种生产如权利要求37所述的饲料组合物的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
(a)培养如权利要求14-20之一所述的转化的宿主生物
(b)通过除去所述转化的宿主生物回收培养基
(c)纯化步骤(b)中回收的培养基中的植酸酶
(d)将步骤(c)中纯化的植酸酶掺入所述饲料组合物。
48.一种提高单胃动物植物基饲料的植酸酶中所含无机磷酸盐同化作用的方法，其特征在于，将如权利要求6-9之一所述的植酸酶或如权利要求31或32所述的酶组合物掺入所述动物的营养物中。
49.如权利要求48所述的方法，其特征在于，用如权利要求33-37之一所述的饲料组合物饲喂所述单胃动物。
50.一种减少单胃动物营养物中磷添加量的方法，其特征在于，用如权利要求33-37之一所述的饲料组合物饲喂所述动物。
51.一种降低单胃动物营养物中磷消耗的方法，其特征在于，用如权利要求33-37之一所述的饲料组合物饲喂所述动物。
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