ES2343884T3

ES2343884T3 - Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de preparacion de dichas fitasas.

Info

Publication number: ES2343884T3
Application number: ES01993689T
Authority: ES
Inventors: Gilles Ravot
Original assignee: Adisseo France SAS
Current assignee: Adisseo France SAS
Priority date: 2000-11-10
Filing date: 2001-11-12
Publication date: 2010-08-12
Anticipated expiration: 2021-11-12
Also published as: JP4149260B2; BR0115277A; FR2816632B1; DK1332217T3; AU2002218359A1; CN100485039C; WO2002038774A2; EP1332217B1; US7563878B2; EP1332217A2; FR2816632A1; US20040096850A1; WO2002038774A3; US20090274792A1; CN1529755A; DE60141911D1; ATE465263T1; JP2004513635A

Abstract

Polinucleótido aislado que codifica para una fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por: (a) un polinucleótido aislado que codifica para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 (b) un polinucleótido aislado que se hibrida al polinucleótido según (a) en unas condiciones astringentes (c) un polinucleótido aislado que presenta por lo menos 70% de identidad con el polinucleótido según (a) presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.

Description

Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de preparación de dichas fitasas.

La presente invención se refiere a nuevas fitasas de origen bacteriano, así como a sus procedimientos de preparación respectivos. La presente invención se refiere más particularmente a nuevas fitasas procedentes de bacterias del género Acidocella, así como a los polinucleótidos que codifican para estas fitasas. La invención se refiere asimismo a unos vectores que contienen estos polinucleótidos, y a unos organismos hospedantes transformados que expresan dichas fitasas en sus tejidos. La invención se refiere asimismo a nuevos extractos bacterianos que comprenden por lo menos una actividad fitasa.

En particular, los extractos bacterianos y las fitasas de la presente invención están particularmente adaptados a su utilización en unas composiciones alimenticias destinadas a la alimentación animal. Esta adaptación está relacionada con sus propiedades, en particular su actividad en unas condiciones de temperatura y de pH que corresponden a las condiciones de preparación de dichas composiciones así como las encontradas en el sistema digestivo de los
animales.

El fósforo es un elemento esencial para la vida de todos los organismos. En particular, es primordial para los criadores de animales de granja asegurarse que sus animales ingieren una cantidad suficiente para optimizar su crecimiento y su desarrollo. La mayoría de los animales de granja son alimentados con unas composiciones alimenticias a base de vegetales. Estos vegetales contienen grandes cantidades de fosfato que almacenan en sus tejidos en forma de un compuesto de reserva, el ácido fítico. Como media, el ácido fítico contiene de 50 a 70% del fósforo presente en las plantas. El ácido fítico está naturalmente movilizado y el fosfato que contiene se libera en la mayoría de los animales de granja, en particular los rumiantes. Sin embargo, el ácido fítico no es metabolizado por los animales monogástricos tales como el cerdo y las aves de corral. En estos animales, el ácido fítico contenido en su ración alimenticia es por lo tanto evacuado con los excrementos, y el criador debe completar dicha ración con fosfato inorgánico con el fin de que sus animales ingieran una cantidad suficiente de fósforo. Esta estrategia genera un sobrecoste para el criador y una contaminación procedente de la emisión en el medioambiente del ácido fítico no asimilado. Esta contaminación es aún más importante en las zonas de cría intensa.

El ácido fítico es conocido asimismo por ser un quelante de elementos nutritivos importantes contenidos en la ración alimenticia, como, por ejemplo, el magnesio, el calcio, el zinc o el hierro. Esta propiedad conduce a una disminución de la calidad nutritiva de la ración alimenticia que da al ácido fítico la propiedad de agente anti-nutricional.

Con el fin de responder a los diferentes inconvenientes relacionados con la ausencia de asimilación del ácido fítico por los animales monogástricos, se ha previsto introducir una enzima, la fitasa, en la ración alimenticia de estos animales de cría. La fitasa hidroliza el ácido fítico liberando inositol y fosfato inorgánico. Unas fitasas y los genes que codifican estas fitasas han sido aislados a partir de numerosos organismos. Las fitasas han sido mayoritariamente aisladas a partir de hongos (Howson y Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382; Wyss et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65(2), 359-366). Entre los hongos que producen una fitasa, se pueden citar los hongos del género Aspergillus, en particular A. ficuum (Ullah y Gibson, 1987, Preparative Biochemistry 17(1), 63-91; Ullah y Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun., 192(2), 747-753), A. terreus (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), A. niger (Dvorakova et al., 1997, Folia Microbiol (Praha), 42(4), 349-352), A. fumigatus (Pasamontes et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63(5), 1696-1700), del género Penicillium, en particular P. caseicolum, del género Myceliophtora, en particular M. thermophila (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), del género Talaromyces, en particular T. thermophilus, del género Neurospora, en particular N. crassa y N. sitophila, del género Thermomyces, en particular T. lanuginosus (Berka et al., 1998, Appl Environ Microbiol. 64(11), 4423-4427), o del género Monascus, en particular M. anka. Asimismo, se han encontrado unas fitasas en unas bacterias. A título de ejemplo, se pueden citar las bacterias de los géneros Bacillus, en particular B. subtilis (Powar y Jagannathan, 1982, J. Bacteriol. 151(3), 102-1108; Shimizu, 1992, Biosci. Biotech. Biocem. 56(8), 1266-1269; Keruvo et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085), Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Austral. J. Biol. Sci. 23, 1207-1220), Escherichia, en particular E. coli (Golovan et al., 2000, Can. J. Microbiol. 46, 59-71), Enterobacter (Yoon et al., 1996, Enzyme and microbiol. Technol; 18, 449-454), o Streptomyces. Se han aislado asimismo unas fitasas de levaduras (Dvorakova, 1998, Folia Microbiol. 43(4), 323-338), como las de las levaduras Schwaniiomyces occidentalis y Saccharomyces cerevisiae. Por último, se han encontrado unas fitasas en las plantas, en particular en la soja (Ullah y Gibson, 1988, Arch. Biochem. Biophys., 260(2), 514-20), en el maíz (Maugenest et al., 1997, Biochem J., 322 (Pt 2), 511-7); Maugenest et al., 1999, Plant Mol. Biol., 39(3), 503-14), o en Arabidopsis (Mullaney y Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 251(1), 252-5).

Entre las propiedades que permiten caracterizar las fitasas, se encuentra la constante de Michaelis (Km) frente al ácido fítico, el pH óptimo y la temperatura óptima de actividad, así como la estabilidad de esta actividad a pH y temperaturas determinados. Unos datos relativos a la estructura de las fitasas pueden ser útiles asimismo, tales como el peso molecular (PM), el punto isoeléctrico (pl), o la secuencia peptídica. Para que se puedan utilizar en la alimentación animal, las fitasas deben poseer unas propiedades compatibles con los tratamientos que sufren los alimentos destinados a esta alimentación. En particular, la actividad de las fitasas utilizadas debe mantenerse y si es posible, ser óptima en las condiciones de temperatura y de pH de los procedimientos de preparación de estos alimentos así como en las presentes en el tracto digestivo de los animales que ingieren estos alimentos. Estas obligaciones conducen principalmente a buscar unas fitasas cuya actividad resiste a unas condiciones de temperatura elevada, tales como las utilizadas en los procedimientos de preparación de las composiciones alimenticias, y a unas condiciones de pH ácido, tales como las presentes en el tracto digestivo de los animales de cría.

Con el fin de responder a estos criterios, se han buscado unas fitasas en unos organismos, en particular unos microorganismos, que se desarrollan en unos medios cuyas condiciones de temperatura y de pH corresponden a estos criterios. Esta estrategia ha permitido aislar unas fitasas resistentes a unas temperaturas elevadas, tales como, por ejemplo, las descritas en las solicitudes de patente WO 97/305016 o EP 0 684 313, pero también unas fitasas que poseen un bajo Km, tales como, por ejemplo las descritas en la solicitud de patente EP 0 960 934. Otra estrategia consistió en modificar artificialmente la secuencia de fitasas conocidas mediante mutagénesis dirigida con el fin de conferirle unas propiedades interesantes. Esta estrategia se ha descrito en particular en las solicitudes de patente WO 99/48380, EP 0 897 985 y EP 0 897 010.

Sólo se han identificado algunas fitasas activas a un bajo pH óptimo. Dichas fitasas han sido identificadas en particular en los hongos, tales como la fitasa de Penicillium caseicolum descrita en la solicitud de patente JP 7067635 y la de Monascus anka descrita en la solicitud de patente WO 98/13480, pero también en las levaduras, como la fitasa de Schwaniiomyces occidentalis descrita en la solicitud de patente EP 699 762. Sin embargo, hasta ahora, ninguna bacteria ha conducido al aislamiento y a la identificación de una fitasa que posee un óptimo de pH bajo, en particular un pH óptimo inferior a 4.

Descripción de las figuras

Figura 1: Actividad de la fitasa de Acidocella aminolytica ATCC 51361 en función de la temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para una temperatura determinada.

Figura 2: Actividad de la fitasa de Acidocella aminolytica ATCC 51361 en función del pH. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para un pH determinado.

Figura 3: Actividad de la fitasa Acidocella facilis ATCC 35904 en función de la temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para una temperatura determinada.

Figura 4: Actividad de la fitasa Acidocella facilis ATCC 35904 en función del pH. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para un pH determinado.

Figura 5: Actividad de la fitasa contenida en la fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 en función de la temperatura. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para una temperatura determinada.

Figura 6: Actividad de la fitasa contenida en la fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 en función del pH. El valor de 100% de la actividad relativa corresponde a la actividad óptima de la fitasa para un pH dado.

Descripción

La presente invención se refiere a unos polinucleótidos aislados que codifican para una fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Esta fitasa y los polinucleótidos que la codifican están asimismo caracterizados porque proceden de una cepa bacteriana del género Acidocella.

Según la presente invención, por el término "polinucleótido", se entiende una molécula de ácido nucleico compuesta por una secuencia de bases, natural o artificial, que puede ser de tipo ADN o ARN, preferentemente de tipo ADN, en particular bicatenaria. Cuando dicho polinucleótido es natural, resulta evidente que la invención no cubre este polinucleótido en su entorno natural, sino el mismo polinucleótido aislado y purificado del genoma del organismo vivo en el que se encuentra en el estado natural. Este polinucleótido se puede obtener de manera directa, mediante extracción y purificación, o de manera indirecta mediante copia. Sin embargo, la presente invención comprende dicho polinucleótido cuando se encuentra integrado de manera artificial en el genoma de un organismo vivo diferente de aquél en el que existe en el estado natural, o cuando se reintroduce artificialmente en el organismo vivo del que procede, en uno o varios ejemplares en el genoma de este organismo. Cuando este polinucleótido es una sonda, es generalmente monocatenario.

La invención comprende por lo tanto los polinucleótidos que codifican para la secuencia peptídica de la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Es bien conocido por el experto en la materia que esta definición incluye todos los polinucleótidos que, a pesar de que comprenden unas secuencias nucleotídicas diferentes como resultado de la degenerescencia del código genético, codifican para una misma secuencia de aminoácidos, por lo tanto una misma fitasa, la cual está representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2.

La presente invención comprende asimismo unos polinucleótidos homólogos de los polinucleótidos descritos anteriormente, codificando dichos polinucleótidos homólogos para unas fitasas homólogas de la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Por el término "homólogo" se entiende, según la invención, unos polinucleótidos que codifican unas fitasas y cuyas secuencias presentan unas modificaciones con relación a los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Los polinucleótidos homólogos se caracterizan porque presentan un grado de identidad con los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. El grado de identidad entre dos polinucleótidos homólogos se obtiene mediante la comparación de sus secuencias y se expresa generalmente por un porcentaje de nucleótidos idénticos entre estas secuencias. Este grado de identidad se mide sobre una longitud de secuencia determinada, determinando la más corta de las secuencias comparadas el tamaño de secuencia sobre el cual se mide el grado de identidad de las secuencias homólogas. La invención abarca por lo tanto unos polinucleótidos que presentan una o varias modificaciones de secuencia con relación a los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, y que codifican para unas fitasas cuyas propiedades son equivalentes a las de la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2.

Mediante la expresión "fitasas equivalentes" o "fitasas con propiedades equivalentes" se entiende esencialmente, según la invención, unas proteínas que poseen una actividad fitasa, independientemente de sus propiedades intrínsecas tales como el Km, el pH óptimo de actividad o la temperatura óptima de actividad. El nivel de actividad fitasa se puede medir mediante cualquier método que permite caracterizar una actividad fitasa. Por fitasa, se entiende una enzima cuya actividad catalítica consiste en hidrolizar el ácido fítico para liberar inositol y fosfato inorgánico. Sin embargo, puesto que la mayoría de las fitasas no realizan una hidrólisis completa del ácido fítico (que comprende 6 fosfatos), la actividad catalítica de una fitasa según la invención puede conducir a la liberación de fosfato inorgánico y de ésteres de fosfato-mioinositol, pudiendo ser dichos ésteres, en función de la capacidad de hidrólisis de la fitasa, unos ésteres de mioinositol mono-, di-, tri-, tetra- o penta-fosfato. A título de ejemplo, la actividad fitasa se puede medir según el método de Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269), en particular tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método que permite caracterizar una actividad fitasa, o bien mediante la medición de la disminución de la cantidad de sustrato, o bien mediante la medición de la acumulación de los productos procedentes de la reacción enzimática, para medir la actividad fitasa. En particular, unos métodos parecidos, que utilizan por ejemplo otro sustrato u otros agentes reactivos, permiten medir asimismo dicha actividad fitasa.

Las modificaciones de secuencias presentes en los polinucleótidos homólogos pueden ser unas adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos que pueden ser naturales u obtenidos por las técnicas habituales de mutagénesis. Se sabe que dichos polinucleótidos homólogos, que codifican para unas proteínas de funciones equivalentes, existen naturalmente en los genomas de especies vivas diferentes, e incluso en los genomas de razas, variedades o cepas diferentes. Por consiguiente, resulta por lo tanto fácil para un experto en la materia, a partir de la enseñanza de los polinucleótidos que codifican para la secuencia peptídica representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 según la invención, aislar dichos polinucleótidos homólogos utilizando unas técnicas bien conocidas de hibridación molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press).

La hibridación molecular es una reacción de apareamiento que se efectúa entre unas hebras complementarias de polinucleótidos que presentan un cierto grado de identidad entre sus secuencias nucleotídicas. La hibridación permite por lo tanto, a partir de los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, identificar unos polinucleótidos homólogos de éstos en el genoma de organismos vivos diferentes del que proceden, por ejemplo otras bacterias, en particular otras cepas de Acidocella, y que codifican para unas fitasas con las propiedades equivalentes a la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Cuanto más fuerte es la identidad de secuencia entre unos polinucleótidos, más posible y fácil resulta la hibridación entre dichos polinucleótidos, y más alta es la probabilidad de que estos polinucleótidos codifiquen para unas proteínas con las propiedades equivalentes. Los métodos que permiten hibridar unos polinucleótidos se describen ampliamente en la bibliografía (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) y son bien conocidos por el experto en la materia. Se basan, por ejemplo, en el cribado de un banco genómico o de ADNc creado a partir de un organismo vivo o de un tejido de este organismo. El cribado se lleva a cabo con la ayuda de una sonda constituida por un polinucleótido conocido o un fragmento de éste, con el fin de identificar en estos bancos los polinucleótidos homólogos a dicha sonda que se hibridarán a ésta. Según la invención, la sonda está constituida por un polinucleótido que codifica la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, o un fragmento de éstos. Con el fin de identificar los polinucleótidos sobre los cuales se hibrida la sonda, ésta se marca, por ejemplo con unos elementos radiactivos, tal como el ^{32}P. Se pueden utilizar asimismo unos marcadores no radiactivos comercializados y bien conocidos por el experto en la materia.

La presente invención comprende por lo tanto asimismo unos polinucleótidos capaces de hibridarse de manera selectiva a uno de los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Se entiende que estos polinucleótidos forman parte de la presente invención sólo si codifican para una fitasa equivalente a la representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Mediante la expresión "polinucleótidos capaces de hibridarse de manera selectiva" se entiende por lo tanto, según la invención, los polinucleótidos que, mediante uno de los métodos habituales de hibridación molecular (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), se hibridan con una sonda marcada constituida por uno de los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, o un fragmento de éstos, a un nivel superior a la hibridación no específica de dicha sonda con otros polinucleótidos poco homólogos, en particular otros ADNc si los polinucleótidos sondados proceden de un banco de ADNc. El nivel de hibridación se mide gracias a la señal producida por el marcador de la sonda. El nivel de la señal generado por la interacción entre los polinucleótidos capaces de hibridarse de manera selectiva y la sonda es generalmente 10 veces, preferentemente 100 veces más intenso que el generado por la interacción de la sonda con los demás polinucleótidos que generan un "ruido de fondo". La hibridación selectiva se obtiene utilizando unas condiciones de hibridación y de lavado astringentes o muy astringentes (por ejemplo hibridación con un tampón que contiene por lo menos 5 x SSC y 1% de SDS a aproximadamente 50ºC-60ºC, y lavados sucesivos con 0,1% de SDS y disminución progresiva de la concentración en SSC de 2xSSC a 0,4xSSC así como aumento de la temperatura de 20ºC a 50ºC). El experto en la materia sabrá adaptar las condiciones de hibridación, es decir, esencialmente la temperatura y la concentración salina de los tampones utilizados para la etapa de hibridación y la etapa de lavado. Estas condiciones deben ser adaptadas en particular en función del tamaño de la sonda utilizada y del grado de identidad de los polinucleótidos presentes en el banco cribado con esta sonda. La adaptación de las condiciones de hibridación es necesaria con el fin de optimizar la señal generada por las secuencias homólogas que se hibridan, minimizando al mismo tiempo el ruido de fondo.

Los polinucleótidos capaces de hibridarse de manera selectiva a los polinucleótidos según la invención pueden ser aislados a partir de bancos genómicos o de bancos de ADNc producidos, por ejemplo, a partir de cepas bacterianas, en particular de cepas del género Acidocella. El aislamiento de dichos polinucleótidos se puede llevar a cabo mediante las técnicas estándares de hibridación (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), utilizando como sonda un polinucleótido que codifica la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, un fragmento de estos polinucleótidos, o un polinucleótido complementario de éstos. Cuando un polinucleótido ha sido aislado por estas técnicas, es necesario determinar su secuencia e identificar las propiedades de la proteína codificada por este polinucleótido, en particular verificar que esta proteína es una fitasa equivalente a la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2.

Las técnicas de hibridación mencionadas anteriormente permiten por lo tanto aislar unos polinucleótidos homólogos de los polinucleótidos que codifican para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Dichos polinucleótidos y las fitasas que codifican, son fácilmente identificables por un experto en la materia del campo de las biotecnologías que domina las técnicas estándares de biología molecular. La invención comprende por lo tanto unos polinucleótidos homólogos de los polinucleótidos que codifican la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. El grado de identidad de los polinucleótidos homólogos será de por lo menos 70% con relación a los polinucleótidos que codifican la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, preferentemente de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90% y de manera preferida de por lo menos 95%. Los métodos de medición y de identificación del grado de identidad entre unas secuencias son asimismo bien conocidos por el experto en la materia. Se pueden utilizar, por ejemplo, los programas PILEUP, BLAST (en particular Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10), o BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman descrito en Applied Mathematics, 1981, nº 2, 482-489).

Dichos polinucleótidos homólogos se pueden obtener asimismo de manera artificial mediante las técnicas habituales de mutagénesis.

Un polinucleótido preferido que codifica la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 se representa mediante el identificador de secuencia SEC ID nº 1.

Según un modo particular de realización de la invención, los polinucleótidos que codifican una fitasa descritos anteriormente proceden de una bacteria del género Acidocella.

De manera ventajosa, los polinucleótidos según la invención codifican una fitasa cuyo pH óptimo de actividad es inferior o igual a 4. Por pH óptimo de actividad, se entiende el valor de pH al que la actividad de la fitasa según la invención es máxima, siendo esta actividad medida mediante el método mencionado anteriormente y que corresponde a la cantidad de ácido fítico degradado y de fosfato inorgánico producido.

Según un modo particular de realización de la invención, los polinucleótidos según la invención codifican una fitasa que posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 70ºC

(b): pH óptimo = 4

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Según otro modo particular de realización de la invención, los polinucleótidos según la invención codifican una fitasa que posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 60ºC

(b): pH óptimo = 3,5

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Preferentemente, los polinucleótidos según la invención codifican una fitasa que procede de una cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

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La presente invención describe asimismo unos fragmentos de los polinucleótidos descritos anteriormente. El término "fragmento" designa en particular un fragmento de por lo menos 20 nucleótidos, en particular de por lo menos 50 nucleótidos, y preferentemente de por lo menos 100 nucleótidos. Dichos fragmentos se designan generalmente oligonucleótidos. Pueden servir de sondas de hibridación para identificar unos polinucleótidos homólogos, o de cebadores para identificar y amplificar dichos polinucleótidos homólogos mediante la técnica de PCR ("Polymerase Chain Reaction" tal como se ha descrito en Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, edit., John Wiley & Sons, Sección 6.3-6.4.

El término fragmento designa asimismo unos fragmentos de los polinucleótidos según la invención que codifican un fragmento de la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, o un fragmento de una fitasa homóloga o equivalente de la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2.

La presente invención se refiere asimismo a unos polinucleótidos que comprenden por lo menos uno de los polinucleótidos tales como los descritos anteriormente.

Todos los polinucleótidos descritos anteriormente codifican o bien la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, o bien una fitasa homóloga, o bien un fragmento activo de estas fitasas. En consecuencia, la invención se extiende por lo tanto a todas las fitasas codificadas por el conjunto de estos polinucleótidos. Esta definición incluye por lo tanto la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, las fitasas homólogas de esta fitasa, y los fragmentos activos de estas fitasas.

Según un modo preferido de realización de la invención, la fitasa es una proteína que comprende por lo menos la secuencia peptídica descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. De manera preferida, la fitasa representada por la secuencia peptídica descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 hidroliza 5 de los 6 fosfatos presentes sobre una molécula de ácido fítico.

La invención comprende por lo tanto asimismo las fitasas homólogas de la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Mediante la expresión "fitasas homólogas" se entiende, según la invención, las fitasas cuyas secuencias presentan unas modificaciones con relación a la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Al igual que los polinucleótidos homólogos, las fitasas homólogas son unas fitasas cuyas secuencias peptídicas presentan un cierto grado de identidad, grado de identidad que está generalmente expresado por un porcentaje de aminoácidos idénticos. La invención abarca por lo tanto unas fitasas que presentan una o varias modificaciones de secuencia con relación a la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, y cuyas propiedades son equivalentes a las de la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2. Estas modificaciones pueden ser unas adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos que pueden ser naturales u obtenidas mediante las técnicas habituales de mutagénesis. El grado de identidad de las fitasas homólogas será de por lo menos 70% con relación a la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2, preferentemente de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90%, y de manera preferida de por lo menos 95%. Los métodos de medición y de identificación del grado de identidad entre secuencias son bien conocidos por el experto en la materia. Se pueden utilizar, por ejemplo, los programas PILEUP, BLAST (en particular Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-10), o BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman descrito en Applied Mathematics, 1981, nº 2, 482-489).

Según un modo particular de realización de la invención, la fitasa según la invención procede de una bacteria del género Acidocella.

De manera ventajosa, la fitasa según la invención tiene un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4. Por pH óptimo de actividad, se entiende el valor de pH al que la actividad de la fitasa según la invención es máxima, siendo esta actividad medida mediante el método mencionado anteriormente y que corresponde a la cantidad de ácido fítico degradado y de fosfato inorgánico producido.

Según un modo particular de realización de la invención, la fitasa posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 70ºC

(b): pH óptimo = 4

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Según otro modo particular de realización de la invención, la fitasa posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 60ºC

(b): pH óptimo = 3,5

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Según otro modo particular de realización de la invención, la fitasa según la invención procede de una cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

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Se describen asimismo unos fragmentos de la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2 y los fragmentos de las fitasas homólogas. Por fragmento, se entiende esencialmente un fragmento biológicamente activo, es decir, un fragmento que posee una actividad fitasa equivalente a la de la fitasa completa tal como se ha medido mediante el ensayo descrito en el ejemplo 2, o un ensayo parecido.

La presente invención se refiere asimismo a un gen quimérico que comprende por lo menos, unidos entre sí de manera operativa, un promotor funcional en un organismo hospedante, un polinucleótido que codifica una fitasa según la invención, y un elemento terminador funcional en este mismo organismo hospedante. Los diferentes elementos que un gen quimérico puede contener son, por un lado, unos elementos reguladores de la transcripción, de la traducción y de la maduración de las proteínas, tales como un promotor, una secuencia que codifica para un péptido señal o un péptido de tránsito, o un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación y, por otro lado, un polinucleótido que codifica para una proteína. La expresión "unidos entre sí de manera operativa" significa que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre sí de manera que el funcionamiento de uno de estos elementos está afectado por el de otro. A título de ejemplo, un promotor está unido de manera operativa a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar a la expresión de dicha secuencia codificante. La construcción del gen quimérico según la invención y el ensamblaje de sus diferentes elementos se realiza mediante la utilización de técnicas bien conocidas por el experto en la materia, en particular las descritas en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). La selección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo hospedante en el que deben funcionar, y el experto en la materia es capaz de seleccionar unos elementos reguladores funcionales en un organismo hospedante determinado. Por "funcionales", se entiende capaces de funcionar en un organismo hospedante determinado.

Los promotores que puede contener el gen quimérico según la invención son o bien constitutivos, o bien inducibles. A título de ejemplo, los promotores utilizados para la expresión en unas bacterias se podrán seleccionar de entre los promotores citados a continuación. Para la expresión en Escherichia coli, se pueden citar los promotores lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, \lambdaPL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gen 32, nprM-lac, VHb, proteína A (Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60:512-538; Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7; Weickert et al., 1996, Current Opinions in Biotechnology 7: 494-499) o también el promotor P_{trp} (WO 99/64607). Para la expresión en las bacterias Gram positivas tales como las Corinebacterias o Streptomyces, se pueden citar los promotores P_{tipA} (Holmes et al., 1993, EMBO J. 12:3183-3191) o PS1, PS2 (FR 91/09870) o los descritos en la solicitud EP 0 629 699 A2. Para la expresión en las levaduras y en los hongos, se pueden citar los promotores P_{LAC4} de K. lactis (Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:135-139) o P_{pgk} de K. lactis (solicitud de patente FR 91/05294), tef1 o cbh 1 de Trichoderma (WO 94/04673), his, csl, apf de Penicillium (WO 00/68401), gla de Aspergillus (Gwynne et al., 1987, Bio/Technology 5: 713-719).

El gen quimérico puede comprender asimismo una secuencia de direccionamiento subcelular, que codifica un péptido señal o un péptido de tránsito. Dicha secuencia, situada corriente arriba o corriente abajo del polinucleótido que codifica para la fitasa, permite dirigir dicha fitasa de manera específica a un compartimento celular del organismo hospedante, o dirigir su secreción en el espacio extracelular. Por ejemplo, el gen quimérico puede comprender una secuencia que codifica un péptido señal o un péptido de tránsito que permite dirigir la fitasa hacia un compartimento particular del citoplasma como las mitocondrias, los plastos, el retículo endoplásmico o las vacuolas. De manera preferida, la secuencia de direccionamiento codifica un péptido señal que dirige la fitasa al apoplasto o la matriz celular.

Según un modo de realización, el péptido de tránsito puede ser una señal de direccionamiento cloroplástico, vacuolar o mitocrondial, el cual se escinde a continuación en los cloroplastos, las vacuolas o las mitocondrias. Dichos péptidos se describen ampliamente en la bibliografía: Neuhaus y Rodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38: 127-144; péptido de tránsito del EPSPS descrito en la patente US nº 5.188.642; péptido de tránsito de la pequeña sub-unidad de la ribulosa-biscarboxilasa/oxigenasa (EP 189 707).

Según otro modo de realización, el péptido de tránsito puede estar constituido por un péptido señal de direccionamiento al periplasmo bacteriano como los de los genes pac (Schumacher et al., 1986, Nucl. Acids. Res. 14:5713-5727), ompA (Bowden y Georgiou, 1990, J. Biol. Chem. 265: 16761-16766), phoA (Chang et al., 1986, Gene 44: 121-124), o por un péptido de anclaje en la superficie de la bacteria como los de los genes PS1 y PS2 (FR 91/09870).

Los péptidos de tránsito pueden ser o bien simples, o bien dobles. Los péptidos de tránsito dobles están eventualmente separados por una secuencia intermedia. A título de ejemplo de péptido de tránsito cloroplástico, se puede citar un péptido de tránsito doble que comprende, en el sentido de la transcripción, una secuencia que codifica para un péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, una parte de secuencia de la parte madura N-terminal de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial, y después una secuencia que codifica para un segundo péptido de tránsito de un gen vegetal que codifica para una enzima de localización plastidial. Dichos péptidos de tránsito cloroplástico dobles se describen, por ejemplo, en la solicitud de patente EP 0 508 909.

Según un modo de realización, el péptido de tránsito puede estar compuesto por diferentes elementos que permiten aumentar el índice de proteína de interés segregada en el medio. Se puede así citar la asociación de una proteína portadora y de un sitio de escisión proteolítico fusionado con la proteína de interés (US nº 6.130.063).

Según la invención, el gen quimérico puede comprender asimismo otras secuencias de regulación, que se sitúan entre el promotor y la secuencia codificante, tales como unos activadores de transcripción (enhancer).

La presente invención se refiere asimismo a un vector de clonación y/o de expresión que comprende un gen quimérico según la invención. El vector según la invención es útil para transformar un organismo hospedante y expresar en éste una fitasa. Este vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus. De manera preferida, el vector de transformación según la invención es un plásmido. De manera general, las principales cualidades de este vector deben ser una capacidad para mantenerse y para autoreplicarse en las células del organismo hospedante, en particular gracias a la presencia de un origen de replicación, y para expresar una fitasa. Con el objetivo de una transformación estable de un organismo hospedante, el vector puede integrarse asimismo en el genoma. Su composición puede limitarse entonces a los elementos necesarios para la síntesis de la fitasa en estos hospedantes. La elección de dicho vector así como las técnicas de inserción en éste del gen quimérico según la invención se describen ampliamente en Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), y forman parte de los conocimientos generales del experto en la materia. De manera ventajosa, el vector utilizado en la presente invención contiene asimismo, además del gen quimérico según la invención, un gen quimérico que codifica un marcador de selección. Este marcador de selección permite seleccionar los organismos hospedantes efectivamente transformados, es decir, los que han incorporado el vector. Según un modo particular de realización de la invención, el organismo hospedante a transformar es una planta o un hongo. Entre los marcadores de selección que se pueden utilizar, se pueden citar unos marcadores que contienen unos genes de resistencia a los antibióticos o a los fungicidas tales como, por ejemplo, el gen de la higromicina fosfotransferasa (Gritz et al., 1983, Gene 25:179-188; Punt et al., 1987; Gene, 56: 117-24), el de la estreptotricina acetiltransferasa, el que codifica para un polipéptido que confiere una resistencia a la fleomicina, el de la beta-tubulina mutada que confiere la resistencia al benomil (Gold et al., 1994, Gene 142: 225-30), o el de la bialafos-acetiltransferasa (Avalos et al., 1989, Curr Genet, 16:369-72). Otros marcadores pueden ser unos genes que complementan una auxotrofia tales como los genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4 (Buxton y Radford, 1983, Mol. Gen. Genet. 190: 403-405), arg4, argB (Berse et al., 1983, Gene 25: 109-117), trpC (Goosen et al., 1989, Mol Gen Genet, 219:282-88), el gen de la molibdopterina sintasa (Appleyard et al., 1998, J Biol Chem 273: 14869-76; Unkles et al., 1999; J Biol Chem, 274:19286-93), o el de la acetamidasa (Beri y Turner, 1987, Curr Genet, 11:639-41). Otra categoría de marcadores de selección está constituida por unos genes de tolerancia a los herbicidas tales como el gen bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) para la tolerancia al bialafos, el gen EPSPS (US nº 5.188.642) para la tolerancia al glifosato, el gen HPPD (WO 96/38567) para la tolerancia a los isoxazoles, o también el gen de la glifosato oxidorreductasa (US nº 5.463.175). Se pueden citar asimismo unos genes que codifican para unas enzimas fácilmente identificables tales como la enzima GUS, unos genes que codifican para unos pigmentos o unas enzimas que regulan la preparación de pigmentos en las células transformadas. Dichos genes marcadores de selección se describen en particular en las solicitudes de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, y WO 97/04103.

La presente invención se refiere asimismo a unos organismos hospedantes transformados, que contienen por lo menos un gen quimérico según la invención o bien integrado en su genoma, o bien soportado sobre un elemento genético extra-cromosómico, por ejemplo un plásmido. Por organismo hospedante, se entiende cualquier organismo mono o pluricelular, inferior o superior, en el que puede ser introducido el gen quimérico según la invención, para la preparación de una fitasa según la invención. De manera preferida, el organismo hospedante es un microorganismo, en particular un hongo, por ejemplo de los géneros Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, o Trichoderma, una bacteria, por ejemplo del género Escherichia, en particular E. coli, del género Corynebacterium o del género Streptomyces, una levadura, en particular de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, o Pichia, un baculovirus, o unas células vegetales. El organismo hospedante puede ser asimismo una planta o una parte de planta.

Mediante la expresión "organismo hospedante transformado", se entiende un organismo hospedante que ha incorporado en su genoma, o en un elemento genético extra-cromosómico, por ejemplo un plásmido, por lo menos un gen quimérico según la invención, y produce por consiguiente una fitasa en sus tejidos, o en un medio de cultivo. Para obtener los organismos hospedantes según la invención, el experto en la materia puede utilizar uno de los numerosos métodos de transformación conocidos.

Uno de estos métodos consiste en poner las células o tejidos de los organismos hospedantes a transformar en presencia de polietilenglicol (PEG) y de los vectores de la invención (Chang y Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet 168(1), 111-115; Mercenier y Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). La electroporación es otro método que consiste en someter las células o tejidos a transformar y los vectores de la invención a un campo eléctrico (Andreason y Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa y Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Otro método consiste en inyectar directamente los vectores en las células o en los tejidos mediante microinyección (Gordon y Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). De manera ventajosa, se podrá utilizar el método denominado de "biolístico". Consiste en bombardear unas células o unos tejidos con unas partículas sobre las cuales se adsorben los vectores de la invención (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; patente US nº 4.945.050).

Varios métodos de transformación de bacterias se describen en la bibliografía para Escherichia coli y otras bacterias Gram negativas (Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York; Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28; Chung et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2172-2175). Se puede utilizar asimismo la conjugación (Cameron et al., 1989, J. Bacteriol., 171: 547-557). Para las bacterias Gram positivas se puede utilizar la electroporación así como la transformación de protoplastos, en particular para las bacterias del género Streptomyces (Bonamy et al., 1990, FEMS Microbio. Lett 66: 263-270; Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich).

Varios métodos de transformación de hongos se describen asimismo en la bibliografía (Talbot, 2001, Molecular and cellular biology of filamentous fungi, Oxford University Press, Nueva York). La transformación de protoplastos con PEG se describe para Aspergillus en el documento EP 0 260 762, y una adaptación de este método a la especie Penicillium funiculosum en el documento WO 00/36120. Se conoce asimismo la transformación mediante integración asistida de enzima de restricción o REMI (Sanchez et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258; 89-94), así como la transformación de protoplastos con la ayuda de bacterias del género Agrobacterium (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 839-842). Unas técnicas de transformación de levaduras han sido descritas asimismo en la bibliografía, en particular en Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, Nueva York) y Van den Berg et al. (1990, Bio/Technology 8: 135-139).

En el caso particular en el que el organismo hospedante a transformar es de origen vegetal, la transformación de células o de tejidos vegetales se puede llevar a cabo preferentemente con la ayuda de bacterias del género Agrobacterium, preferentemente mediante la infección de las células o de los tejidos de dichas plantas por A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23(3):315-330) o A. rhizogenes (Bevan y Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16:357-384; Tepfer y Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De manera preferida, la transformación de células o de tejidos vegetales por Agrobacterium tumefaciens se lleva a cabo según el protocolo descrito por Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750). El experto en la materia seleccionará el método apropiado en función de la naturaleza de los organismos hospedantes a transformar.

La presente invención se refiere asimismo a un nuevo extracto bacteriano que comprende por lo menos una actividad fitasa, caracterizado porque procede de una bacteria del género Acidocella. Por extracto bacteriano, se entiende según la presente invención, una fracción soluble en agua o en una disolución acuosa, procediendo dicha fracción de la trituración de bacterias y de la separación mediante centrifugación de los constituyentes bacterianos así liberados en fracción sólida y en fracción líquida, comprendiendo la fracción líquida el conjunto de los constituyentes bacterianos solubles. La actividad fitasa corresponde a la cantidad de ácido fítico degradado y se mide generalmente mediante la cuantificación del fosfato inorgánico liberado por la reacción enzimática. En particular, la actividad fitasa se mide según el método de Shimizu (1992, Biosci. Biotech, Biochem. 56(8), 1266-1269), en particular tal como se ha descrito en el ejemplo 2 siguiente. Sin embargo, se puede utilizar cualquier método que permite caracterizar una actividad fitasa, o bien mediante la medición de la disminución de la cantidad de sustrato, o bien mediante la medición de la acumulación de los productos procedentes de la reacción enzimática, para medir la actividad fitasa del extracto bacteriano según la invención.

El extracto bacteriano según la invención se caracteriza porque procede de una bacteria del género Acidocella. Las características de las bacterias agrupadas en el género Acidocella se describen en Kishimoto et al. (1995, System. Appl. Microbiol. 18, 85-91).

Preferentemente, el extracto bacteriano según la invención expresa una actividad fitasa cuyo pH óptimo de actividad es inferior o igual a 4. El pH óptimo de actividad corresponde al pH al que la actividad fitasa medida en el extracto bacteriano según la invención es máxima.

Según un modo particular de realización de la invención, el extracto bacteriano comprende una actividad fitasa que posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 70ºC

(b): pH óptimo = 4

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Según otro modo particular de realización de la invención, el extracto bacteriano comprende una actividad fitasa que posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 60ºC

(b): pH óptimo = 3,5

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Por temperatura óptima y pH óptimo, se entiende la temperatura y el pH a los que la actividad fitasa medida en el extracto bacteriano según la invención es máxima.

Según otro modo particular de realización de la invención, el extracto bacteriano según la invención procede de una cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o de una cepa bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

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La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de dicho extracto bacteriano. Este procedimiento se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(e): recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d)

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Según el presente procedimiento, una cepa bacteriana del género Acidocella se cultiva en un medio de cultivo apropiado que permite que las bacterias se multipliquen, y cuyo pH se ajusta a las condiciones de pH del medio natural en el que se desarrolla dicha cepa bacteriana. Numerosos medios de cultivo para bacterias se describen en la bibliografía, y el experto en la materia sabrá seleccionarlos y adaptar sus condiciones de pH. A título de ejemplo, un medio de cultivo para bacterias acidófilas, en particular del género Acidocella se describe en Kishimoto et al., 1995, System. Appl. Microbiol. 18, 85-91).

Después del cultivo, las bacterias obtenidas se concentran. La concentración de las bacterias se puede llevar a cabo mediante numerosos medios, en particular mediante centrifugación o mediante filtración. Después de la concentración, las bacterias se trituran. La trituración de las bacterias consiste en romper las células bacterianas. Se puede llevar a cabo mediante diferentes medios conocidos por el experto en la materia. Preferentemente, la trituración se lleva a cabo mediante la exposición de las bacterias a un campo de ultrasonidos. El triturado bacteriano se centrifuga a continuación con el fin de separar los desechos celulares no solubles, y después recuperar el sobrenadante de centrifugación que comprende los elementos celulares solubles, y en particular unas enzimas que expresan una actividad fitasa.

Según un modo particular de realización de la invención, la cepa bacteriana utilizada en el procedimiento según la invención es una cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o una cepa bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de preparación de la fitasa según la invención. Según un modo de realización de la invención, este procedimiento se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(f): purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e)

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Las etapas (a) a (e) de este procedimiento son comunes con las etapas (a) a (e) del procedimiento de preparación de un extracto bacteriano descrito anteriormente. La etapa (f) del presente procedimiento de preparación de una fitasa según la invención consiste en purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e). La purificación de la fitasa se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica de separación de las proteínas, en particular las técnicas de electroforesis y de cromatografía bien conocidas por el experto en la materia. Con el fin de conseguir una fitasa purificada, el experto en la materia sabrá utilizar el método de medición de la actividad fitasa mencionada anteriormente para identificar la o las fracciones de purificación que contienen dicha fitasa.

Preferentemente, la cepa bacteriana utilizada en el procedimiento según la invención es una cepa bacteriana de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o una cepa bacteriana de la especie de Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

Según otro modo de realización de la invención, en particular cuando la fitasa según la invención es segregada en el medio de cultivo, este procedimiento se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de las bacterias

(c): purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (d)

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Según este procedimiento, la etapa de recuperación del medio de cultivo por eliminación de las bacterias se puede llevar a cabo mediante cualquier método de separación de fracciones sólidas comprendidas en una fracción líquida. En particular, la filtración y la centrifugación son unos medios adaptados a la realización de esta etapa.

Según otro modo de realización de la invención, el procedimiento de preparación de la fitasa según la invención utiliza un organismo hospedante transformado según la invención, y se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar un organismo hospedante transformado según la invención

(b): concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)

(c): triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

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La etapa (f) del presente procedimiento de preparación de una fitasa según este modo de realización de la invención consiste en purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e). La purificación de la fitasa se puede llevar a cabo mediante cualquier técnica de separación de las proteínas, en particular las técnicas de electroforesis y de cromatografía bien conocidas por el experto en la materia. Con el fin de conseguir una fitasa purificada, el experto en la materia sabrá utilizar el método de medición de la actividad fitasa mencionada anteriormente para identificar la o las fracciones de purificación que contienen dicha fitasa.

Preferentemente, el organismo hospedante transformado utilizado en este procedimiento es un microorganismo. En particular dicho microorganismo puede ser un hongo, por ejemplo de los géneros Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, o Trichoderma, una bacteria, por ejemplo del género Escherichia, en particular E. coli, del género Corynebacterium o del género Streptomyces, una levadura, en particular de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, o Pichia, un baculovirus, o unas células vegetales.

Según otro modo de realización de la invención, en particular cuando la fitasa según la invención es segregada en un medio de cultivo, este procedimiento se caracteriza porque comprende las etapas siguientes:

a): cultivar un organismo hospedante transformado según la invención

b): recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de dicho organismo hospedante transformado

c): purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (e).

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Según este procedimiento, la etapa de recuperación del medio de cultivo por eliminación del organismo hospedante transformado se puede realizar mediante cualquier medio de separación de fracciones sólidas comprendidas en una fracción líquida. En particular, la filtración y la centrifugación son unos medios adaptados a la realización de esta etapa.

La presente invención se refiere asimismo a unas composiciones enzimáticas que comprenden por lo menos una fitasa según la invención. Según un modo de realización particular, la composición enzimática según la invención comprende un extracto bacteriano según la invención.

Mediante la expresión "composición enzimática", se entiende una composición que comprende por lo menos una fitasa según la invención, fitasa que está asociada a unos adyuvantes diversos que favorecen su estabilidad y su conservación. La composición enzimática según la invención puede estar en forma líquida, encontrándose entonces dicha composición y la fitasa que contiene en una disolución acuosa, o en forma sólida, encontrándose entonces dicha composición y la fitasa que contiene liofilizadas en forma de polvo.

Según un modo particular de realización de la invención, la composición enzimática comprende, además de la fitasa según la invención, por lo menos una enzima adicional. Esta enzima adicional puede o bien poseer una actividad fitasa, o bien poseer una actividad distinta de la actividad fitasa. En el caso en el que esta enzima adicional posee una actividad fitasa, dicha actividad fitasa es preferentemente diferente y complementaria de la actividad fitasa de la fitasa según la invención. En el caso en el que esta enzima adicional posee una actividad diferente de la actividad fitasa, ésta puede, por ejemplo, poseer una actividad xilanasa, celulasa, \beta-glucanasa, ácido ferúlico estearasa, pululanasa, amidasa, fosfatasa o mananasa.

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De manera preferida, dichas composiciones enzimáticas están destinadas a ser incorporadas en unos alimentos para animales de cría, en particular unos animales monogástricos, preferentemente cerdos o aves de corral.

La presente invención se refiere asimismo a una composición alimenticia que comprende por lo menos una fitasa según la invención.

Mediante la expresión "composición alimenticia" se entiende esencialmente un alimento destinado a los animales de cría, en particular a los animales monogástricos, preferentemente los cerdos o las aves de corral. Una composición alimenticia según la invención es idealmente un alimento destinado a los animales de cría adicionado con una composición enzimática según la invención. La composición alimenticia según la invención es, por lo tanto, un alimento para animales de cría al que se adiciona por lo menos una composición enzimática según la invención, siendo dicho alimento y dicha composición enzimática mezclados de manera que se obtiene dicha composición alimenticia.

Según un modo particular de realización de la invención, dichas composiciones alimenticias comprenden por lo menos un organismo hospedante transformado según la invención. Según otro modo particular de realización de la invención, dichas composiciones alimenticias comprenden por lo menos una bacteria del género Acidocella. De manera preferida, la bacteria del género Acidocella es una bacteria de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o una bacteria de la especie Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

La invención se refiere asimismo a unas composiciones alimenticias que comprenden por lo menos un extracto bacteriano o una fitasa según la invención.

Ventajosamente, las composiciones alimenticias según la invención están destinadas a ser utilizadas en la alimentación de los animales monogástricos. Según un modo particular de realización de la invención, dichas composiciones alimenticias están destinadas a la alimentación de los cerdos. Según otro modo particular de realización de la invención, dichas composiciones alimenticias están destinadas a la alimentación de las aves de corral.

La presente invención tiene asimismo por objeto un procedimiento de preparación de una composición alimenticia tal como se ha descrito anteriormente.

Según un modo particular de realización de la invención, dicho procedimiento consiste en cultivar un organismo hospedante según la invención o una bacteria del género Acidocella, en concentrar dichos organismos hospedantes o dichas bacterias mediante cualquier procedimiento de concentración conocido por el experto en la materia, en particular la filtración o la centrifugación, y después en incorporar dichos organismos hospedantes o dichas bacterias concentrados en una composición alimenticia. De manera preferida, cuando el procedimiento según la invención utiliza una bacteria del género Acidocella, ésta es una bacteria de la especie Acidocella aminolytica, en particular la cepa A. aminolytica ATCC 51361, o una bacteria de la especie Acidocella facilis, en particular la cepa A. facilis ATCC 35904.

Según otro modo particular de realización de la invención, dicho procedimiento consiste en aislar un extracto bacteriano según la invención mediante el procedimiento de preparación de dicho extracto tal como se ha descrito anteriormente, y después en incorporar el sobrenadante producido en la etapa (e) de dicho procedimiento en una composición alimenticia.

Según otro modo particular de realización de la invención, dicho procedimiento consiste en preparar una fitasa según la invención mediante uno de los procedimientos de preparación de dicha fitasa tales como se han descrito anteriormente, y después en incorporar dicha fitasa producida en una composición alimenticia.

La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento para aumentar la asimilación del fosfato inorgánico contenido en la fitasa de los alimentos a base de vegetales para los animales monogástricos, caracterizado porque se incorpora una fitasa o una composición enzimática según la invención en la alimentación de dichos animales. De manera preferida, dicho procedimiento se caracteriza porque se alimenta a dichos animales monogástricos con una composición alimenticia según la invención.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para disminuir la adición de fósforo en la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según la invención.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para disminuir las emisiones de fósforo procedentes de la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según la invención.

Los ejemplos siguientes permiten ilustrar la presente invención, sin limitar por ello su alcance.

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Ejemplo 1 Cultivo de las bacterias del género Acidocella

Las bacterias del género Acidocella son unas bacterias acidófilas de Gram negativo, que se desarrollan en unos medios a pH ácido. A título de ejemplo, las bacterias de las cepas A. aminolytica ATCC 51361 y A. facilis ATCC 35904 se pueden utilizar para realizar la presente invención. Estas bacterias pueden ser cultivadas según un método similar. En particular, se cultivan en condiciones aeróbicas a 30ºC y pH 4 en un medio compuesto por peptona y por glucosa. Un medio de cultivo se describe por ejemplo en Kishimoto y Tano (1987, J. Gen. Appl. Microbiol. 33, 11-25). El medio utilizado para la expresión de la fitasa está exento de fosfato inorgánico, y suplementado con fitato (0,4%) y en CaCl_{2} (2,2 g/l).

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Ejemplo 2 Medición de la actividad fitasa

La medición de la actividad fitasa se lleva a cabo en medio líquido. Se efectúa sobre unas muestras de cultivo bacteriano o sobre unos extractos bacterianos según la invención, o sobre unas fitasas según la invención. Se basa en el método de Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269). El principio de este método consiste en medir la cantidad de fosfato inorgánico liberado durante la reacción enzimática de la fitasa con su sustrato (disolución de fitato de sodio al 1%). La cantidad de fosfato inorgánico liberado se mide mediante la reacción de éste con un agente reactivo cromógeno (1 volumen de sulfato de hierro al 10,8%, mezclado extemporáneamente con 4 volúmenes de amonio molibdato 0,012M H_{2}SO_{4}). Esta reacción conduce, en medio muy ácido, a la formación de un complejo de fosfomolibdato coloreado (en presencia de Fe^{2+}), y la cantidad de complejo formado se cuantifica mediante la medición con el espectrofotómetro de la absorbancia a 700 nm de la disolución coloreada generada.

Dos reacciones distintas permiten la medición de la actividad: una primera medición se efectúa en el momento de la puesta en contacto de la muestra con el sustrato (tiempo T0) y una segunda después de 60 minutos de incubación (tiempo T60). La variación de la absorbancia entre los tiempos T0 y T60 (contra los blancos respectivos constituidos por tampón en lugar de la muestra) es proporcional a la cantidad de fosfato inorgánico liberado durante la reacción enzimática.

Se realiza una gama patrón de referencia mezclando 250 \mul de disolución de KH_{2}PO_{4} a las concentraciones de 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2 mM y 4 mM en el tampón deseado con 250 \mul de TCA y revelando mediante 450 \mul de agente reactivo cromógeno. Una unidad enzimática se define como la cantidad de enzima que libera un micromol de fosfato inorgánico por minuto (a temperatura y pH determinados).

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Ejemplo 3 Aislamiento de un extracto bacteriano que contiene una actividad fitasa

Después del cultivo, las bacterias del género Acidocella se concentran mediante centrifugación durante 15 minutos a 5.000 g y 4ºC. El sobrenadante se elimina y las bacterias así concentradas se resuspenden a continuación en un tampón formiato (100 mM)-CaCl_{2} (1 mM) a pH 3,5 de manera que se concentran aproximadamente 100 veces con relación a su concentración inicial en el medio de cultivo. Las bacterias concentradas se trituran a continuación con la ayuda de un aparato "Cell disrupter" (Cell-d) utilizado a razón de dos pasadas en un flujo de una presión de 2,5 kbar. Los triturados bacterianos se centrifugan a continuación durante 15 minutos a 5.000 g y 4ºC y el sobrenadante, que constituye el extracto bacteriano se recupera, y se mide su actividad fitasa.

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Ejemplo 4 Características de las fitasas aisladas según la invención 4.1. Actividad fitasa en función de la temperatura

La actividad de las fitasas según la invención ha sido determinada a diferentes temperaturas. Los resultados de estas mediciones se presentan para las bacterias Acidocella aminolytica ATCC 51361 (figura 1), y Acidocella facilis ATCC 35904 (figura 3). Las temperaturas óptimas de actividad son de 70ºC y 60ºC respectivamente para las bacterias Acidocella aminolytica ATCC 51361 y Acidocella facilis ATCC 35904.

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4.2. Actividad fitasa en función del pH

La actividad de las fitasas según la invención ha sido determinada a diferentes pH. Los resultados de estas mediciones se presentan para las bacterias Acidocella aminolytica ATCC 51361 (figura 2), y Acidocella facilis ATCC 35904 (figura 4). Los pH óptimos de actividad son de 4 y 3,5 respectivamente para las bacterias Acidocella aminolytica ATCC 51361 y Acidocella facilis ATCC 35904.

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Ejemplo 5 Purificación de una fitasa según la invención 5.1. Preparación de un extracto bruto

Las células de una cepa bacteriana del género Acidocella se centrifugan y después se lavan 3 veces en tampón MES pH 6,5 (25 mM) que contiene 1 mM de CaCl_{2} con el fin de eliminar el fitato del medio y el fosfato inorgánico (acumulado durante el crecimiento). La suspensión celular así obtenida se rompe después mediante "Cell disrupter" (1,5 kbar) y después se reduce el pH hasta 5,5 (mediante la adición de ácido clorhídrico al 3,7%).

El extracto así obtenido se centrifuga a 20.000 g durante 1 hora. El sobrenadante se filtra a continuación sobre una membrana de 0,45 \mum de porosidad.

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5.2. Cromatografía de intercambio de aniones

El sobrenadante se pasa sobre una columna de tipo POROS 20 HQ (4,6/100 mm: 1,7 ml de gel). La elución se lleva a cabo con un tampón MES pH 5,5 (25 mM) 1 mM de CaCl_{2}, 1M de NaCl. La actividad fitasa (50% de la actividad inyectada) se encuentra en la fracción del volumen muerto.

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5.3. Cromatografía de interacción hidrófoba

La fracción recuperada al final de la cromatografía de intercambio de aniones se lleva a 1,5 M (NH_{4})_{2}SO_{4}. Esta disolución se deposita entonces sobre una columna de tipo POROS 20 HP2 (HQ 4,6/100 mm: 1,7 ml de gel) previamente equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (25 mM), 1 mM de CaCl_{2}, 1,5 M de (NH_{4})_{2}SO_{4}. Las proteínas se eluyen a continuación mediante un gradiente de 1,5 a 0 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en 20 volúmenes de columna.

La actividad fitasa se eluye a 0,95 M de (NH_{4})_{2}SO_{4} en 3 fracciones de 2 ml. Estas fracciones se reúnen y después se dializan contra 5 litros de tampón MES pH 5,5 (20 mM), 1 mM de CaCl_{2} a 4ºC durante una noche.

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5.4. Cromatografía intercambiadora de cationes

La disolución dializada se inyecta sobre una columna de tipo POROS 20 HS (4,6/100 mm: 1,7 ml de gel) previamente equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (20 mM), 1 mM de CaCl_{2}. Las proteínas se eluyen mediante un gradiente NaCl de 0 a 1 M en 20 volúmenes de columnas.

La proteína con actividad fitasa se eluye a una concentración en NaCl de 0,35 M.

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5.5 Filtración sobre gel

Las fracciones obtenidas durante la etapa anterior han sido reunidas, concentradas y depositadas sobre una columna SUPEROSE 12 HR 10/30 (24 ml, Pharmacia®) previamente equilibrada con un tampón MES pH 5,5 (25 mM), 1 mM de CaCl_{2}, 0,1 M de NaCl. Las proteínas han sido eluidas con 24 ml del tampón a un caudal de 0,5 ml/minuto. Se han recogido unas fracciones de 0,5 ml. La actividad fitasa se detecta en tres fracciones entre 14 y 15 ml de tampón de elución (tabla 1).

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TABLA 1 Actividad en las fracciones de interés después de la etapa de filtración sobre gel

1

Las tres fracciones que presentan una actividad fitasa han sido concentradas y depositadas sobre un gel SDS-PAGE de 14,4%. Este gel revela una banda principal de aproximadamente 63 kDa.

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Ejemplo 6 Micro-secuenciación de péptidos internos

La banda de interés (a aproximadamente 63 kDa) ha sido cortada directamente sobre el gel de poliacrilamida. El colorante contenido en el gel se retira parcialmente mediante 2 lavados en 50% de acetonitrilo/50 mM de Tris-HCl pH 8,6. La proteína, en gel de poliacrilamida, se digiere en 400 \mul de tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,6/0,03% de SDS a 35ºC durante 18 horas en presencia de 0,4 \mug de endolisina-C (Sequencing grade de Roche).

Los péptidos obtenidos se separan mediante HPLC sobre una columna en línea de DEAE-C18 de 2,1 mm de diámetro. El gradiente de separación es un gradiente de 2 a 45% de acetonitrilo/TFA al 0,1%.

Cuatro péptidos han sido purificados, y después secuenciados mediante el método de Edman con la ayuda de un secuenciador Applied Biosystems 473A.

TABLA 2 Secuencias de los péptidos internos obtenidos

2

Ejemplo 7 Clonación del gen que codifica la fitasa 7.1. Definición de una sonda

En base a las secuencias de los péptidos internos, se han sintetizados varios oligonucleótidos degenerados con el fin de amplificar por PCR un fragmento del gen de interés.

Oligo 10:: ATDATDATNGCNGTRTTYTT

Oligo 12:: TCRTCRTASGTGATGATGATSGCSGTRTTYTT

Oligo 22:: AARATGGARGGNCARAAYATHGG

Oligo 23:: ATGGAAGGCCAGAAYATCGGCGA

Oligo 25:: ATCGGCGAYCTBCTBAAYGCCAA

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Se han ensayado unas combinaciones de cebadores Oligo 10 y Oligo 12 con los tres cebadores Oligo 22, 23 y 25, y el par de cebadores Oligo 12 y Oligo 22 ha permitido aislar el fragmento de 500 pb a partir del ADN genómico de una cepa del género Acidocella. Después de la purificación, se ha secuenciado este fragmento de ADN.

El análisis de esta secuencia ha permitido demostrar en este fragmento una secuencia nucleica que codifica para el péptido 1, lo que sugiere que el producto PCR secuenciado corresponde efectivamente a la proteína de interés que ha sido objeto de la microsecuenciación.

En base a la secuencia obtenida a partir del producto PCR de aproximadamente 500 pb, se han definido nuevos cebadores Oligo 29 y Oligo 30 con el fin de disponer de un juego de cebadores específicos no degenerados del gen de interés.

Oligo 29:: TTCATGGGTGGCTTCGATC

Oligo 30:: GCTGCCGCATCAGGAAGTTG

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7.2. Transferencia Southern

El producto PCR de aproximadamente 500 pb obtenido mediante amplificación con los cebadores Oligo 12 y Oligo 22 se ha utilizado como sonda en unos experimentos de transferencia Southern.

Con el fin de marcar la sonda, se han marcado 10 ng de producto PCR mediante "random priming" con la ayuda del kit Labelling Q-BIOgene.

Se han digerido 10 \mug de ADN genómico respectivamente por EcoRI, SacII o BamHI y después se han depositado sobre un gel de agarosa al 1%. Después de la migración, el ADN ha sido transferido por capilaridad sobre una membrana de nylon (BIODYNE® Plus membrane, Pall Gelman).

Se ha efectuado una pre-hibridación durante 4 h a 60ºC con un tampón 5x SSC, 5x Dehardt, 1% de SDS, 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de pescado.

La hibridación se lleva a cabo a continuación durante 16 h a 60ºC con un tampón que contiene 10 ml de tampón de pre-hibridación y 10 ng de la sonda a 4,08 10^{8} cpm/\mug (recuento con contador de centelleos en seco, es decir, en ausencia de centelleo).

Después, se han realizado varias fases de lavado:

: 2 lavados: 2x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC

: 2 lavados: 0,5x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC

: 2 lavados: 0,4x SCC + 0,1% SDS durante 15 minutos a 50ºC

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El gel ha sido revelado sobre película después de una exposición de 24 h a -80ºC.

Estos experimentos han permitido mostrar que SacII corta en la porción del gen utilizada como sonda, pero que no existe ningún sitio EcoRI ni BamHI en esta secuencia. Las digestiones EcoRI y BamHI liberan respectivamente un fragmento de aproximadamente 4 kb y un fragmento de tamaño superior a 9 kb sobre los cuales se hibrida la secuencia diana.

Sabiendo, en base a estudios bioquímicos, que la proteína de interés debe ser codificada por un gen de aproximadamente 1,6 kb, se ha construido un banco de ADN genómico por digestión total EcoRI.

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7.3. Construcción de un banco genómico

Aproximadamente 30 \mug de ADN genómico de una cepa del género Acidocella han sido digeridos por EcoRI. Después de la migración sobre gel de agarosa al 0,7%, los fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 3 y 4 kb han sido purificados con la ayuda del kit QIAEX II gel extraction kit (Qiagen) y desalados (microbio spin 6, Biorad). Se han purificado asimismo los fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 2,5 y 3 kb así como aquéllos cuyo tamaño está comprendido entre 4 y 5 kb.

Los fragmentos purificados han sido insertados en un vector pBlueScript KS (II+) con la ayuda de la T4 DNA ligase (QBIOgene). Los productos de la ligación realizada con los fragmentos cuyo tamaño está comprendido entre 3 y 4 kb han sido utilizados para transformar la cepa MC 1061 de E. coli mediante electroporación. Después de la transformación, las células se recogen en SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, 0,05% de NaCl, 2,5 mM de KCl, 10 mM de MgCl_{2}, 20 mM de glucosa) y se disponen durante 1 hora a 37ºC antes de ser extendidas sobre un medio LB suplementado con ampicilina (100 \mug/ml). Las cajas de Petri se incuban entonces durante una noche a 37ºC.

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7.4. Cribado del banco genómico

Se han cribado entonces 383 colonias distintas mediante PCR utilizando el juego de cebadores Oligo 29 y Oligo 39.

De estos clones, 4 han permitido la obtención de un producto PCR de aproximadamente 400 pb. Dos de los clones que permiten la amplificación de un fragmento de tamaño esperado se han utilizado para realizar una mini-preparación de plásmido (con la ayuda del kit Qiagen).

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7.5. Secuenciación de los insertos genómicos

Los dos plásmidos identificados han sido digeridos por EcoRI y EcoRV. La secuenciación de sus insertos ha mostrado que estos dos plásmidos tenían el mismo inserto. El análisis de las secuencias ha permitido demostrar una fase abierta de lectura de 1.665 pb que corresponde a una proteína de 554 aminoácidos. Además, las secuencias que codifican los 4 péptidos internos secuenciados en el ejemplo 6 han sido encontradas en esta fase de lectura.

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Ejemplo 8 Sub-clonación del gen identificado

La secuencia que contiene la fase abierta de lectura (denominada ORF281) identificada en el inserto genómico clonado en el ejemplo 7 ha sido amplificada por PCR con los oligonucleótidos 5'ORF281 y 3'ORF281.

5'ORF281: 5' TAA CGA TAA \underline{CAT \ ATG} AAT ATC CGC CGG GCT CT 3'

3'ORF281: 5' ATA TCT GAT \underline{AAG \ CTT} TTA TTC GGC GTG CGC GGC 3'

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El producto PCR ha sido purificado y digerido por las enzimas de restricción NdeI e HindIII y después sub-clonado en el vector pETCm digerido por las mismas enzimas. El vector obtenido se denomina pETCm281. El inserto ORF281 ha sido secuenciado con el fin de verificar que la secuencia clonada es idéntica a la determinada a partir de los insertos genómicos previamente clonados.

El vector pETCm comprende un gen de resistencia al cloramfenicol. Su utilización, y por lo tanto la de la resistencia al cloramfenicol como marcador de selección, permite la expresión in vivo en una cepa de E. coli resistente a la kanamicina: la cepa BL21 appA (fitasa-).

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Ejemplo 9 Expresión del gen sub-clonado en E. coli 9.1. Preparación de las cepas E. coli recombinantes

Se han realizado unos ensayos de expresión in vivo en la cepa E. coli BL21 appA. Esta cepa ya no expresa ninguna fitasa endógena debido a una inserción de un gen de resistencia a la kanamicina en el gen appA que codifica para la fitasa de E. coli. Un vector de control ha sido preparado asimismo con el gen TEM que codifica la \beta-lactamasa de E. coli. El gen TEM ha sido clonado asimismo en el vector pETCm, y el vector obtenido ha sido denominado pETCmTEM.

La cepa de E. coli BL21 appA ha sido transformada por los vectores pETCmTEM o pETCm281. Se han seleccionado unas colonias aisladas sobre medio LB adicionado con 60 mg/l de kanamicina y con 20 mg/l de cloramfenicol. Una colonia de cada tipo ha sido cultivada en un medio LB adicionado con kanamicina y con cloramfenicol a las mismas concentraciones. Estos cultivos han sido utilizados para preparar unas reservas gliceroladas (un volumen de células para un volumen de glicerol de 40%) a partir de las cuales se inoculan los cultivos destinados a realizar los ensayos de expresión. Estas reservas gliceroladas se conservan a -80ºC.

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9.2. Ensayos de expresión

La cepa E. coli BL21 appA pETCm281 ha sido cultivada en medio M98 (medio Terrific Broth modificado (con glucosa) que contiene, para 1 litro, 12 g de Bacto Tryptone, 24 g de extracto de levadura, 9,4 g de K_{2}HPO_{4}, y 2,2 g de KH_{2}PO_{4}, pH 7,2, autoclavado, a los que se añaden 20 ml de glucosa (50%) por litro de media antes de la utilización) en paralelo con la cepa E. coli BL21 appA pETCmTEM. La expresión se induce mediante la adición de 0,25 mM de IPTG, y se realiza a dos temperaturas: 30 y 37ºC.

Después de 3 horas de inducción, los cultivos se centrifugan. La actividad fitasa se determina sobre cada residuo resuspendido en tampón formiato para alcanzar una concentración final de 5 mg/ml de células secas. No se ha encontrado ninguna actividad para la cepa que contiene pETCm281 así como la cepa que contiene pETCmTEM, sean cuales sean las condiciones de cultivo.

Unas alícuotas de residuos de los cultivos inducidos y no inducidos que contienen pETCm281 han sido tratadas entonces con ultrasonidos y después centrifugadas. El sobrenadante representa la fracción de las proteínas solubles y el residuo las proteínas insolubles.

Estas dos fracciones han sido depositadas sobre gel desnaturalizante SDS-PAGE.

Aparece claramente una banda proteica de PM 63 kDa en la fracción insoluble de la cepa E. coli BL21 appA pETCm281 inducida con el IPTG. No se encuentra ninguna banda correspondiente en el control negativo no inducido. La ORF281 está por lo tanto bien expresada en E. coli. Sin embargo, la proteína correspondiente es insoluble y aparentemente inactiva en esta forma.

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9.3. Solubilización y renaturalización de los cuerpos de inclusión

Se ha realizado una serie de etapas que tienen como objetivo solubilizar y después renaturalizar la proteína codificada por ORF281 con el fin de determinar si esta proteína posee o no una actividad fitasa.

La cepa E. coli BL21 appA pETCm281 se cultiva en medio M98 y después se induce con 0,25 mM de IPTG cuando la DO a 600 nm alcanza 0,4. Después de 3 horas de inducción, el cultivo se centrifuga (DO final alrededor de 1). El residuo se recoge en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0 a razón de 4 ml para 100 ml de cultivo. Las células se tratan con ultrasonidos a 4ºC: 4 ciclos de 10 segundos a una potencia de 500 Vatios. La DO_{600} pasa de 14 a 3. La suspensión se centrifuga a continuación durante 10 minutos a 16.000 g, y después se elimina el sobrenadante.

El residuo se resuspende en 5 ml para 100 ml de cultivo de tampón de solubilización: Tris-HCl 20 mM pH 8, urea 8M, NaCl 0,5 M, 2-mercaptoetanol 1 mM. La suspensión se trata con ultrasonidos a razón de 4 ciclos de 10 segundos a una potencia de 500 Vatios, y después se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, se dializan 30 ml de esta suspensión a 4ºC durante 16 horas contra 3 litros de tampón de renaturalización. MES 25 mM pH 6,5, 0,5 M NaCl, 1 mM Mercaptoetanol (Cutt-off 10 kDa). Se realiza una segunda diálisis contra 3 litros de tampón de renaturalización MES 25 mM pH 5,5, 0,5 M NaCl, 1 mM Mercaptoetanol (Cutt-off 10 kDa) durante 5 horas. Después, la suspensión se centrifuga durante 10 minutos a 16.000 g y se conserva a 4ºC antes de la dosificación enzimática.

El mismo protocolo de cultivo, de solubilización y de renaturalización ha sido aplicado a la cepa E. coli BL21 appA pETCmTEM.

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9.4. Actividad de los cuerpos de inclusión

Las suspensiones de las proteínas renaturalizadas producidas por las cepas E. coli BL21 appA pETCm281 y pETCmTEM han sido concentradas 10 veces sobre Nanosep^{TM} 10K Omega (Pall). La actividad fitasa se mide sobre estas disoluciones concentradas según un protocolo estándar (a pH 3,5). Este ensayo se ha realizado por duplicado.

3

Sólo se detecta una actividad fitasa en la cepa E. coli BL21 appA pETCm281. Esta actividad se confirma mediante una dosificación pMUF. Utilizando este método fluorométrico, no se detecta ninguna actividad en la cepa E. coli BL21 appA pETCmTEM, a pesar de que esta dosificación es cinco veces más sensible que el método colorimétrico utilizado generalmente.

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9.5. Purificación de los cuerpos de inclusión

La fracción resolubilizada de los cuerpos de inclusión de la cepa E. coli BL21 appA pETCm281 ha sido depositada sobre una columna POROS 20 HS (4,6/100 mm: 1,7 ml de gel) previamente equilibrada con un tampón 20 mM MES pH 5,5, 1 mM de CaCl_{2}. Las proteínas se eluyen mediante un gradiente NaCl de 0 a 1 M en 20 volúmenes de columnas.

La actividad fitasa se eluye a una concentración en NaCl de 0,35 M. Este resultado es en todos los puntos idéntico al obtenido en el ejemplo 5.4. con la fitasa nativa.

En paralelo, un extracto total (proteínas solubles e insolubles) de E. coli BL21 appA pETCmTEM ha sido depositado sobre la misma columna, y las proteínas han sido eluidas en las mismas condiciones. No se ha podido detectar ninguna actividad fitasa en las fracciones eluidas entre 0,15 y 0,45 M NaCl.

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9.6. Gel SDS-PAGE

La fracción que presenta una actividad fitasa, procedente de la columna intercambiadora de cationes, ha sido depositada sobre un gel SDS-PAGE (10% de acrilamida) después de la concentración de un factor 10 sobre Nanosep^{TM}. En el mismo gel, se ha depositado asimismo un lisado de células (inducidas con el IPTG) de E. coli BL21 appA pETCm281 y E. coli BL21 appA pETCmTEM.

Aparece también claramente que sólo el lisado de E. coli BL21 appA pETCm281 contiene una banda de PM 63 kDa. En la fracción purificada sobre columna y que presenta una actividad fitasa, una banda de PM 61-63 kDa está presente y es mayoritaria.

Estos resultados muestran por lo tanto, después de la sub-clonación en E. coli BL21 appA, que la ORF281 codifica bien para una fitasa.

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Ejemplo 10 Características de la fitasa recombinante purificada 10.1. Actividad fitasa en función de la temperatura

La actividad de la fitasa contenida en la fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 se ha determinado a diferentes temperaturas. Los resultados de estas mediciones se presentan en la figura 5. La temperatura óptima de actividad medida es de 60ºC. La dosificación ha sido realizada a pH 3.

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4.2. Actividad fitasa en función del pH

La actividad de la fitasa contenida en la fracción purificada en el ejemplo 5.5 y codificada por la ORF281 se ha determinado asimismo a diferentes pH. Los resultados de estas mediciones se presentan en la figura 5. El pH óptimo de actividad es de 3,5. La dosificación se ha realizado a 60ºC con la sucesión de tampones siguientes: Glicina-HCl (para los pH de 2 a 2,5), Formiato (pH de 2,5 a 4), Acetato (pH de 4 a 5), y MES (pH de 5 a 6).

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Ejemplo 11 Búsqueda de secuencias homólogas

La secuencia que contiene la fase abierta de lectura identificada en el fragmento genómico clonado en el ejemplo 7 ha sido utilizada como sonda para buscar unas secuencias homólogas entre los microorganismos de los géneros Acidocella y Acidiphilium.

Las cepas ensayadas pertenecen a las especies Acidocella aminolytica, Acidocella facilis, Acidiphilium angustrum, y Acidiphilium multivorum.

Se han marcado 10 ng de producto PCR purificado mediante "random priming" con la ayuda del kit Labelling Q-BlOgene. Se han digerido 10 \mug de ADN genómico de las diferentes cepas a ensayar respectivamente mediante EcoRI o EcoRV y después se han depositado sobre dos geles de agarosa 1%. Después de la migración, se ha transferido el ADN por capilaridad sobre dos membranas de nylon (BIODYNE® Plus membrane, Pall Gelman).

Se ha llevado a cabo una pre-hibridación durante 4 h a 60ºC con un tampón 5x SSC, 5x Dehardt, 1% SDS, 100 \mug/ml de ADN desnaturalizado de pescado.

La hibridación se realiza a continuación durante 16 h a 60ºC con un tampón que contiene 10 ml de tampón de pre-hibridación y 10 ng de la sonda a respectivamente 7.10^{8} y 9.10^{8} cpm/\mug para la membrana 1 (EcoRI) y la membrana 2 (EcoRV) (recuento con contador de centelleos en seco, es decir, en ausencia de centelleo).

Se han realizado a continuación varias fases de lavado:

: 2 lavados: 2x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC

: 2 lavados: 0,5x SCC + 0,1% SDS durante 3 minutos a 20ºC

: 2 lavados: 0,4x SCC + 0,1% SDS durante 15 minutos a 50ºC

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Las membranas han sido reveladas sobre película después de una exposición de 65 h a -80ºC.

No se ha observado ninguna diferencia significativa entre las dos autorradiografías.

Los resultados muestran la presencia, en todas las cepas del género Acidocella ensayadas, de una hibridación selectiva de la sonda que contiene la fase abierta de lectura identificada en el ejemplo 7. Estos resultados sugieren que existe una homología de secuencia significativa entre unos genes de bacterias del género Acidocella y la fase abierta de lectura identificada que codifica para una fitasa. Además, sugieren en gran medida que estos genes codifican asimismo para unas fitasas.

A la inversa, no se ha obtenido ninguna hibridación con la sonda en el seno de los microorganismos del género Acidiphilum. Esta observación está de acuerdo con la ausencia de detección de una actividad fitasa mediante unos métodos microbiológicos en los microorganismos de este género.

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<110> Aventis Animal Nutrition SA

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<120> Nuevas fitasas bacterianas y procedimiento de producción de estas fitasas

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<130> PM 00080

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<140>

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<141>

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<150> FR 0014448

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<151> 2000-11-10

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1665

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> g. Acidocella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(1665)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 554

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> g. Acidocella

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atdatdatng cngtrttytt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcrtcrtasg tgatgatgat sgcsgtrtty tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaratggarg gncaraayat hgg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggaaggcc agaayatcgg cga

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcggcgayc tbctbaaygc caa

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttcatgggtg gcttcgatc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligo30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctgccgcat caggaagttg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: 5'ORF281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taacgataac atatgaatat ccgccgggct ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: 3'ORF281

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atatctgata agcttttatt cggcgtgcgc ggc

\hfill

33

Claims

1. Polinucleótido aislado que codifica para una fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre el grupo constituido por:

(a): un polinucleótido aislado que codifica para la fitasa descrita por el identificador de secuencia SEC ID nº 2

(b): un polinucleótido aislado que se hibrida al polinucleótido según (a) en unas condiciones astringentes

(c): un polinucleótido aislado que presenta por lo menos 70% de identidad con el polinucleótido según (a)

: presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.

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2. Polinucleótido según la reivindicación 1, caracterizado porque está representado por el identificador de secuencia SEC ID nº 1.

3. Polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque procede de una bacteria del género Acidocella.

4. Polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

5. Fitasa caracterizada porque está codificada por un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4, presentando dicha fitasa un pH óptimo de actividad inferior o igual a 4.

6. Fitasa según la reivindicación 5, caracterizada porque se selecciona de entre el grupo constituido por:

(a): la fitasa representada por el identificador de secuencia SEC ID nº 2

(b): una fitasa que presenta por lo menos 70% de identidad con la fitasa según (a)

(c): un fragmento biológicamente activo de una fitasa según (a) o (b).

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7. Fitasa según una de las reivindicaciones 5 ó 6, caracterizada porque procede de una bacteria del género Acidocella.

8. Gen quimérico que comprende por lo menos, unidos entre sí de manera operativa:

(a): un promotor funcional en un organismo hospedante

(b): un polinucleótido según una de las reivindicaciones 1 a 4

(c): un elemento terminador funcional en un organismo hospedante.

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9. Gen quimérico según la reivindicación 8, caracterizado porque comprende, además, un péptido señal o un péptido de tránsito funcional en dicho organismo hospedante.

10. Vector de expresión o de transformación que contiene un gen quimérico según una de las reivindicaciones 8 ó 9.

11. Vector según la reivindicación 10, caracterizado porque es un plásmido, un fago o un virus.

12. Organismo hospedante transformado que contiene un vector según la reivindicación 10.

13. Organismo hospedante según la reivindicación 12, caracterizado porque se trata de un microorganismo.

14. Organismo hospedante según la reivindicación 13, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de entre las bacterias, los hongos, las levaduras o los virus.

15. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es una bacteria seleccionada de entre los géneros Corynebacterium, Streptomyces y Escherichia, en particular E. coli.

16. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es un hongo seleccionado de entre los géneros Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium y Trichoderma.

17. Organismo hospedante según la reivindicación 14, caracterizado porque el microorganismo es una levadura seleccionada de entre los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces y Pichia.

18. Organismo hospedante según la reivindicación 12, caracterizado porque se trata de una célula vegetal, de una planta o de una parte de planta.

19. Extracto bacteriano que comprende por lo menos una actividad fitasa, caracterizado porque procede de una bacteria del género Acidocella y cuyo pH óptimo de actividad de dicha actividad fitasa es inferior o igual a 4.

20. Extracto bacteriano según la reivindicación 19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 70ºC

(b): pH óptimo = 4.

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21. Extracto bacteriano según la reivindicación 19, caracterizado porque la actividad fitasa posee las propiedades siguientes:

(a): temperatura óptima = 60ºC

(b): pH óptimo = 3,5.

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22. Procedimiento de preparación de un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(e): recuperar el sobrenadante que posee la actividad fitasa procedente de la etapa (d).

\vskip1.000000\baselineskip

23. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(f): purificar la fitasa a partir del sobrenadante recuperado en la etapa (e).

\vskip1.000000\baselineskip

24. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): recuperar el medio de cultivo mediante eliminación de las bacterias

(c): purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (d).

\newpage

25. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18

(b): concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)

(c): triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

\vskip1.000000\baselineskip

26. Procedimiento de producción de una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(b): recuperar el medio de cultivo mediante la eliminación de dicho organismo hospedante transformado

(c): purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (b).

\vskip1.000000\baselineskip

27. Composición enzimática, caracterizada porque comprende por lo menos un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21.

28. Composición enzimática, caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

29. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos un organismo hospedante transformado según una de las reivindicaciones 12 a 18.

30. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos una bacteria del género Acidocella que expresa una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

31. Composición alimenticia según la reivindicación 30, caracterizada porque la bacteria se selecciona de entre las especies Acidocella aminolytica y Acidocella facilis.

32. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos un extracto bacteriano según una de las reivindicaciones 19 a 21.

33. Composición alimenticia, caracterizada porque comprende por lo menos una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7.

34. Utilización de una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33, para la alimentación de los animales monogástricos.

35. Utilización de una composición alimenticia según la reivindicación 34, caracterizada porque está destinada a la alimentación de los cerdos.

36. Utilización de una composición alimenticia según la reivindicación 34, caracterizada porque está destinada a la alimentación de las aves de corral.

37. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar un organismo hospedante según una de las reivindicaciones 12 a 18

(b): concentrar el organismo hospedante cultivado en la etapa (a)

(c): incorporar el organismo hospedante aislado en la etapa (b) en dicha composición alimenticia.

\newpage

38. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): incorporar las bacterias aisladas en la etapa (b) en dicha composición alimenticia.

\vskip1.000000\baselineskip

39. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 32, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(f): incorporar el sobrenadante recuperado en la etapa (e) en dicha composición alimenticia.

\vskip1.000000\baselineskip

40. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(b): concentrar las bacterias cultivadas en la etapa (a)

(c): triturar las bacterias aisladas en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

(g): incorporar la fitasa purificada en la etapa (f) en dicha composición alimenticia.

\vskip1.000000\baselineskip

41. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a): cultivar una cepa bacteriana del género Acidocella

(c): purificar la fitasa a partir del medio de cultivo recuperado en la etapa (b)

(d): incorporar la fitasa purificada en la etapa (c) en dicha composición alimenticia.

\vskip1.000000\baselineskip

42. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(b): concentrar el organismo hospedante transformado cultivado en la etapa (a)

(c): triturar el organismo hospedante transformado aislado en la etapa (b)

(d): centrifugar el triturado obtenido en la etapa (c)

\vskip1.000000\baselineskip

43. Procedimiento de preparación de una composición alimenticia según la reivindicación 33, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

44. Procedimiento para aumentar la asimilación del fosfato inorgánico contenido en el ácido fítico de los alimentos a base de vegetales por los animales monogástricos, caracterizado porque se incorpora una fitasa según una de las reivindicaciones 5 a 7 o una composición enzimática según una de las reivindicaciones 27 y 28 en la alimentación de dichos animales.

45. Procedimiento según la reivindicación 44, caracterizado porque se alimenta a dichos animales monogástricos con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.

46. Procedimiento para disminuir la adición de fósforo en la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.

47. Procedimiento para disminuir las emisiones de fósforo procedentes de la alimentación de los animales monogástricos, caracterizado porque se alimenta a dichos animales con una composición alimenticia según una de las reivindicaciones 29 a 33.