CN111183228A - 减少生物燃料发酵系统中乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种减少和/或防止发酵产物生产方法中、如尤其是乙醇生产中乳酸水平增加的方法，其中在糖化和/或发酵之前或期间、或在扩培之前或期间添加裂解性多糖单加氧酶(LPMO)或包含LPMO的酶组合物，以减少和/或防止乳酸水平增加。

Description

减少生物燃料发酵系统中乳酸的方法
技术领域
本发明涉及一种减少和/或防止发酵产物生产方法、如尤其是乙醇生产中乳酸水平增加(例如，由于细菌污染)的方法，其中在糖化和/或发酵之前或期间添加裂解性多糖单加氧酶，以减少和/或防止发酵期间乳酸水平增加。
背景技术
发酵产物(例如乙醇)典型地是通过以下产生的：首先在干磨或湿磨过程中研磨含淀粉材料，然后使用酶将材料降解成可发酵糖，并且最后使用发酵生物将糖直接或间接转化为所希望的发酵产物。例如通过从其他液体和/或固体分离所希望的发酵产物(例如乙醇)的蒸馏，从发酵醪(通常被称为“啤酒醪”)回收液体发酵产物。剩余级分称为“全酒糟”。全酒糟典型地含有约10％至20％的固体。例如通过离心，将全酒糟分离为固体级分和液体级分。所分离的固体级分被称作“湿饼”(或“湿谷粒”)，而所分离的液体级分被称作“酒糟水(thin stillage)”。湿饼和酒糟水分别含有约35％和7％固体。湿饼(采用任选的另外的脱水)被用作动物饲料中的组分，或被干燥以提供用作动物饲料的组分的“干酒糟”(DDG)。通常蒸发酒糟水，以提供蒸发器冷凝物和浆料，或可替代地可以作为“逆流”被再循环至浆料槽。蒸发器冷凝物可以在被排放前送往甲烷转化器，和/或可以作为“蒸煮水”被再循环到浆料槽。可以在干燥方法(其可以依次包含一个或多个干燥器)之前或期间将浆料共混入DDG中或添加到湿饼中，以生产DDGS(干酒糟及其可溶物)。浆料通常含有约25％至35％的固体。还可以从酒糟水和/或浆料中提取油，作为副产物(用于生物柴油生产)，作为饲料或食品添加剂或产物，或其他生物可再生产物。
污染细菌及其代谢最终产物(例如乳酸和/或乙酸)会导致发酵产量降低，从而给生产者带来可观的经济损失(参见Thomas等人,2001,J.Aplied Microbiology[应用微生物学杂志],90:819-828)。污染细菌与发酵生物(例如酵母)竞争发酵培养基中的糖。不希望的细菌产生的乳酸和/或乙酸还对酵母的生长产生负面影响。因此，希望降低乳酸和/或与发酵生物竞争糖的不希望的细菌的水平。
发明内容
本发明通过提供证明减少和/或消除乳酸(例如由于细菌细胞)的生物溶液提供了解决不希望的细菌在发酵培养基中竞争糖和它们产生的乳酸的问题的解决方案，例如通过在糖化和/或发酵之前或期间添加至少一种裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽或包含LPMO的酶组合物来实现。
在一方面，本发明涉及一种减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的方法，该方法包括将裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入生物燃料发酵系统，其中该发酵系统包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件。在一个实施例中，以足以减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的浓度添加LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入扩培或发酵罐。在一个实施例中，发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐(yeast propagation tank)，并且将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入该酵母扩培罐。在一个实施例中，生物燃料是乙醇。
在一方面，本发明涉及一种由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将糖发酵，其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，步骤b)和c)同时进行。在一个实施例中，将含淀粉材料的浆液加热至高于糊化温度。
在一个实施例中，在液化后添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，在糖化之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，在发酵之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，发酵生物是酵母，并且在酵母扩培之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物在醪冷却系统的任何点引入。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物添加至热交换器。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物添加至混合槽。
在一个实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇。
在一个实施例中，细菌细胞是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌细胞。在一个实施例中，细菌细胞是乳杆菌属(Lactobacillus)细胞或产生乳酸的细胞。
在一方面，本发明涉及LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低乙醇生产过程中发酵期间乳酸水平的用途。
在一方面，本发明涉及LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低酵母扩培期间乳酸水平的用途。
在一个实施例中，LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
在一个实施例中，LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌(Penicillium emersonii)AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及iv)在里氏木霉背景中表达的SEQID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施例中，LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：i)SEQ ID NO:119的土曲霉(Aspergillus terreus)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉(Aspergilluslentulus)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉(Aspergillus nidulans)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉(Penicillium polonicum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；v)SEQ ID NO:125的草酸青霉(Penicilliumoxalicum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌(Mycothermus thermophiles)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种(Acremonium sp.)XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉(Aspergillus insuetus)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌(Cladosporiumgossypiicola)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种(Myrothecium sp.)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种(Paraphoma sp.)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xi)SEQ ID NO:135的南极青霉(Penicillium antarcticum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xii)SEQ ID NO:136的同心青霉(Penicillium concentricum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉(Penicilliumroseopurpureum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉(Penicillium sclerotiorum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xv)SEQ IDNO:142的青霉属物种(Penicillium sp)-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉(Penicillium steckii)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉(Penicillium vulpinum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种(Pestalotiopsissp)-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌(Talaromyces sayulitensis)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢(Trichocladium asperum)多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
附图说明
图1显示了示例性的干磨乙醇生产方法。
图2显示了与对照(0,0)相比，在不同AA9多肽存在下玉米醪发酵后的乳酸浓度。
图3显示了与对照(0,0)相比，在不同AA9多肽存在下玉米醪发酵后的乙醇浓度。
图4显示了与对照相比，在不同AA13多肽存在下玉米醪发酵后的乳酸浓度。
图5显示了与对照相比，在增加剂量的At-AA13多肽存在下玉米醪发酵后的乳酸浓度。
发明说明
本发明涉及减少和/或消除例如生物燃料发酵系统中的细菌污染。本发明还涉及使用发酵生物从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在发酵之前和/或期间添加至少一种裂解性多糖单加氧酶(LPMO)。
诸位发明人惊奇地发现，诸如辅助活性9(AA9)的裂解性多糖单加氧酶(LPMO)能够降低乙醇发酵期间污染(主要由乳酸细菌引起)指标水平，导致较低的乳酸滴度。使用某些辅助活性13(AA13)多肽也证明了相似的结果。与在没有LPMO的情况下受污染的醪的发酵相比，在受污染的醪的扩培或发酵期间添加LPMO还导致乙醇产量的提高。出乎意料的是，根据本披露的LPMO在发酵过程中在降低乳酸水平方面的表现等于或优于抗生素，例如青霉素。
I.减少和/或消除生物燃料发酵系统中的细菌污染
因此，在一方面，本发明涉及用于减少和/或消除生物燃料发酵系统中的细菌污染的方法，该方法包括向生物燃料发酵系统中引入裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽或包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽的酶组合物。能以足以抑制生物燃料发酵系统中污染性细菌细胞生长的浓度添加LPMO多肽。
本披露预期减少和/或消除由于存在于生物燃料发酵系统中的多种类型的污染性细菌细胞而引起的细菌污染。在一个实施例中，细菌细胞是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌细胞。在一个实施例中，污染性细菌细胞是但不限于乳杆菌属的产生乳酸和/或乙酸的细菌，已知这些细菌污染发酵系统。已发现污染发酵系统的乳杆菌属物种的实例包括：柯氏乳杆菌(Lactobacillus collinoides)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和/或鼠李糖乳杆菌的菌株，及其混合物。
如本文所用，短语“减少和/或消除细菌污染”包括减少发酵系统中存在的细菌细胞的现有群体，以及抑制细菌生长。例如，LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物可减少发酵系统中存在的细菌细胞数量或将细菌生长抑制至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
用于生物燃料发酵的系统和方法是本领域众所周知的。发酵系统可以包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，其被配置为执行发酵产物生产过程，例如图1中所示的示例性干磨乙醇生产过程。本领域技术人员将理解，可以在多个不同位置将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入扩培或发酵系统中或之前。在一个实施例中，发酵系统中的至少一个发酵容器是发酵罐，并且将酶组合物引入发酵罐中。在一个实施例中，在发酵开始之前将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入发酵罐。在一个实施例中，发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入该酵母扩培罐。在一个实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物在醪冷却系统的任何点引入。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物添加至热交换器。在一个实施例中，将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物添加至混合槽。在一个实施例中，生物燃料是醇。在一个实施例中，醇是乙醇。在一个实施例中，醇是甲醇。在一个实施例中，醇是丁醇。
应该理解的是，任何LPMO多肽，例如在下面的第III部分中描述的LPMO多肽，都可以在该部分中描述的组合物或方法中使用。
II.减少和/或防止乳酸增加
在一方面，本发明涉及用于减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸增加的方法，该方法包括将LPMO多肽或包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽的酶组合物引入生物燃料发酵系统中。以足以减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的浓度添加LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
如本文所用，短语“减少和/或防止乳酸增加”包括减少现有乳酸分子，以及减少发酵系统中乳酸分子的增加或积累。例如，LPMO多肽或包含至少一种LPMO的酶组合物可以使发酵系统中的乳酸水平降低至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。在一个实施例中，LPMO多肽或包含至少一种LPMO的酶组合物可以防止发酵系统中的乳酸水平增加至少1％、3％、5％、10％、11％、13％、15％、17％、21％、24％、26％、32％、35％、40％、45％、50％、54％、58％、61％、63％、66％、70％、75％、77％、80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％或更多。
用于生物燃料发酵的系统和方法是本领域众所周知的。发酵系统可以包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，其被配置为执行发酵产物生产过程，例如图1中所示的示例性干磨乙醇生产过程。本领域技术人员将理解，可以在多个不同位置将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入发酵系统中。在一个实施例中，发酵系统中发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入该发酵罐。在一个实施例中，在发酵开始之前将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入发酵罐。在一个实施例中，发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入该酵母扩培罐。在一个实施例中，恰好在液化之后且在发酵罐或扩培罐之前引入LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物在一个实施例中，在醪冷却系统的任何点引入LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，生物燃料是醇。在一个实施例中，醇是乙醇。在一个实施例中，醇是甲醇。在一个实施例中，醇是丁醇。
应该理解的是，任何LPMO多肽，例如在下面的第III部分中描述的LPMO多肽，都可以在该部分中描述的组合物或方法中使用。
III.裂解性多糖单加氧酶
本披露预期包含任何裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽的方法和组合物，该多肽在发酵期间减少或防止乳酸水平的增加和/或减少发酵培养基中污染性细菌细胞的影响。术语“裂解性多糖单加氧酶”或“LPMO”在本文中与“裂解性多糖单加氧酶多肽”和“LPMO多肽”同义使用，它们是指在外部电子供体的存在下氧化多糖(例如壳多糖、纤维素和淀粉)中sp(3)碳且据信在活性位点利用铜来活化分子氧的酶。如在碳水化合物活性酶的数据库(http://www.cazy.org/)中所定义的，示例性LPMO属于辅助活性家族AA9、AA10、AA11和AA13。在一个实施例中，LPMO选自辅助活性9(AA9)、辅助活性10(AA10)、辅助活性11(AA11)、辅助活性13(AA13)及其组合。
在一个实施例中，LPMO多肽是AA9多肽。术语“辅助活性9多肽”或“AA9多肽”意指分类为裂解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]08:15079-15084；Phillips等人,201 1,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Li等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。根据Henrissat,1991,Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316以及Henrissat和Bairoch,1996,Biochem.J.[生物化学杂志]316:695-696，AA9多肽之前被分类为糖苷水解酶家族61(GH61)。
任何AA9多肽都可以用作酶组合物的组分或用于本发明的方法中，例如细菌、真菌、古细菌等。
在本发明的方法中有用的AA9裂解性多糖单加氧酶的实例包括但不限于来自于以下的AA9裂解性多糖单加氧酶：土生梭孢壳霉(WO 2005/074647、WO 2008/148131和WO2011/035027)、橙色嗜热子囊菌(WO 2005/074656和WO 2010/065830)、里氏木霉(WO 2007/089290和WO 2012/149344)、嗜热毁丝霉(WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868及WO 2009/033071)、烟曲霉(WO 2010/138754)、嗜松青霉(WO2011/005867)、嗜热子嚢菌属物种(WO 2011/039319)、青霉属物种(WO 201 1/041397和WO2012/000892)、甲壳嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceous)(WO 201 1/041504)、棘孢曲霉(WO 2012/030799)、疏棉状嗜热丝孢菌(WO 2012/1 13340、WO 2012/129699、WO 2012/130964、和WO 2012/129699)、阿尔博鲁宾斯深黄孔菌(WO 2012/122477)、褐孢长毛盘菌(WO2012/122477)、托姆青霉(WO 2012/122477)、柄篮状菌(WO 2012/135659)、特异腐质霉(WO2012/146171)、樟绒枝霉(WO 2012/101206)、雷塞氏篮状菌(Talaromyces leycettanus)(WO 2012/101206)、嗜热毛壳菌(WO 2012/101206)和嗜热篮状菌(Talaromycesthermophilus)(WO 2012/129697和WO 2012/130950)、梭孢端梗霉(WO 2013/043910)和瘤孢棒囊孢壳(WO 2013/043910)。
在一个实施例中，AA9多肽来自嗜热子囊菌属(Thermoascus)，如橙色嗜热子囊菌或甲壳嗜热子囊菌，例如：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、或SEQ ID NO:22的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、或SEQ ID NO:37的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自青霉属，如埃默森青霉菌，例如：SEQ ID NO:3的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:21的嗜松青霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:23的青霉属物种AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ ID NO:49的托姆青霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自梭孢壳属，如土生梭孢壳霉，例如，SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、或SEQ ID NO:34的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自曲霉属，如烟曲霉，例如：SEQ ID NO:5的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、或SEQ ID NO:44的棘孢曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽是在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌AA9多肽，或SEQ ID NO:6的变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自木霉属，如里氏木霉，例如：SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:84的里氏木霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自嗜热毁丝霉属，如嗜热毁丝霉菌，例如：SEQ ID:15、SEQ ID:16、SEQ ID:17、SEQ ID:18、SEQ ID:19、SEQ ID:88、SEQ ID:93、或SEQ ID:94的嗜热毁丝霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自深黄孔菌属(Aurantiporus)，如阿尔博鲁宾斯深黄孔菌，例如，SEQ ID:45或SEQ ID:46的阿尔博鲁宾斯深黄孔菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自长毛盘菌属(Trichophaea)，如褐孢长毛盘菌，例如，SEQ ID:47或SEQ ID:48的褐孢长毛盘菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自篮状菌属(Talaromyces)，如柄篮状菌，例如：SEQID:50的柄篮状菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:82的雷塞氏篮状菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ IDNO:89的埃默森篮状菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQID NO:90或SEQ ID NO:91的嗜热毁丝霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自嗜热子嚢菌属(Thermomyces)，如疏棉状嗜热丝孢菌，例如，SEQ ID:52或SEQ ID:53的疏棉状嗜热丝孢菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自腐质霉属(Humicola)，如特异腐质霉，例如，SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ IDNO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:79、或SEQ ID NO:80的特异腐质霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自畸枝霉属(Malbranchea)，如樟绒枝霉，例如，SEQID:81的樟绒枝霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自毛壳菌属(Chaetomium)，如嗜热毛壳菌，例如，SEQID:83的嗜热毛壳菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自端梗孢属(Acrophialophora)，如梭孢端梗霉，例如，SEQ ID:85的梭孢端梗霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽来自棒囊壳属(Corynascus)，如瘤孢棒囊孢壳，例如，SEQ ID:86或SEQ ID:87的瘤孢棒囊孢壳AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA9多肽是在对应于SEQ ID NO:4的全长多肽的位置23、61、62、63、64、103、104、105、106、108、109、156、185、186和194的一个或多个位置处包含取代的AA9变体，其中该变体减少和/或消除发酵培养基中的污染性细菌细胞。
在一个实施例中，AA9变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、或94的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，基于预测SEQ ID NO:4的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:4的氨基酸22至250。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:7的氨基酸1至19是信号肽的SignalP 3.0程序(Bendtsen等人,2004,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]340:783-795)，成熟多肽是SEQ ID NO:7的氨基酸20至326。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:8的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:8的氨基酸18至239。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:9的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸20至258。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:10的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:10的氨基酸19至226。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:11的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸20至304。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:12的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:12的氨基酸16至317。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:13的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:13的氨基酸22至249。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:14的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸20至249。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:15的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:15的氨基酸18至232。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:16的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:16的氨基酸16至235。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:17的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:17的氨基酸19至323。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:18的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:18的氨基酸16至310。在另一方面，基于预测SEQ I D NO:19的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:19的氨基酸20至246。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:20的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:20的氨基酸22至354。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:21的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:21的氨基酸22至322。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:22的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸24至444。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:23的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:23的氨基酸26至253。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:24的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:24的氨基酸18至246。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:25的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:25的氨基酸20至334。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:26的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:26的氨基酸18至227。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:27的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:27的氨基酸20至223。在另一个方面，基于预测SEQ I D NO:28的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸22至368。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:29的氨基酸1至24是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:29的氨基酸25至330。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:30的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:30的氨基酸17至236。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:31的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:31的氨基酸19至250。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:32的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:32的氨基酸23至478。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:33的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:33的氨基酸17至230。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:34的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:34的氨基酸20至257。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:35的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:35的氨基酸23至251。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:36的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:36的氨基酸19至349。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:37的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:37的氨基酸24至436。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:38的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:38的氨基酸21至344。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:39的氨基酸1至25是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:39的氨基酸26至400。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:40的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:40的氨基酸21至389。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:41的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:41的氨基酸22至406。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:42的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:42的氨基酸20至427。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:43的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:43的氨基酸18至267。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:44的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:44的氨基酸21至273。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:45的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:45的氨基酸21至322。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:46的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:46的氨基酸18至234。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:47的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:47的氨基酸24至233。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:48的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:48的氨基酸17至237。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:49的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:49的氨基酸20至484。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:50的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:50的氨基酸22至320。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:51的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:51的氨基酸23至272。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:52的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:52的氨基酸22至327。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:53的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:53的氨基酸23至274。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:54的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:54的氨基酸18至227。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:55的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:55的氨基酸17至257。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:56的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:56的氨基酸20至246。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:57的氨基酸1至27是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:57的氨基酸28至265。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:58的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:58的氨基酸16至310。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:59的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:59的氨基酸21至354。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:60的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:60的氨基酸22至267。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:61的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:61的氨基酸16至237。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:62的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:62的氨基酸20至234。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:63的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:63的氨基酸18至226。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:64的氨基酸1至16是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:64的氨基酸17至231。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:65的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:65的氨基酸22至248。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:66的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:66的氨基酸18至233。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:67的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:67的氨基酸21至243。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:68的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:68的氨基酸21至363。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:69的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:69的氨基酸20至296。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:70的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:70的氨基酸16至318。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:71的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:71的氨基酸19至259。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:72的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:72的氨基酸20至325。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:74的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:74的氨基酸19至298。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:74的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:74的氨基酸20至298。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:75的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:75的氨基酸22至344。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:76的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:76的氨基酸20至330。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:77的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:77的氨基酸19至216。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:78的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:78的氨基酸18至490。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:79的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:79的氨基酸21至306。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:80的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:80的氨基酸22至339。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:81的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:81的氨基酸23至334。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:82的氨基酸1至23是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ IDNO:82的氨基酸24至366。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:83的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:83的氨基酸21至364。在另一方面，基于预测SEQ IDNO:84的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:84的氨基酸22至344。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:85的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:85的氨基酸20至252。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:86的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:86的氨基酸20至344。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:87的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:87的氨基酸22至347。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:88的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:88的氨基酸20至342。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:89的氨基酸1至26是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:89的氨基酸27至254。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:90的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:90的氨基酸23至272。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:91的氨基酸1至22是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:91的氨基酸23至272。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:128的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:128的氨基酸19至381。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:130的氨基酸1至21是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:130的氨基酸氨基酸22至386。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:131的氨基酸1至19是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:131的氨基酸20至387。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:132的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:132的氨基酸19至253。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:133的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:133的氨基酸19至377。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:134的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:134的氨基酸18至388。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:135的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:135的氨基酸19至391。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:136的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:136的氨基酸19至387。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:139的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:139的氨基酸19至390。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:141的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:141的氨基酸19至386。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:144的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:144的氨基酸19至394。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:145的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQID NO:145的氨基酸19至391。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:148的氨基酸1至15是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:148的氨基酸16至393。在另一方面，基于预测SEQID NO:149的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:149的氨基酸18至382。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:150的氨基酸1至17是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:150的氨基酸18至379。在另一方面，基于预测SEQ ID NO:151的氨基酸1至18是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO:151的氨基酸19至383。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
在一个实施例中，AA9多肽是SEQ ID NO:1-91中任一种的成熟AA9多肽或SEQ IDNO:1-91中任一种的变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，LPMO多肽是AA10多肽。术语“辅助活性10多肽”或“AA10多肽”意指分类为裂解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]08:15079-15084；Phillips等人,201 1,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Li等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。AA10可包含含有碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，CBM)的CBM33结构域，其被定义为碳水化合物结合蛋白内的连续氨基酸序列，其中谨慎(discreet)折叠具有碳水化合物结合活性。例如，已知壳多糖酶除催化区域外还包含一个或多个壳多糖结合模块。粘质沙雷氏菌的ChiA包含III型纤连蛋白CBM，粘质沙雷氏菌的ChiB包含家族5CBM，且粘质沙雷氏菌的ChiC包含家族12和III型纤连蛋白样CBM。对于域命名，参见Bourne和Henrissat,2001,Curr.Opin.Struct.Biol.[结构生物学最新观点]11:593。同样地，许多纤维素酶含有结合纤维素的CBM。结合壳多糖并含有刺激这类结合的CBM的蛋白质可以是，例如结构性或信号传导分子，或者它们可以是酶，并且可以由除了碳水化合物结合模块以外存在的域确定该蛋白质的总体功能。
任何AA10多肽都可以用作酶组合物的组分或用于本发明的方法中，例如细菌、真菌、古细菌等。本文中使用的AA10多肽可以根据基于序列相似性的CAZY分类系统(cazy.org/CAZY/fam/acc_CBM.html)来鉴定(Davies和Henrissat,2002,Biochem Soc T[生化学会会报]30:291-297以及Bourne和Henrissat,2001,同上)。已知该家族中的蛋白质结合壳多糖，但也观察到与其他多糖包括纤维素的结合(Moser等人,2008,Biotechnol.Bioeng.[生物技术与生物工程]100(6):1066-77)。对于这些蛋白质中的一些，已显示它们分别在壳多糖和纤维素的降解中与壳多糖酶和纤维素酶协同作用(Vaaje-Kolstad等人,2005,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]280(31):28492-7；Vaaje-Kolstad等人,2009,FEBS J.276(8):2402-15)。
AA10多肽包含家族33碳水化合物结合模块(CBM33)。在数种情况中，CBM33模块构成了整个蛋白质，即蛋白质由或基本上由单一家族33CBM组成，其天然就这样合成并分泌。然而，可以将一些家族33CBM融合到一种或多种另外的非催化性的碳水化合物结合模块(例如CBM家族2、CBM家族3、和CBM家族5模块)上。这些蛋白质是双域或多域蛋白质。还有一个作为单独模块存在于大得多的催化蛋白质中的家族33碳水化合物结合模块的已知实例。这是嗜纤维梭菌(Caldibacillus cellulovorans)的β-1,4-甘露聚糖酶蛋白(Sunna等人,2000,Appl.Environ.Micro.[应用与环境微生物学]66(2):664-670)。
家族33CBM通常大小约为150-250个氨基酸，例如160-240、170-230、180-220、190-210个氨基酸，并且分子量约为20kDa，优选19-21kDa、18-21kDa、19-22kDa或18-20kDa，尽管也可以使用分子量约为30-40kDa的像300-400个氨基酸那样大的CBM33域。可以通过本领域中已知的标准方法容易地测定蛋白质的大小。
优选地，AA10多肽由单一家族33CBM组成、或基本由家族33CBM组成。如果所述AA10多肽“基本上由”家族33CBM“组成”，则意味着除构成家族33CBM的氨基酸外，蛋白质中还可存在其他氨基酸。优选地，存在1-3、1-5、1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90或90-100或更多个另外的氨基酸。这些另外的氨基酸通常位于家族33CBM的C末端。
可替代地，AA10多肽可包含家族33CBM。由此，该蛋白质中可以存在另外的模块或域。这类模块的实例是CBM家族2、CBM家族3、和CBM家族5模块。如果存在另外的域或模块，它们一般被发现位于家族33CBM的C末端。
因此，在一个优选的方面，AA10多肽可以含有、组成为或基本组成为：天然存在的家族33CBM(或CBM33家族蛋白)如CBP21(或其另一物种的同源物)、或其生物学活性片段。可替代地，其可以含有、组成为或基本组成为：天然存在的家族33CBM(或CBM33家族蛋白)的变体或其生物学活性片段。
包含或组成为家族33CBM模块、或完整的家族33CBM蛋白(其包含家族33CBM模块)、或其片段或变体的AA10多肽在本文中被统一称为CBM33蛋白、或CBM33家族成员或蛋白。可以在本发明中使用的天然存在的CBM33蛋白包括微生物(例如细菌)、真核生物(例如网柄菌属(Dictyostelium))或病毒CBM33蛋白。然而，优选细菌CBM33蛋白。
在WO 2012/019151(通过引用以其整体并入本文)的表1中列出了可以在本发明的组合物和方法中使用的已知的CBM33蛋白的实例和相关的数据库登录号(其通过引用特此并入)。
细菌CBM33蛋白可以来自任何合适的来源，但优选来自选自下组的属，该组由以下组成：芽孢杆菌属(Bacillus)、色杆菌属(Chromobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、弗朗西斯菌属(Francisella)、河氏菌属(Hahella)、乳杆菌属、乳球菌属(Lactococcus)、军团菌属(Legionella)、李斯特菌属(Listeria)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、光细菌属(Photobacterium)、光杆菌属(Photothabdus)、变形杆菌属(Proteus)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏菌属(Rickettsia)、Saccharophagus属、Salinvibrio属、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、Sodalis属、链霉菌属(Streptomyces)、温双岐菌属(Thermobifida)、弧菌属(Vibrio)和Yersini属、以及任选的纤维单胞菌属(Cellulomonas)和纤维弧菌属(Cellvibrio)。
在一个实施例中，CBM33蛋白是如美国专利申请号2007/0218046中所述的CBP21，所述文献通过引用并入本文。例如，可以使用粘质沙雷菌的CBP21(WO 2012/019151中的SEQID NO:4)。可替代地，可以使用粪肠球菌的EfCBM33(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:5)、褐色嗜热裂孢菌的E7(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:6)、天蓝链霉菌A3(2)的CelS2(WO2012/019151中的SEQ ID NO:7)、产黄纤维单胞菌DSM 20109)的Cfla_0175(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:8)、产黄纤维单胞菌DSM 20109)的Cfla_0172(SEQ ID NO:9)、产黄纤维单胞菌DSM 20109)的Cfla_0316(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:10)、产黄纤维单胞菌DSM 20109)的Cfla_0490(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:11)、纤维弧菌Ueda107的CJA_2191(Cbp33A)(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:12)、纤维弧菌Ueda107的CJA_3139(Cbp33/10B)(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:13)以及天蓝链霉菌A3(2)的SC01734(WO 2012/019151中的SEQ ID NO:14)。解淀粉芽孢杆菌的ChbA(Chu等人,2001,Microbiology[微生物学]147(Pt 7):1793-803)链霉菌属的CHB1、2和3(Svergun等人,2000,Biochemistry[生物化学]39(35):10677-83,Zeltins等人,1997,Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]246(2):557-64,Zeltins等人,1995,Anal.Biochem.[分析化学]231(2):287-94,Schnellmann等人,1994,Mol.Microbiol.[分子微生物学]13(5):807-19；Kolbe等人,1998,Microbiology[微生物学]144(Pt 5):1291-7；Saito等人,2001,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]67(3):1268-73)和Alteramonas属的CBP1(Tsujibo等人,2002,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]68:263-270)也是用于本发明的优选的CBM33蛋白。所有这些参考文献均通过引用并入本文。
因此，AA10多肽可以是或对应于或包含自然界中发现的天然存在的CBM33家族蛋白(例如CBP21，EfCBM33，ChbA，CHB1、2和3以及CBP1或E7，CelS2，Cfla_0175，Cfla_0172，Cfla_0316，Cfla_0490，CJA_2191(Cbp33A)，CJA_3139(Cbp33/10B)和SC01734)，或其生物活性片段。可供选择地，AA10多肽可以是非天然的变体。
在一个实施例中，AA10多肽来自链霉菌属，如天蓝链霉菌，或另一种链霉菌属物种，例如：SEQ ID NO:114的天蓝链霉菌AA10多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ ID NO:115的链霉菌属物种(Streptomyces sp.)AA10多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA10多肽是SEQ ID NO:116的多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个实施例中，AA10多肽是SEQ ID NO:116的多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但非100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA10多肽是SEQ ID NO:117的多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一个实施例中，AA10多肽是SEQ ID NO:117的多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但非100％的序列同一性。
在一个实施例中，LPMO多肽是AA11多肽。术语“辅助活性11多肽”或“AA11多肽”意指分类为裂解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]08:15079-15084；Phillips等人,201 1,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Li等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。
任何AA11多肽都可以用作酶组合物的组分或用于本发明的方法中，例如细菌、真菌、古细菌等。在一个实施例中，AA11多肽是真菌来源的。适用于本文的组合物和方法的示例性AA11多肽来自曲霉属，如黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、棒曲霉、米曲霉或黄曲霉；链孢霉属，如粗糙脉孢霉或四孢脉孢霉；核盘菌属；赤霉属；盾壳霉属；Psiticum属；稻瘟菌属；柄孢壳菌属；毛壳菌属；暗球腔菌属；盘菌属；新萨托菌属；核腔菌属；黍属(Panicum)；Aureococcus属；青霉属；木霉属；粪壳菌属；Colleotrichum属；轮枝孢属；节丛孢属；丛赤壳属；小球腔菌属；镰孢属；小丛壳属；地丝霉属；和毁丝霉属。
在一个实施例中，AA11多肽来自枝顶孢霉属，如嗜碱枝顶孢，例如SEQ ID NO:118的嗜碱枝顶孢AA10多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，AA11多肽是SEQ ID NO:118的嗜碱枝顶孢AA10多肽。
在一个实施例中，LPMO多肽是AA13多肽。术语“辅助活性13多肽”或“AA13多肽”意指分类为裂解性多糖单加氧酶(Quinlan等人,2011,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]08:15079-15084；Phillips等人,201 1,ACS Chem.Biol.[ACS化学生物学]6:1399-1406；Li等人,2012,Structure[结构]20:1051-1061)的多肽。
任何AA13多肽都可以用作酶组合物的组分或用于本发明的方法中，例如细菌、真菌、古细菌等。在一个实施例中，AA13多肽是真菌来源的。适用于本文的组合物和方法的示例性AA13多肽来自曲霉属，如黑曲霉、构巢曲霉、土曲霉、棒曲霉、米曲霉或黄曲霉；链孢霉属，如粗糙脉孢霉或四孢脉孢霉；核盘菌属；赤霉属；盾壳霉属；Psiticum属；稻瘟菌属；柄孢壳菌属；毛壳菌属；暗球腔菌属；盘菌属；新萨托菌属；核腔菌属；黍属(Panicum)；Aureococcus属；青霉属；木霉属；粪壳菌属；Colleotrichum属；轮枝孢属；节丛孢属；丛赤壳属；小球腔菌属；镰孢属；小丛壳属；地丝霉属；和毁丝霉属。
在一个实施例中，AA13多肽来自曲霉属，如土曲霉、迟缓曲霉、费雪氏曲霉、构巢曲霉、奇突曲霉等，例如：SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:122的费雪氏曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:123的构巢曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ ID NO:130的奇突曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:130的氨基酸22至386或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自青霉属，如波兰青霉、草酸青霉、亚利桑那青霉(Penicillium arizonense)等，例如：SEQ ID NO:124的波兰青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:125的草酸青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:126的亚利桑那青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:135的南极青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:136的同心青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:137的霍克斯青霉(Penicilliumpaxilli)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:138的蕈青霉(Penicillium paxilli)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:140的萨姆森青霉(Penicillium samsonianum)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:141的菌核青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:143的青霉属物种-54569AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:145的歧皱青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；SEQ ID NO:146的栖葡萄青霉(Penicillium viticola)AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性；或SEQ ID NO:147的狐粪青霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:135的氨基酸19至391或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:136的氨基酸19至387或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:139的氨基酸19至390或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:141的氨基酸19至386或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:144的氨基酸19至394或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:145的氨基酸19至391或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自嗜热链球菌属(Mycothermus)，如嗜热链球属，例如，SEQ ID NO:127的嗜热链球属AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自枝顶孢霉属，如枝顶孢霉属物种XZ1982，例如SEQID NO:128的顶孢霉属物种XZ1982AA13 AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:128的氨基酸19至381或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自顶孢霉属(Acrostalagmus)，如黄笋顶孢霉(Acrostalagmus luteoalbus)，例如，SEQ ID NO:129的黄笋顶孢霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自枝孢菌属，如棉生枝孢菌，例如，SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:131的氨基酸20至387或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自镰孢属，如镰孢属物种-75363，例如SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:132的氨基酸19至253或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自漆斑菌属，如漆斑菌属物种，例如，SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:133的氨基酸19至377或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自异茎点霉属，如异茎点霉属物种，例如，SEQ IDNO:134的异茎点霉属物种AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:134的氨基酸18至388或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自拟盘多毛孢属，如拟盘多毛孢属物种-71627，例如，SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:148的氨基酸16至393或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自Setophaeosphaeria属，如Setophaeosphaeria属物种NN051506，例如，SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506AA13 AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:149的氨基酸18至382或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自篮状菌属，如西柳篮状菌，例如，SEQ ID NO:150的西柳篮状菌AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:150的氨基酸18至379或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽来自短梗蠕孢属，如粗糙短梗蠕孢，例如，SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，AA13多肽是SEQ ID NO:151的氨基酸19至383或其变体，该变体与该多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％但小于100％的序列同一性。
IV.酶组合物
本发明还涉及包含至少一种本发明的裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽的组合物。优选地，组合物富含本发明的至少一种LPMO多肽。术语“富集”表示组合物的活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。
在一个实施例中，组合物包含本发明的至少一种、至少两种、至少三种或至少四种LPMO多肽。
这些组合物可以进一步包含多种酶活性，如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下组成：乙酰木聚糖酯酶、酰基甘油脂肪酶、淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、阿魏酸酯酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、葡聚糖1,4-a-葡糖苷酶、葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶、溶血磷脂酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶(甘露聚糖酶)、植酸酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D、蛋白酶、支链淀粉酶、果胶酯酶、三酰基甘油脂肪酶、木聚糖酶、β-木糖苷酶或其任何组合。
在实施例中，该组合物包含一种或多种如本文披露的配制剂，优选一种或多种选自以下列表的化合物，该列表由以下组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉、高岭土和纤维素。
在一个实施例中，该组合物包含一种或多种选自以下列表的组分，该列表由以下组成：维生素、矿物质和氨基酸。
IV.用于生产发酵产物的方法
本发明还涉及使用发酵生物从含淀粉材料生产发酵产物的方法，其中在糖化和/或发酵之前和/或期间添加裂解性多糖单加氧酶(LPMO)或包含至少一种裂解性多糖单加氧酶(LPMO)的酶组合物。
由含经未经糊化的淀粉的材料生产发酵产物的工艺
在一方面，本发明涉及在含淀粉材料不糊化(即，不蒸煮)的情况下从含淀粉材料生产发酵产物的方法(通常被称为“生淀粉水解”方法)，其中添加至少一种裂解性多糖单加氧酶。可在不使包含含淀粉材料以及水的水性浆料液化的情况下生产发酵产物如乙醇。在一个实施例中，本发明的方法包括：在低于初始糊化温度下、优选地在α-淀粉酶和/或产碳水化合物源的酶的存在下将(例如碾磨的)含淀粉材料(例如颗粒状淀粉)糖化，以产生可以通过适合的发酵生物发酵成发酵产物的多种糖。在此实施例中，所希望的发酵产物例如乙醇是从未经糊化的(即，未蒸煮)，优选地经碾磨的谷粒如玉米中产生的。
因此，在一方面，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括使用产碳水化合物源的酶和发酵生物，在低于所述含淀粉材料的初始糊化温度的温度处，在本发明的变体蛋白酶的存在下将含淀粉材料同时糖化和发酵。糖化和发酵还可以是分开的。因而，在另一方面，本发明涉及生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)在低于初始糊化温度的温度处使用产碳水化合物源的酶(例如葡糖淀粉酶)糖化含淀粉材料；以及
(ii)使用发酵生物进行发酵；
其中步骤(i)和/或(ii)使用至少一种葡糖淀粉酶和至少一种本发明的LPMO多肽或包含至少一种本发明的LPMO多肽的酶组合物进行。在一个实施例中，以足以抑制污染性细菌细胞生长的浓度添加所述至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，以足以降低糖化、发酵和/或同时糖化或发酵(SSF)期间乳酸水平的浓度添加所述至少一种LPMO或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，在糖化步骤(i)期间添加至少一种LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，在发酵步骤(ii)期间添加至少一种LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，在步骤(i)中还添加α淀粉酶，特别是真菌阿尔法淀粉酶。可以同时进行步骤(i)和(ii)。在一个实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)期间添加至少一种LPMO。在一个实施例中，该方法进一步包括在适于进一步用于发酵的条件下扩培发酵生物。在一个实施例中，发酵生物是酵母，并且在酵母扩培期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，以足以降低扩培期间乳酸水平的浓度添加所述至少一种LPMO或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法
在一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依序地或同时地进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：
(a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
(b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；以及
(c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵；
其中在糖化步骤(b)和/或发酵步骤(c)之前或期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，以足以抑制污染性细菌细胞生长的浓度添加所述至少一种LPMO或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。在一个实施例中，以足以降低糖化、发酵和/或同时糖化或发酵(SSF)期间乳酸水平的浓度添加所述至少一种LPMO或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
在一个实施例中，在糖化步骤(b)之前或期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，在发酵步骤(c)之前或期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，在步骤(b)中还添加α淀粉酶，特别是真菌α淀粉酶。步骤(b)和(c)可以同时进行。在一个实施例中，在同时糖化和发酵(SSF)期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，该方法进一步包括在适于进一步用于发酵的条件下扩培发酵生物。在一个实施例中，发酵生物是酵母，并且在酵母扩培之前或期间添加包含至少一种LPMO多肽的至少一种LPMO酶组合物。在一个实施例中，以足以降低扩培期间乳酸水平的浓度添加所述至少一种LPMO或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
将浆料加热至高于糊化温度并且可添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀化)。在一个实施例中，该浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使该浆料糊化。在一个实施例中，液化可作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6，特别是在pH 4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间，优选70℃-90℃之间，如优选80℃-85℃之间，并且添加α-淀粉酶变体，任选地连同半纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶，以开始液化(稀化)。通常在pH 4-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、特别是从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在该方法中，该糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(如酵母)和酶可以一起添加。SSF可典型地在从25℃至40℃、如从28℃至35℃、如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。
含淀粉材料
可以在本发明的方法中使用任何适合的含淀粉起始材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适于在本发明的方法中使用的含淀粉起始材料的实例包括大麦、豆类、树薯(cassava)、谷物、玉米、买罗高梁(milo)、豌豆、马铃薯、稻、黑麦、西米、高粱、甘薯、木薯(tapioca)、小麦以及全谷物或其任何混合物。该含淀粉材料还可以是蜡质或非蜡质类型的玉米和大麦。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是玉米。在一个优选的实施例中，该含淀粉材料是小麦。
发酵产物
术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物的发酵方法或过程生产的产物。发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在一个优选的实施例中，该发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。在一个实施例中，该发酵产物是乙醇。
发酵生物
术语“发酵生物”是指适于生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，如酵母和丝状真菌。适合的发酵生物能够将可发酵糖(如阿拉伯糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖或木糖)直接或间接地发酵(即，转化)为所希望的发酵产物。
发酵生物的实例包括真菌生物，如酵母。优选的酵母包括酵母菌(Saccharomyces)的菌株，特别是酿酒酵母或葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；毕赤酵母属(Pichia)的菌株，特别是树干毕赤酵母(Pichiastipitis)的菌株，如树干毕赤酵母CBS 5773，或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；假丝酵母属(Candida)的菌株，特别是阿拉伯糖发酵假丝酵母(Candida arabinofermentans)、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)、迪丹斯假丝酵母(Candida diddensii)、休哈塔假丝酵母(Candida shehatae)、萨纳瑞西斯假丝酵母(Candida sonorensis)、假热带假丝酵母(Candida tropicalis)、或产朊假丝酵母(Candida utilis)。其他发酵生物包括汉逊酵母属(Hansenula)的菌株，特别是异常汉逊酵母(Hansenula anomala)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的菌株，特别是脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)或马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)；和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的菌株，特别是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)。
在一个实施例中，该发酵生物是C6糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
在一个实施例中，该发酵生物是C5糖发酵生物，如例如酿酒酵母的菌株。
发酵
基于例如植物材料的种类、可获得的可发酵糖、一种或多种发酵生物和/或所希望的发酵产物确定发酵条件。本领域的普通技术人员可以容易地确定适合的发酵条件。发酵可以在常规使用的条件下进行。优选的发酵过程是厌氧过程。
例如，发酵可以在高达75℃，例如40℃-70℃之间，如50℃-60℃之间的温度处进行。然而，还已知的是细菌具有低至室温左右(20℃左右)的显著较低的最适温度。适合的发酵生物的实例可以发现于上面的“发酵生物”部分中。
对于使用酵母生产乙醇，发酵可以持续24至96小时，特别是持续35至60小时。在一个实施例中，在20℃至40℃，优选26℃至34℃之间，特别是32℃左右的温度处进行发酵。在一个实施例中，pH是从pH 3至6，优选pH 4至5左右。
发酵产物的回收
发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。典型地，获得具有高达例如约96vol.％的纯度的发酵产物，例如，乙醇。
因此，在一个实施例中，本发明的方法还包括蒸馏以获得发酵产物，例如，乙醇。该发酵和蒸馏可以同时和/或分别/顺序进行；任选地，随后是用于进一步精制该发酵产物的一个或多个方法步骤。
蒸馏方法完成后，剩余材料被视为全酒糟。如本文所用，术语“全酒糟”包括在发酵产物例如乙醇的回收之后在蒸馏方法结束时保留的材料。任选地可以通过本领域已知的任何方法回收该发酵产物。
将全酒糟分离(脱水)为酒糟水和湿饼
在一个实施例中，通过一种或多种将酒糟水与湿饼分离的方法，将该全酒糟分离或分配成固相和液相。
将全酒糟分离为酒糟水和湿饼，以去除很大一部分的液体/水，可以使用任何适合的分离技术(包括离心、压榨和过滤)来实现。在一个优选实施例中，通过离心进行分离/脱水。在工业中，优选的离心机是沉降式离心机，优选高速沉降式离心机。适合的离心机的一个实例是来自阿法拉伐公司(Alfa Laval)的NX 400陡锥系列，它是高性能沉降器。在另一个优选实施例中，使用其他常规分离设备(如板/框压滤机、带压滤机、螺旋压榨机、重力浓缩机和脱水机)或类似设备来进行分离。
酒糟水的加工
酒糟水是用于全酒糟离心的上清液的术语。典型地，该酒糟水包含4％-6％的干固体(DS)(主要是蛋白质、可溶性纤维、细纤维、和细胞壁组分)，并且温度为约60℃-90℃。该酒糟水流可以通过蒸发进行冷凝，以提供两种工艺流，包括：(i)蒸发器冷凝流，其包含在蒸发期间从该酒糟水中去除的冷凝水，和(ii)浆料流，其包含更浓缩的非挥发性溶解的和未溶解的固体流，如由于去除了蒸发的水而从酒糟水中剩余下来的不可发酵糖和油。任选地，可从该酒糟水中去除油，或者可以作为蒸发方法的中间步骤去除油，该蒸发方法典型地使用一系列的若干个蒸发阶段进行。可以将浆料和/或脱油浆料与湿谷粒(来自全酒糟分离步骤)一起引入干燥器中，以提供被称作含可溶物的干酒糟的产物，其也可用作动物饲料。
在一个实施例中，将浆料和/或脱油浆料喷入一个或多个干燥器中，以将该浆料和/或脱油浆料与全酒糟合并，以生产含可溶物的干酒糟。
可以将5vol-％-90vol-％之间，如10％-80％之间，如15％-70％之间，如20％-60％之间的酒糟水(例如，任选地水解的)再循环(作为逆流)到步骤(a)。该再循环的酒糟水(即，逆流)可以占步骤(a)中形成的浆料的约1vol.-％-70vol.-％、优选15vol.-％-60vol.-％、尤其是从约30vol.-％至50vol.-％。
在一个实施例中，该方法还包括任选地在已经从用本发明的LPMO处理的酒糟水流中提取油之后，将该酒糟水流的至少一部分再循环到浆料中。
湿饼的干燥以及干酒糟和含可溶物的干酒糟的生产
在已经从酒糟水分离含约25wt-％-40wt-％、优选30wt-％-38wt-％干固体的湿饼后(例如，脱水)，可以在转鼓式干燥机、喷雾干燥机、环式干燥机、流化床干燥机等上将其干燥，以生产“干酒糟”(DDG)。DDG是用于动物(如家畜、家禽和鱼)的有价值饲料成分。优选以小于约10-12wt.-％湿度的含量提供DDG，以避免发霉和微生物分解并且增加保质期。另外，高含湿量还使得运输DDG更昂贵。优选在不变性湿饼中的蛋白质的条件下干燥湿饼。湿饼可以与分离自酒糟水的浆料共混，并且被干燥为DDG及其可溶物(DDGS)。可以通过部分干燥湿饼，任选地在干燥方法之前、期间或之后添加浆料来生产部分干燥的中间产物，如有时被称作经修饰的湿酒糟。
液化过程中存在的和/或添加的α-淀粉酶
根据本发明，在液化中，α-淀粉酶任选地与半纤维素酶、内切葡聚糖酶、蛋白酶、产碳水化合物源的酶(如葡糖淀粉酶)、磷脂酶、植酸酶、和/或普鲁兰酶一起存在和/或添加。
在液化步骤i)过程中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，如尤其是芽孢杆菌α-淀粉酶，如在液化过程中使用的温度是稳定的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
细菌α-淀粉酶
术语“细菌α-淀粉酶”意指在EC 3.2.1.1项下分类的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可例如源自芽孢杆菌属(有时也称作地芽孢杆菌属)的菌株。在一个实施例中，该芽孢杆菌属α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、芽孢杆菌属TS-23、或枯草芽孢杆菌的菌株，但是也可源自其他芽孢杆菌属物种。
细菌α-淀粉酶的具体实例包括WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:95的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、WO 99/19467中的SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶、和WO 99/19467中的SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、以及WO 2009/061380中披露为SEQ ID NO:1的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(所有序列都通过引用特此并入)。
在一个实施例中，细菌α-淀粉酶可为分别与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、4或5以及WO 2009/061380中的SEQ ID NO:1所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在一个实施例中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3、或本文的SEQID NO:95所示的任何序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性程度的酶。
在一个优选的实施例中，该α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可为成熟野生型或其成熟变体。成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以是在重组产生过程中天然地截短的。例如，成熟嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是在C-末端截短的，所以它是约491个氨基酸长(与WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ IDNO:95比较)，如从480至495个氨基酸长。
该芽孢杆菌α-淀粉酶还可为变体和/或杂合体。这样的变体的实例可见于以下任一者中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059、WO 02/10355以及WO 2009/061380(所有文件都通过引用特此并入)。具体的α-淀粉酶变体在美国专利号6,093,562、6,187,576、6,297,038和7,713,723中披露(通过引用特此并入)并包括具有以下情况的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常常称作BSGα-淀粉酶)变体：在位置R179、G180、I181和/或G182的任何一处的一个或两个氨基酸的缺失，优选WO 96/23873中披露的双缺失-参见例如第20页，第1-10行(通过引用特此并入)，优选与WO 99/19467中披露的SEQID NO:3所阐述的或本文的SEQ ID NO:95的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列相比对应于位置I181和G182的缺失，或使用WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:95的氨基酸R179和G180的缺失。甚至更优选的是芽孢杆菌α-淀粉酶，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌(BSG)α-淀粉酶，其与WO 99/19467中披露的SEQ ID NO:3所阐述的或本文的SEQ IDNO:95的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比在对应于位置R179、G180、I181和G182具有一个或两个氨基酸缺失，优选地其对应于R179和G180具有双缺失，或优选地位置181和182的缺失(被表示为I181*+G182*)，并且任选地，还包含N193F取代(被表示为I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在对应于WO 99/19467中的SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶、或WO 99/19467中的SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体或本文的SEQ ID NO:95中的S239的位置处具有取代。
在一个实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q或A变体(使用本文的SEQ ID NO:95进行编号)。
在一个实施例中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的E188变体，优选E188P变体(使用本文的SEQ ID NO:95进行编号)。
其他涵盖的变体是WO 2009/061380中披露的芽孢杆菌属物种TS-23变体，尤其是WO 2009/061380的权利要求1中定义的变体(通过引用特此并入)。
细菌杂合α-淀粉酶
细菌α-淀粉酶也可为杂合细菌α-淀粉酶，例如包含地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(WO99/19467的SEQ ID NO:4中所示)的445个C-末端氨基酸残基和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶(WO 99/19467的SEQ ID NO:5中所示)的37个N-末端氨基酸残基的α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，该杂合体具有下列取代中的一个或多个，尤其是全部：
G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:4中的地衣芽孢杆菌编号方式)。还优选的是具有以下突变(或在其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的对应突变)中的一个或多个的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V以及Q264S和/或在位置176与179之间的两个残基的缺失，优选E178和G179的缺失(使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5进行位置编号)。
在一个实施例中，细菌α-淀粉酶是嵌合α-淀粉酶的成熟部分，其披露于Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry[生物化学杂志]277(29):.267501-26507，被称作BD5088或其变体。此α-淀粉酶与WO 2007134207中的SEQ IDNO:2所示的相同。成熟酶序列在位置1处的起始“Met”氨基酸之后开始。
热稳定的α-淀粉酶
根据本发明，将α-淀粉酶与具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选是木聚糖酶)组合使用。任选地，可以包括具有大于70℃、如大于75℃、特别是大于80℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶。热稳定的α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶)优选地源自嗜热脂肪芽孢杆菌或芽孢杆菌属物种TS-23。在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少15的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少20的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少25的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少30的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少40的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少50的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少60的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在10-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在15-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在20-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在25-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在30-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在40-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在50-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有在60-70之间的T1/2(min)。
在一个实施例中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选地源自芽孢杆菌属，尤其是嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌，如在WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:95，其中在位置R179、G180、I181和/或G182处具有一个或两个氨基酸缺失，特别是R179和G180缺失、或具有I181和G182缺失，具有如下突变列表中的突变。在优选的实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，以及任选的取代N193F，任选地进一步包括选自以下列表的突变：
Figure BDA0002439145670000551
Figure BDA0002439145670000561
在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：
-I181*+G182*；
-I181*+G182*+N193F；
优选地
-I181*+G182*+E129V+K177L+R179E；
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
-181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
-I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；以及
-I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(使用本文的SEQ ID NO:95进行编号)。
在实施例中，细菌α-淀粉酶，如芽孢杆菌α-淀粉酶，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶与本文的SEQ ID NO:95的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。
在实施例中，细菌α-淀粉酶变体，如芽孢杆菌α-淀粉酶变体，如嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:95的多肽的成熟部分具有至少60％，如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式自然地产生。特别地，截短是这样的，使得WO 99/19467中的SEQ ID NO:3或本文的SEQID NO:95中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-末端截短并且典型地是约491个氨基酸长，如从480至495个氨基酸长。
在液化过程中存在的和/或添加的热稳定的半纤维素酶
根据本发明，具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)与α-淀粉酶(如细菌α-淀粉酶(以上描述的))组合存在于和/或被添加至液化步骤i)中。
半纤维素酶(优选地木聚糖酶)的热稳定性可以如“材料与方法”部分“通过差示扫描量热法测定Td对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”中所述测定。
在一个实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10或GH11木聚糖酶具有大于82℃，如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如大于88℃、如大于90℃、如大于92℃、如大于94℃、如大于96℃、如大于98℃、如大于100℃、如在80℃和110℃之间、如在82℃和110℃之间、如在84℃和110℃之间的熔点(DSC)。
在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:96的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株、如嗜热网团菌的菌株。
在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH11木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:97的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自网团菌属的菌株，如嗜热网团菌的菌株。
在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:98的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自霉状篮状菌属(Rasamsonia)的菌株，如丝衣霉状篮状菌的菌株。
在一个优选的实施例中，半纤维素酶，特别是木聚糖酶，尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:99的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自篮状菌属的菌株、如雷塞氏篮状菌的菌株。
在一个优选的实施例中，半纤维素酶、特别是木聚糖酶、尤其是GH10木聚糖酶与本文的SEQ ID NO:100的多肽(优选地源自曲霉属的菌株、如烟曲霉的菌株)的成熟部分具有至少60％(如至少70％、如至少75％)的同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的同一性。
在液化过程中存在的和/或添加的热稳定的内切葡聚糖酶
根据本发明，在液化步骤i)中，具有大于70℃(如在70℃和95℃之间)的熔点(DSC)的任选的内切葡聚糖酶(“E”)可以与α-淀粉酶(如热稳定的细菌α-淀粉酶)和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。
内切葡聚糖酶的热稳定性可以如WO 2017/112540(其通过引用以其整体并入本文)的“材料与方法”部分中“通过差示扫描量热法测定Td对内切葡聚糖酶和半纤维素酶的测定”标题下所述测定。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶具有大于72℃、如大于74℃、如大于76℃、如大于78℃、如大于80℃、如大于82℃、如大于84℃、如大于86℃、如大于88℃、如在70℃和95℃之间、如在76℃和94℃之间、如在78℃和93℃之间、如在80℃和92℃之间、如在82℃和91℃之间、如在84℃和90℃之间的熔点(DSC)。
在一个优选的实施例中，在本发明的方法中使用的或包含在本发明的组合物中的内切葡聚糖酶是糖苷水解酶家族5内切葡聚糖酶或GH5内切葡聚糖酶(参见在“www.cazy.org”网站的CAZy数据库)。
在一个实施例中，GH5内切葡聚糖酶来自家族EG II，如本文的SEQ ID NO:101中显示的雷塞氏篮状菌内切葡聚糖酶；本文的SEQ ID NO:102中显示的胶囊青霉内切葡聚糖酶、以及本文的SEQ ID NO:103中显示的褐孢长毛盘菌内切葡聚糖酶。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶是家族GH45内切葡聚糖酶。在一个实施例中，GH45内切葡聚糖酶来自家族EG V，如本文的SEQ ID NO:104中显示的粪生粪壳菌或本文的SEQID NO:105中显示的土生梭孢壳霉内切葡聚糖酶。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:101的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性。在一个实施例中，内切葡聚糖酶是源自篮状菌属(Talaromyces)的菌株，如雷塞氏篮状菌的菌株。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:102的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自青霉菌属的菌株，如胶囊青霉的菌株。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:103的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自长毛盘菌属的菌株，如褐孢长毛盘菌的菌株。
在一个实施例中，内切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:104的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自粪壳菌属的菌株，如粪生粪壳菌的菌株。
在一个实施例中，切葡聚糖酶与本文的SEQ ID NO:105的多肽的成熟部分具有至少60％、如至少70％、如至少75％同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％同一性，优选地源自梭孢壳属的菌株、如土生梭孢壳霉的菌株。
在一个实施例中，在液化步骤i)中在从1-10,000μg EP(酶蛋白)/g DS)如10-1,000μg EP/g DS的剂量添加内切葡聚糖酶。
液化过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶
根据本发明，在液化中，任选的产碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选是热稳定的葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选的具有大于70℃的熔点(DSC)的内切葡聚糖酶、以及任选的支链淀粉酶和/或任选的植酸酶一起存在和/或添加。
术语“产碳水化合物源的酶”包括产生可发酵糖的任何酶。产碳水化合物源的酶能够产生碳水化合物，该碳水化合物可以被讨论中的一种或多种发酵生物用作能量源，例如，当在用于生产发酵产物(如乙醇)的本发明的工艺中使用时。产生的碳水化合物可以直接或间接转化成希望的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用碳水化合物源产生酶的混合物。具体实例包括葡糖淀粉酶(为葡萄糖生产者)、β-淀粉酶和产麦芽糖淀粉酶(为麦芽糖生产者)。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是热稳定的。该产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶可以与α-淀粉酶和热稳定的蛋白酶一起或分开添加。
在一个具体并优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是热稳定的葡糖淀粉酶，优选真菌来源，优选丝状真菌，如来自青霉属的菌株，尤其是草酸青霉的菌株，特别是在WO2011/127802(将其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的以及显示在本文的SEQ IDNO:106中的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在一个实施例中，该热稳定的葡糖淀粉酶与WO 2011/127802的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:106中显示的成熟多肽具有至少80％、更优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少91％、更优选至少92％、甚至更优选至少93％、最优选至少94％、以及甚至最优选至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在一个实施例中，产碳水化合物源的酶，特别是热稳定的葡糖淀粉酶是本文的SEQID NO:106中显示的草酸青霉葡糖淀粉酶。
在一个优选的实施例中，产碳水化合物源的酶是披露为WO 2011/127802中的SEQID NO:2以及显示在本文的SEQ ID NO:106中的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体，具有K79V取代(称为“PE001”)(使用SEQ ID NO:14中所示的成熟序列用于编号)。如WO 2013/036526(将其通过引用特此并入)中披露的，该K79V葡糖淀粉酶变体相对于亲本对蛋白酶降解具有降低的敏感度。
涵盖的草酸青霉葡糖淀粉酶变体披露于WO 2013/053801(其通过引用特此并入)中。
在一个实施例中，这些变体具有对蛋白酶降解的降低的敏感度。
在一个实施例中，这些变体与亲本相比具有改进的热稳定性。
更具体地，在一个实施例中，葡糖淀粉酶具有对应于PE001变体的K79V取代(使用本文的SEQ ID NO:106进行编号)，并且进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：
T65A；Q327F；E501V；Y504T；Y504*；T65A+Q327F；T65A+E501V；T65A+Y504T；T65A+Y504*；Q327F+E501V；Q327F+Y504T；Q327F+Y504*；E501V+Y504T；E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V；T65A+Q327F+Y504T；T65A+E501V+Y504T；Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+Y504*；T65A+E501V+Y504*；Q327F+E501V+Y504*；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504*；E501V+Y504T；T65A+K161S；T65A+Q405T；T65A+Q327W；T65A+Q327F；T65A+Q327Y；P11F+T65A+Q327F；
R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；P11F+T65A+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；T65A+Q327F+E501V+Y504T；T65A+S105P+Q327W；T65A+S105P+Q327F；T65A+Q327W+S364P；T65A+Q327F+S364P；T65A+S103N+Q327F；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；S255N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
在一个优选的实施例中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有K79V取代，使用本文的SEQID NO:106进行编号(PE001变体)，并且进一步包括以下突变中的一种：
P11F+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；
P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；
P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶变体，如草酸青霉葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ IDNO:106的成熟多肽具有至少60％(如至少70％、如至少75％)的同一性、优选地至少80％、更优选地至少85％、更优选地至少90％、更优选地至少91％、更优选地至少92％、甚至更优选地至少93％、最优选地至少94％、以及甚至最优选地至少95％、如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、但小于100％的同一性。
产碳水化合物源的酶(特别是麦芽糖酶)能以从0.1-100微克EP/g DS、如0.5-50微克EP/g DS、如1-25微克EP/g DS、如2-12微克EP/g DS的量添加。
在液化过程中存在的和/或添加的支链淀粉酶
任选地，在液化步骤i)过程中，普鲁兰酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的任选的半纤维素酶(优选木聚糖酶)一起存在和/或添加。如以上提及的，蛋白酶、产碳水化合物源的酶、优选地热稳定的葡糖淀粉酶也可以任选地在液化步骤i)过程中存在和/或添加。
支链淀粉酶可以在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化发酵过程中存在和/或添加。
普鲁兰酶(E.C.3.2.1.41，普鲁兰糖6-葡聚糖-水解酶)是去分支酶，其特征在于它们在例如支链淀粉和普鲁兰糖中水解α-1,6-糖苷键的能力。
根据本发明涵盖的普鲁兰酶包括来自美国专利号4,560,651(其通过引用特此并入)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的普鲁兰酶、WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:2的普鲁兰酶、WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)、以及来自WO 01/151620(其通过引用特此并入)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸普鲁兰芽孢杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的普鲁兰酶以及还有描述于FEMS Mic.Let.[FEMS微生物学通讯](1994)115,97-106中的普鲁兰酶。
根据本发明涵盖的另外的支链淀粉酶包括来自沃斯氏热球菌、具体地来自WO 92/02614中披露的沃斯氏热球菌DSM No.3773的支链淀粉酶。
在一个实施例中，该支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一个实施例中，该支链淀粉酶包括如披露于WO 2011/087836中的(将其通过引用特此并入)中的X47结构域。更具体地该支链淀粉酶可以源自热球菌属的菌株，包括嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，如显示在WO 2011/087836中的在X47结构域之后的X4位点右侧截短的热水高温球菌支链淀粉酶。该支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶杂合体或具有截短位点X4的、披露于WO2011/087836(将其通过引用特此并入)中的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂合酶。
在另一个实施例中，该支链淀粉酶是包括披露于WO 2011/076123(诺维信公司)中的X46结构域的一种支链淀粉酶。
根据本发明，该支链淀粉酶能以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”-部分中。
适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME 400L、PROMOZYMETMD2(诺维信公司(Novozymes A/S)，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司，美国)、以及AMANO 8安能满公司，日本)。
液化过程中存在的和/或添加的植酸酶
任选地，在液化中植酸酶可以与α-淀粉酶和具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)组合存在和/或添加。
根据本发明使用的植酸酶可以是能够从植酸(肌醇六磷酸盐)或其任何盐(植酸盐)中释放无机磷酸盐的任何酶。植酸酶可以根据其在初始水解步骤中的特异性进行分类，据此首先水解磷酸酯基团。本发明中使用的植酸酶可以具有任何特异性，例如是3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)或5-植酸酶(无EC号)。在一个实施例中，植酸酶具有大于50℃最适温度，如在从50℃至90℃的范围。
植酸酶可以源自植物或微生物，如细菌或真菌，例如酵母或丝状真菌。
植物植酸酶可以来自麦麸、玉蜀黍、大豆或百合花粉。适合的植物植酸酶描述在Thomlinson等人，Biochemistry[生物化学]，1(1962)，166-171；Barrientos等人,Plant.Physiol.[植物生理学],106(1994),1489-1495；WO 98/05785；WO 98/20139。
细菌植酸酶可以来自芽孢杆菌属、柠檬酸杆菌属、哈夫尼菌属、假单胞菌属、布丘氏菌属或埃希氏菌属，特别是枯草芽孢杆菌、布氏柠檬酸杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、蜂房哈夫尼菌、布伽瓦尼布丘氏菌(Buttiauxella gaviniae)、乡间布丘菌(Buttiauxellaagrestis)、诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)和大肠杆菌。适合的细菌植酸酶描述在Paver和Jagannathan，1982，Journal of Bacteriology[细菌学杂志]151:1102-1108；Cosgrove,1970,Australian Journal of Biological Sciences[生物科学澳大利亚杂志]23:1207-1220；Greiner等人,Arch.Biochem.Biophys.[农业生物化学生物生理学],303,107-113,1993；WO 1997/33976；WO 1997/48812、WO 1998/06856、WO 1998/028408、WO2004/085638、WO 2006/037327、WO 2006/038062、WO 2006/063588、WO 2008/092901、WO2008/116878、和WO 2010/034835中。
酵母植酸酶可以源自酵母属或许旺酵母属，具体地物种酿酒酵母或许旺酵母。前面的酶已经描述为适合的酵母植酸酶描述于Nayini等人，1984，LebensmittelWissenschaft und Technologie[食品科学与技术]17:24-26；Wodzinski等人,Adv.Appl.Microbiol.[应用与环境微生物学],42,263-303；AU-A-24840/95；
来自丝状真菌的植酸酶可以源自子囊菌(Ascomycota、ascomycetes)真菌门或担子菌门，例如曲霉属、嗜热真菌属(也称为腐质霉属)、毁丝霉属、红曲霉属、青霉菌属、隔孢伏革属、田头菇属(Agrocybe)、桩菇属(Paxillus)或栓菌属(Trametes)，具体地物种土曲霉、黑曲霉、黑曲霉泡盛曲霉(Aspergillus niger var.awamori)、无花果曲霉、烟曲霉、米曲霉、疏绵状嗜热丝孢菌(也称为疏棉状腐质霉)、嗜热毁丝霉、隔孢伏革菌、平田头菇(Agrocybe pediades)、安卡红曲霉、卷边网褶菌(Paxillus involtus)或绒毛栓菌(Trametes pubescens)。适合的真菌植酸酶描述在Yamada等人,1986,Agric.Biol.Chem.[农业和生物化学]322:1275-1282；Piddington等人，1993，Gene[基因]133:55-62；EP 684,313；EP 0 420 358；EP 0 684 313；WO 1998/28408；WO 1998/28409；JP 7-67635；WO 1998/44125；WO 1997/38096；WO 1998/13480中。
在一个优选的实施例中，植酸酶源自布丘氏菌属，如布伽瓦尼布丘氏菌、乡间布丘菌、或诺亚克布丘氏菌(Buttiauxella noackies)，如在WO 2008/092901(通过引用特此并入)中分别披露为SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的那些。
在一个优选的实施例中，植酸酶源自柠檬酸杆菌属，如布氏柠檬酸杆菌，如在WO2006/037328(通过引用特此并入)中披露的。
通过本领域已知的方法获得修饰的植酸酶或植酸酶变体，特别是通过以下中披露的方法：EP 897010；EP 897985；WO 99/49022；WO 99/48330、WO 2003/066847、WO 2007/112739、WO 2009/129489、和WO 2010/034835中。
含有产物的可商购的植酸酶包括BIO-FEED植酸酶TM、植酸酶NOVOTMCT或L(均来自诺维信公司(Novozymes))、LIQMAX(杜邦公司(DuPont))或RONOZYMETMNP、
Figure BDA0002439145670000681
HiPhos、
Figure BDA0002439145670000682
P5000(CT)、NATUPHOSTMNG 5000(来自DSM)。
根据本发明，在糖化和/或发酵过程中存在和/或添加产碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。
在一个优选的实施例中，该产碳水化合物源的酶是一种真菌起源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属，优选黑曲霉、泡盛曲霉、或米曲霉的菌株；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌的菌株，
葡糖淀粉酶
根据本发明，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶可以源自任何适合的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，选自下组，该组由以下组成：曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,1984,EMBOJ.[欧洲分子生物学学会杂志]3(5),第1097-1102页)，或其变体，如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中披露的那些(来自丹麦诺维信公司，(Novozymes，Denmark))；WO 84/02921中披露的泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶；米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.[农业与生物化学](1991),55(4),第941-949页)，或它们的变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括具有增强的热稳定性的变体：G137A和G139A(Chen等人,(1996),Prot.Eng.[蛋白质工程]9,499-505)；D257E和D293E/Q(Chen等人,(1995),Prot.Eng.[蛋白质工程]8,575-582)；N182(Chen等人,(1994),Biochem.J[生物化学杂志]301,275-281)；二硫键、A246C(Fierobe等人,(1996),Biochemistry[生物化学],35,8698-8704)；以及在A435和S436位置导入Pro残基(Li等人,(1997),Protein Eng.[蛋白质工程]10,1199-1204)。
其他葡糖淀粉酶包括罗耳阿太菌(Athelia rolfsii)(以前命名为罗尔伏革菌(Corticium rolfsii))葡糖淀粉酶(参见美国专利号4,727,026和Nagasaka等人(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases fromCorticium rolfsii[来自罗尔伏革菌的粗淀粉降解葡萄糖淀粉酶的纯化及性质]”Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]50:323-330)，篮状菌属葡糖淀粉酶，特别是源自埃默森篮状菌(WO 99/28448)、雷塞氏篮状菌(美国专利号Re.32,153)、杜氏篮状菌(Talaromyces duponti)、以及嗜热篮状菌(美国专利号4,587,215)。在一个优选的实施例中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中披露的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶。
涵盖的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌属(Clostridium)，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)的葡糖淀粉酶。
涵盖的真菌葡糖淀粉酶包括均在WO 2006/069289中披露的瓣环栓菌，纸质大纹饰孢(Pachykytospora papyracea)；和大白桩蘑(Leucopaxillus giganteus)；和WO2007/124285中披露的红边隔孢伏革菌(Peniophora rufomarginata)；或其混合物。根据本发明还涵盖杂合葡糖淀粉酶。实例包括WO 2005/045018中披露的杂合葡糖淀粉酶。具体实例包括实例1的表1和4中披露的杂合葡糖淀粉酶(这些杂合体通过引用特此并入)。
在一个实施例中，该葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别地如WO 2011/066576中所描述的密孔菌属的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)；或源自褐褶茵属的菌株，特别地如WO2011/068803中所描述的褐褶茵属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)或黑层孔属的菌株，特别地如WO 2012/064351中所披露的黑层孔属物种的菌株(SEQ ID NO:2)(所有参考文献通过引用特此并入)。还涵盖了以下葡糖淀粉酶，该葡糖淀粉酶展现与上述葡糖淀粉酶的任一种的高同一性，即，与上述酶序列的成熟部分中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、如100％的同一性。
在一个实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，如0.1-2AGU/g DS。
市售的包含葡糖淀粉酶的组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER，SANTMEXTRA L，SPIRIZYMETM PLUS，SPIRIZYMETM FUEL，SPIRIZYMETM B4U，SPIRIZYMETM ULTRA，SPIRIZYMETM EXCEL，SPIRIZYMETMACHIEVE和AMGTM E(来自诺维信公司)；OPTIDEXTM 300，GC480，GC417(来自杰能科公司(Genencor Int.))；AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900，G-ZYMETM和G990 ZR(来自丹尼斯科美国公司(Danisco US))。
产麦芽糖淀粉酶
在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的产碳水化合物源的酶还可以是产麦芽糖α-淀粉酶。“产麦芽糖α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够将直链淀粉和支链淀粉水解成α构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的产麦芽糖淀粉酶可商购自诺维信公司。产麦芽糖α-淀粉酶描述于美国专利号4,598,048、4,604,355和6,162,628中，将其通过引用而特此并入。在一个优选的实施例中，能以0.05-5mg总蛋白/克DS或0.05-5MANU/g DS的量添加产麦芽糖淀粉酶。
在糖化和/或发酵或SSF中存在的和/或添加的纤维素酶或纤维素分解酶组合物
在本发明的方法中使用的纤维素分解组合物可以源自任何微生物。如本文所用，“源自任何微生物”意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在微生物中表达的酶。例如，源自里氏木霉的菌株的纤维素分解组合物意指该纤维素分解组合物包含一种或多种在里氏木霉中表达的酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自曲霉属的菌株，如黄曲霉、黑曲霉或米曲霉的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自金孢子菌属(Chrysosporium)的菌株，如卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自腐质霉属(Humicola)的菌株，如特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌或草酸青霉菌的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自篮状菌属的菌株，如金黄篮状菌或埃默森篮状菌的菌株。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物源自里氏木霉的菌株。
该纤维素分解组合物可以包括以下多肽(包括酶)中的一种或多种：具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI和CBHII、或其中两种、三种、或四种的混合物。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
该纤维素分解组合物可以包含一些半纤维素酶，例如像木聚糖酶和/或β-木糖苷酶。该半纤维素酶可以来自生产纤维素分解组合物的生物或其他来源，例如，该半纤维素酶可以对生产纤维素分解组合物的生物例如像里氏木霉而言是外源的。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物中的半纤维素酶含量小于10wt.％，如小于纤维素分解组合物的5wt.％。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽以及β-葡糖苷酶。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBH。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶以及CBHI。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括β-葡糖苷酶和CBHI。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包括具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、β-葡糖苷酶、CBHI以及CBHII。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶、CBHI、和CBHII。
该纤维素分解组合物还可以包含选自由以下组成的组的一种或多种酶：纤维素酶、具有纤维素分解增强活性的GH61多肽、酯酶、棒曲霉素、漆酶、木质素分解酶、果胶酶、过氧化物酶、蛋白酶、和膨胀素。
在一个实施例中，该纤维素酶是选自由以下组成的组的一种或多种酶：内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶、和β-葡糖苷酶。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶I。
在一个实施例中，该内切葡聚糖酶是内切葡聚糖酶II。
β-葡糖苷酶
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种β-葡糖苷酶。在一个实施例中，β-葡糖苷酶可以是源自曲霉属的菌株的一种，如源自米曲霉的，如在WO 2002/095014中披露的一种或在WO 2008/057637中披露的具有β-葡糖苷酶活性的融合蛋白，或源自烟曲霉的，如在WO 2005/047499或本文的SEQ ID NO:107中披露的一种或烟曲霉β-葡糖苷酶变体，如在WO 2012/044915或共同未决的PCT申请PCT/US11/054185(或美国临时申请号61/388,997)中披露的一种，如具有以下取代的一种：F100D、S283G、N456E、F512Y。
在另一个实施例中，该β-葡糖苷酶源自青霉属的菌株，如披露于WO 2007/019442中的巴西青霉(Penicillium brasilianum)的菌株，或木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是选自由以下组成的组的烟曲霉β-葡糖苷酶或其同系物：
(i)β-葡糖苷酶，其包含SEQ ID NO:107的成熟多肽；
(ii)β-葡糖苷酶，其包含与本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)β-葡糖苷酶，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶是一个变体，该变体在对应于本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽的位置100、283、456以及512的一个或多个(若干个)位置处包括取代，其中该变体具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施例中，变体的亲本β-葡糖苷酶是(a)多肽，包括本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽；(b)多肽，其与本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽具有至少80％序列同一性；(c)多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在高或非常高严格条件下与(i)WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列、(ii)包含在WO 2013/148993中的SEQ IDNO:5的成熟多肽编码序列中的cDNA序列或(iii)(i)或(ii)的全长互补链杂交；(d)多肽，其由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少80％同一性；或(e)本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽的片段，该片段具有β-葡糖苷酶活性。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶变体与亲本β-葡糖苷酶的氨基酸序列具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，变体与本文的SEQ ID NO:107的成熟多肽具有至少80％，例如至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的序列同一性。
在一个实施例中，β-葡糖苷酶来自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如烟曲霉β-葡糖苷酶(本文的SEQ ID NO:107)，其包括一个或多个选自由以下组成的组的取代：L89M、G91L、F100D、I140V、I186V、S283G、N456E、和F512Y；如其变体，具有以下取代：
-F100D+S283G+N456E+F512Y；
-L89M+G91L+I186V+I140V；
-I186V+L89M+G91L+I140V+F100D+S283G+N456E+F512Y。
在一个实施例中，取代的数目在1与4之间，如1、2、3或4个取代。
在一个实施例中，变体在对应于位置100的位置处包括取代、在对应于位置283的位置处包括取代、在对应于位置456的位置处包括取代和/或在对应于位置512的位置处包括取代。
在一个优选的实施例中，该β-葡糖苷酶变体包括以下取代：本文的SEQ ID NO:107中的Phe100Asp、Ser283Gly、Asn456Glu、Phe512Tyr。
在一个优选的实施例中，该β-葡糖苷酶的相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
具有纤维素分解增强活性的GH61多肽
在一个实施例中，根据本发明所使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种具有纤维素分解增强活性的GH61多肽。在一个实施例中，酶组合物包含具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，如衍生自嗜热子囊菌属，如橙色嗜热子囊菌的菌株的一种，例如WO 2005/074656中以SEQ ID NO:2描述的那种；或源自梭孢壳属，如土生梭孢壳霉的菌株的一种，如WO 2005/074647中作为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8描述的一种；或源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株的一种，如WO 2010/138754中作为SEQ ID NO:2描述的多肽；或源自青霉属的菌株，如埃默森青霉菌的菌株的一种，如在WO 2011/041397中披露的或本文的SEQ ID NO:108的一种。
在一个实施例中，具有纤维素分解增强活性的青霉属物种GH61多肽或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含本文的SEQ ID NO:108的成熟多肽；
(ii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其包含与本文的SEQ ID NO:108的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)具有纤维素分解增强活性的GH61多肽，其由多核苷酸编码，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:7的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维二糖水解酶I
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHI(纤维二糖水解酶I)。在一个实施例中，纤维素分解组合物包括纤维二糖水解酶I(CBHI)，如源自曲霉属的菌株，如烟曲霉的菌株，如在WO 2011/057140中披露的SEQ ID NO:6或本文的SEQ ID NO:109的Cel7A CBHI，或源自木霉属的菌株，如里氏木霉的菌株。
在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶I或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)包含本文的SEQ ID NO:109的成熟多肽的纤维二糖水解酶I；
(ii)纤维二糖水解酶I，其包含与本文的SEQ ID NO:109的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶I，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维二糖水解酶II
在一个实施例中，根据本发明使用的纤维素分解组合物可以包含一种或多种CBHII(纤维二糖水解酶II)。在一个实施例中，纤维二糖水解酶II(CBHII)是如源自以下的纤维二糖水解酶II：曲霉属种的菌株(如烟曲霉的菌株)，如本文的SEQ ID NO:110中的纤维二糖水解酶II，或木霉属种的菌株，如里氏木霉，或梭孢壳属的菌株，如土生梭孢壳霉的菌株，如来自土生梭孢壳霉的纤维二糖水解酶II CEL6A。
在一个实施例中，烟曲霉纤维二糖水解酶II或其同系物选自下组，该组由以下组成：
(i)包括本文的SEQ ID NO:110的成熟多肽的纤维二糖水解酶II；
(ii)纤维二糖水解酶II，其包含与本文的SEQ ID NO:110的成熟多肽具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的氨基酸序列；
(iii)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸包含与WO 2013/148993中的SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少70％，例如，75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性的核苷酸序列；和
(iv)由以下多核苷酸编码的纤维二糖水解酶II，该多核苷酸在至少高严格条件，例如，非常高严格条件下，与WO 2013/148993中SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列或其全长互补序列杂交。
纤维素分解组合物
如以上提及的，该纤维素分解组合物可以包括多种不同的多肽(如酶)。
在一个实施例中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656)和米曲霉β-葡糖苷酶融合蛋白(WO 2008/057637)。
在另一个实施例中，纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含具有纤维素分解增强活性的橙色嗜热子囊菌GH61A多肽(WO 2005/074656中的SEQ ID NO:2)和烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)。
在另一个实施例中，该纤维素分解组合物包含里氏木霉纤维素分解组合物，还包含在WO 2011/041397中披露的具有纤维素分解增强活性的埃默森青霉菌GH61A多肽、烟曲霉β-葡糖苷酶(WO 2005/047499的SEQ ID NO:2)或其具有以下取代的变体：F100D、S283G、N456E、F512Y。
本发明的酶组合物可以处于任何适于使用的形式，例如像除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或不具有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物、或作为酶的来源的宿主细胞(例如，木霉属宿主细胞)。
该酶组合物可以是干粉或颗粒、无粉尘的颗粒、液体、稳定化液体或稳定化受保护的酶。可以根据已建立的方法例如通过添加稳定剂(如糖、糖醇或其他多元醇)、和/或乳酸或另一种有机酸，将液体酶组合物稳定化。
在一个优选的实施例中，该纤维素分解组合物包含β-葡糖苷酶，其相对ED50负载值小于1.00，优选小于0.80，如优选小于0.60，如在0.1-0.9之间，如在0.2-0.8之间，如0.30-0.70。
在一个实施例中，纤维素分解酶组合物(即，在步骤ii)的糖化和/或步骤iii)的发酵或SSF过程中)从0.0001-3mg EP/g DS、优选地0.0005-2mg EP/g DS、优选地0.001-1mg/gDS、更优选的从0.005-0.5mg EP/g DS、甚至更优选的0.01-0.1mg EP/g DS剂量添加。
液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶
在本发明的一个实施例中，在液化中，可以将任选的蛋白酶(如热稳定的蛋白酶)与α-淀粉酶(如热稳定的α-淀粉酶)、和具有大于80℃的熔点(DSC)的半纤维素酶(优选地木聚糖酶)、以及任选地内切葡聚糖酶、产碳水化合物源的酶(特别是葡糖淀粉酶、任选地支链淀粉酶和/或任选地植酸酶)一起存在和/或添加。
蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。
在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。
为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。
蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。下文在WO 2017/112540(其通过引用并入本文的“材料和方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中优选的测定是所谓的“AZCL-酪蛋白测定”。
在一个实施例中，如通过在WO 2017/112540中“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，热稳定的蛋白酶具有JTP196变体(来自WO 2017/112540的实例2)或蛋白酶Pfu(本文的SEQ ID NO:111)的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。
对于在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该蛋白酶是真菌来源的。
在一个优选的实施例中，该热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本发明的方法或组合物中使用的热稳定的蛋白酶是真菌起源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。
在一个实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的变体或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1以及本文的SEQID NO:112所示的成熟部分的变体，进一步具有选自以下列表的突变：
-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
-D79L+S87P+D142L。
在一个优选的实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露为以下的成熟金属蛋白酶的变体：披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQID NO:1或本文的SEQ ID NO:112的成熟部分，该变体具有以下突变：
D79L+S87P+A112P+D142L；
D79L+S87P+D142L；或
A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
在一个实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:112的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。
该热稳定的蛋白酶还可源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性。
在一个实施例中，该热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如激烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。
在一个实施例中，该蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:111所示的一种。
在一个实施例中，该热稳定的蛋白酶是披露在本文的SEQ ID NO:111或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:111具有至少80％同一性、如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。激烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(Takara Bio，Japan)。
激烈火球菌蛋白酶是一种根据本发明的热稳定的蛋白酶。如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，发现商业产品激烈火球菌蛋白酶(Pfu S)在pH 4.5具有110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)的热稳定性(参见实例5)。
在一个实施例中，热稳定的蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的、超过20％的热稳定性值，如实例2中所述的进行测定。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、如超过105％、如超过110％、如超过115％、如超过120％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在20％与50％之间、如在20％与40％之间、如20％与30％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在80℃/70℃的相对活性的，在50％与115％之间、如在50％与70％之间、如在50％与60％之间、如在100％与120％之间、如在105％与115％之间的热稳定性。
在一个实施例中，如WO 2017/112540的实例2中所述的进行测定，该蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的、超过10％的热稳定性值。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，超过10％，如超过12％、超过14％、超过16％、超过18％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％、超过100％、超过110％的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有确定为在85℃/70℃的相对活性的，在10％与50％之间、如在10％与30％之间、如在10％与25％之间的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在80℃的残余活性；和/或
在一个实施例中，蛋白酶具有超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的测定为在84℃的残余活性。
“相对活性”以及“残余活性”的测定是如在WO 2017/112540的实例2中描述的进行的。
在一个实施例中，如使用WO 2017/112540的实例3中披露的Zein-BCA测定确定的，该蛋白酶在85℃可以具有高于90，如高于100的热稳定性。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，如高于90％，如高于100％，如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，如在70％-120％之间，如在80％-120％之间，如在90％-120％之间，如在100％-120％之间，如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。
在一个实施例中，如通过在WO 2017/112540的“材料与方法”部分中描述的AZCL-酪蛋白测定进行确定，该热稳定的蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的活性。
V.本发明的另外方面
在本发明的另外方面，其涉及LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物用于减少和/或消除生物燃料发酵系统中的细菌污染的用途。
在本发明的另外方面，其涉及LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物用于减少和/或消除酵母扩培期间的细菌污染的用途。
在本发明的另外方面，其涉及LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物用于减少和/或消除发酵培养基中的细菌污染的用途。
在本发明的另外方面，其涉及包含至少一种LPMO多肽的LPMO多肽酶组合物用于降低生物燃料发酵系统中乳酸水平的用途。
在本发明的另外方面，其涉及LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物用于降低发酵培养基中乳酸水平的用途。
在本发明的另一方面，其涉及LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物用于降低酵母扩培期间的乳酸水平的用途。
本领域技术人员将理解，本节中描述的方面和实施例适用于任何LPMO，例如本文第III部分中描述的LPMO。
在一个实施例中，LPMO多肽选自辅助活性9(AA9)、辅助活性10(AA10)、辅助活性11(AA11)、辅助活性13(AA13)及其组合。
LPMO多肽可以是真菌、细菌或古细菌LPMO多肽。在一个实施例中，LPMO多肽是真菌AA9多肽。在一个实施例中，LPMO多肽是细菌AA9多肽。在一个实施例中，LPMO是古细菌AA9多肽。
在一个实施例中，LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9：
i)SEQ ID NO:1所示的Ta AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2所示的Pe AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3所示的Tt AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4所示的Af AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5所示的Tc AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和
iv)SEQ ID NO:6所示的VL AA9或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在一个实施例中，LPMO多肽是真菌AA10多肽。在一个实施例中，LPMO多肽是细菌AA10多肽。在一个实施例中，LPMO是古细菌AA10多肽。
在一个实施例中，LPMO多肽是真菌AA11多肽。在一个实施例中，LPMO多肽是细菌AA11多肽。在一个实施例中，LPMO是古细菌AA11多肽。
在一个实施例中，LPMO多肽是真菌AA13多肽。在一个实施例中，LPMO多肽是细菌AA13多肽。在一个实施例中，LPMO是古细菌AA13多肽。
在一个实施例中，LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
在以下段落中进一步总结了本发明：
1.一种减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的方法，该方法包括将LPMO多肽或包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽的酶组合物引入生物燃料发酵系统，其中该发酵系统包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，并且其中以足以减少和/或防止该生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的浓度添加该LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
2.一种减少和/或消除生物燃料发酵系统中细菌污染的方法，该方法包括将LPMO多肽或包含裂解性多糖单加氧酶(LPMO)的酶组合物引入生物燃料发酵系统，其中该发酵系统包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，并且其中以足以抑制该生物燃料发酵系统中污染性细菌细胞生长的浓度添加该LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
3.如段落2所述的方法，其中该细菌细胞是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌细胞。
4.如段落1至3中任一项所述的方法，其中该细菌细胞是乳杆菌属细胞。
5.如段落1至4中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将该LPMO多肽或酶组合物引入该发酵罐。
6.如段落1至5中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将该LPMO多肽或酶组合物引入该发酵罐。
7.如段落1至6中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将该LPMO多肽或该酶组合物引入该酵母扩培罐。
8.如段落1至7中任一项所述的方法，其中该生物燃料是乙醇。
9.如段落1至8中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
10.如段落1至9中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；和
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
11.如段落1至10中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
12.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；
c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵，
其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
13.如段落12所述的方法，其中步骤b)和c)同时进行。
14.如段落12或13所述的方法，其中将该含淀粉材料的浆液加热至高于糊化温度。
15.如段落12至14中任一项所述的方法，其中在液化期间添加该至少一种LPMO多肽或酶组合物。
16.如段落12至15中任一项所述的方法，其中在糖化之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或酶组合物。
17.如段落12至16中任一项所述的方法，其中在发酵之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或酶组合物。
18.如段落12至17中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母并且在酵母扩培之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或酶组合物。
19.如段落12至18中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇。
20.如段落12至19中任一项所述的方法，其中该细菌细胞是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌细胞。
21.如段落12至20中任一项所述的方法，其中该细菌细胞是乳杆菌属细胞。
22.如段落12至21中任一项中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
23.如段落12至22中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
24.如段落12至23中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
25.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于减少和/或消除生物燃料发酵系统中细菌污染的用途。
26.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于减少和/或消除酵母扩培期间细菌污染的用途。
27.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低乙醇生产过程中发酵期间乳酸水平的用途。
28.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低酵母扩培期间乳酸水平的用途。
29.如段落25至28中任一项所述的用途，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
30.如段落25至29中任一项所述的用途，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
31.如段落25至30中任一项所述的用途，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
本文中所描述和要求保护的本发明并不局限于本文中所披露的具体实施例的范围，因为这些实施例旨在作为本发明的若干方面的说明。任何等同的实施例都旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。本文引用了多个参考，其披露内容通过援引以其全部内部结合本文。进一步通过以下实例来描述本发明，所述实例不应理解为限制本发明的范围。
材料与方法
Ta AA9：来自橙色嗜热子囊菌的AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
Pe AA9：来自埃默森青霉菌的AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
Tt AA9：来自土生梭孢壳霉的AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
Af AA9：来自烟曲霉的AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
Tc AA9：来自甲壳嗜热子囊菌AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
VL-AA9：来自在里氏木霉背景中表达的埃默森青霉菌的AA9多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:6。
At-AA13：来自土曲霉的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:SEQ ID NO:119。
Al-AA13：来自迟缓曲霉的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:SEQ ID NO:120。
An-AA13：来自构巢曲霉的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:123。
Pp-AA13：来自波兰青霉的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:124。
Po-AA13：草酸青霉的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:125。
Mt-AA13：来自嗜热链球菌的AA13多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:127。
α-淀粉酶369(AA369)：具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(本文的SEQ ID NO:95)，被截短为491个氨基酸。
葡糖淀粉酶SA(GSA)：包括以下的共混物：在WO 99/28448中披露为SEQ ID NO:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶、在WO 06/69289中披露为SEQ ID NO:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶、以及以本文的SEQ ID NO:113披露的具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合结构域(SBD)的具有以下取代G128D+D143N的微小根毛霉α-淀粉酶(AGU:AGU:FAU-F中活性比为约20:5:1)。
蛋白酶Pfu：源自激烈火球菌的蛋白酶，示于本文的SEQ ID NO:111中。
实例
实例1-LPMO作为生物燃料发酵中的微生物控制生物溶液的评估
这个实例表明，LPMO可用于减少乙醇发酵过程中的细菌污染水平，这可以通过减少感染的玉米醪中存在的细菌的代谢产物水平来证明。特别地，该实例表明LPMO(如AA9多肽)可以减少乙醇发酵过程中玉米醪中细菌污染的影响，这可以通过发酵醪中乳酸形成水平的降低来证明。
清洁玉米醪：在我们的实验室中，在典型的液化条件下使用AA369和蛋白酶Pfu的共混物制备玉米醪。发现通过在选择性培养基中铺板无法检测到感染。将底物冷冻并在使用前解冻。
受感染的玉米醪：将感染程度未知的商业工业相关玉米醪(由乳酸形成和约为105细胞/mL的初始细胞数鉴定)孵育过夜，并用作我们的污染源。
对照：将清洁玉米醪加1％的受感染的玉米醪以36％的干固体使用，并与尿素(至最终浓度为400ppm)和商业葡糖淀粉酶GSA(在发酵中每克干固体0.6AGU)混合。将混合物在32℃孵育60分钟。此后，以发酵中的接种酵母(pitch)为0.5g/L添加酵母。进行六次重复发酵，持续3天。
商业抗生素对照：将清洁玉米醪加1％的受感染的玉米醪以36％的干固体使用，并与尿素(至最终浓度为400ppm)、商业葡糖淀粉酶GSA(在发酵中每克干固体0.6AGU)和每干固体2、6或12ppm的青霉素混合。将混合物在32℃孵育60分钟。此后，以发酵中的接种酵母为0.5g/L添加酵母。一式三份进行3天发酵。
将清洁玉米醪加1％的受感染的玉米醪以36％的干固体使用，并与尿素(至最终浓度为400ppm)、商业葡糖淀粉酶GSA(在发酵中每克干固体0.6AGU)和上文“材料与方法”部分中列出的AA9多肽(每干固体5、25或125ppm蛋白质)混合。将混合物在32℃孵育60分钟。此后，以发酵中的接种酵母为0.5g/L添加酵母。一式三份进行3天发酵。
图2显示了在不同AA9多肽和对照(对照，具有商业抗生素的对照)存在下玉米醪发酵后的乳酸浓度。如图2所示，测试的每种AA9多肽比对照(未使用抗生素)在更大程度上减少了乳酸形成，并且与使用最大剂量的青霉素的阳性对照相当。这些数据表明，LPMO(如AA9多肽)有效减少乙醇发酵过程中受感染的醪中乳酸形成的水平。图3显示了在不同AA9多肽和对照(对照，具有商业抗生素的对照)存在下玉米醪发酵后的乙醇浓度。如图3所示，测试的AA9多肽比对照(未使用抗生素)在更大程度上改善了乙醇形成，并且与使用最大剂量的青霉素的阳性对照相当。这些数据表明，LPMO(如AA9多肽)有效改善乙醇发酵过程中受感染的醪中乙醇形成的水平
在生物燃料发酵系统中，本披露的LPMO可于乙醇发酵期间使用以减少基线细菌污染的影响以及由产生乳酸和乙酸的细菌引起的感染事件，与乙醇生产的改善相一致。
实例2-LPMO作为生物燃料发酵中的微生物控制生物溶液的评估
这个实例表明，LPMO可用于减少乙醇发酵过程中的细菌污染的影响，这可以通过减少感染的玉米醪中存在的细菌的代谢产物水平来证明。特别地，该实例表明LPMO(如AA13多肽)可以减少乙醇发酵过程中由不希望的细菌细胞产生的乳酸。
清洁液化玉米醪：在我们的实验室中，在典型的液化条件下使用AA369和蛋白酶Pfu的共混物制备清洁玉米醪。发现通过在选择性培养基中铺板无法检测到感染率。将底物冷冻储存并在使用前解冻。
受感染的液化玉米醪：用先前从受感染的商业玉米醪中分离出的混合细菌群接种清洁玉米醪。将受感染的醪与接种物在约32℃下孵育长达24小时。发现在每个铺板的MRS选择性培养基上，最终感染率均大于108集落形成单位(CFU)。将底物冷冻在20％甘油溶液中，然后在使用前解冻。
1％受感染的液化醪：每100g“清洁”醪，添加1g受感染的醪并充分混合。
发酵程序
低干固体发酵。将1％受感染的醪稀释于20％干固体中。添加200ppm靶标尿素作为酵母的外源氮源。商业葡糖淀粉酶GSA以0.6AGU/g-干固体的剂量使用。以0.25g/L接种酵母。实验酶的剂量在2ppm和100ppm之间。剂量是针对干固体的。
阳性对照：以25ppm使用青霉素。
阴性对照：未添加任何处理。
近于同时添加酵母、酶和任何其他自来水以开始发酵。将发酵物在32℃静态水浴中孵育长达24小时。所有处理均重复三次。
HPLC分析
在各个时间点对发酵进行采样，以检查可溶性碳水化合物和有机酸。首先将样品以约3krpm离心长达5分钟。然后通过0.2μm过滤器过滤上清液。将滤液用5mmolL-1硫酸流动相并使用分离分析物的H柱稀释高达5倍(以在内标的线性范围内)。折射率被采用具有检测模式。针对内标对分析物进行定量。感兴趣的分析物是：麦芽三糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、乳酸、甘油、乙酸和乙醇。
数据分析
使用SAS JMP统计软件分析数据。
结果
在发酵开始时，处理测得的乳酸滴度低于0.3g/L。图4显示了在不同AA13多肽和对照存在下玉米醪的低干固体发酵24小时后的乳酸浓度。如图4所示，测试的每种AA13多肽比阴性对照更多地减少了乳酸形成。这些数据表明，LPMO(如AA13多肽)可以减少乙醇发酵过程中受感染的醪中乳形成的水平，就像上文实例1中的AA9多肽一样。
选择At-AA13进行剂量反应的另外筛选，并且在上述条件下玉米醪的低干固体发酵20小时后，与对照相比，其继续显示出降低的乳酸滴度。这些结果在图5中示出。
实例3-LPMO作为生物燃料发酵中的乳酸控制生物溶液的评估
这个实例表明，在受到感染挑战的乙醇发酵过程中，LPMO可用于降低乳酸水平。特别地，这个实例表明，在乙醇发酵过程中当受到感染挑战时，LPMO(如AA13多肽)可用于降低乳酸水平。
使用AA369和蛋白酶Pfu的与行业相关的共混物，用Lab-O-Mat培养箱在85℃和36％DS下孵育2小时(以模拟典型工业条件)，内部制备对照醪。然后将醪冷冻，之后用于SSF。通过用在MRS中生长的多菌株LAB培养物感染对照醪来制备受感染的醪。将对照醪中的细菌孵育过夜，然后用20％甘油冷冻。对于该实验，将1％重量/重量的受感染的醪混合到对照醪中。这模仿了大规模乙醇设施中的感染事件。对于SSF，所有醪均用1000ppm的尿素制备，以帮助酵母发酵。所有处理均给予基线商业葡糖淀粉酶GSA，而AA13候选物以10ug/g-DS或50ug/g-DS给予。在20％DS下，在32℃下用10uL/g复水的乙醇红酵母(Ethanol Redyeast)以5g规模进行SSF长达24小时。发酵结束时，用50uL的40％硫酸使样品失活，然后离心。通过.2um过滤器过滤上清液，然后在HPLC上使用离子交换H柱测量可溶性碳水化合物和有机酸。
在这项研究中，与未处理的对照相比在高剂量和低剂量下，有若干种候选物除了乙醇增加外还显示乳酸减少，如下表所示。感兴趣的候选物以粗体突出显示。
结果：
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Claims (24)

1.一种减少和/或防止生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的方法，该方法包括将裂解性多糖单加氧酶(LPMO)多肽或包含LPMO多肽的酶组合物引入生物燃料发酵系统，其中该发酵系统包含一个或多个发酵容器、管道和/或组件，并且其中以足以减少和/或防止该生物燃料发酵系统中乳酸水平增加的浓度添加该LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将该LPMO多肽或酶组合物引入该发酵罐。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是发酵罐，并且将该LPMO多肽或酶组合物引入该发酵罐。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中这些发酵容器中的至少一个是酵母扩培罐，并且将该LPMO多肽或酶组合物引入该酵母扩培罐。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该生物燃料是乙醇。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
9.一种用于从含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括：
a)在α-淀粉酶的存在下使含淀粉材料液化以形成液化的醪；
b)使用产碳水化合物源的酶将该液化的醪糖化以生产可发酵糖；
c)在适于生产该发酵产物的条件下，使用发酵生物将该糖发酵，
其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)之前或期间添加至少一种LPMO多肽或包含至少一种LPMO多肽的酶组合物。
10.如权利要求9所述的方法，其中步骤b)和c)同时进行。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中将该含淀粉材料的浆液加热至高于糊化温度。
12.如权利要求9至11中任一项所述的方法，其中在液化过程中添加该至少一种LPMO多肽或该至少一种酶组合物。
13.如权利要求9至12中任一项所述的方法，其中在糖化之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或该至少一种酶组合物。
14.如权利要求9至13中任一项所述的方法，其中在发酵之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或该至少一种酶组合物。
15.如权利要求9至14中任一项所述的方法，其中该发酵生物是酵母，并且在酵母扩培之前或期间添加该至少一种LPMO多肽或该至少一种酶组合物。
16.如权利要求9至15中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇。
17.如权利要求9至16中任一项中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
18.如权利要求9至17中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
19.如权利要求9至18中任一项所述的方法，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
20.以下影响的影响.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低乙醇生产方法中发酵期间乳酸水平的用途。
21.LPMO多肽或包含LPMO多肽的酶组合物用于降低酵母扩培期间乳酸水平的用途。
22.如权利要求20或21所述的用途，其中该LPMO多肽选自由以下组成的组：辅助活性9(AA9)多肽、辅助活性10(AA10)多肽、辅助活性11(AA11)多肽、辅助活性13(AA13)多肽及其组合。
23.如权利要求20至22中任一项所述的用途，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA9多肽：
i)SEQ ID NO:1的橙色嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:2的埃默森青霉菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:3的土生梭孢壳霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:4的烟曲霉AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:5的甲壳嗜热子囊菌AA9多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；以及
iv)在里氏木霉背景中表达的SEQ ID NO:6的埃默森青霉菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
24.如权利要求20至23中任一项所述的用途，其中该LPMO多肽是选自由以下组成的组的AA13多肽：
i)SEQ ID NO:119的土曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ii)SEQ ID NO:120的迟缓曲霉AA13多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iii)SEQ ID NO:123的构巢曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:124的波兰青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:125的草酸青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
iv)SEQ ID NO:127的嗜热链球菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
v)SEQ ID NO:128的枝顶孢霉属物种XZ1982多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vi)SEQ ID NO:130的奇突曲霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
vii)SEQ ID NO:131的棉生枝孢菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
viii)SEQ ID NO:132的镰孢属物种-75363多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
ix)SEQ ID NO:133的漆斑菌属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
x)SEQ ID NO:134的异茎点霉属物种多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xi)SEQ ID NO:135的南极青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xii)SEQ ID NO:136的同心青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiii)SEQ ID NO:139的玫瑰紫青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xiv)SEQ ID NO:141的菌核青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xv)SEQ ID NO:142的青霉属物种-52627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvi)SEQ ID NO:144的青霉属物种-72443多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xvii)SEQ ID NO:145的歧皱青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xviii)SEQ ID NO:147的狐粪青霉多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xix)SEQ ID NO:148的拟盘多毛孢属物种-71627多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xx)SEQ ID NO:149的Setophaeosphaeria属物种NN051506多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxi)SEQ ID NO:150的西柳篮状菌多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性；
xxii)SEQ ID NO:151的粗糙短梗蠕孢多肽或其变体，该变体与该多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同一性。
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