ES2343884T3 - Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de preparacion de dichas fitasas. - Google Patents
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Abstract
Polinucleótido aislado que codifica para una fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por: (a) un polinucleótido aislado que codifica para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 (b) un polinucleótido aislado que se hibrida al polinucleótido según (a) en unas condiciones astringentes (c) un polinucleótido aislado que presenta por lo menos 70% de identidad con el polinucleótido según (a) presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.
Description
Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de
preparación de dichas fitasas.
La presente invención se refiere a nuevas
fitasas de origen bacteriano, así como a sus procedimientos de
preparación respectivos. La presente invención se refiere más
particularmente a nuevas fitasas procedentes de bacterias del
género Acidocella, así como a los polinucleótidos que
codifican para estas fitasas. La invención se refiere asimismo a
unos vectores que contienen estos polinucleótidos, y a unos
organismos hospedantes transformados que expresan dichas fitasas en
sus tejidos. La invención se refiere asimismo a nuevos extractos
bacterianos que comprenden por lo menos una actividad fitasa.
En particular, los extractos bacterianos y las
fitasas de la presente invención están particularmente adaptados a
su utilización en unas composiciones alimenticias destinadas a la
alimentación animal. Esta adaptación está relacionada con sus
propiedades, en particular su actividad en unas condiciones de
temperatura y de pH que corresponden a las condiciones de
preparación de dichas composiciones así como las encontradas en el
sistema digestivo de los
animales.
animales.
El fósforo es un elemento esencial para la vida
de todos los organismos. En particular, es primordial para los
criadores de animales de granja asegurarse que sus animales ingieren
una cantidad suficiente para optimizar su crecimiento y su
desarrollo. La mayoría de los animales de granja son alimentados con
unas composiciones alimenticias a base de vegetales. Estos
vegetales contienen grandes cantidades de fosfato que almacenan en
sus tejidos en forma de un compuesto de reserva, el ácido fítico.
Como media, el ácido fítico contiene de 50 a 70% del fósforo
presente en las plantas. El ácido fítico está naturalmente
movilizado y el fosfato que contiene se libera en la mayoría de los
animales de granja, en particular los rumiantes. Sin embargo, el
ácido fítico no es metabolizado por los animales monogástricos
tales como el cerdo y las aves de corral. En estos animales, el
ácido fítico contenido en su ración alimenticia es por lo tanto
evacuado con los excrementos, y el criador debe completar dicha
ración con fosfato inorgánico con el fin de que sus animales
ingieran una cantidad suficiente de fósforo. Esta estrategia genera
un sobrecoste para el criador y una contaminación procedente de la
emisión en el medioambiente del ácido fítico no asimilado. Esta
contaminación es aún más importante en las zonas de cría
intensa.
El ácido fítico es conocido asimismo por ser un
quelante de elementos nutritivos importantes contenidos en la
ración alimenticia, como, por ejemplo, el magnesio, el calcio, el
zinc o el hierro. Esta propiedad conduce a una disminución de la
calidad nutritiva de la ración alimenticia que da al ácido fítico la
propiedad de agente anti-nutricional.
Con el fin de responder a los diferentes
inconvenientes relacionados con la ausencia de asimilación del ácido
fítico por los animales monogástricos, se ha previsto introducir
una enzima, la fitasa, en la ración alimenticia de estos animales
de cría. La fitasa hidroliza el ácido fítico liberando inositol y
fosfato inorgánico. Unas fitasas y los genes que codifican estas
fitasas han sido aislados a partir de numerosos organismos. Las
fitasas han sido mayoritariamente aisladas a partir de hongos
(Howson y Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5,
377-382; Wyss et al., 1999, Appl. Environ.
Microbiol., 65(2), 359-366). Entre los hongos
que producen una fitasa, se pueden citar los hongos del género
Aspergillus, en particular A. ficuum (Ullah y Gibson,
1987, Preparative Biochemistry 17(1), 63-91;
Ullah y Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun.,
192(2), 747-753), A. terreus
(Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1),
245-252), A. niger (Dvorakova et al.,
1997, Folia Microbiol (Praha), 42(4),
349-352), A. fumigatus (Pasamontes et
al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63(5),
1696-1700), del género Penicillium, en
particular P. caseicolum, del género Myceliophtora,
en particular M. thermophila (Mitchell et al., 1997,
Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), del género
Talaromyces, en particular T. thermophilus, del género
Neurospora, en particular N. crassa y N.
sitophila, del género Thermomyces, en particular T.
lanuginosus (Berka et al., 1998, Appl Environ Microbiol.
64(11), 4423-4427), o del género
Monascus, en particular M. anka. Asimismo, se han
encontrado unas fitasas en unas bacterias. A título de ejemplo, se
pueden citar las bacterias de los géneros Bacillus, en
particular B. subtilis (Powar y Jagannathan, 1982, J.
Bacteriol. 151(3), 102-1108; Shimizu, 1992,
Biosci. Biotech. Biocem. 56(8), 1266-1269;
Keruvo et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6),
2079-2085), Pseudomonas (Cosgrove, 1970,
Austral. J. Biol. Sci. 23, 1207-1220),
Escherichia, en particular E. coli (Golovan et
al., 2000, Can. J. Microbiol. 46, 59-71),
Enterobacter (Yoon et al., 1996, Enzyme and
microbiol. Technol; 18, 449-454), o
Streptomyces. Se han aislado asimismo unas fitasas de
levaduras (Dvorakova, 1998, Folia Microbiol. 43(4),
323-338), como las de las levaduras
Schwaniiomyces occidentalis y Saccharomyces
cerevisiae. Por último, se han encontrado unas fitasas en las
plantas, en particular en la soja (Ullah y Gibson, 1988, Arch.
Biochem. Biophys., 260(2), 514-20), en el
maíz (Maugenest et al., 1997, Biochem J., 322 (Pt 2),
511-7); Maugenest et al., 1999, Plant Mol.
Biol., 39(3), 503-14), o en
Arabidopsis (Mullaney y Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 251(1), 252-5).
Entre las propiedades que permiten caracterizar
las fitasas, se encuentra la constante de Michaelis (Km) frente al
ácido fítico, el pH óptimo y la temperatura óptima de actividad, así
como la estabilidad de esta actividad a pH y temperaturas
determinados. Unos datos relativos a la estructura de las fitasas
pueden ser útiles asimismo, tales como el peso molecular (PM), el
punto isoeléctrico (pl), o la secuencia peptídica. Para que se
puedan utilizar en la alimentación animal, las fitasas deben poseer
unas propiedades compatibles con los tratamientos que sufren los
alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la
actividad de las fitasas utilizadas debe mantenerse y si es
posible, ser óptima en las condiciones de temperatura y de pH de los
procedimientos de preparación de estos alimentos así como en las
presentes en el tracto digestivo de los animales que ingieren estos
alimentos. Estas obligaciones conducen principalmente a buscar unas
fitasas cuya actividad resiste a unas condiciones de temperatura
elevada, tales como las utilizadas en los procedimientos de
preparación de las composiciones alimenticias, y a unas condiciones
de pH ácido, tales como las presentes en el tracto digestivo de los
animales de cría.
Con el fin de responder a estos criterios, se
han buscado unas fitasas en unos organismos, en particular unos
microorganismos, que se desarrollan en unos medios cuyas condiciones
de temperatura y de pH corresponden a estos criterios. Esta
estrategia ha permitido aislar unas fitasas resistentes a unas
temperaturas elevadas, tales como, por ejemplo, las descritas en
las solicitudes de patente WO 97/305016 o EP 0 684 313, pero también
unas fitasas que poseen un bajo Km, tales como, por ejemplo las
descritas en la solicitud de patente EP 0 960 934. Otra estrategia
consistió en modificar artificialmente la secuencia de fitasas
conocidas mediante mutagénesis dirigida con el fin de conferirle
unas propiedades interesantes. Esta estrategia se ha descrito en
particular en las solicitudes de patente WO 99/48380, EP 0 897 985 y
EP 0 897 010.
Sólo se han identificado algunas fitasas activas
a un bajo pH óptimo. Dichas fitasas han sido identificadas en
particular en los hongos, tales como la fitasa de Penicillium
caseicolum descrita en la solicitud de patente JP 7067635 y la
de Monascus anka descrita en la solicitud de patente WO
98/13480, pero también en las levaduras, como la fitasa de
Schwaniiomyces occidentalis descrita en la solicitud de
patente EP 699 762. Sin embargo, hasta ahora, ninguna bacteria ha
conducido al aislamiento y a la identificación de una fitasa que
posee un óptimo de pH bajo, en particular un pH óptimo inferior a
4.
Figura 1: Actividad de la fitasa de
Acidocella aminolytica ATCC 51361 en función de la
temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a
la actividad óptima de la fitasa para una temperatura
determinada.
Figura 2: Actividad de la fitasa de
Acidocella aminolytica ATCC 51361 en función del pH. El valor
de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima
de la fitasa para un pH determinado.
Figura 3: Actividad de la fitasa Acidocella
facilis ATCC 35904 en función de la temperatura. El valor de
100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de
la fitasa para una temperatura determinada.
Figura 4: Actividad de la fitasa Acidocella
facilis ATCC 35904 en función del pH. El valor de 100% de la
actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa
para un pH determinado.
Figura 5: Actividad de la fitasa contenida en la
fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 en
función de la temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa
corresponde a la actividad óptima de la fitasa para una temperatura
determinada.
Figura 6: Actividad de la fitasa contenida en la
fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 en
función del pH. El valor de 100% de la actividad relativa
corresponde a la actividad óptima de la fitasa para un pH dado.
La presente invención se refiere a unos
polinucleótidos aislados que codifican para una fitasa descrita por
el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Esta fitasa y los
polinucleótidos que la codifican están asimismo caracterizados
porque proceden de una cepa bacteriana del género
Acidocella.
Según la presente invención, por el término
"polinucleótido", se entiende una molécula de ácido nucleico
compuesta por una secuencia de bases, natural o artificial, que
puede ser de tipo ADN o ARN, preferentemente de tipo ADN, en
particular bicatenaria. Cuando dicho polinucleótido es natural,
resulta evidente que la invención no cubre este polinucleótido en
su entorno natural, sino el mismo polinucleótido aislado y
purificado del genoma del organismo vivo en el que se encuentra en
el estado natural. Este polinucleótido se puede obtener de manera
directa, mediante extracción y purificación, o de manera indirecta
mediante copia. Sin embargo, la presente invención comprende dicho
polinucleótido cuando se encuentra integrado de manera artificial en
el genoma de un organismo vivo diferente de aquél en el que existe
en el estado natural, o cuando se reintroduce artificialmente en el
organismo vivo del que procede, en uno o varios ejemplares en el
genoma de este organismo. Cuando este polinucleótido es una sonda,
es generalmente monocatenario.
La invención comprende por lo tanto los
polinucleótidos que codifican para la secuencia peptídica de la
fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Es
bien conocido por el experto en la materia que esta definición
incluye todos los polinucleótidos que, a pesar de que comprenden
unas secuencias nucleotídicas diferentes como resultado de la
degenerescencia del código genético, codifican para una misma
secuencia de aminoácidos, por lo tanto una misma fitasa, la cual
está representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2.
La presente invención comprende asimismo unos
polinucleótidos homólogos de los polinucleótidos descritos
anteriormente, codificando dichos polinucleótidos homólogos para
unas fitasas homólogas de la fitasa representada por el
identificador de secuencia SEC ID nº 2. Por el término
"homólogo" se entiende, según la invención, unos
polinucleótidos que codifican unas fitasas y cuyas secuencias
presentan unas modificaciones con relación a los polinucleótidos
que codifican la fitasa representada por el identificador de
secuencia SEC ID nº 2. Los polinucleótidos homólogos se
caracterizan porque presentan un grado de identidad con los
polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el
identificador de secuencia SEC ID nº 2. El grado de identidad entre
dos polinucleótidos homólogos se obtiene mediante la comparación de
sus secuencias y se expresa generalmente por un porcentaje de
nucleótidos idénticos entre estas secuencias. Este grado de
identidad se mide sobre una longitud de secuencia determinada,
determinando la más corta de las secuencias comparadas el tamaño de
secuencia sobre el cual se mide el grado de identidad de las
secuencias homólogas. La invención abarca por lo tanto unos
polinucleótidos que presentan una o varias modificaciones de
secuencia con relación a los polinucleótidos que codifican la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, y que
codifican para unas fitasas cuyas propiedades son equivalentes a las
de la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº
2.
Mediante la expresión "fitasas
equivalentes" o "fitasas con propiedades equivalentes" se
entiende esencialmente, según la invención, unas proteínas que
poseen una actividad fitasa, independientemente de sus propiedades
intrínsecas tales como el Km, el pH óptimo de actividad o la
temperatura óptima de actividad. El nivel de actividad fitasa se
puede medir mediante cualquier método que permite caracterizar una
actividad fitasa. Por fitasa, se entiende una enzima cuya actividad
catalítica consiste en hidrolizar el ácido fítico para liberar
inositol y fosfato inorgánico. Sin embargo, puesto que la mayoría de
las fitasas no realizan una hidrólisis completa del ácido fítico
(que comprende 6 fosfatos), la actividad catalítica de una fitasa
según la invención puede conducir a la liberación de fosfato
inorgánico y de ésteres de fosfato-mioinositol,
pudiendo ser dichos ésteres, en función de la capacidad de
hidrólisis de la fitasa, unos ésteres de mioinositol mono-, di-,
tri-, tetra- o penta-fosfato. A título de ejemplo,
la actividad fitasa se puede medir según el método de Shimizu
(1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8),
1266-1269), en particular tal como se ha descrito en
el ejemplo 2. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método que
permite caracterizar una actividad fitasa, o bien mediante la
medición de la disminución de la cantidad de sustrato, o bien
mediante la medición de la acumulación de los productos procedentes
de la reacción enzimática, para medir la actividad fitasa. En
particular, unos métodos parecidos, que utilizan por ejemplo otro
sustrato u otros agentes reactivos, permiten medir asimismo dicha
actividad fitasa.
Las modificaciones de secuencias presentes en
los polinucleótidos homólogos pueden ser unas adiciones, deleciones
o sustituciones de nucleótidos que pueden ser naturales u obtenidos
por las técnicas habituales de mutagénesis. Se sabe que dichos
polinucleótidos homólogos, que codifican para unas proteínas de
funciones equivalentes, existen naturalmente en los genomas de
especies vivas diferentes, e incluso en los genomas de razas,
variedades o cepas diferentes. Por consiguiente, resulta por lo
tanto fácil para un experto en la materia, a partir de la enseñanza
de los polinucleótidos que codifican para la secuencia peptídica
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 según la
invención, aislar dichos polinucleótidos homólogos utilizando unas
técnicas bien conocidas de hibridación molecular (Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La hibridación molecular es una reacción de
apareamiento que se efectúa entre unas hebras complementarias de
polinucleótidos que presentan un cierto grado de identidad entre sus
secuencias nucleotídicas. La hibridación permite por lo tanto, a
partir de los polinucleótidos que codifican la fitasa representada
por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, identificar unos
polinucleótidos homólogos de éstos en el genoma de organismos vivos
diferentes del que proceden, por ejemplo otras bacterias, en
particular otras cepas de Acidocella, y que codifican para
unas fitasas con las propiedades equivalentes a la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Cuanto
más fuerte es la identidad de secuencia entre unos polinucleótidos,
más posible y fácil resulta la hibridación entre dichos
polinucleótidos, y más alta es la probabilidad de que estos
polinucleótidos codifiquen para unas proteínas con las propiedades
equivalentes. Los métodos que permiten hibridar unos polinucleótidos
se describen ampliamente en la bibliografía (Sambrook et
al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición,
Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y son
bien conocidos por el experto en la materia. Se basan, por ejemplo,
en el cribado de un banco genómico o de ADNc creado a partir de un
organismo vivo o de un tejido de este organismo. El cribado se
lleva a cabo con la ayuda de una sonda constituida por un
polinucleótido conocido o un fragmento de éste, con el fin de
identificar en estos bancos los polinucleótidos homólogos a dicha
sonda que se hibridarán a ésta. Según la invención, la sonda está
constituida por un polinucleótido que codifica la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, o un
fragmento de éstos. Con el fin de identificar los polinucleótidos
sobre los cuales se hibrida la sonda, ésta se marca, por ejemplo
con unos elementos radiactivos, tal como el ^{32}P. Se pueden
utilizar asimismo unos marcadores no radiactivos comercializados y
bien conocidos por el experto en la materia.
La presente invención comprende por lo tanto
asimismo unos polinucleótidos capaces de hibridarse de manera
selectiva a uno de los polinucleótidos que codifican la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Se
entiende que estos polinucleótidos forman parte de la presente
invención sólo si codifican para una fitasa equivalente a la
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Mediante
la expresión "polinucleótidos capaces de hibridarse de manera
selectiva" se entiende por lo tanto, según la invención, los
polinucleótidos que, mediante uno de los métodos habituales de
hibridación molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press), se hibridan con una sonda
marcada constituida por uno de los polinucleótidos que codifican la
fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2,
o un fragmento de éstos, a un nivel superior a la hibridación no
específica de dicha sonda con otros polinucleótidos poco homólogos,
en particular otros ADNc si los polinucleótidos sondados proceden
de un banco de ADNc. El nivel de hibridación se mide gracias a la
señal producida por el marcador de la sonda. El nivel de la señal
generado por la interacción entre los polinucleótidos capaces de
hibridarse de manera selectiva y la sonda es generalmente 10 veces,
preferentemente 100 veces más intenso que el generado por la
interacción de la sonda con los demás polinucleótidos que generan
un "ruido de fondo". La hibridación selectiva se obtiene
utilizando unas condiciones de hibridación y de lavado astringentes
o muy astringentes (por ejemplo hibridación con un tampón que
contiene por lo menos 5 x SSC y 1% de SDS a aproximadamente
50ºC-60ºC, y lavados sucesivos con 0,1% de SDS y
disminución progresiva de la concentración en SSC de 2xSSC a
0,4xSSC así como aumento de la temperatura de 20ºC a 50ºC). El
experto en la materia sabrá adaptar las condiciones de hibridación,
es decir, esencialmente la temperatura y la concentración salina de
los tampones utilizados para la etapa de hibridación y la etapa de
lavado. Estas condiciones deben ser adaptadas en particular en
función del tamaño de la sonda utilizada y del grado de identidad de
los polinucleótidos presentes en el banco cribado con esta sonda.
La adaptación de las condiciones de hibridación es necesaria con el
fin de optimizar la señal generada por las secuencias homólogas que
se hibridan, minimizando al mismo tiempo el ruido de fondo.
Los polinucleótidos capaces de hibridarse de
manera selectiva a los polinucleótidos según la invención pueden
ser aislados a partir de bancos genómicos o de bancos de ADNc
producidos, por ejemplo, a partir de cepas bacterianas, en
particular de cepas del género Acidocella. El aislamiento de
dichos polinucleótidos se puede llevar a cabo mediante las técnicas
estándares de hibridación (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York:
Cold Spring Harbor Laboratory Press), utilizando como sonda un
polinucleótido que codifica la fitasa representada por el
identificador de secuencia SEC ID nº 2, un fragmento de estos
polinucleótidos, o un polinucleótido complementario de éstos. Cuando
un polinucleótido ha sido aislado por estas técnicas, es necesario
determinar su secuencia e identificar las propiedades de la proteína
codificada por este polinucleótido, en particular verificar que
esta proteína es una fitasa equivalente a la fitasa descrita por el
identificador de secuencia SEC ID nº 2.
Las técnicas de hibridación mencionadas
anteriormente permiten por lo tanto aislar unos polinucleótidos
homólogos de los polinucleótidos que codifican para la fitasa
descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Dichos
polinucleótidos y las fitasas que codifican, son fácilmente
identificables por un experto en la materia del campo de las
biotecnologías que domina las técnicas estándares de biología
molecular. La invención comprende por lo tanto unos polinucleótidos
homólogos de los polinucleótidos que codifican la fitasa descrita
por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. El grado de
identidad de los polinucleótidos homólogos será de por lo menos 70%
con relación a los polinucleótidos que codifican la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2,
preferentemente de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo
menos 90% y de manera preferida de por lo menos 95%. Los métodos de
medición y de identificación del grado de identidad entre unas
secuencias son asimismo bien conocidos por el experto en la materia.
Se pueden utilizar, por ejemplo, los programas PILEUP, BLAST (en
particular Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol.
36:290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol.
Biol. 215:403-10), o BestFit (Wisconsin Sequence
Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711,
utilizando el algoritmo de Smith y Waterman descrito en Applied
Mathematics, 1981, nº 2, 482-489).
Dichos polinucleótidos homólogos se pueden
obtener asimismo de manera artificial mediante las técnicas
habituales de mutagénesis.
Un polinucleótido preferido que codifica la
fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 se
representa mediante el identificador de secuencia SEC ID nº 1.
Según un modo particular de realización de la
invención, los polinucleótidos que codifican una fitasa descritos
anteriormente proceden de una bacteria del género
Acidocella.
De manera ventajosa, los polinucleótidos según
la invención codifican una fitasa cuyo pH óptimo de actividad es
inferior o igual a 4. Por pH óptimo de actividad, se entiende el
valor de pH al que la actividad de la fitasa según la invención es
máxima, siendo esta actividad medida mediante el método mencionado
anteriormente y que corresponde a la cantidad de ácido fítico
degradado y de fosfato inorgánico producido.
Según un modo particular de realización de la
invención, los polinucleótidos según la invención codifican una
fitasa que posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 70ºC
- (b)
- pH óptimo = 4
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro modo particular de realización de la
invención, los polinucleótidos según la invención codifican una
fitasa que posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 60ºC
- (b)
- pH óptimo = 3,5
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, los polinucleótidos según la
invención codifican una fitasa que procede de una cepa bacteriana de
la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa
A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa bacteriana de la
especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A.
facilis ATCC 35904.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención describe asimismo unos
fragmentos de los polinucleótidos descritos anteriormente. El
término "fragmento" designa en particular un fragmento de por
lo menos 20 nucleótidos, en particular de por lo menos 50
nucleótidos, y preferentemente de por lo menos 100 nucleótidos.
Dichos fragmentos se designan generalmente oligonucleótidos. Pueden
servir de sondas de hibridación para identificar unos
polinucleótidos homólogos, o de cebadores para identificar y
amplificar dichos polinucleótidos homólogos mediante la técnica de
PCR ("Polymerase Chain Reaction" tal como se ha descrito en
Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular
Biology, edit., John Wiley & Sons, Sección
6.3-6.4.
El término fragmento designa asimismo unos
fragmentos de los polinucleótidos según la invención que codifican
un fragmento de la fitasa representada por el identificador de
secuencia SEC ID nº 2, o un fragmento de una fitasa homóloga o
equivalente de la fitasa representada por el identificador de
secuencia SEC ID nº 2.
La presente invención se refiere asimismo a unos
polinucleótidos que comprenden por lo menos uno de los
polinucleótidos tales como los descritos anteriormente.
Todos los polinucleótidos descritos
anteriormente codifican o bien la fitasa representada por el
identificador de secuencia SEC ID nº 2, o bien una fitasa homóloga,
o bien un fragmento activo de estas fitasas. En consecuencia, la
invención se extiende por lo tanto a todas las fitasas codificadas
por el conjunto de estos polinucleótidos. Esta definición incluye
por lo tanto la fitasa representada por el identificador de
secuencia SEC ID nº 2, las fitasas homólogas de esta fitasa, y los
fragmentos activos de estas fitasas.
Según un modo preferido de realización de la
invención, la fitasa es una proteína que comprende por lo menos la
secuencia peptídica descrita por el identificador de secuencia SEC
ID nº 2. De manera preferida, la fitasa representada por la
secuencia peptídica descrita por el identificador de secuencia SEC
ID nº 2 hidroliza 5 de los 6 fosfatos presentes sobre una molécula
de ácido fítico.
La invención comprende por lo tanto asimismo las
fitasas homólogas de la fitasa representada por el identificador de
secuencia SEC ID nº 2. Mediante la expresión "fitasas
homólogas" se entiende, según la invención, las fitasas cuyas
secuencias presentan unas modificaciones con relación a la fitasa
representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Al
igual que los polinucleótidos homólogos, las fitasas homólogas son
unas fitasas cuyas secuencias peptídicas presentan un cierto grado
de identidad, grado de identidad que está generalmente expresado
por un porcentaje de aminoácidos idénticos. La invención abarca por
lo tanto unas fitasas que presentan una o varias modificaciones de
secuencia con relación a la fitasa representada por el identificador
de secuencia SEC ID nº 2, y cuyas propiedades son equivalentes a
las de la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID
nº 2. Estas modificaciones pueden ser unas adiciones, deleciones o
sustituciones de aminoácidos que pueden ser naturales u obtenidas
mediante las técnicas habituales de mutagénesis. El grado de
identidad de las fitasas homólogas será de por lo menos 70% con
relación a la fitasa representada por el identificador de secuencia
SEC ID nº 2, preferentemente de por lo menos 80%, más
preferentemente de por lo menos 90%, y de manera preferida de por
lo menos 95%. Los métodos de medición y de identificación del grado
de identidad entre secuencias son bien conocidos por el experto en
la materia. Se pueden utilizar, por ejemplo, los programas PILEUP,
BLAST (en particular Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol.
36:290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol.
Biol. 215:403-10), o BestFit (Wisconsin Sequence
Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group,
University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711,
utilizando el algoritmo de Smith y Waterman descrito en Applied
Mathematics, 1981, nº 2, 482-489).
Según un modo particular de realización de la
invención, la fitasa según la invención procede de una bacteria del
género Acidocella.
De manera ventajosa, la fitasa según la
invención tiene un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4. Por
pH óptimo de actividad, se entiende el valor de pH al que la
actividad de la fitasa según la invención es máxima, siendo esta
actividad medida mediante el método mencionado anteriormente y que
corresponde a la cantidad de ácido fítico degradado y de fosfato
inorgánico producido.
Según un modo particular de realización de la
invención, la fitasa posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 70ºC
- (b)
- pH óptimo = 4
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro modo particular de realización de la
invención, la fitasa posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 60ºC
- (b)
- pH óptimo = 3,5
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro modo particular de realización de la
invención, la fitasa según la invención procede de una cepa
bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en
particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa
bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular
la cepa A. facilis ATCC 35904.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se describen asimismo unos fragmentos de la
fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 y
los fragmentos de las fitasas homólogas. Por fragmento, se entiende
esencialmente un fragmento biológicamente activo, es decir, un
fragmento que posee una actividad fitasa equivalente a la de la
fitasa completa tal como se ha medido mediante el ensayo descrito en
el ejemplo 2, o un ensayo parecido.
La presente invención se refiere asimismo a un
gen quimérico que comprende por lo menos, unidos entre sí de manera
operativa, un promotor funcional en un organismo hospedante, un
polinucleótido que codifica una fitasa según la invención, y un
elemento terminador funcional en este mismo organismo hospedante.
Los diferentes elementos que un gen quimérico puede contener son,
por un lado, unos elementos reguladores de la transcripción, de la
traducción y de la maduración de las proteínas, tales como un
promotor, una secuencia que codifica para un péptido señal o un
péptido de tránsito, o un elemento terminador que constituye una
señal de poliadenilación y, por otro lado, un polinucleótido que
codifica para una proteína. La expresión "unidos entre sí de
manera operativa" significa que dichos elementos del gen
quimérico están unidos entre sí de manera que el funcionamiento de
uno de estos elementos está afectado por el de otro. A título de
ejemplo, un promotor está unido de manera operativa a una secuencia
codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de dicha
secuencia codificante. La construcción del gen quimérico según la
invención y el ensamblaje de sus diferentes elementos se realiza
mediante la utilización de técnicas bien conocidas por el experto en
la materia, en particular las descritas en Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nueva
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La selección de los
elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende
esencialmente del organismo hospedante en el que deben funcionar, y
el experto en la materia es capaz de seleccionar unos elementos
reguladores funcionales en un organismo hospedante determinado. Por
"funcionales", se entiende capaces de funcionar en un organismo
hospedante determinado.
Los promotores que puede contener el gen
quimérico según la invención son o bien constitutivos, o bien
inducibles. A título de ejemplo, los promotores utilizados para la
expresión en unas bacterias se podrán seleccionar de entre los
promotores citados a continuación. Para la expresión en
Escherichia coli, se pueden citar los promotores lac,
trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, proU, cst-1, tetA,
cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA,
PL, PL-9G-50,
PR-PL, T7, \lambdaPL-PT7,
T3-lac, T5-lac, T4 gen 32,
nprM-lac, VHb, proteína A (Makrides, 1996,
Microbiol. Rev. 60:512-538; Current Opinions in
Biotechnology, 1996, 7; Weickert et al., 1996, Current
Opinions in Biotechnology 7: 494-499) o también el
promotor P_{trp} (WO 99/64607). Para la expresión en las bacterias
Gram positivas tales como las Corinebacterias o
Streptomyces, se pueden citar los promotores P_{tipA}
(Holmes et al., 1993, EMBO J. 12:3183-3191)
o PS1, PS2 (FR 91/09870) o los descritos en la solicitud EP 0 629
699 A2. Para la expresión en las levaduras y en los hongos, se
pueden citar los promotores P_{LAC4} de K. lactis (Van den
Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:135-139)
o P_{pgk} de K. lactis (solicitud de patente FR 91/05294),
tef1 o cbh 1 de Trichoderma (WO 94/04673),
his, csl, apf de Penicillium (WO 00/68401),
gla de Aspergillus (Gwynne et al., 1987,
Bio/Technology 5: 713-719).
El gen quimérico puede comprender asimismo una
secuencia de direccionamiento subcelular, que codifica un péptido
señal o un péptido de tránsito. Dicha secuencia, situada corriente
arriba o corriente abajo del polinucleótido que codifica para la
fitasa, permite dirigir dicha fitasa de manera específica a un
compartimento celular del organismo hospedante, o dirigir su
secreción en el espacio extracelular. Por ejemplo, el gen quimérico
puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal o un
péptido de tránsito que permite dirigir la fitasa hacia un
compartimento particular del citoplasma como las mitocondrias, los
plastos, el retículo endoplásmico o las vacuolas. De manera
preferida, la secuencia de direccionamiento codifica un péptido
señal que dirige la fitasa al apoplasto o la matriz celular.
Según un modo de realización, el péptido de
tránsito puede ser una señal de direccionamiento cloroplástico,
vacuolar o mitocrondial, el cual se escinde a continuación en los
cloroplastos, las vacuolas o las mitocondrias. Dichos péptidos se
describen ampliamente en la bibliografía: Neuhaus y Rodgers, 1998,
Plant Molecular Biology 38: 127-144; péptido de
tránsito del EPSPS descrito en la patente US nº 5.188.642; péptido
de tránsito de la pequeña sub-unidad de la
ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (EP 189 707).
Según otro modo de realización, el péptido de
tránsito puede estar constituido por un péptido señal de
direccionamiento al periplasmo bacteriano como los de los genes
pac (Schumacher et al., 1986, Nucl. Acids. Res.
14:5713-5727), ompA (Bowden y Georgiou,
1990, J. Biol. Chem. 265: 16761-16766), phoA
(Chang et al., 1986, Gene 44: 121-124), o
por un péptido de anclaje en la superficie de la bacteria como los
de los genes PS1 y PS2 (FR 91/09870).
Los péptidos de tránsito pueden ser o bien
simples, o bien dobles. Los péptidos de tránsito dobles están
eventualmente separados por una secuencia intermedia. A título de
ejemplo de péptido de tránsito cloroplástico, se puede citar un
péptido de tránsito doble que comprende, en el sentido de la
transcripción, una secuencia que codifica para un péptido de
tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de
localización plastidial, una parte de secuencia de la parte madura
N-terminal de un gen vegetal que codifica para una
enzima de localización plastidial, y después una secuencia que
codifica para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que
codifica para una enzima de localización plastidial. Dichos péptidos
de tránsito cloroplástico dobles se describen, por ejemplo, en la
solicitud de patente EP 0 508 909.
Según un modo de realización, el péptido de
tránsito puede estar compuesto por diferentes elementos que permiten
aumentar el índice de proteína de interés segregada en el medio. Se
puede así citar la asociación de una proteína portadora y de un
sitio de escisión proteolítico fusionado con la proteína de interés
(US nº 6.130.063).
Según la invención, el gen quimérico puede
comprender asimismo otras secuencias de regulación, que se sitúan
entre el promotor y la secuencia codificante, tales como unos
activadores de transcripción (enhancer).
La presente invención se refiere asimismo a un
vector de clonación y/o de expresión que comprende un gen quimérico
según la invención. El vector según la invención es útil para
transformar un organismo hospedante y expresar en éste una fitasa.
Este vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un
virus. De manera preferida, el vector de transformación según la
invención es un plásmido. De manera general, las principales
cualidades de este vector deben ser una capacidad para mantenerse y
para autoreplicarse en las células del organismo hospedante, en
particular gracias a la presencia de un origen de replicación, y
para expresar una fitasa. Con el objetivo de una transformación
estable de un organismo hospedante, el vector puede integrarse
asimismo en el genoma. Su composición puede limitarse entonces a
los elementos necesarios para la síntesis de la fitasa en estos
hospedantes. La elección de dicho vector así como las técnicas de
inserción en éste del gen quimérico según la invención se describen
ampliamente en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor
Laboratory Press), y forman parte de los conocimientos generales
del experto en la materia. De manera ventajosa, el vector utilizado
en la presente invención contiene asimismo, además del gen
quimérico según la invención, un gen quimérico que codifica un
marcador de selección. Este marcador de selección permite
seleccionar los organismos hospedantes efectivamente transformados,
es decir, los que han incorporado el vector. Según un modo
particular de realización de la invención, el organismo hospedante
a transformar es una planta o un hongo. Entre los marcadores de
selección que se pueden utilizar, se pueden citar unos marcadores
que contienen unos genes de resistencia a los antibióticos o a los
fungicidas tales como, por ejemplo, el gen de la higromicina
fosfotransferasa (Gritz et al., 1983, Gene
25:179-188; Punt et al., 1987; Gene, 56:
117-24), el de la estreptotricina acetiltransferasa,
el que codifica para un polipéptido que confiere una resistencia a
la fleomicina, el de la beta-tubulina mutada que
confiere la resistencia al benomil (Gold et al., 1994, Gene
142: 225-30), o el de la
bialafos-acetiltransferasa (Avalos et al.,
1989, Curr Genet, 16:369-72). Otros marcadores
pueden ser unos genes que complementan una auxotrofia tales como
los genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4 (Buxton y Radford, 1983, Mol. Gen.
Genet. 190: 403-405), arg4, argB (Berse et
al., 1983, Gene 25: 109-117), trpC (Goosen et
al., 1989, Mol Gen Genet, 219:282-88), el gen
de la molibdopterina sintasa (Appleyard et al., 1998, J Biol
Chem 273: 14869-76; Unkles et al., 1999; J
Biol Chem, 274:19286-93), o el de la acetamidasa
(Beri y Turner, 1987, Curr Genet, 11:639-41). Otra
categoría de marcadores de selección está constituida por unos genes
de tolerancia a los herbicidas tales como el gen bar (White
et al., NAR 18:1062, 1990) para la tolerancia al bialafos, el
gen EPSPS (US nº 5.188.642) para la tolerancia al glifosato, el gen
HPPD (WO 96/38567) para la tolerancia a los isoxazoles, o también
el gen de la glifosato oxidorreductasa (US nº 5.463.175). Se pueden
citar asimismo unos genes que codifican para unas enzimas
fácilmente identificables tales como la enzima GUS, unos genes que
codifican para unos pigmentos o unas enzimas que regulan la
preparación de pigmentos en las células transformadas. Dichos genes
marcadores de selección se describen en particular en las
solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, y WO
97/04103.
La presente invención se refiere asimismo a unos
organismos hospedantes transformados, que contienen por lo menos un
gen quimérico según la invención o bien integrado en su genoma, o
bien soportado sobre un elemento genético
extra-cromosómico, por ejemplo un plásmido. Por
organismo hospedante, se entiende cualquier organismo mono o
pluricelular, inferior o superior, en el que puede ser introducido
el gen quimérico según la invención, para la preparación de una
fitasa según la invención. De manera preferida, el organismo
hospedante es un microorganismo, en particular un hongo, por
ejemplo de los géneros Penicillium, Aspergillus,
Chrysosporium, o Trichoderma, una bacteria, por ejemplo
del género Escherichia, en particular E. coli, del
género Corynebacterium o del género Streptomyces, una
levadura, en particular de los géneros Saccharomyces,
Kluyveromyces, o Pichia, un baculovirus, o unas células
vegetales. El organismo hospedante puede ser asimismo una planta o
una parte de planta.
Mediante la expresión "organismo hospedante
transformado", se entiende un organismo hospedante que ha
incorporado en su genoma, o en un elemento genético
extra-cromosómico, por ejemplo un plásmido, por lo
menos un gen quimérico según la invención, y produce por
consiguiente una fitasa en sus tejidos, o en un medio de cultivo.
Para obtener los organismos hospedantes según la invención, el
experto en la materia puede utilizar uno de los numerosos métodos de
transformación conocidos.
Uno de estos métodos consiste en poner las
células o tejidos de los organismos hospedantes a transformar en
presencia de polietilenglicol (PEG) y de los vectores de la
invención (Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet 168(1),
111-115; Mercenier y Chassy, 1988, Biochimie
70(4), 503-517). La electroporación es otro
método que consiste en someter las células o tejidos a transformar
y los vectores de la invención a un campo eléctrico (Andreason y
Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660;
Shigekawa y Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1),
56-62). Otro método consiste en inyectar
directamente los vectores en las células o en los tejidos mediante
microinyección (Gordon y Ruddle, 1985, Gene 33(2),
121-136). De manera ventajosa, se podrá utilizar el
método denominado de "biolístico". Consiste en bombardear unas
células o unos tejidos con unas partículas sobre las cuales se
adsorben los vectores de la invención (Bruce et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24),
9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology
10(3), 286-291; patente US nº 4.945.050).
Varios métodos de transformación de bacterias se
describen en la bibliografía para Escherichia coli y otras
bacterias Gram negativas (Ausubel et al., 1995, Current
Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York;
Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28; Chung
et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
2172-2175). Se puede utilizar asimismo la
conjugación (Cameron et al., 1989, J. Bacteriol., 171:
547-557). Para las bacterias Gram positivas se puede
utilizar la electroporación así como la transformación de
protoplastos, en particular para las bacterias del género
Streptomyces (Bonamy et al., 1990, FEMS Microbio.
Lett 66: 263-270; Hopwood et al., 1985,
Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. John
Innes Foundation, Norwich).
Varios métodos de transformación de hongos se
describen asimismo en la bibliografía (Talbot, 2001, Molecular and
cellular biology of filamentous fungi, Oxford University Press,
Nueva York). La transformación de protoplastos con PEG se describe
para Aspergillus en el documento EP 0 260 762, y una
adaptación de este método a la especie Penicillium
funiculosum en el documento WO 00/36120. Se conoce asimismo la
transformación mediante integración asistida de enzima de
restricción o REMI (Sanchez et al., 1998, Mol. Gen. Genet.
258; 89-94), así como la transformación de
protoplastos con la ayuda de bacterias del género
Agrobacterium (de Groot et al., 1998, Nature
Biotechnology 16: 839-842). Unas técnicas de
transformación de levaduras han sido descritas asimismo en la
bibliografía, en particular en Ausubel et al. (1995, Current
Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, Nueva York) y
Van den Berg et al. (1990, Bio/Technology 8:
135-139).
En el caso particular en el que el organismo
hospedante a transformar es de origen vegetal, la transformación de
células o de tejidos vegetales se puede llevar a cabo
preferentemente con la ayuda de bacterias del género
Agrobacterium, preferentemente mediante la infección de las
células o de los tejidos de dichas plantas por A.
tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,
143-173; Shaw et al., 1983, Gene
23(3):315-330) o A. rhizogenes (Bevan
y Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357-384;
Tepfer y Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci.
4(1), 24-28). De manera preferida, la
transformación de células o de tejidos vegetales por
Agrobacterium tumefaciens se lleva a cabo según el protocolo
descrito por Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol.
14(6), 745-750). El experto en la materia
seleccionará el método apropiado en función de la naturaleza de los
organismos hospedantes a transformar.
La presente invención se refiere asimismo a un
nuevo extracto bacteriano que comprende por lo menos una actividad
fitasa, caracterizado porque procede de una bacteria del género
Acidocella. Por extracto bacteriano, se entiende según la
presente invención, una fracción soluble en agua o en una disolución
acuosa, procediendo dicha fracción de la trituración de bacterias y
de la separación mediante centrifugación de los constituyentes
bacterianos así liberados en fracción sólida y en fracción líquida,
comprendiendo la fracción líquida el conjunto de los constituyentes
bacterianos solubles. La actividad fitasa corresponde a la cantidad
de ácido fítico degradado y se mide generalmente mediante la
cuantificación del fosfato inorgánico liberado por la reacción
enzimática. En particular, la actividad fitasa se mide según el
método de Shimizu (1992, Biosci. Biotech, Biochem. 56(8),
1266-1269), en particular tal como se ha descrito en
el ejemplo 2 siguiente. Sin embargo, se puede utilizar cualquier
método que permite caracterizar una actividad fitasa, o bien
mediante la medición de la disminución de la cantidad de sustrato,
o bien mediante la medición de la acumulación de los productos
procedentes de la reacción enzimática, para medir la actividad
fitasa del extracto bacteriano según la invención.
El extracto bacteriano según la invención se
caracteriza porque procede de una bacteria del género
Acidocella. Las características de las bacterias agrupadas en
el género Acidocella se describen en Kishimoto et al.
(1995, System. Appl. Microbiol. 18, 85-91).
Preferentemente, el extracto bacteriano según la
invención expresa una actividad fitasa cuyo pH óptimo de actividad
es inferior o igual a 4. El pH óptimo de actividad corresponde al pH
al que la actividad fitasa medida en el extracto bacteriano según la
invención es máxima.
Según un modo particular de realización de la
invención, el extracto bacteriano comprende una actividad fitasa que
posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 70ºC
- (b)
- pH óptimo = 4
\vskip1.000000\baselineskip
Según otro modo particular de realización de la
invención, el extracto bacteriano comprende una actividad fitasa que
posee las propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 60ºC
- (b)
- pH óptimo = 3,5
\vskip1.000000\baselineskip
Por temperatura óptima y pH óptimo, se entiende
la temperatura y el pH a los que la actividad fitasa medida en el
extracto bacteriano según la invención es máxima.
Según otro modo particular de realización de la
invención, el extracto bacteriano según la invención procede de una
cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en
particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa
bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular
la cepa A. facilis ATCC 35904.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de dicho extracto bacteriano. Este
procedimiento se caracteriza porque comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
\vskip1.000000\baselineskip
Según el presente procedimiento, una cepa
bacteriana del género Acidocella se cultiva en un medio de
cultivo apropiado que permite que las bacterias se multipliquen, y
cuyo pH se ajusta a las condiciones de pH del medio natural en el
que se desarrolla dicha cepa bacteriana. Numerosos medios de cultivo
para bacterias se describen en la bibliografía, y el experto en la
materia sabrá seleccionarlos y adaptar sus condiciones de pH. A
título de ejemplo, un medio de cultivo para bacterias acidófilas,
en particular del género Acidocella se describe en Kishimoto
et al., 1995, System. Appl. Microbiol. 18,
85-91).
Después del cultivo, las bacterias obtenidas se
concentran. La concentración de las bacterias se puede llevar a
cabo mediante numerosos medios, en particular mediante
centrifugación o mediante filtración. Después de la concentración,
las bacterias se trituran. La trituración de las bacterias consiste
en romper las células bacterianas. Se puede llevar a cabo mediante
diferentes medios conocidos por el experto en la materia.
Preferentemente, la trituración se lleva a cabo mediante la
exposición de las bacterias a un campo de ultrasonidos. El triturado
bacteriano se centrifuga a continuación con el fin de separar los
desechos celulares no solubles, y después recuperar el sobrenadante
de centrifugación que comprende los elementos celulares solubles, y
en particular unas enzimas que expresan una actividad fitasa.
Según un modo particular de realización de la
invención, la cepa bacteriana utilizada en el procedimiento según
la invención es una cepa bacteriana de la especie Acidocella
aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC
51361, o una cepa bacteriana de la especie de Acidocella
facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de la fitasa según la invención. Según
un modo de realización de la invención, este procedimiento se
caracteriza porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e)
\vskip1.000000\baselineskip
Las etapas (a) a (e) de este procedimiento son
comunes con las etapas (a) a (e) del procedimiento de preparación de
un extracto bacteriano descrito anteriormente. La etapa (f) del
presente procedimiento de preparación de una fitasa según la
invención consiste en purificar la fitasa a partir del sobrenadante
recuperado en la etapa (e). La purificación de la fitasa se puede
llevar a cabo mediante cualquier técnica de separación de las
proteínas, en particular las técnicas de electroforesis y de
cromatografía bien conocidas por el experto en la materia. Con el
fin de conseguir una fitasa purificada, el experto en la materia
sabrá utilizar el método de medición de la actividad fitasa
mencionada anteriormente para identificar la o las fracciones de
purificación que contienen dicha fitasa.
Preferentemente, la cepa bacteriana utilizada en
el procedimiento según la invención es una cepa bacteriana de la
especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A.
aminolytica ATCC 51361, o una cepa bacteriana de la especie de
Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis
ATCC 35904.
Según otro modo de realización de la invención,
en particular cuando la fitasa según la invención es segregada en el
medio de cultivo, este procedimiento se caracteriza porque comprende
las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de las bacterias
- (c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (d)
\global\parskip1.000000\baselineskip
Según este procedimiento, la etapa de
recuperación del medio de cultivo por eliminación de las bacterias
se puede llevar a cabo mediante cualquier método de separación de
fracciones sólidas comprendidas en una fracción líquida. En
particular, la filtración y la centrifugación son unos medios
adaptados a la realización de esta etapa.
Según otro modo de realización de la invención,
el procedimiento de preparación de la fitasa según la invención
utiliza un organismo hospedante transformado según la invención, y
se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según la invención
- (b)
- concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)
- (c)
- triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e)
\vskip1.000000\baselineskip
La etapa (f) del presente procedimiento de
preparación de una fitasa según este modo de realización de la
invención consiste en purificar la fitasa a partir del sobrenadante
recuperado en la etapa (e). La purificación de la fitasa se puede
llevar a cabo mediante cualquier técnica de separación de las
proteínas, en particular las técnicas de electroforesis y de
cromatografía bien conocidas por el experto en la materia. Con el
fin de conseguir una fitasa purificada, el experto en la materia
sabrá utilizar el método de medición de la actividad fitasa
mencionada anteriormente para identificar la o las fracciones de
purificación que contienen dicha fitasa.
Preferentemente, el organismo hospedante
transformado utilizado en este procedimiento es un microorganismo.
En particular dicho microorganismo puede ser un hongo, por ejemplo
de los géneros Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, o
Trichoderma, una bacteria, por ejemplo del género
Escherichia, en particular E. coli, del género
Corynebacterium o del género Streptomyces, una
levadura, en particular de los géneros Saccharomyces,
Kluyveromyces, o Pichia, un baculovirus, o unas células
vegetales.
Según otro modo de realización de la invención,
en particular cuando la fitasa según la invención es segregada en un
medio de cultivo, este procedimiento se caracteriza porque comprende
las etapas siguientes:
- a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según la invención
- b)
- recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de dicho organismo hospedante transformado
- c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (e).
\vskip1.000000\baselineskip
Según este procedimiento, la etapa de
recuperación del medio de cultivo por eliminación del organismo
hospedante transformado se puede realizar mediante cualquier medio
de separación de fracciones sólidas comprendidas en una fracción
líquida. En particular, la filtración y la centrifugación son unos
medios adaptados a la realización de esta etapa.
La presente invención se refiere asimismo a unas
composiciones enzimáticas que comprenden por lo menos una fitasa
según la invención. Según un modo de realización particular, la
composición enzimática según la invención comprende un extracto
bacteriano según la invención.
Mediante la expresión "composición
enzimática", se entiende una composición que comprende por lo
menos una fitasa según la invención, fitasa que está asociada a
unos adyuvantes diversos que favorecen su estabilidad y su
conservación. La composición enzimática según la invención puede
estar en forma líquida, encontrándose entonces dicha composición y
la fitasa que contiene en una disolución acuosa, o en forma sólida,
encontrándose entonces dicha composición y la fitasa que contiene
liofilizadas en forma de polvo.
Según un modo particular de realización de la
invención, la composición enzimática comprende, además de la fitasa
según la invención, por lo menos una enzima adicional. Esta enzima
adicional puede o bien poseer una actividad fitasa, o bien poseer
una actividad distinta de la actividad fitasa. En el caso en el que
esta enzima adicional posee una actividad fitasa, dicha actividad
fitasa es preferentemente diferente y complementaria de la
actividad fitasa de la fitasa según la invención. En el caso en el
que esta enzima adicional posee una actividad diferente de la
actividad fitasa, ésta puede, por ejemplo, poseer una actividad
xilanasa, celulasa, \beta-glucanasa, ácido
ferúlico estearasa, pululanasa, amidasa, fosfatasa o mananasa.
\newpage
De manera preferida, dichas composiciones
enzimáticas están destinadas a ser incorporadas en unos alimentos
para animales de cría, en particular unos animales monogástricos,
preferentemente cerdos o aves de corral.
La presente invención se refiere asimismo a una
composición alimenticia que comprende por lo menos una fitasa según
la invención.
Mediante la expresión "composición
alimenticia" se entiende esencialmente un alimento destinado a
los animales de cría, en particular a los animales monogástricos,
preferentemente los cerdos o las aves de corral. Una composición
alimenticia según la invención es idealmente un alimento destinado a
los animales de cría adicionado con una composición enzimática
según la invención. La composición alimenticia según la invención
es, por lo tanto, un alimento para animales de cría al que se
adiciona por lo menos una composición enzimática según la
invención, siendo dicho alimento y dicha composición enzimática
mezclados de manera que se obtiene dicha composición
alimenticia.
Según un modo particular de realización de la
invención, dichas composiciones alimenticias comprenden por lo
menos un organismo hospedante transformado según la invención. Según
otro modo particular de realización de la invención, dichas
composiciones alimenticias comprenden por lo menos una bacteria del
género Acidocella. De manera preferida, la bacteria del
género Acidocella es una bacteria de la especie Acidocella
aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC
51361, o una bacteria de la especie Acidocella facilis, en
particular la cepa A. facilis ATCC 35904.
La invención se refiere asimismo a unas
composiciones alimenticias que comprenden por lo menos un extracto
bacteriano o una fitasa según la invención.
Ventajosamente, las composiciones alimenticias
según la invención están destinadas a ser utilizadas en la
alimentación de los animales monogástricos. Según un modo particular
de realización de la invención, dichas composiciones alimenticias
están destinadas a la alimentación de los cerdos. Según otro modo
particular de realización de la invención, dichas composiciones
alimenticias están destinadas a la alimentación de las aves de
corral.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de preparación de una composición alimenticia tal
como se ha descrito anteriormente.
Según un modo particular de realización de la
invención, dicho procedimiento consiste en cultivar un organismo
hospedante según la invención o una bacteria del género
Acidocella, en concentrar dichos organismos hospedantes o
dichas bacterias mediante cualquier procedimiento de concentración
conocido por el experto en la materia, en particular la filtración
o la centrifugación, y después en incorporar dichos organismos
hospedantes o dichas bacterias concentrados en una composición
alimenticia. De manera preferida, cuando el procedimiento según la
invención utiliza una bacteria del género Acidocella, ésta es
una bacteria de la especie Acidocella aminolytica, en
particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o una bacteria
de la especie Acidocella facilis, en particular la cepa A.
facilis ATCC 35904.
Según otro modo particular de realización de la
invención, dicho procedimiento consiste en aislar un extracto
bacteriano según la invención mediante el procedimiento de
preparación de dicho extracto tal como se ha descrito
anteriormente, y después en incorporar el sobrenadante producido en
la etapa (e) de dicho procedimiento en una composición
alimenticia.
Según otro modo particular de realización de la
invención, dicho procedimiento consiste en preparar una fitasa
según la invención mediante uno de los procedimientos de preparación
de dicha fitasa tales como se han descrito anteriormente, y después
en incorporar dicha fitasa producida en una composición
alimenticia.
La presente invención se refiere asimismo a un
procedimiento para aumentar la asimilación del fosfato inorgánico
contenido en la fitasa de los alimentos a base de vegetales para los
animales monogástricos, caracterizado porque se incorpora una
fitasa o una composición enzimática según la invención en la
alimentación de dichos animales. De manera preferida, dicho
procedimiento se caracteriza porque se alimenta a dichos animales
monogástricos con una composición alimenticia según la
invención.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para disminuir la adición de fósforo en la
alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se
alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según la
invención.
La invención se refiere asimismo a un
procedimiento para disminuir las emisiones de fósforo procedentes de
la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque
se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según
la invención.
Los ejemplos siguientes permiten ilustrar la
presente invención, sin limitar por ello su alcance.
\vskip1.000000\baselineskip
Las bacterias del género Acidocella son
unas bacterias acidófilas de Gram negativo, que se desarrollan en
unos medios a pH ácido. A título de ejemplo, las bacterias de las
cepas A. aminolytica ATCC 51361 y A. facilis ATCC
35904 se pueden utilizar para realizar la presente invención. Estas
bacterias pueden ser cultivadas según un método similar. En
particular, se cultivan en condiciones aeróbicas a 30ºC y pH 4 en un
medio compuesto por peptona y por glucosa. Un medio de cultivo se
describe por ejemplo en Kishimoto y Tano (1987, J. Gen. Appl.
Microbiol. 33, 11-25). El medio utilizado para la
expresión de la fitasa está exento de fosfato inorgánico, y
suplementado con fitato (0,4%) y en CaCl_{2} (2,2 g/l).
\vskip1.000000\baselineskip
La medición de la actividad fitasa se lleva a
cabo en medio líquido. Se efectúa sobre unas muestras de cultivo
bacteriano o sobre unos extractos bacterianos según la invención, o
sobre unas fitasas según la invención. Se basa en el método de
Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8),
1266-1269). El principio de este método consiste en
medir la cantidad de fosfato inorgánico liberado durante la reacción
enzimática de la fitasa con su sustrato (disolución de fitato de
sodio al 1%). La cantidad de fosfato inorgánico liberado se mide
mediante la reacción de éste con un agente reactivo cromógeno (1
volumen de sulfato de hierro al 10,8%, mezclado extemporáneamente
con 4 volúmenes de amonio molibdato 0,012M H_{2}SO_{4}). Esta
reacción conduce, en medio muy ácido, a la formación de un complejo
de fosfomolibdato coloreado (en presencia de Fe^{2+}), y la
cantidad de complejo formado se cuantifica mediante la medición con
el espectrofotómetro de la absorbancia a 700 nm de la disolución
coloreada generada.
Dos reacciones distintas permiten la medición de
la actividad: una primera medición se efectúa en el momento de la
puesta en contacto de la muestra con el sustrato (tiempo T0) y una
segunda después de 60 minutos de incubación (tiempo T60). La
variación de la absorbancia entre los tiempos T0 y T60 (contra los
blancos respectivos constituidos por tampón en lugar de la muestra)
es proporcional a la cantidad de fosfato inorgánico liberado durante
la reacción enzimática.
Se realiza una gama patrón de referencia
mezclando 250 \mul de disolución de KH_{2}PO_{4} a las
concentraciones de 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM y 4 mM en el tampón
deseado con 250 \mul de TCA y revelando mediante 450 \mul de
agente reactivo cromógeno. Una unidad enzimática se define como la
cantidad de enzima que libera un micromol de fosfato inorgánico por
minuto (a temperatura y pH determinados).
\vskip1.000000\baselineskip
Después del cultivo, las bacterias del género
Acidocella se concentran mediante centrifugación durante 15
minutos a 5.000 g y 4ºC. El sobrenadante se elimina y las bacterias
así concentradas se resuspenden a continuación en un tampón
formiato (100 mM)-CaCl_{2} (1 mM) a pH 3,5 de
manera que se concentran aproximadamente 100 veces con relación a
su concentración inicial en el medio de cultivo. Las bacterias
concentradas se trituran a continuación con la ayuda de un aparato
"Cell disrupter" (Cell-d) utilizado a razón de
dos pasadas en un flujo de una presión de 2,5 kbar. Los triturados
bacterianos se centrifugan a continuación durante 15 minutos a
5.000 g y 4ºC y el sobrenadante, que constituye el extracto
bacteriano se recupera, y se mide su actividad fitasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de las fitasas según la invención
ha sido determinada a diferentes temperaturas. Los resultados de
estas mediciones se presentan para las bacterias Acidocella
aminolytica ATCC 51361 (figura 1), y Acidocella facilis
ATCC 35904 (figura 3). Las temperaturas óptimas de actividad son de
70ºC y 60ºC respectivamente para las bacterias Acidocella
aminolytica ATCC 51361 y Acidocella facilis ATCC
35904.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de las fitasas según la invención
ha sido determinada a diferentes pH. Los resultados de estas
mediciones se presentan para las bacterias Acidocella
aminolytica ATCC 51361 (figura 2), y Acidocella facilis
ATCC 35904 (figura 4). Los pH óptimos de actividad son de 4 y 3,5
respectivamente para las bacterias Acidocella aminolytica
ATCC 51361 y Acidocella facilis ATCC 35904.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células de una cepa bacteriana del género
Acidocella se centrifugan y después se lavan 3 veces en
tampón MES pH 6,5 (25 mM) que contiene 1 mM de CaCl_{2} con el fin
de eliminar el fitato del medio y el fosfato inorgánico (acumulado
durante el crecimiento). La suspensión celular así obtenida se rompe
después mediante "Cell disrupter" (1,5 kbar) y después se
reduce el pH hasta 5,5 (mediante la adición de ácido clorhídrico al
3,7%).
El extracto así obtenido se centrifuga a 20.000
g durante 1 hora. El sobrenadante se filtra a continuación sobre una
membrana de 0,45 \mum de porosidad.
\vskip1.000000\baselineskip
El sobrenadante se pasa sobre una columna de
tipo POROS 20 HQ (4,6/100 mm: 1,7 ml de gel). La elución se lleva a
cabo con un tampón MES pH 5,5 (25 mM) 1 mM de CaCl_{2}, 1M de
NaCl. La actividad fitasa (50% de la actividad inyectada) se
encuentra en la fracción del volumen muerto.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción recuperada al final de la
cromatografía de intercambio de aniones se lleva a 1,5 M
(NH_{4})_{2}SO_{4}. Esta disolución se deposita
entonces sobre una columna de tipo POROS 20 HP2 (HQ 4,6/100 mm: 1,7
ml de gel) previamente equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (25
mM), 1 mM de CaCl_{2}, 1,5 M de (NH_{4})_{2}SO_{4}.
Las proteínas se eluyen a continuación mediante un gradiente de 1,5
a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en 20 volúmenes de
columna.
La actividad fitasa se eluye a 0,95 M de
(NH_{4})_{2}SO_{4} en 3 fracciones de 2 ml. Estas
fracciones se reúnen y después se dializan contra 5 litros de tampón
MES pH 5,5 (20 mM), 1 mM de CaCl_{2} a 4ºC durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
La disolución dializada se inyecta sobre una
columna de tipo POROS 20 HS (4,6/100 mm: 1,7 ml de gel) previamente
equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (20 mM), 1 mM de CaCl_{2}.
Las proteínas se eluyen mediante un gradiente NaCl de 0 a 1 M en 20
volúmenes de columnas.
La proteína con actividad fitasa se eluye a una
concentración en NaCl de 0,35 M.
\vskip1.000000\baselineskip
Las fracciones obtenidas durante la etapa
anterior han sido reunidas, concentradas y depositadas sobre una
columna SUPEROSE 12 HR 10/30 (24 ml, Pharmacia®) previamente
equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (25 mM), 1 mM de CaCl_{2},
0,1 M de NaCl. Las proteínas han sido eluidas con 24 ml del tampón a
un caudal de 0,5 ml/minuto. Se han recogido unas fracciones de 0,5
ml. La actividad fitasa se detecta en tres fracciones entre 14 y 15
ml de tampón de elución (tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Las tres fracciones que presentan una actividad
fitasa han sido concentradas y depositadas sobre un gel
SDS-PAGE de 14,4%. Este gel revela una banda
principal de aproximadamente 63 kDa.
\vskip1.000000\baselineskip
La banda de interés (a aproximadamente 63 kDa)
ha sido cortada directamente sobre el gel de poliacrilamida. El
colorante contenido en el gel se retira parcialmente mediante 2
lavados en 50% de acetonitrilo/50 mM de Tris-HCl pH
8,6. La proteína, en gel de poliacrilamida, se digiere en 400 \mul
de tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,6/0,03% de SDS a 35ºC
durante 18 horas en presencia de 0,4 \mug de
endolisina-C (Sequencing grade de Roche).
Los péptidos obtenidos se separan mediante HPLC
sobre una columna en línea de DEAE-C18 de 2,1 mm de
diámetro. El gradiente de separación es un gradiente de 2 a 45% de
acetonitrilo/TFA al 0,1%.
Cuatro péptidos han sido purificados, y después
secuenciados mediante el método de Edman con la ayuda de un
secuenciador Applied Biosystems 473A.
En base a las secuencias de los péptidos
internos, se han sintetizados varios oligonucleótidos degenerados
con el fin de amplificar por PCR un fragmento del gen de
interés.
- Oligo 10:
- ATDATDATNGCNGTRTTYTT
- Oligo 12:
- TCRTCRTASGTGATGATGATSGCSGTRTTYTT
- Oligo 22:
- AARATGGARGGNCARAAYATHGG
- Oligo 23:
- ATGGAAGGCCAGAAYATCGGCGA
- Oligo 25:
- ATCGGCGAYCTBCTBAAYGCCAA
\vskip1.000000\baselineskip
Se han ensayado unas combinaciones de cebadores
Oligo 10 y Oligo 12 con los tres cebadores Oligo 22, 23 y 25, y el
par de cebadores Oligo 12 y Oligo 22 ha permitido aislar el
fragmento de 500 pb a partir del ADN genómico de una cepa del
género Acidocella. Después de la purificación, se ha
secuenciado este fragmento de ADN.
El análisis de esta secuencia ha permitido
demostrar en este fragmento una secuencia nucleica que codifica para
el péptido 1, lo que sugiere que el producto PCR secuenciado
corresponde efectivamente a la proteína de interés que ha sido
objeto de la microsecuenciación.
En base a la secuencia obtenida a partir del
producto PCR de aproximadamente 500 pb, se han definido nuevos
cebadores Oligo 29 y Oligo 30 con el fin de disponer de un juego de
cebadores específicos no degenerados del gen de interés.
- Oligo 29:
- TTCATGGGTGGCTTCGATC
- Oligo 30:
- GCTGCCGCATCAGGAAGTTG
\vskip1.000000\baselineskip
El producto PCR de aproximadamente 500 pb
obtenido mediante amplificación con los cebadores Oligo 12 y Oligo
22 se ha utilizado como sonda en unos experimentos de transferencia
Southern.
Con el fin de marcar la sonda, se han marcado 10
ng de producto PCR mediante "random priming" con la ayuda del
kit Labelling Q-BIOgene.
Se han digerido 10 \mug de ADN genómico
respectivamente por EcoRI, SacII o BamHI y
después se han depositado sobre un gel de agarosa al 1%. Después de
la migración, el ADN ha sido transferido por capilaridad sobre una
membrana de nylon (BIODYNE® Plus membrane, Pall Gelman).
Se ha efectuado una
pre-hibridación durante 4 h a 60ºC con un tampón 5x
SSC, 5x Dehardt, 1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de
pescado.
La hibridación se lleva a cabo a continuación
durante 16 h a 60ºC con un tampón que contiene 10 ml de tampón de
pre-hibridación y 10 ng de la sonda a 4,08 10^{8}
cpm/\mug (recuento con contador de centelleos en seco, es decir,
en ausencia de centelleo).
Después, se han realizado varias fases de
lavado:
- 2 lavados: 2x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC
- 2 lavados: 0,5x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC
- 2 lavados: 0,4x SCC + 0,1% SDS durante 15 minutos a 50ºC
\vskip1.000000\baselineskip
El gel ha sido revelado sobre película después
de una exposición de 24 h a -80ºC.
Estos experimentos han permitido mostrar que
SacII corta en la porción del gen utilizada como sonda, pero
que no existe ningún sitio EcoRI ni BamHI en esta
secuencia. Las digestiones EcoRI y BamHI liberan
respectivamente un fragmento de aproximadamente 4 kb y un fragmento
de tamaño superior a 9 kb sobre los cuales se hibrida la secuencia
diana.
Sabiendo, en base a estudios bioquímicos, que la
proteína de interés debe ser codificada por un gen de
aproximadamente 1,6 kb, se ha construido un banco de ADN genómico
por digestión total EcoRI.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 30 \mug de ADN genómico de una
cepa del género Acidocella han sido digeridos por
EcoRI. Después de la migración sobre gel de agarosa al 0,7%,
los fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 3 y 4 kb han sido
purificados con la ayuda del kit QIAEX II gel extraction kit
(Qiagen) y desalados (microbio spin 6, Biorad). Se han purificado
asimismo los fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 2,5 y 3
kb así como aquéllos cuyo tamaño está comprendido entre 4 y 5
kb.
Los fragmentos purificados han sido insertados
en un vector pBlueScript KS (II+) con la ayuda de la T4 DNA ligase
(QBIOgene). Los productos de la ligación realizada con los
fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 3 y 4 kb han sido
utilizados para transformar la cepa MC 1061 de E. coli
mediante electroporación. Después de la transformación, las células
se recogen en SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura,
0,05% de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl_{2}, 20 mM de glucosa)
y se disponen durante 1 hora a 37ºC antes de ser extendidas sobre
un medio LB suplementado con ampicilina (100 \mug/ml). Las cajas
de Petri se incuban entonces durante una noche a 37ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se han cribado entonces 383 colonias distintas
mediante PCR utilizando el juego de cebadores Oligo 29 y Oligo
39.
De estos clones, 4 han permitido la obtención de
un producto PCR de aproximadamente 400 pb. Dos de los clones que
permiten la amplificación de un fragmento de tamaño esperado se han
utilizado para realizar una mini-preparación de
plásmido (con la ayuda del kit Qiagen).
\vskip1.000000\baselineskip
Los dos plásmidos identificados han sido
digeridos por EcoRI y EcoRV. La secuenciación de sus
insertos ha mostrado que estos dos plásmidos tenían el mismo
inserto. El análisis de las secuencias ha permitido demostrar una
fase abierta de lectura de 1.665 pb que corresponde a una proteína
de 554 aminoácidos. Además, las secuencias que codifican los 4
péptidos internos secuenciados en el ejemplo 6 han sido encontradas
en esta fase de lectura.
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia que contiene la fase abierta de
lectura (denominada ORF281) identificada en el inserto genómico
clonado en el ejemplo 7 ha sido amplificada por PCR con los
oligonucleótidos 5'ORF281 y 3'ORF281.
- 5'ORF281
- 5' TAA CGA TAA \underline{CAT \ ATG} AAT ATC CGC CGG GCT CT 3'
- 3'ORF281
- 5' ATA TCT GAT \underline{AAG \ CTT} TTA TTC GGC GTG CGC GGC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
El producto PCR ha sido purificado y digerido
por las enzimas de restricción NdeI e HindIII y
después sub-clonado en el vector pETCm digerido por
las mismas enzimas. El vector obtenido se denomina pETCm281. El
inserto ORF281 ha sido secuenciado con el fin de verificar que la
secuencia clonada es idéntica a la determinada a partir de los
insertos genómicos previamente clonados.
El vector pETCm comprende un gen de resistencia
al cloramfenicol. Su utilización, y por lo tanto la de la
resistencia al cloramfenicol como marcador de selección, permite la
expresión in vivo en una cepa de E. coli resistente a
la kanamicina: la cepa BL21 appA (fitasa-).
\vskip1.000000\baselineskip
Se han realizado unos ensayos de expresión in
vivo en la cepa E. coli BL21 appA. Esta cepa ya no
expresa ninguna fitasa endógena debido a una inserción de un gen de
resistencia a la kanamicina en el gen appA que codifica para
la fitasa de E. coli. Un vector de control ha sido preparado
asimismo con el gen TEM que codifica la
\beta-lactamasa de E. coli. El gen TEM ha
sido clonado asimismo en el vector pETCm, y el vector obtenido ha
sido denominado pETCmTEM.
La cepa de E. coli BL21 appA ha
sido transformada por los vectores pETCmTEM o pETCm281. Se han
seleccionado unas colonias aisladas sobre medio LB adicionado con 60
mg/l de kanamicina y con 20 mg/l de cloramfenicol. Una colonia de
cada tipo ha sido cultivada en un medio LB adicionado con kanamicina
y con cloramfenicol a las mismas concentraciones. Estos cultivos han
sido utilizados para preparar unas reservas gliceroladas (un volumen
de células para un volumen de glicerol de 40%) a partir de las
cuales se inoculan los cultivos destinados a realizar los ensayos de
expresión. Estas reservas gliceroladas se conservan a -80ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa E. coli BL21 appA pETCm281
ha sido cultivada en medio M98 (medio Terrific Broth modificado
(con glucosa) que contiene, para 1 litro, 12 g de Bacto Tryptone, 24
g de extracto de levadura, 9,4 g de K_{2}HPO_{4}, y 2,2 g de
KH_{2}PO_{4}, pH 7,2, autoclavado, a los que se añaden 20 ml de
glucosa (50%) por litro de media antes de la utilización) en
paralelo con la cepa E. coli BL21 appA pETCmTEM. La
expresión se induce mediante la adición de 0,25 mM de IPTG, y se
realiza a dos temperaturas: 30 y 37ºC.
Después de 3 horas de inducción, los cultivos se
centrifugan. La actividad fitasa se determina sobre cada residuo
resuspendido en tampón formiato para alcanzar una concentración
final de 5 mg/ml de células secas. No se ha encontrado ninguna
actividad para la cepa que contiene pETCm281 así como la cepa que
contiene pETCmTEM, sean cuales sean las condiciones de cultivo.
Unas alícuotas de residuos de los cultivos
inducidos y no inducidos que contienen pETCm281 han sido tratadas
entonces con ultrasonidos y después centrifugadas. El sobrenadante
representa la fracción de las proteínas solubles y el residuo las
proteínas insolubles.
Estas dos fracciones han sido depositadas sobre
gel desnaturalizante SDS-PAGE.
Aparece claramente una banda proteica de PM 63
kDa en la fracción insoluble de la cepa E. coli BL21
appA pETCm281 inducida con el IPTG. No se encuentra ninguna
banda correspondiente en el control negativo no inducido. La ORF281
está por lo tanto bien expresada en E. coli. Sin embargo, la
proteína correspondiente es insoluble y aparentemente inactiva en
esta forma.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ha realizado una serie de etapas que tienen
como objetivo solubilizar y después renaturalizar la proteína
codificada por ORF281 con el fin de determinar si esta proteína
posee o no una actividad fitasa.
La cepa E. coli BL21 appA pETCm281
se cultiva en medio M98 y después se induce con 0,25 mM de IPTG
cuando la DO a 600 nm alcanza 0,4. Después de 3 horas de inducción,
el cultivo se centrifuga (DO final alrededor de 1). El residuo se
recoge en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 a razón de 4
ml para 100 ml de cultivo. Las células se tratan con ultrasonidos a
4ºC: 4 ciclos de 10 segundos a una potencia de 500 Vatios. La
DO_{600} pasa de 14 a 3. La suspensión se centrifuga a
continuación durante 10 minutos a 16.000 g, y después se elimina el
sobrenadante.
El residuo se resuspende en 5 ml para 100 ml de
cultivo de tampón de solubilización: Tris-HCl 20 mM
pH 8, urea 8M, NaCl 0,5 M, 2-mercaptoetanol 1 mM.
La suspensión se trata con ultrasonidos a razón de 4 ciclos de 10
segundos a una potencia de 500 Vatios, y después se agita durante 1
hora a temperatura ambiente. Después, se dializan 30 ml de esta
suspensión a 4ºC durante 16 horas contra 3 litros de tampón de
renaturalización. MES 25 mM pH 6,5, 0,5 M NaCl, 1 mM Mercaptoetanol
(Cutt-off 10 kDa). Se realiza una segunda diálisis
contra 3 litros de tampón de renaturalización MES 25 mM pH 5,5, 0,5
M NaCl, 1 mM Mercaptoetanol (Cutt-off 10 kDa)
durante 5 horas. Después, la suspensión se centrifuga durante 10
minutos a 16.000 g y se conserva a 4ºC antes de la dosificación
enzimática.
El mismo protocolo de cultivo, de solubilización
y de renaturalización ha sido aplicado a la cepa E. coli BL21
appA pETCmTEM.
\vskip1.000000\baselineskip
Las suspensiones de las proteínas
renaturalizadas producidas por las cepas E. coli BL21
appA pETCm281 y pETCmTEM han sido concentradas 10 veces sobre
Nanosep^{TM} 10K Omega (Pall). La actividad fitasa se mide sobre
estas disoluciones concentradas según un protocolo estándar (a pH
3,5). Este ensayo se ha realizado por duplicado.
Sólo se detecta una actividad fitasa en la cepa
E. coli BL21 appA pETCm281. Esta actividad se confirma
mediante una dosificación pMUF. Utilizando este método
fluorométrico, no se detecta ninguna actividad en la cepa E.
coli BL21 appA pETCmTEM, a pesar de que esta dosificación
es cinco veces más sensible que el método colorimétrico utilizado
generalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
La fracción resolubilizada de los cuerpos de
inclusión de la cepa E. coli BL21 appA pETCm281 ha
sido depositada sobre una columna POROS 20 HS (4,6/100 mm: 1,7 ml de
gel) previamente equilibrada con un tampón 20 mM MES pH 5,5, 1 mM de
CaCl_{2}. Las proteínas se eluyen mediante un gradiente NaCl de 0
a 1 M en 20 volúmenes de columnas.
La actividad fitasa se eluye a una concentración
en NaCl de 0,35 M. Este resultado es en todos los puntos idéntico al
obtenido en el ejemplo 5.4. con la fitasa nativa.
En paralelo, un extracto total (proteínas
solubles e insolubles) de E. coli BL21 appA pETCmTEM
ha sido depositado sobre la misma columna, y las proteínas han sido
eluidas en las mismas condiciones. No se ha podido detectar ninguna
actividad fitasa en las fracciones eluidas entre 0,15 y 0,45 M
NaCl.
\newpage
La fracción que presenta una actividad fitasa,
procedente de la columna intercambiadora de cationes, ha sido
depositada sobre un gel SDS-PAGE (10% de acrilamida)
después de la concentración de un factor 10 sobre Nanosep^{TM}. En
el mismo gel, se ha depositado asimismo un lisado de células
(inducidas con el IPTG) de E. coli BL21 appA pETCm281
y E. coli BL21 appA pETCmTEM.
Aparece también claramente que sólo el lisado de
E. coli BL21 appA pETCm281 contiene una banda de PM 63
kDa. En la fracción purificada sobre columna y que presenta una
actividad fitasa, una banda de PM 61-63 kDa está
presente y es mayoritaria.
Estos resultados muestran por lo tanto, después
de la sub-clonación en E. coli BL21
appA, que la ORF281 codifica bien para una fitasa.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la fitasa contenida en la
fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 se
ha determinado a diferentes temperaturas. Los resultados de estas
mediciones se presentan en la figura 5. La temperatura óptima de
actividad medida es de 60ºC. La dosificación ha sido realizada a pH
3.
\vskip1.000000\baselineskip
La actividad de la fitasa contenida en la
fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 se
ha determinado asimismo a diferentes pH. Los resultados de estas
mediciones se presentan en la figura 5. El pH óptimo de actividad es
de 3,5. La dosificación se ha realizado a 60ºC con la sucesión de
tampones siguientes: Glicina-HCl (para los pH de 2 a
2,5), Formiato (pH de 2,5 a 4), Acetato (pH de 4 a 5), y MES (pH de
5 a 6).
\vskip1.000000\baselineskip
La secuencia que contiene la fase abierta de
lectura identificada en el fragmento genómico clonado en el ejemplo
7 ha sido utilizada como sonda para buscar unas secuencias homólogas
entre los microorganismos de los géneros Acidocella y
Acidiphilium.
Las cepas ensayadas pertenecen a las especies
Acidocella aminolytica, Acidocella facilis, Acidiphilium
angustrum, y Acidiphilium multivorum.
Se han marcado 10 ng de producto PCR purificado
mediante "random priming" con la ayuda del kit Labelling
Q-BlOgene. Se han digerido 10 \mug de ADN genómico
de las diferentes cepas a ensayar respectivamente mediante
EcoRI o EcoRV y después se han depositado sobre dos
geles de agarosa 1%. Después de la migración, se ha transferido el
ADN por capilaridad sobre dos membranas de nylon (BIODYNE® Plus
membrane, Pall Gelman).
Se ha llevado a cabo una
pre-hibridación durante 4 h a 60ºC con un tampón 5x
SSC, 5x Dehardt, 1% SDS, 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de
pescado.
La hibridación se realiza a continuación durante
16 h a 60ºC con un tampón que contiene 10 ml de tampón de
pre-hibridación y 10 ng de la sonda a
respectivamente 7.10^{8} y 9.10^{8} cpm/\mug para la membrana
1 (EcoRI) y la membrana 2 (EcoRV) (recuento con contador de
centelleos en seco, es decir, en ausencia de centelleo).
Se han realizado a continuación varias fases de
lavado:
- 2 lavados: 2x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC
- 2 lavados: 0,5x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC
- 2 lavados: 0,4x SCC + 0,1% SDS durante 15 minutos a 50ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Las membranas han sido reveladas sobre película
después de una exposición de 65 h a -80ºC.
No se ha observado ninguna diferencia
significativa entre las dos autorradiografías.
Los resultados muestran la presencia, en todas
las cepas del género Acidocella ensayadas, de una hibridación
selectiva de la sonda que contiene la fase abierta de lectura
identificada en el ejemplo 7. Estos resultados sugieren que existe
una homología de secuencia significativa entre unos genes de
bacterias del género Acidocella y la fase abierta de lectura
identificada que codifica para una fitasa. Además, sugieren en gran
medida que estos genes codifican asimismo para unas fitasas.
A la inversa, no se ha obtenido ninguna
hibridación con la sonda en el seno de los microorganismos del
género Acidiphilum. Esta observación está de acuerdo con la
ausencia de detección de una actividad fitasa mediante unos métodos
microbiológicos en los microorganismos de este género.
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Aventis Animal Nutrition SA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nuevas fitasas bacterianas y
procedimiento de producción de estas fitasas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PM 00080
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 0014448
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-11-10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1665
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g. Acidocella
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1665)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 554
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> g. Acidocella
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatdatdatng cngtrttytt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcrtcrtasg tgatgatgat sgcsgtrtty tt
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaaratggarg gncaraayat hgg
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatggaaggcc agaayatcgg cga
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatcggcgayc tbctbaaygc caa
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttcatgggtg gcttcgatc
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Oligo30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgctgccgcat caggaagttg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: 5'ORF281
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptaacgataac atatgaatat ccgccgggct ct
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: 3'ORF281
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatatctgata agcttttatt cggcgtgcgc ggc
\hfill33
Claims (47)
1. Polinucleótido aislado que codifica para una
fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo
constituido por:
- (a)
- un polinucleótido aislado que codifica para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2
- (b)
- un polinucleótido aislado que se hibrida al polinucleótido según (a) en unas condiciones astringentes
- (c)
- un polinucleótido aislado que presenta por lo menos 70% de identidad con el polinucleótido según (a)
- presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polinucleótido según la reivindicación 1,
caracterizado porque está representado por el identificador
de secuencia SEC ID nº 1.
3. Polinucleótido según una de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque procede de una
bacteria del género Acidocella.
4. Polinucleótido aislado que comprende un
polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Fitasa caracterizada porque está
codificada por un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1
a 4, presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o
igual a 4.
6. Fitasa según la reivindicación 5,
caracterizada porque se selecciona de entre el grupo
constituido por:
- (a)
- la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2
- (b)
- una fitasa que presenta por lo menos 70% de identidad con la fitasa según (a)
- (c)
- un fragmento biológicamente activo de una fitasa según (a) o (b).
\vskip1.000000\baselineskip
7. Fitasa según una de las reivindicaciones 5 ó
6, caracterizada porque procede de una bacteria del género
Acidocella.
8. Gen quimérico que comprende por lo menos,
unidos entre sí de manera operativa:
- (a)
- un promotor funcional en un organismo hospedante
- (b)
- un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4
- (c)
- un elemento terminador funcional en un organismo hospedante.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Gen quimérico según la reivindicación 8,
caracterizado porque comprende, además, un péptido señal o un
péptido de tránsito funcional en dicho organismo hospedante.
10. Vector de expresión o de transformación que
contiene un gen quimérico según una de las reivindicaciones 8 ó
9.
11. Vector según la reivindicación 10,
caracterizado porque es un plásmido, un fago o un virus.
12. Organismo hospedante transformado que
contiene un vector según la reivindicación 10.
13. Organismo hospedante según la reivindicación
12, caracterizado porque se trata de un microorganismo.
14. Organismo hospedante según la reivindicación
13, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de
entre las bacterias, los hongos, las levaduras o los virus.
15. Organismo hospedante según la reivindicación
14, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria
seleccionada de entre los géneros Corynebacterium,
Streptomyces y Escherichia, en particular E.
coli.
16. Organismo hospedante según la reivindicación
14, caracterizado porque el microorganismo es un hongo
seleccionado de entre los géneros Penicillium, Aspergillus,
Chrysosporium y Trichoderma.
17. Organismo hospedante según la reivindicación
14, caracterizado porque el microorganismo es una levadura
seleccionada de entre los géneros Saccharomyces,
Kluyveromyces y Pichia.
18. Organismo hospedante según la reivindicación
12, caracterizado porque se trata de una célula vegetal, de
una planta o de una parte de planta.
19. Extracto bacteriano que comprende por lo
menos una actividad fitasa, caracterizado porque procede de
una bacteria del género Acidocella y cuyo pH óptimo de
actividad de dicha actividad fitasa es inferior o igual a 4.
20. Extracto bacteriano según la reivindicación
19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las
propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 70ºC
- (b)
- pH óptimo = 4.
\vskip1.000000\baselineskip
21. Extracto bacteriano según la reivindicación
19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las
propiedades siguientes:
- (a)
- temperatura óptima = 60ºC
- (b)
- pH óptimo = 3,5.
\vskip1.000000\baselineskip
22. Procedimiento de preparación de un extracto
bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d).
\vskip1.000000\baselineskip
23. Procedimiento de producción de una fitasa
según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e).
\vskip1.000000\baselineskip
24. Procedimiento de producción de una fitasa
según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- recuperar el medio de cultivo mediante eliminación de las bacterias
- (c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (d).
\newpage
25. Procedimiento de producción de una fitasa
según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18
- (b)
- concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)
- (c)
- triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e).
\vskip1.000000\baselineskip
26. Procedimiento de producción de una fitasa
según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18
- (b)
- recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de dicho organismo hospedante transformado
- (c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (b).
\vskip1.000000\baselineskip
27. Composición enzimática, caracterizada
porque comprende por lo menos un extracto bacteriano según una de
las reivindicaciones 19 a 21.
28. Composición enzimática, caracterizada
porque comprende por lo menos una fitasa según una de las
reivindicaciones 5 a 7.
29. Composición alimenticia,
caracterizada porque comprende por lo menos un organismo
hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a
18.
30. Composición alimenticia,
caracterizada porque comprende por lo menos una bacteria del
género Acidocella que expresa una fitasa según una de las
reivindicaciones 5 a 7.
31. Composición alimenticia según la
reivindicación 30, caracterizada porque la bacteria se
selecciona de entre las especies Acidocella aminolytica y
Acidocella facilis.
32. Composición alimenticia,
caracterizada porque comprende por lo menos un extracto
bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21.
33. Composición alimenticia,
caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa según
una de las reivindicaciones 5 a 7.
34. Utilización de una composición alimenticia
según una de las reivindicaciones 29 a 33, para la alimentación de
los animales monogástricos.
35. Utilización de una composición alimenticia
según la reivindicación 34, caracterizada porque está
destinada a la alimentación de los cerdos.
36. Utilización de una composición alimenticia
según la reivindicación 34, caracterizada porque está
destinada a la alimentación de las aves de corral.
37. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 33,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 12 a 18
- (b)
- concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)
- (c)
- incorporar el organismo hospedante aislado en la etapa (b) en dicha composición alimenticia.
\newpage
38. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según una de las reivindicaciones 30 ó 31,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- incorporar las bacterias aisladas en la etapa (b) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
39. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 32,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- incorporar el sobrenadante recuperado en la etapa (e) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
40. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 33,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)
- (c)
- triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e)
- (g)
- incorporar la fitasa purificada en la etapa (f) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
41. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 33,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella
- (b)
- recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de las bacterias
- (c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (b)
- (d)
- incorporar la fitasa purificada en la etapa (c) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
42. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 33,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18
- (b)
- concentrar el organismo hospedante transformado cultivado en la etapa (a)
- (c)
- triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)
- (d)
- centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)
- (e)
- recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)
- (f)
- purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e)
- (g)
- incorporar la fitasa purificada en la etapa (f) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
43. Procedimiento de preparación de una
composición alimenticia según la reivindicación 33,
caracterizado porque comprende las etapas siguientes:
- (a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18
- (b)
- recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de dicho organismo hospedante transformado
- (c)
- purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (b)
- (d)
- incorporar la fitasa purificada en la etapa (c) en dicha composición alimenticia.
\vskip1.000000\baselineskip
44. Procedimiento para aumentar la asimilación
del fosfato inorgánico contenido en el ácido fítico de los alimentos
a base de vegetales por los animales monogástricos,
caracterizado porque se incorpora una fitasa según una de las
reivindicaciones 5 a 7 o una composición enzimática según una de las
reivindicaciones 27 y 28 en la alimentación de dichos animales.
45. Procedimiento según la reivindicación 44,
caracterizado porque se alimenta a dichos animales
monogástricos con una composición alimenticia según una de las
reivindicaciones 29 a 33.
46. Procedimiento para disminuir la adición de
fósforo en la alimentación de los animales monogástricos,
caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una
composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a
33.
47. Procedimiento para disminuir las emisiones
de fósforo procedentes de la alimentación de los animales
monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos
animales con una composición alimenticia según una de las
reivindicaciones 29 a 33.
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