FI108299B - Mikrobifytaasia sisältävä koostumus ja sen käyttö - Google Patents

Description

I 08299

Mikrobifytaasia sisältävä koostumus ja sen käyttö (Jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 912530) 5 Tämä keksintö liittyy fytaasin tuottamiseen geeniteknisesti .

Fosfori on välttämätön alkuaine kaikkien organismien kasvulle. Karjankasvatuksessa rehuun on lisättävä epäorgaa-10 nista fosforia, jotta saataisiin aikaan hyvä kasvuteho yksimahaisilla eläimillä (esim. sioilla, siipikarjalla ja kaloilla).

Sitävastoin epäorgaanista fosfaattia ei tarvitse lisätä 15 lainkaan märehtijäeläinten rehuihin. Pötsin mikro-organismit tuottavat entsyymejä, jotka katalysoivat fytaatin (myo-inositoliheksakis-fosfaatin) muuntumisen inositolik-si ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi.

20 Fytaattia esiintyy varastofosforilähteenä käytännöllisesti katsoen kaikissa rehuaineissa, jotka ovat peräisin kasveista (katso kokoomajulkaisu: Phytic acid, chemistry and applications, E. Graf (ed.), Pilatus Press; Minneapolis, MN, U.S.A. (1986)). Fytaattia esiintyy 1-3 % kaikis-25 sa pähkinöissä, viljakasveissa, hernekasveissa, öljysie-menissä, itiöissä ja siitepölyssä. Fytiinihapon (fytic ...: acid) kompleksisuoloja nimitetään fytiiniksi. Fytiiniha- pon ei katsota olevan ravintotekijä, koska se kelatoi : : : mineraaleja, kuten kalsiumia, sinkkiä, magnesiumia, rau- 30 taa, ja se voi myös reagoida proteiinien kanssa, mikä alentaa proteiinin ja ravinteenisten tärkeiden mineraa- .···. lien biologista käyttökelpoisuutta.

* · ·*» • · T Fytaatin sisältämä fosfori läpäisee yksimahaisten eläin- ·♦· 35 ten ruoansulatuskanavan ja erittyy lannan mukana. Vaikka , « fytaatin hydrolysoitumista esiintyy jonkin verran paksus- sasuolessa, siten vapautuneella epäorgaanisella fosforil- *, la ei ole ravinnearvoa, koska epäorgaaninen fosfori imey- • * tyy vain ohutsuolessa. Tästä syystä yksimahaisilla eläi- 2 108299 millä jää käyttämättä merkittävä määrä ravinteellisesti tärkeätä fosforia, huolimatta sen läsnäolosta rehussa.

Fytaattifosforin erittyminen lantaan tuo lisäseuraamuk-5 siä. Laajaperäinen karjankasvatus on lisääntynyt valtavasti kuluneiden vuosikymmenten aikana. Tuotetun lannan määrä on siis lisääntynyt vastaavasti ja aiheuttanut ympäristöongelmia eri puolilla maailmaa. Tämä johtuu osaksi lannan fosfaatin kertymisestä pintavesiin, mikä on 10 aiheuttanut rehevöitymistä.

Mikro-organismien tuottamat entsyymit, jotka katalysoivat fytaatin muuntumisen inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosforiksi, tunnetaan laajalti fytaaseina. Fytaasia tuot-15 tavat mikro-organismit käsittävät bakteereja, kuten Ba- clUus subt11i a (V.K. Paver ja V.J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151, 1102-1108) ja Pseudomonas (D.J. Cosgrove (1970) Austral. J. Biol. Sei. 22, 1207-1220) ; hiivoja, kuten Saccharranycas csravisiae (N.R. Nayini ja P. Marka-20 kis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 11, 24-26); ja sieniä, kuten Aspergi Uus terreus (K. Yamada, Y. Minoda ja S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 12, ; 1275-1282). Monen muun eri Aspargi1Tus-lajin tiedetään tuottavan fytaasia, joista Aspargi1lus fimiurnn tuotta-25 maila fytaasilla on määritetty olevan yksi korkeimmista Τ'. spesifisistä aktiivisuustasoista, samoin kuin parempi ♦ ♦ ♦ *..* lämmönkestävyys kuin fytaaseilla, joita muut mikro-or- * * · *·]/ ganismit ovat tuottaneet (julkaisemattomia havaintoja) .

• · · • · 30 Ajatusta mikrobifytaasin lisäämisestä yksimahaisten * · · eläinten rehuihin on kuvattu aikaisemmin (Ware, J.H., Bluff, L. ja Shieh, T.R. (1967) US-patentti n:o 3 297 s·.' 548; Nelson, T.S., Shieh, T.R., Wodzinski, R.J. ja Ware, J.H. (1971) J. Nutrition 101, 1289-1294). Tähän mennessä . 35 tämän ajatuksen käyttöön soveltaminen ei kuitenkaan ole f ’.· ollut kaupallisesti mahdollista johtuen mikr obi entsyymi- :i tuotannon korkeista kustannuksista (Y.W. Hän (1989) Ani- 3 108299 mal Feed Sei. & Tecnol. 24, 345-350). Epäorgaanista fosforia lisätään yhä taloudellisista syistä yksimahaisten eläinten rehuihin.

5 Mikrobifytaaseille on löydetty myös muita teollisia käyttösovellutuksia. Tyypillinen esimerkki sellaisista käyttösovellutuksista on teollinen tärkkelyksen tuotantoprosessi viljakasveista kuten maissista ja vehnästä. Jätetuotteet, jotka käsittävät esim. maissigluteenirehuja 10 sellaisesta märkäjauhatusprosessista, myydään eläinten rehuksi. Fytaasia voidaan lisätä liotusprosessin aikana. Olosuhteet (t * 50°C ja pH = 5,5) ovat ihanteelliset sienten fytaaseille (katso esim. eurooppalainen patenttihakemus 0 321 004, Alko Oy). Tämän prosessin jätetuot-15 teista saadut eläinrehut sisältävät edullisesti fosfaattia fytaatin sijasta.

On myös arveltu, että fytaaseja voidaan käyttää soijan prosessoinnissa (katso Alkon Finase™ Enzymes, Alko Oy:n, 20 Rajamäki, Suomi, julkaisema tuoteinformaatioesite). Soijapapu jauhe sisältää suuria määriä ravinteellisesti huonoa fytaattia, joka tekee tästä proteiinilähteestä sopimattoman käytettäväksi vauvan ruoissa ja kalojen, vasikoiden ja muiden ei-märehtijoiden rehuissa. Tämän arvok-25 kaan proteiinilähteen laadun entsymaattinen kohottaminen lisää tämän aineen ravinteellista ja kaupallista arvoa.

• · · • · • · · • · ·

Muut tutkijat ovat kiinnostuneet karakterisoimaan parem- « « « min erilaisia fytaaseja ja parantamaan näiden fytaasien 30 tuotantomenetelmiä ja käyttöä. Ullah on julkaissut mene- • · · telmän fytaasin puhdistamiseksi villityyppisestä Aspei— • ’s gillus -ficuumi staf samoin kuin määrittänyt useita tällä ,<<·, puhdistusmenetelmällä saadun tuotteen biokemiallisia • · • ’**. parametreja (Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem. 18., • · 35 443-458). Ullahin saamia asiaan liittyviä tuloksia esite- • *.* tään taulukossa 1 jäljempänä.

• * 4 108299

Ullah on kahdesti tuonut esille Δ. ficuumin fytaasiprote-iinin N-pään aminohapposekvenssin, Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering conference IX, lokakuun 4-8., 1987, Santa Barbara, California (posteriesitys); ja Ullah, A.

5 (1988b) Prep. Biochem. 18., 459-471. Ullahin saamat amino- happosekvenssitulokset esitetään kuviossa IA, sekvenssi E, jäljempänä.

Useita kiinnostavia havaintoja voidaan tehdä Ullahin jul-10 kaisuista. Ennen kaikkea, Ullahin (1988a ja 1988b) kuvailema "puhdistettu" valmiste muodostaa kaksi proteiinivyö-hykettä SDS-PAGE:11a. Olemme kuitenkin havainneet, että Δ. ficuumista puhdistettu fytaasi sisältää kontaminantin, ja että yksi SDS-PAGE:11a todetuista vyöhykkeistä, jotka 15 Ullah identifioi fytaasiksi, saa alkunsa tästä kontami-nantista.

Tämä eroavuus selviää myös Ullahin (1987, 1988b; vertaa kuvio IA, sekvenssejä A ja B sekvenssiin C) julkaisemista 20 aminohapposekvensointituloksista. Olemme itse asiassa määrittäneet, että yksi Ullahin kuvaileman fytaasin sisäisten peptidien aminohapposekvensseistä (katso kuvio IB, sekvenssi E) tosiaankin kuuluu kontaminoivalle 100 : kDa proteiinille (kuvio 1C), jota on läsnä valmisteessa, 25 joka on saatu Ullahin kuvaileman menetelmän avulla, ja 4 Ί]'. nähdään yhtenä kahdesta vyöhykkeestä SDS-PAGE: 11a (Ullah, 1988a ja 1988b) . Ullah ei tunnista sellaisen kontaminoi- * · · van proteiinin läsnäoloa, ja sen sijaan identifioi sen • · · ’·* * toiseksi fytaasimuodoksi. Sellaisen kontaminaation läs- 30 näolo vuorostaan lisää vaikeutta valittaessa ja eristet- II· ί.,.ί täessä varsinaista nukleotidisekvenssiä, joka koodaa ·***: fytaasiaktiivisuutta. Sen lisäksi kontaminaation läsnäolo alentaa testatun proteiinin spesifistä aktiivisuutta.

• 35 Tarkastelemalla edelleen Ullahin julkaisemaa sekvenssiä | · tulisi huomata, että aminohappotähde paikassa 12 on uila- ·:·*: hin toimesta esitetty glysiiniksi. Keksintöön liittyen on 5 108299 vastaavasti todettu, käytettäessä proteiinin ja DNA:n sekvensointimenetelmiä, että tämä tähde ei ole glysiini, vaan tosiasiassa kysteiini (katso kuviot 6 ja 8).

5 Lopuksi Ullah esittää, että fytaasi on 85 kDa proteiini, jonka molekyylipaino deglykosylaation jälkeen on 61,7 kDa (Ullah, 1988b). Tämä luku, joka on paljon alhaisempi kuin aikaisemmin esille tuotu 76 kDa proteiini (Ullah, A. ja Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(l), 63-91), perustui 10 hydrolyysissä vapautuneiden hiilihydraattien suhteelliseen määrään ja natiivin proteiinin näennäiseen molekyy-lipainoon SDS-PAGE:11a. Keksinnön mukaan on kuitenkin todettu, että glykosyloidulla fytaasilla on yksi 85 kDa näennäinen molekyylipaino, kun taas deglykosyloidun pro-15 teiinin näennäinen molekyylipaino on alueella 48 - 56,5 kDa, riippuen deglykosylaatioasteesta.

Mullaney et ai. (Filamentous Fungi Conference, huhtikuussa 1987, Pacific Grove, California (posteriesitys) tuovat 20 myös esille fytaasin karakterisoinnin Δ. ficuumista. Tämä raportti sisältää kuitenkin myös maininnan kahdesta pro-teiinivyöhykkeestä SDS-PAGE:11a, toinen 85 kDa ja toinen 100 kDa, jotka olivat läsnä "puhdistetussa" proteiinivalmisteessa. Tekijät identifioivat molemmat näistä prote-25 iinivyöhykkeistä fytaasimuodoiksi. Menetelmä mikrobi- isäntien transformoimiseksi ehdotetaan, mutta sitä ei ole • · · selostettu. Fytaasia koodittavan DNA-sekvenssin kloonaus- • · · ta ja eristämistä ei ole kuvailtu.

• ♦ ♦ • « * • ♦ « • 30 Tulee ymmärtää, että taloudellisesta menetelmästä fytaa-:***: sin tuottamiseksi tulee olemaan merkittävää hyötyä muun ·"*: muassa eläinrehuteollisuudelle. Eräs menetelmä taloudel- M· lisemman fytaasin tuottamiseksi olisi yhdistelmä-DNA-tek- • · nilkan käyttäminen entsyymin ilmenemistasojen kohotta-35 miseksi eri mikro-organismeissa, joiden tiedetään tuotta-i van suuria määriä ilmentyneitä peptidejä tai proteiineja.

t · 6 108299 Tähän mennessä ei kuitenkaan ole julkaistu fytaasia koo-daavan DNA-sekvenssin eristämistä ja kloonausta.

Tämä keksintö liittyy puhdistettuun ja eristettyyn DNA-5 sekvenssiin, joka koodaa sieniperäistä fytaasia, joka katalysoi ainakin yhden epäorgaanisen fosfaatin vapauttamista myoinositolifosfaatista, jolle on tunnusomaista että kyseinen DNA-sekvenssi a) sisältää nukleotidisek-venssin, joka koodaa kuviossa 8 esitetyn aminohapposek-10 venssin asemia -23 - 444 tai asemia +1 - 444, b) sisältää kuviossa 6 tai kuviossa 8 esitetyn nukleotidisekvenssin tai c) hybridisoituu melko lievissä olosuhteissa (6 x SSC, 50 °C yön yli, pesu 6 x SSC huoneenlämmössä) DNA-fragmentin, joka vastaa kuviossa 6 esitetyn nukleotidi-15 sekvenssin asemien 210 - 1129 cDNA:ta, kanssa. Tämän fytaasia koodaavan DNA-sekvenssin eristäminen ja kloonaus on saatu aikaan käyttämällä spesifisiä oligonukleotidi-koettimia, jotka kehitettiin erityisesti tätä keksintöä varten. Edullisia fytaaseja koodaavia DNA-sekvenssejä on 20 saatavissa Aspe-rgi Tlus-smnin rihmasienistä.

Tähän keksintöön liittyen on saatu aikaan vektori, joka sisältää ekspressiorakenteen, joka edelleen sisältää vähintään yhden kopion vähintään yhtä, edullisesti homo- ’ 25 logista fytaasia koodaavaa DNA-sekvenssiä, joka on toi- *!", minnallisesti kytketty sopivaan säätelyalueeseen, joka • * ♦ ·./ kykenee ohjaamaan fytaasin korkeaa ilmenemistasoa sopi- • » · *·' * vassa ekspressioisännässä.

• · · • · « • « · * 30 Ekspressiorakenne voidaan liittää vektoriin, edullisesti 11« plasmidiin, joka kykenee transformoimaan mikrobi-isäntä- ·***: solun ja kiinnittymään genomiin.

• « · • ·

Sieni-isäntä voidaan transformoida vektorilla, jota ku-35 vailtiin edellisessä kappaleessa. Edulliset transformoi- : dut isännät ovat Aspergi li us- ja Trichoderma-sukujen ·;·: rihmasieniä, XTuyveromyces- ja Saccharomyces-sukujen 7 108299 hiivoja. Erityisen edullisia ekspressioisäntiä ovat Aspergi Tlus-siivun rihmasienet. Transformoidut isännät kykenevät tuottamaan korkeita rekombinanttifytaasitasoja taloudellisessa, teollisessa mitassa.

5

Menetelmässä fytaasin valmistamiseksi edellä mainittua transformoitua sieni-isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka edistävät fytaasin tuotantoa.

10 Keksintö koskee siten koostumusta, joka sisältää Asper- gillus-fytaasia, joka katalysoi ainakin yhden epäorgaanisen fosfaatin vapautumista myoinositolifosfaatista ja jota fytaasia koodittaa DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu vähemmän ankarissa olosuhteissa (6 x SSC, 50 °c yön yli) 15 koettimeen, joka sisältää kuviossa 8 esitetyn nukleotidin asemat 1-818, jolle on tunnusomaista, että koostumus ei sisällä olennaisia määriä Aspergrillus-happofosfataasia, jonka N-pään aminohapposekvenssi on Vai Vai Asp Glu Arg Phe Pro Tyr Thr Gly.

20

Keksintö koskee myös menetelmiä eläinten kasvun edistämiseksi sekä fytaattitasojen alentamiseksi eläinlannassa, joissa menetelmissä eläintä ruokitaan ruokavaliolla, joka ; sisältää keksinnön mukaista koostumusta. Lisäksi keksintö ’ 25 koskee koostumuksen käyttöä.

t I I t I t • · * **.*· Ullahilta saadun puhdistetun, villityyppisen A. ficuum- • · * fytaasin biokemiallisten parametrien vertaaminen toiseen

• M

v * puhdistettuun, villityyppiseen A. JEicmim-fytaasiin, joka 30 on saatu tässä kuvatun mukaisesti, esitetään taulukossa 1 i\m'i jäljempänä. Erityisen merkille pantavia ovat tulokset * ·“** spesifisestä aktiivisuudesta, jossa yhteydessä osoite- • · · taan, että tässä kuvatun mukaisesti saadun puhdistetun *"[ proteiinin spesifinen aktiivisuus on kaksinkertainen 35 Ullahin julkaisemaan spesifiseen aktiivisuuteen nähden.

« * t • « * t · • < « t > • · 8 108299 Tässä hakemuksessa kuvataan lisäksi nukleotidisekvensse-jä, jotka koodittavat proteiineja, joissa on fytaasiak-tiivisuutta, samoin kuin näiden proteiinien aminohapposekvenssejä. Aikaansaatuja sekvenssejä voidaan käyttää 5 oligonukleotidikoettimien konstruointiin, joita vuorostaan voidaan käyttää hybridisaatioseulontatutkimuksissa fytaasigeenien identifioimiseksi muista lajeista, erityisesti mikrobilajeista, jotka voidaan sen jälkeen eristää ja kloonata.

10 Näin tuotettuja sekvenssejä voidaan käyttää myös lähtöaineina "toisen sukupolven" fytaasien konstruointiin.

"Toisen sukupolven" fytaasit ovat fytaaseja, muunnettuina mutatointitekniikoiden avulla (esim. paikkakohdennettu 15 mutatointi), joilla on ominaisuuksia, jotka poikkeavat villityyppisten fytaasien tai rekombinanttifytaasien, jollaisia tähän keksintöön liittyen on tuotettu, ominaisuuksista. Esimerkiksi lämpötilaa tai pH-optimia, spesifistä aktiivisuutta tai substraattiaffiniteettia voidaan 20 muuttaa niin, että ne sopivat paremmin käytettäväksi määrätyssä prosessissa.

·.. Tämän keksinnön yhteydessä ilmaisu fytaasi käsittää ent- syymiperheen, jotka katalysoivat reaktioita, jotka käsit-' 25 tävät epäorgaanisen fosforin poistamisen erilaisista ···· myoinositolifosfaateista.

• · · • · · « · • · · ·.· · Fytaasiaktiivisuus voidaan määrittää muutamalla määrityk- • « * · sellä, joiden valinta ei ole ratkaisevaa tämän keksinnön 30 kannalta. Fytaasiaktiivisuus voidaan määrittää esimerkik- :***; si määrittämällä entsyymimäärä, joka vapauttaa epäorgaa- • · · .···. nista fosforia 1,5 mM natriumfytaatista nopeudella l ...* #;t μπιοΐ/min 37 °C:ssa ja pH :ssa 5,50.

• « • · » t ' : 35 Tulisi huomata, että ilmaisuun "fytaasi", johon viitataan i‘-‘; kauttaaltaan tämän selityksen tekstissä, on tarkoitus si- säilyttää kaikki peptidit ja proteiinit, joissa on fytaa- 9 108299 siaktiivisuutta. Tätä kohtaa valaistaan kuviossa IA, jossa verrataan sekvenssejä A ja B (sekvenssejä, jotka on saatu tämän työn kuluessa) sekvenssiin C (Ullahin julkaisema, 1988b). Kuva osoittaa, että proteiineja voidaan S saada aikaan tämän keksinnön avulla, joista puuttuu A. fiemmin valmiin fytaasiproteiinin neljä ensimmäistä aminohappoa (sekvenssin A proteiinista puuttuu seitsemän ensimmäistä aminohappoa). Näissä proteiineissa kuitenkin on jäljellä fytaasiaktiivisuutta. Fytaasiproteiinin täy-10 dellinen aminohapposekvenssi, johdettuna vastaavasta nukleotidisekvenssistä, esitetään kuviossa 8.

Tässä kuvatun mukaisesti tuotettuja fytaaseja voidaan käyttää useassa eri prosessissa, joissa tarvitaan fytaa-15 tin muuntamista inositoliksi ja epäorgaaniseksi fosfaatiksi .

Fytaasituotanto tässä kuvatun mukaisesti alentaa esimerkiksi mikrobifytaasien tuotantokustannuksia, mikä mahdol-20 listaa sen taloudellisen käytön eläinrehussa, mikä lopulta johtaa in vivo hinta/teho-suhteeseen, joka on kilpailukykyinen epäorgaanisen fosfaatin kanssa. Lisäetuna lannan fosforipitoisuus alenee tuntuvasti.

I <

I « I

4 I

/ 25 Tulee ymmärtää, että epäorgaanisen fosfaatin hinnan kans- • · < ·;·:^ sa kilpailukykyisenä saatavien fytaasien käyttö lisää ·. 1 2: rehuseosteollisuuden mahdollisuuksia tuottaa korkealaa- • · · : tuista rehua. Kun rehuun esimerkiksi lisätään fytaasia, : : epäorgaanisen fosfaatin lisääminen voidaan jättää pois, 30 ja erilaisten fytaattia sisältävien raaka-aineiden pitoi- ·3. suutta voidaan lisätä.

• · • · φ « · · < · · i

Eläinrehuissa ja soijan prosessoinnissa käytön lisäksi, 2 • « , joita edellä on käsitelty, tässä kuvatun mukaisesti saa- '·"· 35 tua fytaasia voidaan käyttää myös monenlaisissa teol- lisissä käyttösovellutuksissa kuten esimerkiksi: 3 • · ίο 108299 - nestemäisessä rehussa sioille ja siipikarjalle. On tullut yleiseksi käytännöksi liottaa rehua useita tunteja ennen ruokkimista. Tämän jakson aikana entsyymin on mahdollista muuttaa fytaatti inositoliksi ja epäorgaaniseksi 5 fosfaatiksi; - teollisessa prosessissa inositolin tai inositolifos-faattien tuottamiseksi fytaatista; - muissa teollisissa prosesseissa, joissa käytetään substraatteja, jotka sisältävät fytaattia, kuten esimerkiksi 10 tärkkelysteollisuudessa ja fermentointiteollisuuksissa kuten panimoteollisuudessa. Fytaatin aiheuttama metalli-ionien kelatoituminen voi aiheuttaa sen, ettei näitä mineraaleja ole saatavilla mikro-organismituotannossa. Fytaatin entsymaattinen hydrolyysi ehkäisee nämä ongel-15 mat.

Nämä ja muut tämän keksinnön mukaiset kohteet ja edut selviävät seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta.

20 Kuvio 1. A. N-terminaaliset aminohapposekvenssit määri tettynä puhdistetulle fytaasille. Ailia ja B:llä merkityt aminohapposekvenssit saavat alkunsa fytaasin alamuodoista, joiden isoelektriset pisteet ovat 5,2 ja vastaavasti 5,4. Sekvenssi C on siteerattu Ullahilta (1987, 1988b, 25 supra). Sekvenssien A ja B paikassa 12 sijaitseva aminohappotähde ei tämän keksinnön mukaisesti määritettynä ole • · glysiinitähde. [* tarkoittaa yksiselitteistä identifioin- · tia. ** tarkoittaa ettei tähdettä ole havaittu.] B. CNBr-katkaistujen sisäisten fytaasifragmenttien N-ter-30 minaaliset aminohapposekvenssit. A:11a ja B:llä merkityt .···. aminohapposekvenssit (näennäisiltä molekyylipainoiltaan .···. suunnilleen 2,5 kDa ja vastaavasti 36 kDa peptidejä) on * “* aikaansaatu tämän keksinnön avulla. Sekvenssit C - E on • · * siteerattu Ullahilta (1988b, supra) .

35 c. 100 kDa proteiinin N-terminaalinen aminohapposekvens-si, jonka on tämän keksinnön mukaisesti havaittu olevan läsnä fytaasin raakanäytteissä.

t 108299 π

Kuvio 2. A. Oligonukleotidikoettimet, jotka on konstruoitu tulosten pohjalta kuviosta IA, peptidit A - E.

B. Oligonukleotidikoettimet, jotka on konstruoitu tulosten pohjalta kuviosta IB, peptidit A ja B.

5

Kuvio 3. Hapanta fosfataasia koodattavan geenin eristykseen käytetyt oligonukleotidikoettimet.

Kuvio 4. Restriktiokartta bakteriofagista lambda AF201, 10 joka sisältää A. f i cummin fytaasilokuksen. Nuoli osoittaa fytaasigeenin paikan ja kopiointisuunnan. Klooni # osoittaa subkloonit, jotka on saatu osoitetuilla restriktio-entsyymeillä fagista AF201 pAN 8-l:ssä (pAF 28-1:n osalta) ja pUC19:ssa (kaikkien muiden subkloonien osalta).

15

Kuvio 5. pAF 1-1:n fysikaalinen kartta. 10 ke BamHI-frag-mentti, liitettynä pUCl9:iin, sisältää koko geenin, joka koodittaa hapanta fosfataasia A. f1 omimista.

20 Kuvio 6. Kooste nukleotidisekvensseistä koskien plasmide-ja pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7, joka käsittää kromosomaa-lisen fytaasigeenilokuksen. Fytaasin koodausalue sijaitsee nukleotidipaikasta 210 paikkaan 1713; introni on läsnä kromosomaalisessa geenissä nukleotidipaikasta 254 25 paikkaan 355. Asiaankuuluvat yksityiskohdat, kuten rest- ·«·! riktiokohdat, fytaasin aloitus- ja lopetuskodonit ja int- • · ronikohta osoitetaan.

• · · • · · • * « » :T: Kuvio 7. Yksityiskohtainen fysikaalinen kartta sekvensoi- 30 dusta fytaasin kromosomaalisesta lokuksesta; nuolet .··*. osoittavat fytaasia koodaavan alueen kahden eksonin si- , .···. jainnin.

• « ♦ «

Kuvio 8. Fytaasin cDNA-fragmentin luetun alueen nukleoti-35 disekvenssi ja fytaasiproteiinin johdettu aminohapposek-venssi; valmiin fytaasiproteiinin alku osoitetaan paikka-... : na +1. 36 kDa sisäisen proteiinifragmentin aminopää si- 12 108299 jaitsee aminohappopaikassa 241, kun taas 2,5 kDa prote-iinifragmentti alkaa aminohappopaikassa 390.

Kuvio 9. Fytaasin ekspressiokasetin pAF 2-2S fysikaalinen 5 kartta. Nuolet osoittavat geenien kopiointisuunnan.

Kuvio 10. IEF-PAGE tuloskuvio fytaasin liikailmenemisestä A. f-icuum NRRL 3135 -transformantissa. Yhtä suuret tilavuudet A. fiomimin (kaista 1) ja transformantin pAF 2-2S 10 SP7 (kaista 2) kasvustojen supernatanteista, joita oli kasvatettu identtisissä olosuhteissa, analysoitiin Phast-System (Pharmacia) IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5-6. Vertailun vuoksi mukaan sisällytettiin näyte A. fiomimin fytaasista, puhdistettuna homogeeniseksi, joko erikseen 15 (kaista 4) tai sekoitettuna kasvuston supernatantin kanssa (kaista 3). Geelit värjättiin joko tekstissä kuvaillulla fosfataasivärillä (A) tai yleisellä proteiiniväril-lä (Coomassie Brilliant Blue, B). Fytaasivyöhykkeet osoitetaan tähdellä.

20

Kuvio 11. IEF-PAGE tuloskuvio fytaasin liikailmentymi-selle A. niger CBS 513.88 -transformanteissa. Yhtä suuret tilavuudet A. niger -lähtökannan (kaista 1) tai transfor-manttien pAF 2-2S #8 (kaista 2), pFYT3 #205 (kaista 3) & 25 #282 (kaista 4) kasvustojen supernatanteista analysoitiin IEF-PAGE:n avulla kuten kuvion 10 kuvaselityksessä on • * ·.**: kuvailtu. Geelit värjättiin joko yleisellä fosfataasiak- • · · V · tiivisuusvärillä (A) tai yleisellä proteiinivärillä (B).

: : : Fytaasivyöhykkeet osoitetaan tähdellä.

30

.···. Kuvio 12. pAB 6-1:n fysikaalinen kartta. 14,5 ke HindITT

.···. DNA-insertti pUC19:ssa sisältää koko glukoamylaasi (AG)- *·’ lokuksen A. nigeristä.

35 Kuvio 13. Kaavakuva AG-promoottori/fytaasigeeni -fuusioi-den muodostamisesta polymeraasiketjureaktion (PCR) avul- 13 108299 la. Kaikkien käytettyjen oligonukleotidialukkeiden sekvenssit esitetään tekstissä.

Kuvio 14. Fysikaalinen kartta fytaasin ekspressiokasetis-5 ta pAF 2-2SH.

Kuvio 15. Fysikaaliset kartat välirakenteista pXXFYTl, pXXFYT2 ja fytaasin ekspressiokasetista pXXFYT3, joissa XX ilmaisee ohjaussekvenssin (L). pl8FYT#:ssa ja vastaa-10 vasti p24FYT#:ssa 18 aa ja 24 aa AG-ohjaussekvenssit ovat liitettyinä, kun taas pFYT#:ssa käytetään fytaasin oh-jaussekvenssiä.

Kuvio 16. Plasmidin pFYT3AamdS fysikaalinen kartta.

15

Kuvio 17. Plasmidin pFYT3INT fysikaalinen kartta.

Kuvio 18. Fytaasi/AG-vaihtovektorin pREPFYT3 fysikaalinen kartta.

20

Kuvio 19. Autoradiogrammit kromosomaalisesta DNA: sta, pilkottuna Emil:11a (A) ja BamHI:llä (B) ja hybridisoi-tuna 32P-leimatun koettimena olevan A. flcuumin fytaasin cDNA:n kanssa mikrobilajeista S. cerevisiae (kaista 2);

• · I

25 B. subti1 is (kaista 3); K. lactis (kaista 4); E. chryso- ··<: genum (kaista 5); E. aeruginosa (kaista 6); £. 1 ividans • · (kaista 7); A. niger l μg (kaista 8); A. nlger 5 μg (kai- • · · · sta 9) ; sokea (kaista 10); C. thermocellum (kaista 11) .

:T: Kaista 1: markkeri-DNA.

30 .·**. Geenien kloonaus, jotka koodaavat mikro-organismin tuot- ··· .···. tamia valikoituja proteiineja, voidaan saada aikaan ’** usealla eri tavalla. Eräs menetelmä käsittää sen, että ·...1 puhdistetaan kiinnostuksen kohteena oleva proteiini, f ':35 määritetään sen jälkeen sen N-terminaalinen aminohappo-sekvenssi ja seulotaan mainitun mikro-organismin geeni- • · kirjasto käyttäen DNA-oligonukleotidikoetinta, joka pöh- 14 108299 jautuu mainittuun N-terminaaliseen aminohapposekvenssiin. Esimerkkejä tämän menetelmän onnistuneesta soveltamisesta ovat Cephalosporium acremonjumin isopenisilliini N-synte-taasi -geenin kloonaus (S.M. Samson et ai. (1985) Nature 5 318, 191-194) ja AspergiIina oryzaen TAKA-amylaasia koo- daavan geenin eristäminen (Boel et ai. (1986) EP-A-0238023).

Tätä menetelmää käyttäen on yritetty eristää Aspergi1 Tus 10 fiouumin geeni, joka koodaa fytaasia. Proteiini on perusteellisesti puhdistettu ja useita biokemiallisia parametreja on määritetty. Saatuja tuloksia on verrattu Ullahin (1988a) julkaisemiin tuloksiin. Molemmat tulossarjat esitetään taulukossa 1 jäljempänä.

15

Taulukko 1

Puhdistetun viΠityyppi sen A. ficuumin fytaasin biokemiallisia parametreja 20 Parametri Tämä keksintö ITI 1 ah

Spesifinen aktiivisuus* 100 U/mg proteiinia 50 U/mg proteiinia

Puhtaus: SDS-PAGE 85 kDa 85/100 kDa • / 25 IEF-PAGE 3 tai 4 vyöhykettä ei tehty • · « « • · '. *: Km /affiniteetti- : j : vakio) 250 μΜ 40 μΜ • · · # · · • · · 30 Spesifisyys: .··*. Inositoli-l-P:lie ei aktiivinen ei aktiivinen • · » · · .···. Inositoli-2-P:lie Km = 3,3 mM 5 %:n aktiivi- 2* suus '·"· 35 pH-optimi 2,5 ja 5,5 2,5 ja 5,5 • · · Lämpöt.optimi (°C) 50 58 • · 15 108299 MW (KDa)** 85 85 ja 100 MW (glykosyloimaton) 56,5 61,7

Isoelektrinen piste*** 5,0-5,4 4,5 5 * Ullah mittaa fytaasiaktiivisuuden 58 °C:ssa mieluummin kuin 37 °C:ssa. Fytaasiaktiivisuusyksikkö määritellään siksi määräksi entsyymiä, joka vapauttaa epäorgaanista fosforia 1,5 mM natriumfytaatista nopeudella 1 jumoolia/-10 min. 37 °C:ssa ja pH:ssa 5,50. Fermentointisaantojen ja spesifisten aktiivisuuksien vertailemiseksi Ullahin julkituomat aktiivisuudet korjattiin lämpötilaeron osalta. Korjaus perustuu eroavuuteen fytaasiaktiivisuudessa mitattuna 37 °C:ssa ja 58 °C:ssa, kuten Ullahin taulu-15 kossa III on esitetty (1988b).

** Näennäinen molekyylipaino määritettynä SDS-PAGE:lla.

*** Määritettynä IEF-PAGE:n avulla, 20

Fytaasia koodaavan geenin eristämiseksi konstruoitiin ensimmäinen oligonukleotidikoetinsarja edellä kuvaillun menetelmän mukaisesti (kuvio 2A). Näiden koettimien konstruointi perustui aminohapposekvenssituloksiin. Kont-25 rollina koko menettelylle suoritettiin samanlaiset vai-heet hapanta fosfataasia koodittavan geenin eristämisek- • · :.1·· si, käyttäen siinä yhteydessä Ullahin ja Cumminsin ((1987) Prep. Biochem. 12, 397-422) julkaisemia proteii- nituloksia. Happamen fosfataasin osalta vastaava geeni on 30 eristetty ilman vaikeuksia. Fytaasin kohdalla tilanne .···, näytti kuitenkin olevan erilainen. Monista yrityksistä • · huolimatta, joissa käytettiin N-terminaalisesta aminohap-posekvenssistä saatuja koettimia, genomisesta kirjastosta

4 t I

ei voitu eristää yhtään genomista DNA-fragmenttia tai 35 kloonia, jotka voitaisiin positiivisesti identifioida :v. fytaasia koodaavan geenin sisältäväksi.

• » • « I » t ♦ 16 108299 Tämän ongelman voittamiseksi puhdistettu fytaasi saatettiin CNBr-ohjattuun katkaisuun ja tuloksena olevat prote-iinifragmentit eristettiin. Näiden fragmenttien N-ter-minaaliset aminohapposekvenssit määritettiin (kuvio IB), 5 ja uusia oligonukleotidikoettimia konstruoitiin, jotka pohjautuivat uusiin lähtökohtiin (kuvio 2B). Uudet oli-gonukleotidikoettimet tunnistivat yllättäen spesifisiä DNA-fragmentteja ja olivat sopivia yksiselitteisesti tunnistamaan klooneja genomisesta kirjastosta. Yhtään 10 ristihybridisaatiota ei havaittu uusien kloonien tai niistä eristettyjen DNA-fragmenttien ja ensimmäisen oli-gonukleotidikoetinsarjän tai ensimmäistä koetinsarjaa käyttämällä eristettyjen kloonien välillä.

15 Tulee ymmärtää, että myös tätä toista koetinsarjaa voidaan käyttää läheisesti yhteen kuuluvien fytaasien koodi-tussekvenssien identifioimiseksi.

Vasta eristettyjä klooneja käytettiin koettimina Northern 20 hiot -hybridisaatioissa. Erillistä mRNA:ta voitiin detek-toida vain, kun mRNA eristettiin fytaasia tuottavasta rihmastosta. Hybridisaatiosignaalia ei havaittu, kun fytaasia tuottamattomasta rihmastosta peräisin olevaa RNA:ta kokeiltiin. mRNA:n koko on noin 1800 emästä, mikä ' "> 25 tuottaa teoreettisesti proteiinia, jonka maksimaalinen molekyylipaino on noin 60 kDa. Tämä arvo vastaa molekyy- • · lipainoa, joka on määritetty glykosyloimattomalle prote-iinille, ja molekyylipainoa DNA-sekvenssistä johdetulle proteiinille.

30 .···, Sen lisäksi, siirrettäessä sienisoluun transformaation • · avulla, voitiin osoittaa lisääntymistä fytaasiaktiivisuu- *1* dessa. Tämä osoittaa ratkaisevasti, että fytaasia koodit- tava nukleotidisekvenssi on todella eristetty. Aminohap- 35 posekvenssit, jotka on määritetty puhdistetulle fytaasi- ;·*·, entsyymille ja siitä saaduille CNBr-fragmenteille, ovat • * yhteneväiset aminohapposekvenssin kanssa, joka on johdet- 17 108299 tu sekvenssistä, joka määritettiin kloonatulle geenille. Nukleotidisekvenssi ja johdettu aminohapposekvenssi esitetään kuvioissa 6 ja 8, ja ne valaisevat edelleen fytaa-sia koodittavaa kloonattua sekvenssiä.

5

Fytaasia koodattavan nukleotidisekvenssin eristäminen mahdollistaa fytaasin taloudellisen tuotannon teollisessa mitassa soveltamalla käytäntöön uudenaikaista rekombi-nantti-DNA-tekniikkaa kuten geenin monistamista, säätely-10 elementtien vaihtoa kuten esimerkiksi promoottorien, eri-tyssignaalien tai niiden yhdistelmien.

Tähän keksintöön liittyy sen mukaisesti myös transformoitu ekspressioisäntä, joka kykenee tehokkaasti ilmentämään 15 korkeita peptidi- tai proteiinitasoja, joissa on fytaasi-aktiivisuutta, ja tarvittaessa tehokkaasti ilmentämään myös happamia fosfataaseja. Kiinnostuksen kohteena olevat ekspressioisännät ovat rihmasieniä, jotka valikoidaan suvuista Aspergi Uus ja Trichoderma f hiivoja, jotka vali-20 taan suvuista κιnyvaroniycas ja Saccharomyces. Edullisesti valitaan ekspressioisäntä, joka kykenee erittämään tehokkaasti endogeenisiä proteiinejaan.

Erityisen kiinnostavia ovat teolliset Aspargillus-kannat, 25 erityisesti niger, ficmun, awamori tai nrysae. Vaihtoeh-toisesti voidaan käyttää mikrobeja Trinhode-rma raasei tai • ·

SaecharomycBS narevi si aa.

• M • · « • · « « ·*·*; Ekspressiorakenne sisältää nukleotidisekvenssejä, jotka 30 koodaavat ilmennettävää haluttua entsyymituotetta, ja .···, sisältää tavallisesti signaalisekvenssin, joka on isän- • · nässä toimiva ja huolehtii peptidi- tai proteiinituotteen T erityksestä.

*« * « · « 4 • · · « *ί"5 35 Voidaan käyttää useita eri signaalisekvenssejä. Signaali- :v. sekvenssiä, joka on homologinen ilmennettävän kloonatun • · *.,*· nukleotidisekvenssin suhteen, voidaan käyttää. Vaihtoeh- 18 108299 toisesti voidaan käyttää signaalisekvenssiä, joka on homologinen tai olennaisesti homologinen isännän kohde-lokuksessa olevan geenin signaalisekvenssin kanssa homologisen rekombinaation helpottamiseksi. Lisäksi voidaan 5 myös käyttää signaalisekvenssejä, jotka on konstruoitu aikaansaamaan parannettu erittyminen valikoidusta ekspressioisännästä. Katso esimerkiksi von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133f 17-21; ja Perlman ja Halverson (1983) J. Mol. Biol. 167f 391-409. Signaalisekvenssiä 10 koodaava DNA-sekvenssi voidaan yhdistää suoraan proses-sointisignaalia (katkaisun tunnistuskohta) koodaavan sekvenssin välityksellä sekvenssiin, joka koodaa haluttua proteiinia, tai lyhyen, tavallisesti vähemmän kuin kymmenen kodonia, sillan välityksellä.

15 Tämän keksinnön piirissä käytettäväksi tarkoitetut sekre-tionaaliset signaalisekvenssit ovat signaalisekvenssejä, jotka ovat homologisia ilmennettävän kloonatun nukleoti-disekvenssin suhteen, 18 aminohappoa käsittävä glukoamy-20 laasin (AG) signaalisekvenssi ja 24 aminohappoa käsittävä glukoamylaasin (AG) signaalisekvenssi, kahden jälkimmäisen ollessa joko homologisia tai heterologisia ilmennettävän nukleotidisekvenssin suhteen.

25 Ekspressiotuote tai kiinnostuksen kohteena oleva nukleo-·’.'·· tidisekvenssi voi olla DNA, joka on homologinen tai hete- rologinen ekspressioisännän suhteen.

• · · ♦ · « • · · "Homologinen" DNA määritellään tässä yhteydessä DNA:ksi, .··. 30 joka on peräisin samasta suvusta. Esimerkiksi, Aspergil- * · lus transformoidaan Aspergilluksen DNA: 11a. Tällä tavalla on mahdollista parantaa sienisuvun jo olemassa olevia • » · ominaisuuksia tuottamatta uusia ominaisuuksia, joita su-vussa ei aikaisemmin ollut läsnä.

35 ’ "Heterologinen" DNA määritellään DNA:ksi, joka on peräi- • « sin useammasta kuin yhdestä suvusta, so., kuten edellisen 19 108299 kappaleen esimerkistä seuraa, DNA:ta, joka on peräisin muusta suvusta kuin Aspergi Uus, joka sen jälkeen ilmennetään Aspergi!1uksessa.

5 Fytaasia koodittavat nukleotidisekvenssit saadaan sieni-lähteestä. Edullisia ovat fytaasia koodittavat nukleotidisekvenssit, jotka saadaan Aspergi1lus-suvusta. Edullisimmat sekvenssit saadaan lajeista Aspergi1lus finuum tai Aspergi Uus niger.

10

Alue, joka on 5'-puolella avointa lukukehystä kiinnostuksen kohteena olevassa nukleotidisekvenssissä, sisältää transkriptionaalisen aloituksen säätelyalueen (eli promoottorin) . Mitä tahansa isännässä toiminnallista aluetta 15 voidaan käyttää, mukaanlukien promoottori, joka on homologinen ilmennettävän fytaasia koodaavan nukleotidisek-venssin suhteen. Käytettävä alue on suurimmaksi osaksi kuitenkin homologinen kohdelokuksen alueen kanssa. Tämän vaikutuksesta kohdelokuksen ekspressiotuote korvautuu 20 kiinnostuksen kohteena olevalla ekspressiotuotteella.

Sillä tasolla, jossa kohdelokuksen koodittaman proteiinin ilmenemisen ja erittymisen taso saa aikaan tehokkaan tuotannon, tämä kopioinnin aloituksen säätelyalue todetaan tavallisesti riittäväksi. Joissain tapauksissa kui-25 tenkin voidaan haluta korkeampaa kopiointitasoa kuin '.'·· kohdelokuksen geenillä, tai voidaan haluta indusoituva ilmeneminen käyttäen erityistä indusoivaa ainetta. Sel-:*·*; laisissa tapauksissa käytetään transkriptionaalista aloi- tuksen säätelyaluetta, joka poikkeaa alueesta kohdelokus- .···. 30 geenissä. Suuri määrä transkriptionaalisia aloituksen • · säätelyalueita tunnetaan, jotka ovat toiminnallisia rih- *!* masienissä. Näihin alueisiin lukeutuvat alueet geeneistä, ··· jotka koodaavat glukoamylaasia (AG), sieniamylaasia, ha-panta fosfataasia, GAPDH:ta, IrpC:tä, AmdS:ää, AlcA:ta, 35 AldA:ta, histoni H2A:ta, Eyr4:ää, PyrG:tä, isopenisillii- ’ft*; ni N-syntetaasia, PGK:ta, hapanta proteaasia, asyyli- transferaasia ja vastaavia.

20 1 08299

Kohdelokus koodaa edullisesti voimakkaasti ilmentyneen proteiinin geeniä, so., geeniä, jonka ilmentymistuote ilmenee vähintään noin 0,1 g/1 pitoisuuteen fermentointi-5 prosessin lopussa. Tämän prosessin kestoaika voi vaihdella muun muassa halutun proteiinituotteen mukaan. Valaisevana esimerkkinä sellaisesta geenistä on glukoamy-laasia (AG) koodaava geeni. Muita kiinnostavia geenejä ovat sienten a-amylaasi, hapan fosfataasi, proteaasi, 10 hapan proteaasi, lipaasi, fytaasi ja sellobiohydrolaasi. Erityisen edullisia kohdelokuksia ovat A. nigerin gluko-amylaasigeeni, A. oryzaen sieniamylaasigeeni, I. r-eesein sellobiohydrolaasigeenit, Mucor miehein happamen proteaa-sin geeni, Kluyveromyces lactiksen laktaasigeeni tai 15 Sannharomyces cerevisiaen invertaasigeeni.

Transkriptionaalinen lopetuksen säätelyalue voi olla kiinnostuksen kohteena olevasta geenistä, kohdelokuksesta tai mistä tahansa sopivasta sekvenssistä. Silloin kun 20 rakenne sisältää kiinnostavia lisäsekvenssejä kiinnostuksen kohteena olevan geenin alapuolella (kopiointisuunnas-sa), transkriptionaalisen lopetuksen säätelyalueen, ollessaan homologinen kohdelokuksen kanssa, tulisi olla olennaisesti pienempi kuin homologinen geeninviereinen 25 alue.

* «4 ·

Tavallisesti käytetään valintamarkkeria, joka voi olla osa ekspressiorakennetta tai erillään ekspressioraken- teestä siten, että se voi kiinnittyä kohdassa, joka on .···, 30 eri kuin kiinnostuksen kohteena olevan geenin. Koska • · 'V. tässä kuvatut rekombinanttimolekyylit transformoidaan ’;** edullisesti isäntäkantaan, jota voidaan käyttää teol- * * · liseen tuotantoon, valintamarkkerit transformaation seuraamiseksi ovat edullisesti dominoivia valintamarkke-:·'· 35 reita, so., isäntäkantaan ei tarvitse tuottaa mutaatioi ta, jotta kyettäisiin käyttämään näitä vaiintamarkkereitä. Esimerkkejä näistä ovat markkerit, jotka mahdollista- 21 108299 vat transformanttien kasvun määrätyillä ravintolähteillä (esim. A. nidulansin amdS-geeni mahdollistaa A. niger-transformanttien kasvun asetamidi ainoana typenlähteenä), tai markkerit, jotka antavat resistenssin antibiootteja 5 vastaan (esim., hle-geeni antaa resistenssin fleomysii-nille tai hph-geeni antaa resistenssin hygromysiini B:tä vastaan).

Valintageenillä on omat transkriptionaaliset ja transla-10 tionaaliset aloituksen ja lopetuksen säätelyalueet, mikä mahdollistaa markkerin itsenäisen ilmenemisen. Suuri määrä transkriptionaalisia aloituksen säätelyalueita tunnetaan kuten aikaimmin on kuvailtu, ja niitä voidaan käyttää merkkigeenin yhteydessä. Silloin kun käytetään 15 antibioottiresistenssiä, valikointiin käytettävän antibiootin pitoisuus vaihtelee riippuen antibiootista, vaihdellen yleensä noin 30 - 300 Mg antibioottia /ml.

Eri sekvenssejä voidaan yhdistää tunnettujen menetelmien 20 mukaisesti, kuten restriktion avulla, yhdistämällä komplementaariset restriktiokohdat ja ligatoimalla, tekemällä tasapäiseksi täyttäen esiintyöntyvät päät ja tasapääliga-toimalla, Bal31-resektion avulla, alukekorjauksella, in * i vitro -mutatoimalla tai vastaavasti. Polylinkkereitä ja 25 adaptoreja voidaan käyttää, kun se on tarkoituksenmukais-ta, ja liittää tai poistaa tunnetuilla menetelmillä, * · ;*·*: jotta ekspressiorakenteen helppo kokoaminen olisi mahdol- lista. Rakenteen synteesin jokaisessa vaiheessa fragmentti voidaan kloonata, analysoida restriktioentsyymin avul-... 30 la, sekvensoimalla tai hybridisoimalla tai vastaavasti.

Suuri määrä vektoreita on saatavissa kloonausta varten, *;·* ja erityinen vaihtoehto ei ole ratkaiseva tämän keksinnön :***: kannalta. Kloonaus tapahtuu normaalisti JE. colissa.

35 Geenin viereiset alueet voivat sisältää vähintään osan • · · * *. kohdelokuksen avoimesta lukukehyksestä, erityisesti sig- naalisekvenssin, säätelyalueet kohdelokuksen geenin 5'- 22 108299 ja 3' puolella, tai ne voivat ulottua säätelyalueiden toiselle puolelle. Viereinen alue käsittää tavallisesti 100 emäsparia (ep), tavallisesti vähintään 200 ep ja voi käsittää 500 ep tai enemmän. Viereiset alueet valitaan 5 siten, että kohdegeenistä tulee epäjatkuva (useassa osassa oleva) ja sen ilmeneminen estyy. Tämä voidaan saada aikaan liittämällä ekspressiokasetti (joka sisältää ilmennettävän nukleotidisekvenssin ja sisältää valinnaisesti lisäelementtejä, kuten signaalisekvenssin, transkrip-10 tionaalisen aloituksen säätelyaluesekvenssin ja/tai tran-skriptionaalisen lopetuksen säätelyaluesekvenssin) avoimeen lukukehykseen 5'-alueen lähelle proksimaalisesti, korvaamalla kaikki tai osa kohdegeenistä ekspressioraken-teella tai sijoittamalla ekspressiorakenne kohdelokuksen 15 kohdalla olevan transkriptionaalisen aloituksen säätely-alueen ja avoimen lukukehyksen väliin. Kuten jo on osoitettu, silloin kun lopetuksen säätelyalue on homologinen kohdelokuksen kohdalla olevan alueen kanssa, 3'-puolen viereisen alueen tulisi olla olennaisesti suurempi kuin 20 rakenteessa läsnä oleva lopetuksen säätelyalue.

Hakemuksessa kuvataan myös lähtömateriaalia 'toisen sukupolven' fytaasien konstruoimiseksi, so. fytaasientsyymi-en, joiden ominaisuudet eroavat tässä yhteydessä eriste-25 tyn entsyymin ominaisuuksista. Toisen sukupolven fytaa-·'/..· seilla voi olla muuttunut lämpötila- tai pH-optimi, muut- tunut spesifinen aktiivisuus tai affiniteetti substraat-te jaan kohtaan, tai mikä tahansa muuttunut ominaisuus, mikä tekee entsyymistä soveliaamman käytettäväksi määrä- .···. 30 tyssä prosessissa. E. coli on paras isäntä sellaiseen • · mutatointiin (esim. paikkakohdennettu mutatointi). Koska T E. edistä puuttuu silmukointisysteemi intronien poista- * · · ·...· miseksi, joita saattaisi olla läsnä fytaasigeenissä, fy- ’.·*: taasin cDNA-klooni on vaihtoehtosekvenssi ilmennettäväksi :·\ 35 E. colissa. Tämä cDNA-sekvenssi voidaan helposti mutatoi- * da alalla hyvin tunnetuilla menetelmillä, minkä jälkeen 23 108299 mutatoitu geeni voidaan liittää haluttuihin ekspressio-rakenteisiin.

Rakenne voidaan transformoida isäntään kloonausvektoris-5 sa, joko lineaarisessa tai rengasmaisessa, tai se voidaan poistaa kloonausvektorista haluttaessa. Kloonausvektori on edullisesti plasmidi. Plasmidi linearisoidaan tavallisesti noin 1 kep kiinnostuksen kohteena olevan geenin alueella. Ekspressiorakenne tässä kuvattujen fytaasien 10 tuottamiseksi kiinnitetään edullisesti valikoidun eks-pressioisännän genomiin.

Useita eri menetelmiä on olemassa rihmasienten transfor-moimiseksi. Näihin menetelmiin lukeutuvat protoplasti-15 fuusio tai -transformaatio, elektroporaatio ja mikroam-musammunta (microprojectile firing) soluihin. Protoplas-titransformaation on todettu olevan menestyksekäs ja sitä voidaan käyttää edullisesti.

20 Kiinnostuksen kohteena olevan sienikannan rihmasto muutetaan ensin protoplasteiksi soluseinän entsymaattisella hajotuksella osmoottisesti stabiloivan aineen kuten KCl:n tai sorbitolin, läsnäollessa. Protoplastien DNA:n sisään- ’ r ottoa helpotetaan lisäämällä CaCl2:a ja väkevöityä poly-25 etyleeniglykoliliuosta, jälkimmäisen aineen aiheuttaessa ' protoplastien yhteenkasautumisen, jonka menettelyn yhtey- dessä transformoiva DNA sisältyy aggregaatteihin ja «

siirtyy protoplasteihin. Protoplastien annetaan sen jälkeen regeneroitua kiinteällä alustalla, joka sisältää 30 osmoottisesti stabiloivaa ainetta, ja kun on tarkoituk-senmukaista, valikoivaa ainetta, jolle transformoiva DNA

"* koodaa resistenssin.

• · ·

• I

• · *:·*: Transformanttien valikoinnin jälkeen kiinnostavan geenin j·'. 35 läsnäolo voidaan määrittää usealla eri tavalla. Käyttä- • · ' *. mällä vasta-aineita, kun ekspressiotuote on heterologinen isännän suhteen, kiinnostavan geenin ilmenemisen läsnäolo 24 108299 voidaan ilmaista. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää Southern- tai Northern-blotteja kiinnittyneen geenin tai sen kopiointituotteen läsnäolon ilmaisemiseksi.

5 Kiinnostuksen kohteena olevan nukleotidisekvenssin tai ekspressiorakenteen monistaminen voidaan saada aikaan va-kiomenetelmillä, kuten liittämällä transformoivaan vektoriin moninkertaisia rakennekopioita tai käyttämällä amds-geeniä valikoivana markkerina (esim. Weinans et aJL.

10 (1985) Current Genetics, 2., 361-368). Monistettava DNA- sekvenssi voi sisältää DNA:ta, joka on homologista tai heterologista ekspressioisännän suhteen kuten edellä on kuvailtu.

15 Soluja voidaan sen jälkeen kasvattaa sopivassa ravinto- alustassa. Voidaan käyttää pieniä pitoisuuksia proteaasi-inhibiittoria, kuten fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, «2-makroglobuliineja, pepstatiinia tai vastaavia. Pitoisuus on tavallisesti alueella noin l μg/ml - 1 mg/ml.

20 Proteaasigeeni(t) voidaan inaktivoida, jotta vältettäisiin tai vähennettäisiin halutun proteiinin hajoamista.

Transformantteja voidaan kasvattaa joko panostyyppisissä tai jatkuvatoimisissa fermentointireaktoreissa, joista 25 kasvualusta eristetään ja haluttu tuote uutetaan.

1 « « * ψ

Erilaisia menetelmiä tuotteen puhdistamiseksi, jos se on tarpeen, voidaan käyttää, kuten kromatografiaa (esim., HPLC), liuotin-liuotin-uuttamista, elektroforeesia, nii- ... 30 den yhdistelmiä tai vastaavia menetelmiä.

• · • · ·

Hakemuksessa kuvataan myös jälkikäsittelymenetelmää, jos-sa fermentoinnin liemi (valinnaisesti puhdistettu) suoda-·:··: tetaan, jota seuraa toinen mikrobi suoda tus, minkä jälkeen 35 suodatettu liuos väkevöidään. Siten saatua nestemäistä • # konsentraattia voidaan käyttää seuraavasti: 25 108299 a) Fytaasi ja muut proteiinit voidaan saostaa nestemäisestä konsentraatista lisäämällä asetonia lopputilavuu-teen 60 % (tilavuus/tilavuus) jatkuvassa sekoituksessa. Saostuma voidaan kuivata alipaineessa 35 °C:ssa. Sen jäi- 5 keen kun kuiva jauhe on jauhettu, entsyymituotetta voidaan käyttää sellaisenaan käyttösovellutuskokeisiin. Talteenottosaannot ovat noin 90 %.

b) Nestemäinen konsentraatti voidaan spraykuivata (sumu-10 tuskuivata) käyttäen tavanomaista spraykuivaustekniikkaa.

Talteenottosaannot vaihtelevat 80 - 99 %.

c) Nestemäinen konsentraatti voidaan sekoittaa kantaja-aineiden kuten vehnäleseiden, kanssa. Siten saatu seos 15 voidaan kuivata spraytornissa tai leijupedissä.

d) Nestemäinen konsentraatti voidaan stabiloida osmoottisesti lisäämällä esim. sorbitolia. Säilöntäainetta, kuten bentsoehappoa, voidaan lisätä mikrobikontaminaation estä- 20 miseksi.

Kaikki neljä formulaatiota voidaan myydä esisekoiteval-mistajille, rehuseosteollisuudelle, muille jakelijoille ja maanviljelijöille.

25

Esimerkit esitetään tässä yhteydessä valaisemisen vuoksi * · :*·*. eikä niitä ole mitenkään tarkoitettu keksinnön piiriä ra- joittaviksi. Alaa tunteville käy selväksi, että tässä kuvattua fytaasigeeniä voidaan käyttää heterologisissa ... 30 hybridisaatiokokeissa, jotka on kohdistettu fytaasia koo- • · ;;; daavien geenien eristämiseen muista mikro-organismeista.

t # «··

Esimerkki Ί ·:·· A. ficmim NRRT. 31 35;n fermentointi 35 \ Aspergillus ficuum -kanta NRRL 3135 saatiin yrityksestä the Northern Region Research Lab, USDA, 1815 North Uni- 26 108299 versity Street, Peoria, Illinois, USA. Sieni-itiövalmis-teet tehtiin noudattaen vakiomenetelmiä.

Itiöitä ja sen jälkeen soluja siirrettiin panosfermentaa-5 tiosarjan kautta erlenmeyerpulloissa 10 l:n fermentoriin.

Panosviljelmänä kasvatuksen jälkeen tämän fermentorin sisältöä käytettiin siirroksena lopulliseen 500 l:n panos-fermentaatioon.

10 Käytetty alusta sisältää: 91 g/1 maissitärkkelystä (BDH Chemicals Ltd.); 38 g/1 glukoosi.H20:ta; 0,6 g/1 MgS04.7H20:ta; 0,6 g/1 KCl:a; 0,2 g/1 FeS04.7H20:ta ja 12 g/1 KN03:a. pH pidettiin tasossa 4,6 ± 0,3 automaattisesti titraten joko 4 N NaOH:lla tai 4 N 15 H2S04: llä.

Soluja kasvatettiin 28 °C:ssa automaattisesti säädellyssä liuenneen hapen pitoisuudessa 25 % kyllästettyä ilmaa. Fytaasituotanto saavutti maksimitason 5-10 U/ml 10 fer-20 mentointipäivän jälkeen.

Esimerkki 7.

A. ficuumin fytaasin puhdistaminen ja karakterisointi A. Fytaasiaktiivisuuden määritys 25 : 100 μΐ liemisuodosta (laimennettuna tarvittaessa) tai su- • · pernatanttia tai 100 μΐ demineralisoitua vettä vertailuna lisätään inkubointiseokseen, jolla on seuraava koostumus: ... 30 - 0,25 M natriumasetaattipuskuri pH 5,5, tai • « * · ;;; - glysiini-HCl-puskuri pH 2,5 • # ···’ - 1 mM fytiinihappo, natriumsuola :***: - demivedellä 900 μΐ^βί * · · 35 Tuloksena olevaa seosta inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 ’ '* °C:ssa. Reaktio pysäytetään lisäämällä 1 ml 10%:ista TCA:ta (trikloorietikkahappo). Kun reaktio on päättynyt, 27 108299 lisätään 2 ml reagenssia (3,66 g FeS04.7H20:ta 50 ml:ssa ammoniummolybdaattiliuosta (2,5 g (NH4)GMo7024.4H20:ta ja 8 ml H2S04:ää, laimennettuna 250 ml:ksi demivedellä)) .

5 Sinisen värin intensiteetti mitataan spektrofotometrises-ti 750 nm:ssä. Mittaukset ilmaisevat vapautuneen fosfaatin määrän suhteessa fosfaatin kalibrointikäyrään alueella 0 - 1 mmoolia/1.

10 Fosfataasiväri

Fosfataasiaktiiviset komponentit ilmaistiin isoelektri-sellä fokusoinnilla käyttäen yleistä fosfataasiväriä. Geeliä inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi cc-naftyyli-15 fosfaattia ja Fast Garnet GBC -suolaa (Sigma, 0,1 & vastaavasti 0,2 % (paino/tilavuus) 0,6 M natriumasetaatti-puskurissa pH 5,5. Reaktio, joka johtaa mustan saostuman ilmaantumiseen, päätettiin joko metanoli:etikkahapolla (30:10 %, tilavuus/tilavuus), tai, tarvittaessa lisäksi 20 fytaasiaktiivista proteiinia, huuhtelemalla tislatulla vedellä.

B. A. finiininin fytaasin puhri 1 saarninsn

25 Fytaasi puhdistettiin homogeeniseksi Δ. ficuum NRRL

: ·.· 3135:n kasvuliemestä. Liemi suodatettiin ensin mikrobiva- • · paaksi. Tuloksena olevaa kasvusuodosta väkevöitiin sen jälkeen edelleen Filtronin ultrasuodatusyksikössä 30 kD raja-arvoisilla kalvoilla. Näytteen pH ja ionivahvuus 30 säädettiin puhdistustoimenpidettä varten pesemällä näy- tettä 10 mM natriumasetaattipuskurilla pH 4,5. Loppupi- ♦ · ”·* toisuus tässä ultrasuodatusoperaatiossa oli suunnilleen i***: 20-kertaisesti pienentynyt.

* * 35 Näyte sijoitettiin sen jälkeen kationinvaihtimeen (S- ‘ *, Sepharose Fast-Flow HR 16/10 20 ml:n kolonnissa, molemmat saatuina Pharmacialta) Waters Preparative 650 Advanced 28 108299

Protein Purification Systemissä. Sitoutuneet proteiinit eluoitiin 0-1 M natriumkloridigradientin avulla natrium-asetaattipuskurissa. Fytaasi eluoitui suunnilleen 250 mM NaCl:n kohdalla. Fytaasiaktiivisuutta sisältävät fraktiot 5 koottiin yhteen, väkevöitiin ja niistä poistettiin suola ultrasuodatuksella. Tuloksena oleva liuos sijoitettiin anioninvaihtimeen (Q-Sepharose Fast-Flow HR 16/10 20 ml:n kolonnissa, Pharmacia), ja proteiinit eluoitiin jälleen 0-1 M natriumkloridigradientin avulla asetaattipuskuris-10 sa, kuten edellä on kuvailtu. Fytaasi eluoitui tästä kolonnista suunnilleen 200 mM NaCl:n kohdalla.

Tuloksena näistä puhdistusvaiheista on osittain puhdistettu fytaasivalmiste, jonka spesifinen aktiivisuus on 15 suunnilleen 40-50 U/mg proteiinia, mikä osoittaa 25-ker-taista puhdistumista.

Osittain puhdistetun fytaasin puhtausanalyysi osoitti huomattavan epäpuhtauden läsnäolon, jonka molekyylipaino 20 oli suunnilleen 100 kDa (kuvio IB, sekvenssi E). Isoelek-trinen fokusointi osoitti, että läsnä oli muutama fosfa-taasiaktiivisuutta sisältävä entsyymi, mukaanlukien 3-4 fytaasin alamuotoa (isoelektriset pisteet vaihtelivat 5,0-5,4) (kuvio IA, sekvenssit A ja B).

25

Homogeenisen fytaasivalmisteen saamiseksi suoritettiin • · .·;·. kaksinkertainen lisäpuhdistus erottamalla seuraavaksi » · « osittain puhdistetun fytaasin komponentit isoelektrisen • » «

fokusoinnin avulla LKB Multiphor Systemissä Ampholine PAG

... 30 -maljoilla (pH-alue 4-6,5). Fosfataasiaktiiviset proteii- • · nit (mukaanlukien fytaasi) ilmaistiin edellä kuvaillun ··.* yleisen fosfataasivärjäysmenetelmän avulla. Kiinnostavat :***; vyöhykkeet leikattiin sen jälkeen geelistä, ja aktiivinen < « « proteiini eluoitiin inkuboimalla geeliliuskoja 16 tuntia 35 10 mM natriumasetaattipuskurissa pH 5,5. Proteiinifrakti- • ·* ot analysoitiin spesifisessä fytaasiaktiivisuusmäärityk- ’ · sessä, kuten esimerkissä 2 on kuvailtu, erottamalla siten 29 108299 fytaasifraktiot muista happamista fosfataaseista. Lopullinen puhdistustekijä fytaasille oli suunnilleen 60-kertainen (lopullisen valmisteen spesifinen aktiivisuus oli 100 U/mg proteiinia). Tässä lopullisessa puhdistus-5 vaiheessa oli myös mahdollista eristää fytaasin eri ala-muodot (kuvio IA, sekvenssit A ja B).

Δ. ficuumin fytaasia vastaan kohdistettuja monoklonaali-sia vasta-aineita valmistettiin, mikä sai aikaan tehok-10 kaan puhdistusmenetelmän. Vasta-aine liitettiin syano-geenibromidi-aktivoituun Sepharose 4B:hen (5 mg/ml geeliä) , ja tätä matriisia käytettiin immunoaffiniteettiko-lonnissa. Matriisi näytti sitovan suunnilleen 1 mg:n fytaasia ml:aa kohti. Fytaasi voitiin eluoida affiniteet-15 tikolonnista puskurilla pH 2,5 (100 mM glysiini-HCl, 500 mM NaCl) menettämättä aktiivisuutta. Tätä menettelyä voidaan käyttää homogeenisen fytaasin eristämiseksi raa-'asta kasvusuodoksesta yhdessä ainoassa vaiheessa talteenoton ollessa 80 % ja puhdistuksen 60-kertainen.

20 C. Fytaasin deglykosylaatio

Δ. ficuumin fytaasia (70 μg proteiinia) inkuboitiin 2,5 U

N-Glycanasen (Genzyme) kanssa liuoksessa, joka sisälsi 25 0,2 M natriumfosfaattipuskuria pH 8,6 ja 10 mM 1,10-fe- ; nantroliinia kokonaistilavuudessa 30 μΐ.

• · ··· * · ♦

Deglykosylaation edistymisaste tarkistettiin 16 tunnin • · · jälkeen 37 °C:ssa elektroforeesin avulla (Phast System, ... 30 Pharmacia). Fytaasin näennäisen molekyylipainon havait- • · ’*·♦* tiin laskevan 85 kDa:sta suunnilleen 56,5 kDa:iin. Jak- *«· » • · ···* sollisella happamella Schiffin (PAS) sokerivärjäyksellä, joka identifioi natiivin fytaasin glykoproteiinina, ei

« < I

<;··· kyetty ilmaisemaan proteiiniin kiinnittyneitä jäännöshii- 35 lihydraatteja. Hiilihydraatin täydellinen poistuminen • ·* vahvistettiin lisäksi herkällä lektiiniblottausmenetel- ’ * mällä. Natiivia ja deglykosyloitua fytaasia (molempia 1,5 30 108299

Mg) ajettiin standardilla SDS-PAGE-geelillä ja siirrettiin elektroforeettisesti PVDF-membraanille (Immobilon, Millipore) 25 mM Tris-glysiini-puskurissa pH 8,3, 20 % metanolia (tilavuus/tilavuus), 16 tunnin ajanjakson ku-5 luessa 30 V jännitteessä.

Membraania inkuboitiin sen jälkeen l%:isen (paino/tila-vuus) naudan seerumin albumiinin kanssa fosfaattipusku-roidussa suolaliuoksessa ja inkuboitiin konkanavaliini A-10 peroksidaasin kanssa (Sigma, 10 Mg/ml fosfaattipuskuroi-dussa suolaliuoksessa). Peroksidaasi värjättiin sen jälkeen 4-kloori-l-naftolilla (Sigma).

Myöskään tällä herkällä menetelmällä ei kyetty ilmaise-15 maan deglykosyloituun fytaasiin kiinnittynyttä jäännös-hiilihydraattia .

Deglykosylaation jälkeen fytaasi on kokonaan menettänyt aktiivisuutensa, johtuen luultavasti entsyymin ryhmitty-20 misestä.

Esimerkki 3

Fytaasin aminnhappoaekvenssin määrittäminen ja oligonuk-leotidlkoettimien konstruointi 25 A. N-terminaalisen aminohapposekvenssin määrittäminen ' i 1 i i • ·

Fytaasi siirrettiin elektroforeettisesti SDS-PAGE:lta tai * · · IEF-PAGE: lta PVDF-blottausmembraanille (Immobilon, Milli- * « · pore). Elektroblottaus suoritettiin 10 mM CAPS (3-syklo-

Mi 30 heksyyliamino-propaanisulfonihappo) -puskurissa pH 11,0, • * '·*·' 10%risen (tilavuus/tilavuus) metanolin kanssa, 16 tunnin

• M

aikana 30 V jännitteessä ja 4 °C:ssa.

• · · • a • ·

Proteiini paikannettiin Coomassie Brilliant Blue -vär-35 jäyksellä. Kiinnostava vyöhyke leikattiin irti, väri * « « ' ·' poistettiin edelleen metanolissa ja suoritettiin kaasu- ‘ * faasinen sekvensointi. Toimenpide on suoritettu useita 31 108299 kertoja käyttäen useita yksittäisiä valmisteita. Saadut tulokset esitetään kuviossa IA (sekvenssit A ja B).

Aminohapposekvenssi on määritetty myös 100 kDa proteiinin 5 osalta, jota oli läsnä raakavalmisteissa. Tälle proteiinille saadut tulokset esitetään kuviossa 1C. Tämä sekvenssi on huomattavan homologinen happamen fosfataasin kanssa, joka on eristetty AspergiTins nigeristä (MacRae et ai. (1988) Gene 21, 339-348).

10 B. Sisä!Sten aminohapposekvenssi en määrittäminen Proteiinin pilkkoutiiTTn nsn syanogeenibroTnidin avulla

Homogeeniseksi puhdistettu fytaasi siirrettiin 100 mM 15 NaHC03:een ultrasuodatuksen avulla (Microconcentrator

Centricon 30, Amicon). Proteiini lyofilisoitiin sen jälkeen, liuotettiin 70%:iseen trifluorietikkahappoon (ti-lavuus/tilavuus), ja inkuboitiin 6 tunnin ajan suunnilleen 300-kertaisen molaarisen CNBr-ylimäärän kanssa.

20 Reaktio pysäytettiin laimentamalla seosta vedellä. Tuloksena olevat fragmentit lyofilisoitiin jälleen. Näyte liuotettiin sitten SDS-PAGE-näytepuskuriin, joka sisälsi DTT:tä (ditiotreitoli), ja pilkkoutumisaste määritettiin PAGE:11a. Analyyttinen PAGE suoritettiin Pharmacian 25 Phast-Systemillä, 20%:isillä SDS-PAGE-geeleillä. Geelejä • esiajettiin yhtenäisen puskurisysteemin muodostamiseksi • " 1 pienten peptidien erottumisen parantamiseksi (käsikirjan mukaisesti) . Peptidit ilmaistiin käyttäen alalla tunnet- • ' · tua hopeavärjäystekniikkaa, koska Coomassie Brilliant ,Vi 30 Bluella ei kyetty ilmaisemaan pienintä peptidiä. Menet-telyn tuloksena oli fytaasin täydellinen hajoaminen pep- • 4 tideiksi, joiden molekyylipainot olivat < 2,5 kDa, 36 :2’· kDa, 57 kDa ja 80 kDa.

I t i • I · « « 35 Peptidit eristettiin kaasufaasista sekvensointia varten « i « ·’ SDS-Tricine-PAGE:n avulla kuten Schagger & Jagow ovat ku- 2 «II.· • · 32 108299 vailleet (1987) Anal. Biochem. lfifi, 368-379, jota seurasi elektroblottaus kuten edellä on kuvailtu.

57 kDa fragmentin N-pää on identtinen Ullahin (1988b, 5 supra) määrittämän fytaasin N-pään kanssa, lukuun ottamatta neljää ensimmäistä aminohappoa, jotka puuttuvat (kuvio IA, sekvenssi B). 2,5 kDa ja 36 kDa peptidien N-terminaaliset sekvenssit esitetään kuviossa IB sekvensseinä A ja B.

10 c. Oligonukleotidikoettimet

Oligonukleotidikoettimia on konstruoitu, jotka pohjautuvat kuvioissa IA ja IB esitettyihin aminohapposekvenssei-15 hin, ja niitä valmistettiin käyttäen Applied Biosystemsin ABI 380B DNA:n synteesilaitetta. Nämä oligonukleotidit esitetään kuvioissa 2A ja 2B.

TtaiimP.rkki 4 20 Genomisten hl.ottien ja genomist.en kirjastojen hybridisaatio ensimmäi sen oi i goniikl eotiriikoetinsar jän kanssa

Genomista DNA:ta Δ. ficuum;sta on eristetty hiertämällä rihmastoa nestetypessä, käyttäen standardimenetelmiä 25 (esim. Yelton et ai. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei.

, U.S.A., 1470-1474). Genominen kirjasto konstruoitiin « · · bakteriofagivektorissa lambda EMBL3, käyttäen A. ficuum • · · ’·]/ NRRL 3135:n kromosomaalisen DNA:n osittaista Sau3A-hydro- • * « '·' * lysaattia standardimenetelmien mukaisesti (esim. Maniatis 30 et ai. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual, • « · ·../ Cold Spring Harbor Laboratory, New York) . Siten saatu ·”*: genominen kirjasto sisälsi 60-70 kertaisesti Δ. ficuumin S*.' genomin. Kirjastosta tarkistettiin plakkien esiintyminen ilman inserttiä hybridisaation avulla lambda EMBL3:n 35 täytefragmentin kanssa. Alle l %:n plakeista havaittiin • · · • ’/· hybridisoituvan lambda EMBL3-koettimeen. Insertin koko ·:* : oli 13 - 17 kiloemästä (ke) .

33 108299

Olosuhteiden ja koettimien identifioimiseksi, jotka olivat sopivia genomisen kirjaston seulontaan, genomista DNA:ta pilkottiin useilla restriktioentsyymeillä, erotet-5 tiin agaroosigeeleillä ja blotattiin Genescreen plus- kantajaan, valmistajan ohjeiden mukaisesti. Blotit hybri-disoitiin kaikkien oiigonukleotidikoettimien kanssa. Hybridisaatio suoritettiin käyttäen vaihtelevankovuisia olosuhteita (6 x SSC, 40 - 60 °C hybridisaatiolle; 0,2 x 10 SSC saakka, 65 °C pesulle). Koettimet 1068 ja 1024 (kuvio 2A) valittiin genomisen kirjaston seulontaan, vaikka yhtään yhteistä DNA-fragmenttia ei voitu identifioida, jotka hybridisoituisivat spesifisesti kummankin koettimen kanssa. Happamen fosfataasin koetin 1025 (kuvio 3) antoi 15 spesifisen ja erillisen hybridisaatiosignaalin, ja tästä johtuen tämä koetin valittiin genomisen kirjaston seulontaan happamen fosfataasin geenin osalta.

Kaikkia kolmea koetinta käyttämällä voitiin identifioida 20 hybridisoituvia plakkeja genomisessa kirjastossa. Hybri-disaatiosignaali, joka vastasi koetinta 1025, oli voimakas ja toistettavissa. Vahvuudeltaan vaihtelevia hybri-disaatiosignaaleja havaittiin käyttäen koettimia 1024 ja 1068 (fytaasi). Ristihybridisaatiota kahden sarjan välil-25 lä ei havaittu. Kaikki kolme plakkisarjaa seulottiin uudelleen ja DNA:ta eristettiin kahdeksasta erillisestä, » I t • · · positiivisesti hybridisoituvasta plakista (Maniatis et • · · ai., supra) . Kussakin sarjassa voitiin identifioida kloo- • A Ψ neja, jotka sisälsivät identtisiä hybridisoituvia frag-30 mentteja, mikä osoitti, että mainittujen kloonien inser- • · * tit liittyvät läheisesti toisiinsa ja luultavasti peittä-vät saman genomisen DNA-alueen. Taaskaan ei voitu osoit-,···, taa ristihybridisaatiota käyttäen kahta fytaasispesifistä sarjaa (koettimet 1024 ja 1068), mikä osoitti, että vaik-35 ka molemmat koettimet, joita käytettiin kahden kloonisar-: jän eristämiseen, saatiin proteiinin N-terminaalisesta " ": aminohapposekvenssistä, erilaiset genomiset DNA-fragmen- tit oli identifioitu ja kloonattu.

34 108299

Kaikki kolme kloonisarjaa hybridisoitiin Northern-blot-tien kanssa, jotka sisälsivät mRNA:ta, jota oli eristetty indusoidusta ja indusoimattomasta rihmastosta (esimerkki 6). Hapan fosfataasi -spesifiset kloonit, samoin kuin 5 näiden kloonien eristetty sisäinen 3,1 ke Sali-fragmentti, hybridisoituivat yksinomaan indusoitujen mRNA-näyt-teiden kanssa. Hapan fosfataasi -spesifisillä koettimilla identifioitu mRNA on pituudeltaan noin 1800 emästä, mikä sopii yhteen proteiinin tunnetun koon kanssa (68 kDa, 10 Ullah ja Cummins (1987) Prep. Biochem. 12, 397-422).

Fytaasispesifisten kloonien hybridisaatiota spesifisten mRNA-molekyylien kanssa ei voitu osoittaa. Keksinnön mukaisesti on siten päätelty, että edellä kuvailtu menetelmä oli tulokseton fytaasia koodittavan geenin kloo-15 nauksessa. Voidaan edelleen päätellä, että tämä epäonnistuminen ei johdu viasta käytetyssä menetelmässä, koska menetelmää on onnistuneesti käytetty hapanta fosfataasia koodittavan geenin identifioimiseen. Lambda-klooni, joka sisälsi happamen fosfataasin geenin, talletettiin 24.

20 huhtikuuta 1989 talletuslaitokseen the Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Hollanti, ja sille on annettu talletusnumero CBS 214.89. 10 ke BamHT-fragmentti on eristetty fagi Zl:stä ja subkloonattu pUC19:ään. Tämä subklooni sisältää koko hapanta fosfataasia koodittavan 25 geenin. Subklooni pAF 1-1 (kuvio 5) talletettiin 24. huhtikuuta 1989 tunnuksella CBS 213.89.

• ·· m · • * · *;!.* Esimerkki 5 • · · ** ' Fytaasia koodaavan geenin eristäminen käyttäen toista 30 oligonukleotidikoetinsarjaa • * · • · · # « «

Koettimia on konstruoitu käyttäen CNBr-synnytettyjen .···. fragmenttien N-terminaalista aminohapposekvenssiä (kuvio

• I

/'W. 2B, koettimet 1295, 1296 ja 1297) ja hybridisoitu genomi- 35 sen DNA:n kanssa kuten edellä on kuvailtu. Näiden koetti- • » · : mien käytön sopivuus fytaasia koodittavan geenin eristä- misessä tutkittiin jälleen genomisten blottien Southern- 35 108299 hybridisaatiolla koettimien kanssa. Tällä kertaa voitiin identifioida vastaavanpituisia hybridisoituvia fragmentteja käyttäen kaikkia kolmea koetinta huolimatta siitä tosiseikasta, että koettimet on saatu toisiaan peittämät-5 tornilta alueilta. Hybridisaatiota ei voitu havaita uuden koetinsarjan ja kloonien välillä, jotka on eristetty käyttäen ensimmäistä koetinsarjaa (esimerkki 4). Genomi-nen kirjasto seulottiin sen vuoksi uudelleen käyttäen kaikkia kolmea koetinta erillisissä kokeissa. Kloonien 10 alaryhmä (lambda AF201, 219, 241 ja 243), jotka oli eristetty kunkin yksittäisen koettimen avulla, hybridisoitui myös molempien muiden koettimien kanssa, mikä osoitti, että tässä tapauksessa, käytettäessä kolmea erilaista koetinta, kloonit eristettiin yhdestä genomisesta aluees-15 ta. Vasta eristettyjä klooneja yritettiin hybridisoida koettimien 1024 ja 1068 kanssa. Kummassakaan tapauksessa hybridisaatiota ei havaittu vasta eristettyjen kloonien kanssa olosuhteissa, joissa kumpikin koettimista oli onnistuneesti hybridisoitunut klooneihin, jotka eristet-20 tiin käyttämällä näitä koettimia (katso esimerkki 4).

Tämä osoittaa, että vasta eristetyillä klooneilla ei ole homologiaa koettimien suhteen, jotka on eristetty puhdistetun fytaasin N-päästä.

25 Lambda EMBL3-kloonilie, joka hybridisoituu kaikkiin kolmeen koettimeen (1295-1297) annettiin nimeksi lambda * · · *; ’· AF201 (kuvio 4), ja se talletettiin 9. maaliskuuta, 1989 * · · '·* ' tunnuksella CBS 155.89.

• · * • « · 30 Lambda AF201:n 5,1 ke BamHI-fragmenttia (subkloonattu pUC19:ään ja nimetty pAF 2-3:ksi, katso kuvio 4), joka ·’**: hybridisoitui kaikkiin kolmeen oligonukleotidikoettimeen, • · · .1. käytettiin Northern-blotin tunnistamiseen. Tässä tapauk sessa identifioitiin erillinen mRNA, jonka koko oli 1800 35 emästä. Tätä mRNA:ta todettiin vain indusoidussa rihmas-:*·*: tossa. Samanlaisia tuloksia saatiin, kun oligonukleotide- ·;··; jä käytettiin koettimina. Siitä johtuen, käyttäen uutta 36 108299 koetinsarjaa, yhteinen DNA-fragmentti on identifioitu, joka hybridisoituu spesifisesti indusoituun mRNA:han. Tämän mRNArn pituus (1800 emästä) on riittävä kooditta-maan noin 60 kDa proteiinia, mikä on suunnilleen glyko-5 syloimattoman proteiinin koko. Eristetyt fragmentit sisältävät epäilemättä ainakin osan fytaasia koodaavasta geenistä.

Esimerkki 6 10 "Indusoidun11 ja »indusoimattoman» mRNÄ:n eristäminen

Kirjallisuudesta tiedetään, että A. ficuumin fytaasisyn-teesi on voimakkaan fosfaattisäätelyn alainen (Hän ja Callagher (1987) J. Indust. Microbiol, l, 295-301). Siitä 15 johtuen osoituksen siitä, että eristetty geeni on samanlaisessa säätelyssä, voidaan katsoa tukevan näyttöä siitä, että geeni on kloonattu.

mRNA:n eristämiseksi, joka on syntetisoitu sekä tuotta-20 vissa että ei-tuottavissa olosuhteissa, A. ficuum NRRL 3135:ttä kasvatettiin seuraavasti. Itiöitä kasvatettiin ensin yli yön ei-indusoivalla alustalla. Seuraavana päivänä rihmasto kerättiin talteen, pestiin steriilillä vedellä ja siirrostettiin joko indusoivaan tai ei-indu-25 soivaan alustaan. Käytetty alusta sisältää (litraa kohti) : 20 g maissitärkkelystä; 7,5 g glukoosia; 0,5 g • · · ’· MgS04.7H20:ta; 0,2 g FeS04.7H20: ta; ja 7,2 g KN03:a. Fytaa- V * sin indusoimiseksi alustaan lisättiin 2 g/1 saakka mais- v · sin liotusvettä, kun taas ei-indusoiva alusta sisältää 2 30 g/1 K2HP04:ää. Rihmastoa kasvatettiin vielä vähintään 100 tuntia. Näytteitä otettiin valikoituina aikaväleinä.

• * · ·*”. Fytaasituotantoa seurattiin fytaasimäärityksen avulla, • · · jota kuvailtiin esimerkissä 2A. Denaturoitunut mRNA ero-tettiin elektroforeesin avulla ja blotattiin Genescreen 35 plus-kantajaa. Blotit hybridisoitiin 32P-leimatun pAF 2-3:n kanssa tai pAF l-l:stä eristetyn 3,1 ke:n Sall-frag- 37 108299 mentin kanssa (hapan fosfataasi), ks. esimerkki 4. Tulokset esitetään taulukossa 2.

Fytaasispesifisen 5,1 ke:n BaomHI-fragmentin ja hapan fos-5 fataasispesifisen 3,1 ke:n Sali-fragmentin positiivista hybridisaatiota eristetyn mRNA:n kanssa havaitaan ainoastaan, kun soluja kasvatetaan olosuhteissa, joiden tiedetään indusoivan fytaasin ja happamien fosfataasien synteesiä. Näistä tuloksista on päätelty, että eristetyt 10 geenit ovat säädeltyjä kuten odotettiin fytaasin ja happamien fosfataasien osalta.

Taulukko 2 15 Northern-blottien hybridisaatio käyttäen fytaasispesifis-tä 5,1 ke:n BamHI-fragmenttia (A) tai hapan fosfataasis-pesifistä 3,1 ke:n Sali-fragmenttia (B) koettimena; + osoittaa 1800 emäksisen fytaasin mKNA:n läsnäolon tai 1800 emäksisen happamen fosfataasin mRNA:n läsnäolon.

20 Suhteellinen fytaasiaktiivisuus määritettiin 24 tuntisten näytteiden osalta: indusoiduissa viljelmissä on 10 kertaa enemmän fytaasiaktiivisuutta kuin ei-indusoiduissa viljelmissä.

25 Aika siirrostuksen Indusoitu Ei-indusoitu jälkeen • i · • · · ψ ·

• · · I I I —— —1" II· I — — —Il I—— 1^1—i I III —I

• · · • · t < * · V ' A 24 tuntia + 30 B 24 tuntia + » · * • * • · «« · ·***; Esimerkki 7 ·· « Näyttö fytaasigeenin kloonauksesta < « * 35 Ehdottoman todisteen saamiseksi onnistuneesta fytaasia • koodittavan geenin eristämisestä ja kloonatun geenin il- ·:· ; menemisen lisäämisen soveltuvuuden tutkimiseksi fytaasi- 38 108299 geeni subkloonattiin sopivaan vektoriin ja transformoitiin A. niger 402:een (ATCC 9092). Tämän saavuttamiseksi fytaasigeeni eristettiin lambdakloonista AF201 10 ke:n Hml-fragmenttina ja kloonattiin vektorin pAN 8-1 (Mat-5 tern, I.E. ja Punt, P.J. (1988) Fungal Genetics Newsletter 23, 25) stuI-kohtaan, joka sisältää hifi-geenin (antaa resistenssin fleomysiinille) valikoivana markkerina. Tuloksena olevaa rakennetta nimitettiin pAF 28-1:ksi (kuvio 4), ja se transformoitiin A. niger 402:een esimer-10 kissä 9 kuvaillun menetelmän mukaisesti sillä poikkeuksella, että protoplastit maljättiin Aspergilluksen mini-maalialustalle, johon oli lisätty 30 μg fleomysiiniä/ml, ja joka oli jähmetetty 0,75 %:illa agaria. Yksittäiset transformantit puhdistettiin ja eristettiin, ja niiden 15 tuotanto testattiin ravistelupulloissa kuten esimerkeissä 1 ja 2 kuvailtiin. Kontrolleina testattiin myös transformantit, joilla oli vain vektori, samoin kuin transformoi-maton isäntä (taulukko 3). Ainoastaan A. niger 402, joka sisälsi pAF 28-1:n, näytti tuottavan fytaasia, joka rea-20 goi spesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka oli kohdennettu A. ficuumin fytaasia vastaan. Tämän monoklonaalisen vasta-aineen kanssa reagoiva fytaasi voitiin eluoida immunoaffiniteettipylväästä pH:ssa 2,5, ja sen osoitettiin olevan identtinen molekyylipainon, glyko-25 sylaatioasteen, isoelektrisen pisteen ja spesifisen aktiivisuuden osalta A. ficuumin fytaasin kanssa. Tämä ha-vainto todistaa selvästi, että pAF 28-1:llä • · · ' transformoidut A. niger 402 -solut ilmentävät fytaasia, *·1 joka on tosiasiassa identtinen A. f 1 cuumin fytaasin 30 kanssa. Samanlaista ilmenemistä ei havaittu kummassakaan < »t 5,,,! kontrollisolutyypissä.

• · · • · · * i * · · · · * 1 · • · ♦ 39 108299

Taulukko 3

Kanta Fytaasi/aktii- % fytaasiaktiivi- visuus U/ml suutta adsorboitu nut immunoaffini- 5 teettipylvääseen A. niger 402 0,5 0 A. niger 402 pAF 28-1 0,7 10 10 A. niger 402 pAN 8-1 0,5 0

Kantoja kasvatettiin indusoiduissa olosuhteissa (esimerkki 6). Näytteet otettiin 96 kasvutunnin kuluttua.

15 Frimerkki 8

Fy-haasigeenin ka-rakterisointr

Fytaasigeenin sisältämät lambdakloonit on analysoitu pilkkomalla eri restriktioentsyymeillä. Kartta genomialu-20 eesta, joka sisältää fytaasigeenin, esitetään kuviossa 4. Määrättyjä restriktiofragmentteja on subkloonattu kloo-nausvektoriin pUC19, kuten kuviossa 4 on osoitettu.

Aikaisemmin on esitetty (esimerkki 5), että 5,1 ke:n Bam- 25 Hl-fragmentti, joka on läsnä pAF 2-3:ssa, sisältää aina- . . kin osan fytaasigeenistä. Sen lisäksi oligonukleotidi- • · « koettimien 1295 ja 1297 (kuvio 2B) osoitettiin hybridi- • # ♦ *·1 1 soituvan Sall-inserttiin pAF 2-7:stä (pAF 2 -kloonien « · · 1 • tv *.1 1 paikat esitetään kuviossa 4) , kun taas koetin 1296 ulot- 30 tuu Sali-kohdan yli fragmenttien välissä pAF 2-6:ssa ja • · « pAF 2-7:ssä. Näiden kokeiden tulokset osoittavat, että fytaasia koodaava sekvenssi sijaitsee pAF 2-3:n BamHI- .1.t insertin vasemmanpuoleisessa osassa.

« 35 Plasmidien pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7 inserttien nukleo- ; ‘ tidisekvenssit on myöhemmin määritetty kokonaan käyttäen dideoksi-ketjunpysäytysmenetelmää (Sanger at ai. (1977) 40 108299

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24., 5463-5467) ja "haulikko"-kloonauksia, jota Messing jet ai. on kuvaillut (1981,

Nucl. Acids Res. 2., 309-321). Lisäksi syntetisoitiin spesifisiä oligonukleotidejä, jotka pohjautuivat sekven-5 sointimenettelyn aikana saatuihin nukleotidisekvenssitie- toihin.

Kloonien pAF 2-3, pAF 2-6 ja pAF 2-7 täydellinen nukle-otidisekvenssi, joka sisältää kromosomaalisen fytaasi-10 geenilokuksen, on koottuna kuviossa 6, graafinen esitys esitetään kuviossa 7.

Analyysi koko sekvenssin proteiinia koodittavasta kapasiteetista osoitti, että valmiin proteiinin N-terminaalinen 15 aminohapposekvenssi kooditettiin alkaen nukleotidipaikas- ta 381 (Ullahin esille tuoma N-pää sijaitsee paikassa 369). Sen lisäksi sisäisten 36 kDa ja 2,5 kDa peptidi-fragmenttien N-terminaalisen aminohapposekvenssin (katso kuvio IB - sekvenssit B ja A) todettiin koodautuvan nuk-20 leotidipaikoissa 1101 ja vastaavasti 1548. Avoin lukukehys loppuu nukleotidipaikassa 1713.

Nämä havainnot todistavat selvästi karakterisoidun kromosomaalisen lokuksen identtisyyden fytaasia koodaavan DNA-25 sekvenssin sisältäväksi.

• · · • ··

Suoraan valmista fytaasiproteiinia koodaavan kromosomaa- • · · lisen sekvenssin yläpuolella ei voida havaita ATG-aloi- • « V * tuskodonia lukukehyksen alueella, joka on valmiin prote- 30 iinin avoimen lukukehyksen vieressä; käyttämällä introni- ♦ « i eksoni rajatunnusmerkkejä intronin voidaan olettaa olevan * nukleotidipaikkojen 254 ja 355 välissä, mikä tuo ATG— kodonin nukleotidipaikkaan 210 oikeassa lukukehyksessä valmista fytaasia koodaavan avoimen lukukehyksen kanssa.

. 35 Tämän N-terminaalisen jatkeen johdettu aminohapposekvens- si sopii tarkoin von Heynen (1983, Eur. J. Biochem. 133, 41 108299 17-21) julkaisemiin sääntöihin koskien erityssignaalisek-venssiä.

Näiden hypoteesien varmistamiseksi fytaasin cDNA eristet-5 tiin PCR-monistamisen avulla spesifisten fytaasialukkei-den kanssa ja templaattina olevan mRNA/cDNA-kokonaispopu-laation kanssa jäljempänä kuvailtavien menettelyjen mukaisesti.

10 poly A+ RNA:r> eristäminen Aspp.rgillus ficuunnsta

Kokonais-RNA eristettiin A. ficuum nrrl 3135:stä, jota oli kasvatettu indusoivissa olosuhteissa, joista mainittiin esimerkissä 6. Kuiva rihmasto jäädytettiin nestety-15 pen kanssa ja hierrettiin. Jauhe homogenoitiin sen jälkeen Ultra-Turrax-laitteella (täysi nopeus 1 minuutin ajan) 3 M LiCl:ssa, 6 H ureassa 0 °C:ssa, ja pidettiin yli yön 4 °C:ssa kuten Auffrey & Rougeon ovat kuvailleet (Eur. J. Biochem., 107, 303-314, 1980). Solun kokonais-20 RNA saatiin sentrifugoinnin jälkeen 16 000 g 30 minuutin ajan, ja kahden perättäisen uuttamisen jälkeen fenoli:-kloroformi:isoamyylialkoholilla (50:48:2). RNA saostet-tiin etanolilla ja liuotettiin 1 ml:aan 10 mM Tris-HCl:ää (pH 7,4), 0,5 % SDS:ää. poly A+:n valikoimiseksi 25 kokonais-RNA-näytettä kuumennettiin 5 minuutin ajan 60 . °C:ssa, säädettiin 0,5 M NaCl:n suhteen ja sijoitettiin sen jälkeen oligo(dT)-selluloosapylvääseen. Usean pesun • · ·

**| * jälkeen liuoksella, joka sisälsi 10 mM Tris-HCl:ää, pH

V : 7,4, 0,5 % SDS:ää ja 0,1 M NaCl:ia, poly A+ RNA kerättiin 30 talteen eluoimalla 10 mM Tris-HCl:n pH 7,4, ja 0,5%:isen M» • '· SDS:n kanssa.

• · 4 ··· • « « ··· thRNA / cDNA -k omp Ί ek s i n valmistaminen « | « i * *. ' 35 Ensimmäisen cDNA-juosteen synteesiä varten 5 μg poly A+ RNA:ta liuotettiin 16,5 Ml:aan H20:ta ja seuraavat kompo-i nentit lisättiin: 2,5 μΐ RNasiinia (30 ϋ/μΐ); 10 μΐ pus- 42 108299 kuria, joka sisälsi 50 roM Tris-HCl:ää pH 7,6, 6 mM MgCl2:a ja 40 mM KCl:a; 2 /il l M KCl:a; 5 /il 0,1 H DTT.-tä; 0,5 /il oligo (dT)12_18:aa (2,5 mg/ml); 5 /il 8 mM dNTP-seosta; 5 /il BSArta (1 mg/ml) ja 2,5 /il Moloneyn MLV 5 käänteistranskriptaasia (200 U/ml). Seosta inkuboitiin 30 minuutin ajan 37 °C:ssa, ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 10 /il 0,2 M EDTArta ja 50 /il H20:ta. Uuttaminen suoritettiin kloroformin kanssa, ja sentrifugoinnin jälkeen supernatanttiin lisättiin perättäisesti 110 /il 5 M 10 NH4Ac:tä ja 440 /il etanolia. mRNA/cDNA-kompleksin saosta-minen suoritettiin kuiva jää/etanoli-liuoksessa 30 minuutin aikana. mRNA/cDNA otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin sen jälkeen 70%:isella jääkylmällä etanolilla ja liuotettiin 20 /il: aan H20:ta.

15

Fytaasin cDMA-fr.agmenttien kloonaus cDNA-kooditteisten fytaasisekvenssien eristäminen suoritettiin polymeraasiketjureaktion (PCR) avulla kahdella 20 fragmentilla. Neljä synteettistä oligonukleotidialuketta konstruoitiin perustuen genomiseen fytaasisekvenssiin, kuten kuviossa 6 esitetään

Oligo 1: 5-'GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.-25 CTA-3 ' . . Oligo 2: 5'-AGT.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG.- • · · • ·· * * 3 , ·*·* *;’/ oligo 3: 5'-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC.-3 ' V1 Oligo 4: 5'-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.- 30 GTT.TAA.AGG.G-3' n# • w • · »«« *’*]: Oligo 1 sisältää nukleotidisekvenssin fytaasin ATG-aloi- tuskodonin alapuolella (paikat 210-231), jonka vieressä t « 5'-rajalla on EcoRI-kohta; oligo 2 sisältää nukleotidi-,' 35 sekvenssin välittömästi Sali-kohdan yläpuolella (paikat • 1129-1109), jota myös vierustaa ylimääräinen JEcoRI-kohta; ‘:"i oligo 3 sisältää nukleotidisekvenssin BamHI-kohdan vie- 43 108299 ressä (paikat 845-865), ja oligo 4 sisältää nukleotidi-sekvenssin, joka sijaitsee fytaasin lopetuskodonin (paikat 1890-1867) alapuolella ylimääräisen Esti-kohdan vieressä.

5

Polymeraasiketjureaktiot suoritettiin Taq-polymeraasin toimittajan (Cetus) mukaisesti. Templaattina käytettiin liuosta (1,5 μΐ), joka sisälsi mRNA/cDNA-hybridejä (kuvattu edellä), ja alukkeina käytettiin 0,3 μg kumpaakin 10 oligoista 1 ja 2 reaktiossa fytaasin N-terminaalisen cDNA-osan monistamiseksi, ja oligoja 3 ja 4 reaktiossa fytaasin C-terminaalisen cDNA-osan monistamiseksi (katso kuvio 8) . Denaturoimisen (7 minuuttia 100 °C:ssa) ja 2 U Taq-polymeraasin lisäämisen jälkeen reaktioseokset monis-15 tettiin 25 syklissä (jokainen: 2' 55°C:ssa, 3' 72°C:ssa, 1' 94 °C:ssa) Perkin-Elmer/Cetusin DNA-monistuslaittees-sa. Viimeisessä syklissä denaturaatiovaihe jätettiin pois. Pilkkomisen jälkeen (EcoRI N-terminaaliselle cDNA-osalle ja BamHi ja PstT C-terminaaliselle cDNA-osalle), 20 molemmat cDNA-fragmentit kloonattiin pTZ18R:n (Promega) sopiviin kohtiin.

Kummankin saadun PCR-fragmentin nukleotidisekvenssi määritettiin dideoksi-ketjunpysäytystekniikalla (Sanger, 25 supra) käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä, jotka oli konstruoitu kromosomaalisen fytaasigeenisekvenssin jäi- : keen, alukkeina ja monistettua kokonais-DNA:ta samoin • · kuin kloonattuja cDNA-fragmentteja templaattina. Fytaasi- < ]·“· proteiinia koodaavan cDNA-alueen sekvenssi ja fytaasipro-

« * I

30 teiinin johdettu aminohapposekvenssi esitetään kuviossa * · · s.

• · · • · · cDNA-sekvenssi varmisti edellä oletetun intronin sijain- • I » nin ja osoitti, että muita introneita ei ollut läsnä * * » ’ 35 kromosomaalisen geenisekvenssin alueella.

44 108299

Fytaasigeeni koodittaa 467 aminohappoa sisältävää primaarista translaatiotuotetta (MP 51091); primaarisen trans-laatiotuotteen prosessointi leikkaamalla pois signaali-peptidi johtaa toimintavalmiiseen 444 (Mp. 48851) tai 448 5 (sisältää neljä ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa kuten Ullah on julkaissut, Mp. 49232) aminohappoa sisältävään fytaasiproteiiniin.

Esimerkki 9 10 Fytaasin liikaiImentäminen Rspergi linksissa ottamalla käyttöön 1jsäkoploita fytaasin genomisesta DNA;sta Fkspressi ovektorin pAF 2-2S konstruointi

Kaikki rakenteet tehtiin käyttäen molekyylibiologisia 15 standardimenetelmiä kuten Maniatis et ai. on kuvaillut, (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.

Ekspressiovektori pAF 2-2S valmistettiin subkloonaamalla 20 6 ke:n Pvuli DNA-fragmentti fytaasin genomisesta kloonis ta lambda AF201 pUC19:n SmaI-kohtaan. Saatua plasmidia merkittiin tunnuksella pAF 2-2 (kuvio 4). Valikoivana markkerina Aspergilluksen transformaatiolle, plasmidin pGW325 (Wernars K. (1986), Thesis, Agriculture Universi-25 ty, Wageningen, Hollanti) EcoPT/Kpnl DNA-fragmentti, joka „ . sisälsi Aspergi Uus nidulansin homologisen amdS-geenin, • · · : liitettiin pAF 2-2:n EcoRT/KpnT-kohtiin. Tuloksena ollut- • · ta ekspressiovektoria merkittiin tunnuksella pAF 2-2S, ja t se esitetään kuviossa 9.

30 • · « A. Fytaasin 1 iikaiiTnentyminen A. ficuum NRRL 3135:ssä • · < • · ·

Plasmidi pAF 2-2S siirrettiin A. fi cuum NRRL 3135 :een käyttäen transformaatiomenetelmiä, joita Tilburn, J. et 35 ai., (1983) Gene 2£, 205-221 ja Kelly, J. & Hynes, M.

.···. (1985) EMBO J., 4., 475-479 ovat kuvailleet seuraavin ,,, |; muunnelmin: 45 108299 - rihmastoa kasvatettiin Aspergilluksen minimaalialustal-la (Cove, D. (1966) Biochem. Biophys. Acta, 111, 51-56), joka sisälsi täydennyksenä 10 mM arginiinia ja 10 mM proliinia, 16 tunnin ajan 30°C:ssa pyöriväliikkeisessä 5 ravistelijassa nopeudella 300 rpm; - protoplastien muodostukseen käytettiin vain Novozym 234:ää (NOVO Industri) eikä lainkaan helikaasia; - 90 minuutin protoplastimuodostuksen jälkeen lisättiin 1 tilavuus STC-puskuria (1,2 M sorbitoli, 10 mM Tris-HCl, 10 pH 7,5, 50 mM CaCl2) protoplastisuspensioon ja sentrifu-goitiin 2500 g 4 °C:ssa 10 minuutin ajan kääntyväkuppises-sa roottorissa. Protoplastit pestiin ja suspendoitiin taas STC-puskuriin pitoisuudessa 108 solua/ml - plasmidi-DNA:ta lisättiin 10 μ1:η tilavuudessa TE-pus-15 kurissa (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) 100 Ritaan protoplastisuspensiota; - DNA-protoplastisuspension inkuboinnin jälkeen 0 °C:ssa 25 minuutin ajan 200 μΐ PEG-liuosta lisättiin pisaroit-tain (25%:inen PEG 4000 (Merck), 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 50 mM CaCl2) . Seuraavaksi lisättiin hitaasti 1 ml PEG- liuosta (60%:inen PEG 4000 10 mM Tris-HCl:ssä, pH 7,5, 50 mM CaCl2:ssa) sekoittaen putkia toistuvasti. Huoneenlämmössä inkuboinnin jälkeen suspensiot laimennettiin STC— puskurilla, sekoitettiin kääntelemällä ja sentrifugoitiin 25 nopeudella 2000 g 4 °C:ssa 10 minuutin ajan. Protoplastit . ; suspendoitiin varovasti uudelleen 200 μ1ΐ&&η STC-puskuria • ·· : ja maljattiin Aspergilluksen minimialustalle, joka si- sälsi 10 mM asetamidia ainoana typenlähteenä, 15 mM CsCl:a, 1 M sakkaroosia, jähmetettiin bakteriologisella * ·« 30 agarilla #1 (Oxoid) pitoisuudessa 0,75 %. Kasvatus suori- ♦ · · **]/ tettiin 33 °C:ssa 6-10 päivän aikana.

• · · * φ ·

Yksittäisiä transformantteja, merkittyinä SP4, SP7 ja • · · SP8, eristettiin, puhdistettiin ja testattiin fytaasi-’ : 35 tuotannon suhteen ravistelupulloissa käyttäen prosessia, jota kuvailtiin esimerkeissä 1 ja 2. Kontrolleina testat- 46 108299 tiin transformantteja, joissa oli vain vektori (amcis-geeni pUC19:ssa), samoin kuin transformoimatonta isäntää.

Kantoja kasvatettiin indusoivissa olosuhteissa (katso 5 esimerkki 6), ja näytteitä otettiin 96 tunnin kasvatuksen jälkeen. Analyysit suoritettiin mittaamalla fytaasiaktii-visuus (taulukko 4) ja isoelektrinen fokusointi polyakryy-liamidigeelielektroforeesin (IEF-PAGE) avulla.

10 Tilavuudeltaan yhtä suuria näytteitä otettiin A. fi cuumin ja A. fiemun pAF 2-2S SP7:n fermentoinneista, joita oli kasvatettu identtisissä olosuhteissa, ja ne sijoitettiin IEF-PAGE-geelille (pH-alue 4,5 - 6, Phast-System, Pharmacia) . Elektroforeesi suoritettiin valmistajan ohjeiden 15 mukaisesti. Geelit värjättiin sen jälkeen joko yleisellä proteiinivärillä Coomassie Brilliant Bluella (kuvio 10B) tai yleisellä fosfataasiaktiivisuusvärjäyksellä, jota on kuvailtu esimerkissä 2 (kuvio 10A) .

20 A. ficuumin fytaasinäyte, joka oli puhdistettu homogeeniseksi (immunoaffiniteettikromatografian avulla, jota kuvailtiin esimerkissä 7), applikoitiin myös joko yksin tai sekoitettuna kasvuston supernatantin kanssa.

25 Fytaasia esiintyy erilaisissa näytteissä joinakin isomuo-töinä (osoitettu tähdellä), kuten tässä keksinnössä on * · · : mainittu. Kaksi tärkeintä isoentsyymiä on selvästi näky- vissä puhdistetussa fytaasissa kaistoilla 3 ja 4 molem- ’Γ\ millä värjäysmenetelmillä (A ja B). Fytaasivyöhykkeet * 14 30 näkyvät heikosti A. ficuum -lähtökannassa, mutta merkit- • · · ’·[/ tävästi selvemmin pAF 2-2S SP7 -transformanttikannassa.

• « « * · · • · · 47 108299

Taulukko,...4

Fytaasituotannon lisääntyminen A. ti mmm NRRL 3135:n transformaation avulla.

5 Kanta Fytaasiaktiivisuus (U/ml) A. ficuum 0,6 A. ficuum + kontrolliplasmidi 0,6 A. ficuum pAF 2-2S SP8 7,6 10 A. ficuum pAF 2-2S SP7 6,7 A. ficuum pAF 2-2S SP4 4,3 B. Fytaasin 11 ikä ilmentyminen Ά. niger CBS 513.88:ssa 15 Ekspressiovektori pAF 2-2S siirrettiin myös A. niger CBS 513.88:aan transformaatiotoimenpiteillä kuten A. ficuumin osalta kuvailtiin. Yksittäisiä transformantteja eristettiin, puhdistettiin ja testattiin fytaasituotannon osalta ravistelupulloissa indusoiduissa kasvatusolosuhteissa 20 kuten esimerkissä 6 kuvailtiin.

Joidenkin transformanttien (merkinnöillä A. niger pAF 2-2S # 8, # 20 ja # 33) ja kontrollikantojen fytaasin il-mentymistasot määritettiin kuten esimerkissä 9A on ku-25 vaiItu, ja ne esitetään taulukossa 5.

• · · ./.: A. nigerin transformanttien fytaasin ilmentymistasot ovat vertailukelpoiset A. ficuumin transformanttien tasojen * [·' · kanssa. Tämä tulos osoittaa lisäksi, että A. f lemuni n fy- • · · I..' 30 taasin promoottori on aktiivinen A. nigerissä.

• · · • * « * · » '·* * Lisäanalysointia suoritettiin transformantin pAF 2-2S #8 kasvualustalla elektroforeesin avulla IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5 - 6 Phast-Systemillä (Pharmacia), jota • · · 35 edellä on kuvailtu. Yhtä suuret tilavuudet A. nigerin .···. lähtökannan ja transformantin pAF 2-2S #8 kasvustojen • · | supernatantteja, joita kantoja oli kasvatettu identtisis- • · 48 108299 sä olosuhteissa, sijoitettiin geelille. Geelit ajettiin ja värjättiin sen jälkeen kuten edellä.

Δ. nigerin lähtökanta tuottaa hyvin pienen määrän fytaa-5 siä, jota ei voitu ilmaista geelielektroforeesin avulla. Kanta pAF 2-2S #8 tuottaa suunnilleen 90 kertaa enemmän fytaasia, ja tämä ero on selvästi näkyvissä kuviossa 11.

Useita fytaasientsyymin isomuotoja havaitaan (osoitettu 10 tähdellä). Yleinen proteiiniväri osoittaa, että fytaasi-proteiinivyöhykkeiden intensiteetti lisääntyy dramaattisesti, vaikka muita tärkeitä proteiinivyöhykkeitä ei tule näkyviin.

15 Taulukko 5

Fytaasituotanto transformoitaessa A. niger CBS 513.88 pAF 2-2S:llä.

Kanta Fytaasiaktiivisuus (U/ml) 20 =================================== A. niger 0,2 A. niger + kontrolliplasmidi 0,2 A. niger pAF 2-2S #8 14 A. ni ger pAF 2-2S #33 5 25 A. niger pAF 2-2S #20 4 • · · : Esimerkki 10 • · · • «

Fytaasin ilmentyminen A. nigerissäjoka on transformoitu ’«** ekspressiovektorei 11a, jotka sisältävät A. .ficuumin fy- • «· 30 taasigeenin yhdistettynä A. nigerin amyloglukosidaasi (AG) geenin promoottoriin ja/f.ai signaalisekvensseihin Ekspressiovektoreiden konstruoinnit

Fytaasin li ikä ilmentymisen aikaansaamiseksi A. nigerissä, 35 uusia ekspressiokasetteja kehitellään, joissa A. ficuumin /··. fytaasigeeni on A. nigerin amyloglukosidaasi (AG) -pro- moottorin ohjauksessa yhdessä eri signaalisekvenssien 49 108299 kanssa. pl8FYT3:ssa ja p24FYT3:ssa vastaavat 18 ja 24 aminohappoa (AA) sisältävät AG-geenin ohjaussekvenssit Δ. nigeristä yhdistetään valmista proteiinia koodittavaan fytaasigeeni-fragmenttiin. Ekspressiokasetissa pFYT3 AG-5 promoottorisekvenssi on liittynyt yhteen fytaasia koodaa-van sekvenssin kanssa, joka sisältää fytaasin ohjaussek-venssin.

pl8FYT3:n konstruointi 10 AG-promoottorin ja 18 aa AG-ohjaussekvenssin yhdistäminen valmista proteiinia koodittavaan fytaasisekvenssiin suoritettiin polymeraasiketjureaktiomenetelmällä. PCR-reak-tioissa käytettiin kahta eri templaattia: pAF 2-2S, joka 15 sisälsi koko fytaasigeenin kuten edellä on kuvailtu, ja pAB6-l, plasmidi, joka sisältää koko AG-lokuksen A. m‘ge-ristä, joka eristettiin A. nigerin plasmidikirjastosta, joka sisältää 13-15 ke Hindlll-fragmentteja pUCl9:ssa. Eristämistä varten käytettiin AG-spesifisiä oligoja: 20 AG-1: 5 ' -GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3 1 AG-2 : 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' joista kumpikin pohjautui A. nigerine julkaistuun nukle-25 otidisekvenssiin (Boel et ai. (1984), EMBO J. 2., 1097-1102; Boel at ai. (1984), Mol. and Cell. Biol. A, 2306- * · · 2315). Oligonukleotidit saatiin sekvenssistä, joka ympä- • 1 röi introni 2:ta: oligo AG-1 sijaitsee 31-puolella intro- ]·.'· nia ja sen polaarisuus on identtinen AG mRNA:n suhteen, • · 1 I./ 30 ja oligo AG-2 tavataan introni 2:n yläpuolella ja sitä ei

• ♦ P

pidetä rinnastettavana AG mRNA:han. Plasmidi pAB6-l sisältää AG-geenin 14,5 ke Hindlll-fragmentissa (katso kuvio 12).

35 Alukkeiksi PCR-monistuksiin konstruoitiin neljä synteettistä oligonukleotidiä, joilla oli seuraavat sekvenssit:

< I I

• « f « · • · 50 108299

Oligo 1: 5'-CTCTGCAGGAATTCAAGCTAG-3' (AG-spesifinen sekvenssi EcoRI-kohdan ympärillä suunnilleen 250 ep ATG-aloituskodonin yläpuolella).

5 oligo 18-2: 5'-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3» valmis fytaasi < > 18 AA AG-ohjain

Oligo 18-3: 5'-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3· 18 AA AG-ohjain < > valmis fytaasi 10

Oligo 4: 5'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3’ (fytaasi-spesi- finen sekvenssi, joka sijaitsee BamHI-kohdassa paikassa 861) 15 PCR suoritettiin kuten Saiki et ai. ovat kuvannut, (1988), Science 239, 487-491, vähäisin muunnoksin (katso esimerkki 8).

AG-sekvenssien yhdistämiseksi fytaasia koodittaviin sek-20 vensseihin suoritettiin kaksi erillistä PCR:ää: ensimmäinen reaktio pAB6-l templaattina ja oligot 1 ja 18-2 aluk-keina 300 ep DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 3'-osan AG-promoottorista ja 18 aa AG-ohjaussekvenssin fytaasigeenin vieressä S'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 25 2-2S templaattina ja oligot 18-3 ja 4 alukkeina 600 ep . DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 5' osan fy- » · · taasigeenistä AG-signaalipeptidin 18 nukleotidin vieressä • ( 5'-rajalla. Kaaviokuva näistä monistuksista esitetään ]·’ kuviossa 13.

*:./ 30 • · • r

Kaksi muodostettua DNA-fragmenttia puhdistettiin geelie- * · « lektroforeesin avulla ja etanolisaostuksella ja käytettiin templaatteina kolmannessa PCR:ssä oligot 1 ja 4 alukkeina AG-fytaasi-fuusion muodostamiseksi. Saatu DNA-35 fraktio pilkottiin EcoRl:llä ja BamHI;llä ja subkloonat- .···. tiin pTZ18R:ään. Tuloksena oleva fuusio sekvensoitiin ja « · merkittiin tunnuksella pl8FYTl. 1 • · · 51 108299 Jäljelle jäänyt (3,5 ke) AG-promoottorin yläpuolinen alue saatiin pilkkomalla pAB6-l Kpnlrllä ja osittain £coRI:llä ja liitettiin pl8FYTl:n 1,1 ke:n EcoRI/BamHI-fragmenttiin 5 ja kloonattiin sen jälkeen pTZ18R:n Kpnl/BamHI-koht iin. Siten saatu plasmidi pl8FYT2 esitetään kuviossa 15.

Uusi Hindlll-restriktiokohta otettiin käyttöön liittämällä synteettinen fragmentti: 10 5' AATTCAAGCTTG 3' 3' GTTCGAACTTAA 5' pAF 2-2S:n EcoRl-kohtaan (amdS-geenin vieressä). Saatua 15 plasmidia merkittiin tunnuksella pAF 2-2SH (kuvio 14), ja sitä käytetään lähtöplasmidina fytaasin promoottorisek-venssien vaihtamiseksi PCR AG-fytaasi-fuusio-DNA-frag-mentteihin.

20 Konstruoinnin viimeisessä vaiheessa pl8FYT2 ja pAF 2-2SH

pilkottiin Kpnl:llä ja osittain BamHI:llä. pl8FYT2:n 4,6 ke:n DNA-fragmentti ja pAF 2-2SH:n 11 ke:n DNA-fragmentti eristettiin ja puhdistettiin geelielektroforeesin avulla, ligoitiin sen jälkeen ja siirrettiin E. coliin. Saatua 25 ekspressiokasettia merkittiin tunnuksella pl8FYT3 (kuvio . 15) .

··· • · • · « • 4 p24FVT3;n konstruointi • « · · • · · 30 AG-promoottorin ja 24 aa AG-ohjaussekvenssin yhdistäminen « · f **|t valmista fytaasia koodaavaan sekvenssiin suoritettiin • · * '·* ' PCR-monistamisen avulla kuten edellä on kuvailtu pl8FYT3:n konstruoinnin osalta lukuun ottamatta käytettyjä alukkeita. Kaksi uutta aluketta syntetisoitiin seuraa-35 villa sekvensseillä:

< < I

«

« M < I « I

52 108299

Oligo 24-2: 5 ' -CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3 ' valmis fytaasi < > 24 AA AG-ohjain

Oligo 24-3: 5'-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3' 5 24 aa AG-ohjain < > valmis fytaasi

Kaksi erillistä PCR:ää suoritettiin: ensimmäinen reaktio pAB 6-1 templaattina ja oligot l ja 24-2 alukkeina 318 ep:n DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi 3'-osan 10 AG-promoottorista ja 24 aa AG-ohjaussekvenssin fytaasi-geenin 18 nukleotidin vieressä 3'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 2-2S templaattina ja oligot 24-3 ja 4 alukkeina DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi fytaa-sigeenin 5'-osan 24 aa AG-ohjaussekvenssin 18 nukleotidin 15 vierustamana 5'-rajalla. Kaaviokuva näistä monistuksista esitetään kuviossa 13.

Lopullisen ekspressiokasetin p24FYT3 konstruoimiseksi väliplasmidien p24FYTl ja p24FYT2 kautta käytettiin samaa 20 kloonausreittiä/menettelyä, jota kuvailtiin pl8FYTl:lle ja pl8FYT2:lle ekspressiokasetin pl8FYT3 saamiseksi (kuvio 15) .

pFYT3:n lcnnstruolnti 25 AG-promoottorin yhdistäminen fytaasigeenin sekvenssiin • t* : (joka sisälsi fytaasin ohjaussekvenssin) suoritettiin ♦ · · myös PCR-monistamisen avulla kuten edellä on kuvailtu *!**. pl8FYT3:n osalta, lukuun ottamatta käytettyjä alukkeita.

• t 30 Kaksi uutta aluketta syntetisoitiin seuraavin sekvens- • · · sein: • « * • · · • · · « « « · « 53 108299

Oligo fyt-2: 5·-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3· fytaasin ohjain < > AG-promoottori

Oligo fyt-3: 5'-CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3' 5 AG-promoottori < > fytaasin ohjain

Kaksi erillistä PCR:ää suoritettiin: ensimmäinen reaktio pAB 6-1 templaattina ja oligot 1 ja fyt-2 alukkeina 282 ep DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi AG-pro-10 moottorin 3’-osan ja jonka vieressä oli fytaasin ohjaus-sekvenssin 18 nukleotidiä 3'-rajalla, ja toinen reaktio pAF 2-2S templaattina ja oligot fyt-3 ja 4 alukkeina DNA-fragmentin monistamiseksi, joka sisälsi fytaasigeenin (mukaanlukien fytaasin ohjain) 5'-osan, ja jonka vieressä 15 oli AG-promoottorin 18 nukleotidiä 5*-rajalla. Kaaviokuva näistä monistamisista esitetään kuviossa 13.

Lopullisen ekspressiokasetin pFYT3 konstruoimiseksi väli-plasmidien pFYTl ja pFYT2 kautta käytettiin samaa kloo-20 nausreittiä/menettelyä, jota kuvailtiin pl8FYTl:lle ja P18FYT2:lie ekspressiokasetin pl8FYT3 saamiseksi (kuvio 15) .

Fytaasigeenin ilmentyminen AG-promoottorin ohjauksessa A.

25 nigerissä ·*·.· E. coli -sekvenssit poistettiin edellä kuvailluista fy- * · .: taasin ekspressiokaseteista HindIIl:lla pilkkoen. A.

; nigerin kanta CBS 513.88 (talletettu 10. lokakuuta, 1988) ^ 30 transformoitiin jälkeenpäin 10 μg:τι DNA-fragmentilla • < · I.. esimerkissä 9 kuvatuilla menetelmillä. Yksittäisiä A.

• * *·' * nigen -transformantteja kustakin ekspressiokasetista eristettiin, ja itiöitä levitettiin selektiivisille aset-amidiagarmaljoille. Jokaisen transformantin itiöitä ke-

< I

35 rättiin talteen soluista, joita oli kasvatettu 3 päivän « ajan 37 °C:ssa 0,4 % peruna-dekstroosiagarmaljoilla

* I

nm • · · • « « « 54 108299 (Oxoid, Englanti). Fytaasituotanto testattiin ravistelu-pulloissa seuraavissa kasvuolosuhteissa:

Suunnilleen 1 x 108 itiötä siirrostettiin 100 ml:aan esi-5 viljelyalustaa, joka sisälsi (litraa kohti): 1 g KH2P-04:ää; 30 g maltoosia; 5 g hiivauutetta; 10 g kaseiini-hydrolysaattia; 0,5 g MgS04.7H20: ta ja 3 g Tween 80:aa. pH säädettiin arvoon 5,5.

10 Yön yli kestäneen kasvatuksen jälkeen 34 °C:ssa pyörivä- liikkeisessä ravistelijassa 1 ml kasvavaa viljelmää siirrostettiin 100 ml:aan pääviljelyalustaa, joka sisälsi (litraa kohti): 2 g KH2P04:ää; 70 g maltodekstriiniä (Maldex MD03, Amylum); 12,5 g hiivauutetta; 25 g kaseiini-15 hydrolysaattia; 2 g K2S04:ää; 0,5 g MgS04.7H20:ta; 0,03 g ZnCl2:ta; 0,02 g CaCl2:ta; 0,05 g MnS04.4HzO:ta ja FeS04:ää. pH säädettiin arvoon 5,6.

Rihmastoa kasvatettiin vähintään 140 tuntia.

20

Fytaasituotanto mitattiin kuten esimerkissä 2 kuvailtiin. Kustakin ekspressiokasetista saadun usean, sattumanvaraisen transformantin tuotantotulokset esitetään taulukossa 6.

25 « # • · · • · « •« • « I «« • * · · f ' · * · · • · · « * * < .

« · 4 • · 4 « ♦ · * • · 55 108299

Taulukko 6

Usean A. niger CBS 513.88 -kannan fytaasituotanto, jotka on transformoitu plasmideilla, jotka sisältävät A. -firani-min fytaasigeenin A. nigerin AG-promoottorin ohjauksessa 5 yhdessä eri ohjaussekvenssien kanssa.

Ekspressiokasetti Transformantti # Fytaasi- aktiivisuus (U/ml) 10 =================================================== P18FYT3 P18FYT3 #240 82 (AG-promoottori/ P18FYT3 # 242 84 18 aa AG-ohjain) P18FYT3 # 243 62 P18FYT3 #244 43 15 P18FYT3 # 245 80 P18FYT3 # 246 82 P18FYT3 # 250 110 P24FYT3 P24FYT3 # 256 8 20 (AG-promoottori/ P24FYT3 # 257 30 24 aa AG-ohjain) P24FYT3 # 258 13 P24FYT3 # 259 33 P24FYT3 #260 17 P24FYT3 # 261 28 25 P24FYT3 #262 18 . . P24FYT3 # 265 12 ··· • « • · 4 ^— ———.1 .1 I, — I··— —— * t '11 ' 1 11 ·™ ^* —* *,f,* pFYT3 pFYT3 # 205 50 (AG-promoottori/ pFYT3 # 282 280 30 fytaasin ohjain) pFYT3 # 299 96 pFYT3 # 302 220 V ‘ pFYT3 #303 175 pFYT3 #304 150 pFYT3 #305 150 \\ 35 pFYT3 # 312 140 i

I · i t I

« ( « ( > t • « I t « • * « « « · « • · 56 108299

Tulokset osoittavat selvästi fytaasin korkeita ilmenty-mistasoja Δ. niger -transformanteissa, jotka sisältävät fytaasigeenin A. nigerin AG-promoottorin ohjauksessa. Tulokset osoittavat myös, että korkein fytaasituotanto 5 saavutetaan pFYT3-ekspressiovektorilla, joka sisältää fytaasin ohjaussekvenssin. Samanlaiset ekspressiovekto-rit, jotka sisälsivät intronittoman fytaasigeenin A. nigeriin transformoinnin jälkeen, johtivat fytaasin il-mentymistasoihin, jotka olivat vertailukelpoisia A. nige-10 rin pFYT3-transformanttien kanssa.

Elektroforesointi IEF-PAGE-geelillä pH-alueella 4,5-6 suoritettiin lisäksi transformanttien pFYT3 #205 ja #282 kasvustojen supernatanteilla. Yhtä suuret tilavuudet A.

15 nigerin lähtökannan ja kummankin transformantin kasvustojen supernatanteista, jotka kannat olivat kasvaneet identtisissä olosuhteissa, sijoitettiin geelille, ajettiin ja sen jälkeen värjättiin kuten esimerkissä 9 on kuvailtu. A. nigerin lähtökanta tuottaa hyvin pieniä fy-20 taasimääriä, jota ei havaita tässä kokeessa. Kannat pFYT3 #205 ja #282 tuottavat suunnilleen 250 ja 1400 kertaa enemmän fytaasia (vertaa fytaasitasoja taulukoissa 4 ja 5), ja tämä ero on selvästi näkyvissä kuviossa 11. Useita fytaasientsyymin isomuotoja havaitaan (osoitettu tähdel-25 lä). Yleinen proteiiniväri osoittaa, että fytaasi-p- roteiinivyöhykkeiden intensiteetti lisääntyy dramaatti- • « !**. sesti, kun taas muita huomattavia proteiinivyöhykkeitä ei • · i 4 ,4 ilmaannu.

··' r • · i · !.’4' 30 Esimerkki 11 K · V ‘ Fytaasin 1iikäilmentyminen A. ficuumissa ja A. nigerissäf «te v : joita on kasvatettu teollisessa mitassa A. A. ficuum 35

Kantoja A. finuum pAF 2-2S #4 ja A. ficuum NRRL 3135 kas- i t '··** vatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Transformantti t M I · ♦ • · « t « « · • » - » t 4 · i 57 108299 tuotti suunnilleen 50 kertaa enemmän fytaasia verrattuna villityypin kantaan.

Taulukko 7 5

Fytaasin liikailmentyminen A. fiemuni n transformantilla, joka sisältää multippeleja fytaasigeenejä. Soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu.

10 Tunteja siirros- Fytaasiaktiivisuus (U/ml fermen-tuksen jälkeen A. ficuum NRRL 3135 tointilientä) A. f lemun pAF 2-2S #4 15 0 0 0 24 0 0 92 2 142 141 5 270 20 £. A. niger

Kantaa A. niger pAF 2-2S #8, A. niger -kannan CBS 513.88 transformanttia, ja itse A. nigerin lähtökantaa kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu. Transformantti 25 tuotti suunnilleen 1000 kertaa enemmän fytaasia verrattuna alkuperäiseen A. nigerin lähtökantaan (taulukko 8).

• · · • · · · • · • · e • m · ♦ · • · · * .» # * · a • · · • · • · ··· 1 ♦ ♦ 58 108299

Tan 1 «Trien fl

Fytaasin liikäilmentyminen A. nigerin transformantilla (CBS 513.88), joka sisälsi multippeleja fytaasigeenejä.

5 Soluja kasvatettiin kuten esimerkissä 1 on kuvailtu.

Tunteja siirros- Fytaasiaktiivisuus (U/ml fermentoin-tuksen jälkeen A. niger CBS 513.88 tilientä) A. niger pAF 2.2 #8 10 ^==============================================================^==== 0 0 0 24 0 5 92 0,1 65 141 0,1 95 15

Esimerkki_12

Vektorin pREPFYT3 konstruoimiseksi, jolla saavutetaan samanaikainen fytaasin ilmentyminen ja AG-geenin vaihto,

20 pFYT3 pilkotaan Kpnlrllä. Saadulla lineaarisella KpnT

DNA-fragmentilla suoritetaan kaksi erillistä ligaatiota.

Ligaatio 1 KpnT-HindiII-adaptorin kanssa: 25 5' CGGGGA -3' 3'—CATGGCCCCTTCGA-5· * ...T Kpnl Hindin ♦ ♦ • · « • < o

Ligaatio 2 KpnI-HindIII1-adaptorin kanssa, jossa HindiII-30 restriktiokohta ei jää jäljelle ligaation jälkeen: .1··. 5'- CGGGGG -3' • · ::: 3 · -.ctaggcccccicga-s ·

Kpnl Hindlll1 35

Ligaatio 1 pilkotaan osittain sen jälkeen Hindin:11a. amdS-geenin sisältävän fragmentin poistamisen jälkeen • 4 • · 1 · · • f 108299 59 geelielektroforeesin avulla, jäljellä oleva DNA-fragment-ti tehdään jälleen renkaanmuotoon ligoimalla ja siirretään E. coliin. Saatu plasmidi merkitään tunnuksella pFYT3Aamds (katso kuvio 16).

5

Ligaatio 2 pilkotaan myös Hindlll:11a ja 4 ke HindIII/Hi= ndlll* DNA-fragmentti, joka sisältää amdS-geenin, eristetään geelielektroforeesin avulla, liitetään sen jälkeen Hindlll:11a osittain pilkottuun pFYT3AamdS:iin ja siirre-10 tään E. coliin. plasmidi, joka sisältää amdS-geenin fy-taasigeenin 3'-päässä, merkitään tunnuksella pFYT3INT (katso kuvio 17).

pAB 6-1:n suunnilleen 6 ke:n Sail/HindITT DNA-fragmentin 15 lisäämiseksi, joka sisältää 3'-viereisen AG-sekvenssin, PFYT3INT pilkotaan osittain HindIII:lla, ligoidaan ensin adaptoriin: 5'-AGCTAGGGGG -3' 20 3 ' -_TCCCCCAGCT—5 ·

Hindlll* Sali (jossa HindIII*-restriktiokohta ei jää jäljelle ligaation jälkeen) ja sen jälkeen pAB 6-1:n SalI/HindIII-fragmentin 25 kanssa. E. coliin transformoinnin jälkeen saadaan haluttu plasmidi pREPFYT3, joka sisältää 3'-pään viereisen AG-sek-venssin oikeassa paikassa (kuvio 18) .

• I • · < • · <.

* ·

Fytaasin ilmentyminen A. nigerlsaä AG-geenin vaihdon yb-30 teydessä » .···. Ennen A. nigerin transformointia pREPFYT3:11a, E. colin • «

sekvenssit plasmidissa poistetaan pilkkomalla Hindlll :11a ja geelielektroforeesin avulla. A. nigerin kanta CBS

• · 35 513.88 transformoidaan 10 /zg:lla DNA-fragmenttia menetel- millä, joita on kuvailtu esimerkissä 9. Valikointi ja transformanttien kasvatus suoritetaan kuten esimerkissä 9 60 108299 on kuvailtu. Vain vähäinen osa valikoiduista transforman-teista menettää AG-aktiivisuuden (suunnilleen 20 %). Kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysi suoritetaan AG-negatiivisilla ja fytaasipositiivisilla transformanteilla 5 sen varmistamiseksi, että AG-geeni todella on vaihdettu fytaas igeeni in.

Erimerkki 13

Fyta asigeenin säilyminen eri_la jei ssa 10

Sen määrittämiseksi, onko fytaasigeeni hyvin säilynyt mikrobilajien joukossa, suoritettiin Southern-analyysejä kymmenen eri lajin kromosomaalisesta DNA:sta A. ficuumin fytaasin cDNA koettimena.

15 Nämä kromosomaalisen DNA:n analyysit suoritettiin rihma-sienten, hiivojen ja bakteerien lajeilla. Esimerkiksi valittiin vain rajoitettu määrä kustakin ryhmästä: rihma-sienten osalta, Peni oi Ilium chrysogenum ja Aspergillus 20 nlger; hiivojen osalta, Saccharomyces cerevisiae ja Kluy-veromyces lactis; ja prokaryoottisten organismien osalta gram-positiiviset lajit Bacillus, subtil is, Clostridium thermooeTlum, ja Streptomyces lividans, ja esimerkkinä gram-negatiivisesta bakteerista Pseudomonas aeruginosa.

25 Näiden lajien suurimolekyylipainoista kromosomaalista DNA:ta pilkottiin erikseen PvuIT: 11a ja fLamHI:llä ja elektroforesoitiin sen jälkeen 0,7%:isella agaroosigee-:T: Iillä.

30 • · ·

Nitroselluloosasuodattimille siirtämisen jälkeen hybri-disaatio suoritettiin yli yön melko lievissä olosuhteissa V.’. (6 x SSC; 50°C) 32P-leimatun 5'-fytaasi-cDNA-fragmentin kanssa (kuvailtu esimerkissä 8). Blotit pestiin 6 x 35 SSC:ssä huoneen lämpötilassa ja altistettiin röntgensä-teillä 18 tunnin ajan.

Claims (9)

108299 Kuten kuvioissa 19 a ja b on esitetty, erillisiä vyöhykkeitä havaitaan melkein joka kaistalla, mikä viittaa fy-taasigeenin korkeaan homologia-asteeseen mikrobilajien välillä. 5

1. Koostumus, joka sisältää Aspergillus-fytaasia, joka 10 katalysoi ainakin yhden epäorgaanisen fosfaatin vapautumista myoinositolifosfaatista ja jota fytaasia koodittaa DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu vähemmän ankarissa olosuhteissa (6 x SSC, 50 °C yön yli) koettimeen, joka sisältää kuviossa 8 esitetyn nukleotidin asemat 1-818, 15 tunnettu siitä, että koostumus ei sisällä olennaisia määriä Aspergillus-happofosfataasia, jonka N-pään aminohapposekvenssi on Vai Vai Asp Glu Arg Phe Pro Tyr Thr Gly.

2. Sammansättning enligt patentkravet 1, kännetecknad vidare därav, att fytasets ph-optimum är 5,5. • · · • 0

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu lisäksi siitä, että fytaasin pH-optimi on 5,5.

3. Sammansättning enligt av patenkravet 1 eller 2, kän-35 netecknad vidare därav, att fytasets andra ph-optimum är ·:·: 2,5. • · « • · 108299

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu lisäksi siitä, että fytaasin toinen pH-optimi on 25 2,5. • « «

4. Sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-3, kännetecknad vidare därav, att fytasets specifikä akti-vitet är cirka 100 U/mg.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen koostumus, tunnettu lisäksi siitä, että fytaasin spesifinen aktii- • « :*·*; visuus on noin 100 U/mg. 30 • « ·

5. Sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-4, kännetecknad därav, att en Aspergillus niger- eller Aspergillus ficuum -gen kodar fytaset.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen koostumus, ... tunnettu siitä, että fytaasia koodittaa Aspergillus ni- ger- tai Aspergillus fieuum -geeni.

6. Förfarande för framställning av djurfoder, känneteck-10 nat därav, att en sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-5 används.

6. Menetelmä eläinrehun valmistamiseksi, tunnettu siitä, ·.*· että käytetään jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaista ;‘ koostumusta. 108299

7. Användning av en sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-5 för frigörelse av ätminstone ett oorga- 15 niskt fosfat frän ett myoinositolfosfat.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaisen koostumuksen käyttö ainakin yhden epäorgaanisen fosfaatin vapauttamiseksi myoinositolifosfaatista.

8. Förfarande för att befrämja djurs växt, kännetecknat därav, att ett djur utfodras med en diet, som innehäller en sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-5. 20

8. Menetelmä eläinten kasvun edistämiseksi, tunnettu siitä, että eläintä ruokitaan ruokavaliolla, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaista koostumusta.

9. Menetelmä fytaattitasojen alentamiseksi eläinlannassa, tunnettu siitä, että eläintä ruokitaan ruokavaliolla, joka sisältää jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukaista koostumusta, jossa on fytaasia sellainen määrä, joka vapauttaa tehokkaasti rehun sisältämästä fytaatista epäor-15 gaanista fosfaattia. 20 l. Sammansättning, som innehäller Aspergillus-fytas, som katalyserar frigörelse av ätminstone ett oorganiskt fos- fat frän ett myoinositolfosfat och vilket fytas kodas av en DNA-sekvens, som hybridiseras under mindre stränga förhällanden (6 x SSC, 50 °C över natten) med en sond, 25 som innehäller positionerna 1 - 818 av nukleotidsekvensen enligt fig. 8, känneteckad därav, att sammansättningen inte i väsentlig grad innehäller Aspergillus-syrafosfa- :*·.* tas, i vars N-terminal aminosyrasekvensen är Vai Vai Asp • » Glu Arg Phe Pro Tyr Thr G ly. .·:·. 30

9. Förfarande för sänkning av fytatniväer i djurspill-ning, kännetecknat därav, att ett djur utfodras med en diet, som innehäller en sammansättning enligt nägot av patentkraven 1-5, med en sädan kvantitet fytas, som 25 effektivt frigör oorganiskt fosfat frän i fodret ingäende :.' fytat. • · · * • 1 · · • · • · · • ·· • · »•e • · , • 1 , < • < · • 4 ( • · I • · · • · • · • · · • · « • « • · · « « • · * 1 · 1 i'·; » ♦