CZ289014B6 - Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy - Google Patents

Abstract

Vy i t n a izolovan sekvence DNA k duj c fung ln fyt zu, kter katalyzuje uvol ov n alespo jednoho anorganick ho fosf tu z myoinositolfosf tu, zvolen ze souboru sest vaj c ho ze sekvence DNA, kter k duje polypeptid s fyt zovou aktivitou, a je zn zorn na na obr. 8 a sekvence DNA, kter je schopna hybridizovat za podm nek n zk stringence (6 x SSC, 50 .degree.C p°es noc) s pr bou zahrnuj c nukleotidov polohy 1 a 818 z obr. 8. Konstrukt pro expresi zahrnuj c v² e uvedenou sekvenci DNA operabiln spojenou s regula n oblast schopnou ° dit expresi fyt zy ve vhodn m hostiteli pro expresi, v n m je regula n oblast odvozena od genu zvolen ho ze souboru zahrnuj c ho geny k duj c glukoamyl zu, fyt zu, amyl zu, kyselou fosfat zu a GAPDH. Vektory schopn transformovat hostitelskou bu ku obsahuj c v² e uveden² konstrukt pro expresi, hostitelsk bu ka transformov na takov²m konstruktem pro expresi nebo vektorem a zp sob produkce fyt zy, p°i n m se takov transformovan hostitelsk \

Description

Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy

Oblast techniky

Vynález se týká vyčištěné a izolované sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstruktů pro expresi na její bázi, vektorů a hostitelských buněk transformovaných takovými konstrukty a vektory a způsobu produkce fytázy.

Dosavadní stav techniky

Fosfor je esenciálním prvkem pro růst všech organismů. Při pěstování dobytka se musí do krmivá přidávat anorganický fosfor, aby se dosáhlo dobrých přírůstků u zvířat s jednoduchým žaludkem (např. prasat, drůbeže a lyb).

Naopak žádný anorganický fosfor se nemusí přidávat do krmivá přežvýkavců. Mikroorganismy, přítomné v bachoru, produkují enzymy, které katalyzují konverzi fytázu (myoinositolhexakisfosfátu) na inositol a anorganický fosfát.

Fytát se vyskytuje jako zásobní zdroj fosforu v prakticky všech krmných hmotách, které pocházejí z rostlin (viz: Kyselina fytová, její chemie a aplikace, Phytic acid, chemistry and applications. E. Graf (vyd.), Pilatus Press; Minneapolis, MN, USA (1986)). Fytát je obsažen v množství 1-3% ve všech druzích ořechů, obilí, luštěninách, olejnatých semenech, sporách a v pylu. Komplexní soli kyseliny fytové se nazývají fytin. Kyselina fytová je pokládána za antinutriční faktor, protože tvoří cheláty s minerály např. s vápníkem, zinkem, hořčíkem, železem a může také reagovat s proteiny. Tímto způsobem kyselina fytová snižuje biologickou dostupnost proteinů a nutričně důležitých minerálních prvků.

Fosfor ve formě fytátu prochází zažívacím traktem zvířat s jednoduchým žaludkem a je vylučován do mrvy. Ačkoliv v tračníku dochází k jisté hydrolýze fytátu, takto uvolněný anorganický fosfor nemá nutriční význam, protože anorganický fosfor se absorbuje pouze v tenkém střevě. V důsledku toho není značné množství nutričně důležitého fosforu zvířaty s jednoduchým žaludkem využito, přestože je v krmivu přítomno.

Vylučování fosforu ve formě fytátu do mrvy má další následky. Intenzivní chov dobytka se během posledních desetiletí enormně zvýšil. V důsledku toho se odpovídajícím způsobem zvýšilo množství mrvy, a to způsobilo ekologické problémy v různých částech světa. Ty jsou částečně také zaviněny hromaděním fosfátu, původem z mrvy, v povrchových vodách, což způsobuje eutrofizaci.

Enzymy, produkované mikroorganismy, které katalyzují konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfor, jsou všeobecně známé jako fytázy. Mikroorganismy, které produkují fytázu, jsou bakterie jako např. Bacillus subtilis (V. K. Paver a V. J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151, 1102-1108) a Pseudomonas (D. J. Cosgrove (1970) Austral. J. Biol. Sci. 23, 1207-1220); kvasinky jako např. Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini a P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17, 24-26); a plísně jako např. Asperqillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda a S. Yamamoto (1986) Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282). Je známo, že i různé jiné druhy rodu Aspergillus produkují fytázu. Bylo zjištěno, že fytáza, produkovaná druhem Aspergillus fícuum, má jednu znejvyšších hodnot specifické aktivity a také má lepší termostabilitu než fytázy, produkované jinými mikroorganismy (nepublikované výsledky).

Přidávání mikrobiální fytázy do krmivá zvířat s jednoduchým žaludkem bylo již dříve popsáno (Ware, J. H., Bluff, L. a Shieh, T. R. (1967) US patent č. 3 297 548; Nelson, T. S., Shieh, T. R.,

-1 CZ 289014 B6

Wodzinski, R. J. a Ware, J. H. (1971) J. Nutrition 101, 1289-1294). Avšak až do dnešní doby nebyla aplikace tohoto nápadu komerčně proveditelná vzhledem k vysokým nákladům na produkci mikrobiálních enzymů (Y. W. Han (1989) Animal Feed Sci. Technol. 24, 345-350). Z ekonomických důvodů se do krmivá zvířat s jednoduchým žaludkem stále přidává anorganický fosfor.

Bylo zjištěno, že mikrobiální fytázy mají také jiná průmyslová použití. Příkladem takových použití je průmyslový proces výroby škrobu z obilnin např. z kukuřice a pšenice. Odpadní produkty, které obsahují např. obilný lepek z mokrého mlecího procesu, se prodávají jako krmivo pro zvířata. Během máčení se může přidat fytáza. Podmínky (t = 50 °C a pH = 5,5) jsou pro houbové fytázy ideální (viz např. Evropská patentová přihláška č. 0 321 004 firmy Alko (Ltd.) Krmivá, vytvořená z odpadních produktů tohoto procesu budou s výhodou obsahovat fosfát místo fytátu.

Také se předpokládá, že fytázy se mohou využít při zpracování sóji (viz „Finase^(TM) Enzymes by Alko“, informační brožura o produktech firmy Alko Ltd., Rajamaki, Finsko). Sojová mouka obsahuje velké množství antinutričního faktoru, fytátu, který způsobuje, že tento zdroj bílkovin je nevhodný k použití v dětské výživě a vkrmivech pro ryby, telata a jiné nepřežvýkavce. Enzymatická úprava tohoto cenného zdroje bílkovin zlepšuje nutriční a komerční hodnotu tohoto materiálu.

Jiní výzkumníci se zajímali o lepší charakterizaci různých fytáz a zlepšení procedur pro produkci a použití těchto fytáz. Ullah publikoval postup purifikace fytázy z divokého kmene Aspergillus ficuum a také některé biochemické parametry produktu, získaného tímto purifikačním postupem (Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem. 18, 443-458). Zmíněné údaje, zjištěné Ullahem, jsou uvedeny v tabulce 1, níže.

Sekvence aminokyselin N-konce fytázy, produkované A. ficcum, byla dvakrát zveřejněna Ullahem: Ullah A. (1987) Enzyme and Engineering conference IX, October 4-8, (1987) Santa Barbara, Califomia (uvedeno na plakátu); a Ullah, A. (1988b) Prep. Biochem. 18, 459-471. Údaje o sekvenci aminokyselin podle Ullaha jsou uvedeny na obr. 1 A, sekvence E, níže.

Z Ullahových zjištění vyplývají různé zajímavé postřehy. Především vyčištěný preparát, popsaný Ullahem (1988 a 1988 b) poskytuje na SDS-PAGE dva proteinové pásy. My jsme však zjistili, že vyčištěná fytáza z A. ficuum obsahuje kontaminant a že jeden z pásů, nalezený na SDS-PAGE a identifikovaný Ullahem jako fytáza, pochází z tohoto kontaminantu.

Tento rozdíl je také zřejmý z údajů o sekvenci aminokyselin, publikovaných Ullahem (1987, 1988 b; srovnej obr. 1 A, sekvenci A a B se sekvencí C). My jsme vlastně určili, že jedna ze sekvencí aminokyselin vnitřních peptidů fytázy, které popsal Ullah (viz obr. 1 B, sekvence E), ve skutečnosti náleží kontaminujícímu proteinu o molekulové hmotnosti 100 000 (obr. IC). Tento protein je obsažen v preparátu, získaném postupem podle Ullaha a na SDS-PAGE je viditelný jako jeden ze dvou pásů (Ullah, 1988a a 1988b). Ullah nerozpoznal přítomnost zmíněného kontaminujícího proteinu a místo toho ho identifikoval jako další formu fytázy. Následkem přítomnosti této kontaminace se zvyšuje obtížnost selekce a izolace vlastní sekvence nukleotidů, která kóduje fytázovou aktivitu. Dále přítomnosti kontaminace snižuje hodnotu specifické aktivity testovaného proteinu.

Při dalším zkoumání sekvence, jak ji popsal Ullah, jsme určitě zjistili pomocí sekvenčních technik pro bílkoviny a DNA, že aminokyselinový zbytek v poloze 12, který Ullah určil jako glycin, je ve skutečnosti cystein (viz obr. 6 a 8).

Nakonec Ullah zveřejnil, že fytáza je protein o molekulové hmotnosti 85 000, po deglykosylaci 61 700 (Ullah 1988b). Tato hodnota, která je mnohem nižší než dříve zveřejněná hodnota 76 kDa (Ullah, A. a Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(1), 63-91), byla určena na základě relativního

-2CZ 289014 B6 množství cukrů, uvolněných při hydrolýze a zdánlivé molekulové hmotnosti nativního proteinu na SDS-PAGE. My jsme však zjistili, že glykosylovaná fytáza má jednu hodnotu zdánlivé molekulové hmotnosti; 85 000, kdežto deglykosylovaný protein má molekulovou hmotnost v rozmezí 48 až 56 500 v závislosti na stupni deglykosylace.

Mullaney a další (Konference o vláknitých houbách, duben 1987, Pacific Grove, Kalifornie (předvedení ve formě plakátu) také zveřejnil charakterizaci fytáza z A. fícuum. Avšak tato zpráva také obsahuje zmínku o dvou proteinových pásech na SDS-PAGE, z nichž jeden má molekulovou hmotnost 85 000 a druhý 100 000 a které jsou přítomné ve „vyčištěném“ proteinovém preparátu. Oba tyto proteinové pásy byly autory identifikovány jako formy fytázy. Metoda pro transformaci mikrobiálních hostitelů byla navržena, ale její provedení nebylo oznámeno. Klonování a izolace sekvence DNA, která kóduje fytázu, nebyly popsány.

Ekonomický způsob produkce fytázy přinese významný užitek mimo jiné vkrmivářském průmyslu. Jednou metodou pro produkci ekonomičtější fytázy by bylo použití techniky rekombinace DNA pro zvýšení úrovně exprese enzymu v různých mikroorganismech, které jsou známé tím, že produkují velké množství peptidů a bílkovin. Do dnešního dne však izolace a klonování sekvence DNA, která kóduje fytázu, nebylo uveřejněno.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je vyčištěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, která katalyzuje uvolňování alespoň jednoho anorganického fosfátu z myoinositolfosfátu, zvolená ze souboru sestávajícího ze sekvence DNA, která kóduje polypeptid s fytázovou aktivitou, a je znázorněna na obr. 8 a sekvence DNA, která je schopna hybridizovat za podmínek nízké stringence (6 x SSC, 50 °C přes noc) s próbou zahrnující nukleotidová polohy 1 až 818 z obr. 8.

Předmětem vynálezu je dále také konstrukt pro expresi zahrnující výše uvedenou sekvenci DNA operabilně spojenou s regulační oblastí schopnou řídit expresi fytázy ve vhodném hostiteli pro expresi, v němž je regulační oblast odvozena od genu zvoleného ze souboru zahrnujícího geny kódující glukoamylázu, fytázu, amylázu, kyselou fosfatázu a GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázu).

Dále jsou předmětem vynálezu vektory schopné transformovat hostitelskou buňku, přičemž tyto vektory obsahují výše uvedený konstrukt pro expresi a jsou zvoleny ze souboru zahrnujícího vektor pAF 2-2 S definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 9, vektory pl8FYT3, p24FYT3 a pFYT3, z nichž každý je definován restrikční mapou znázorněnou na obr. 15c, vektor pFYT3INT definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 17 a vektor pREPFYT3 definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 18. Jako specifický vektor podle vynálezu je možno uvést také vektor pAF 28-1 definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 4.

Předmětem vynálezu jsou i hostitelské buňky, které jsou transformovány výše uvedenými konstrukty pro expresi nebo vektory, zvolené ze souboru zahrnujícího Aspergillus fícuum NRRL 3135, Aspergillus niger CBS 513.88 a Aspergillus níger ATCC 9092.

Konečně je předmětem vynálezu také způsob produkce fytázy, jehož podstata spočívá v tom, že se výše uvedené transformované hostitelské buňky pěstují za podmínek vedoucích k produkci fytázy.

Izolace a klonování sekvence DNA podle vynálezu, kódující fytázu, byly provedeny s použitím specifických oligonukleotidových prób, které byly vyvinuty zvláště pro tento vynález. Nejlepší sekvence DNA, kódující fytázu, se dají získat z hub, zejména z vláknitých hub rodu Aspergillus.

-3CZ 289014 B6

Vektor podle vynálezu obsahuje konstrukt pro expresi podle vynálezu a dále alespoň jednu kopii přinejmenším jedné nejlépe homologní sekvence DNA, která kóduje fytázu. Tato sekvence je operabilně spojena s vhodnou regulátorovou oblastí, která je schopná řídit vysokou úroveň exprese peptidů nebo proteinů s fytázovou aktivitou ve vhodném hostiteli.

Konstrukt pro expresi podle vynálezu může být včleněn do vektoru, nejlépe plazmidu, kteiý je schopen transformovat hostitelskou mikrobiální buňku a integrovat se do jejího genomu.

Jako transformované hostitelské buňky podle vynálezu přicházejí v úvahu zejména mikrobiální buňky, které byly transformovány výše uvedeným vektorem. Transformovanými hostiteli jsou především vláknité houby rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasinky rodu Kluyveromyces a Saccharomyces nebo bakterie rodu Bacillus. Zvláště vhodnými hostiteli pro expresi jsou vláknité houby rodu Aspergillus. Transformovaní hostitelé jsou schopni produkovat velké množství rekombinantní fytázy v ekonomickém, průmyslovém měřítku.

Rekombinantní peptidy a proteiny s fytázovou aktivitou je možno získávat v glykosylované nebo neglykosylované formě.

Srovnání biochemických parametrů vyčištěné fytázy z divokého kmene A. fícuum, kterou získal Ullah, s další vyčištěnou fytázou z divokého kmene A. fícuum, která byla získána při tomto vynálezu, je ukázáno v tabulce 1 níže. Významné jsou údaje o specifické aktivitě, z nichž je vidět, že vyčištěný protein, který byl získán podle vynálezu, má dvojnásobnou specifickou aktivitu než protein, který uvádí Ullah.

Nukleotidové sekvence, které kódují bílkoviny s fytázovou aktivitou a aminokyselinové sekvence těchto bílkovin, které poskytuje tento vynález, mohou být použity pro sestavení oligonukleotidových prób. Tyto próby se mohou dále používat při hybridizačních screening studiích pro identifikaci fytázových genů u jiných druhů, zejména mikrobiálních, které mohou být následně izolovány a klonovány.

Sekvence, které poskytuje tento vynález, mohou být také použity jako startovací materiály, pro konstrukci fytáz „druhé generace“. Fytázy „druhé generace“ jsou fytázy, které byly změněny technikou mutageneze (např. mutagenezí, cílenou na určité místo). Mají vlastnosti, které jsou odlišné od vlastností fytáz divokých typů nebo rekombinantních fytáz, které jsou produkovány postupem podle tohoto vynálezu. Například teplotní nebo pH optimum, specifická aktivita nebo substrátová specifita se dají změnit tak, aby to lépe vyhovovalo pro aplikaci v daném procesu.

V kontextu tohoto vynálezu termín fytáza zahrnuje skupinu enzymů, které katalyzují uvolňování anorganického fosforu z různých myoinositol fosfátů.

Fytázová aktivita se může měřit pomocí různých stanovení. Volba stanovení nemá při tomto vynálezu rozhodující důležitost. Pro ilustraci, fytázová aktivita se může stanovit měřením množství enzymu, které uvolní anorganický fosfor z 1,5 mM fytátu sodného rychlostí 1 pmol/min při teplotě 37 °C a pH 5,50.

Je třeba poznamenat, že do rozsahu termínu fytáza, jak je používán v celém textu tohoto popisu, spadají všechny peptidy a proteiny s fytázovou aktivitou. To ukazuje obr. IA, ktefy srovnává sekvence A a B (sekvence byly získány během práce na vynálezu) se sekvencí C (publikovaná Ullahem 1988b). Tento obrázek ukazuje, že proteiny, získané postupem podle tohoto vynálezu, mohou postrádat první čtyři aminokyseliny (protein se sekvencí A postrádá prvních sedm aminokyselin) ze sekvence maturovaného fytázového proteinu z A. fícuum. Avšak tyto proteiny si zachovávají fytázovou aktivitu. Kompletní sekvenci aminokyselin fytázového proteinu, která byla odvozena z korespondující sekvence nukleotidů, ukazuje obr. 8.

-4CZ 289014 B6

Fytázy, produkované postupem podle tohoto vynálezu, se mohou aplikovat v různých procesech, které vyžadují konverzi fytátu na inositol a anorganický fosfát.

Například výroba fytáz podle tohoto vynálezu sníží výrobní náklady mikrobiálních fytáz tak, že bude možná jejich ekonomická aplikace v krmivech. To nakonec povede ktomu, že poměr ceny a výsledku dosažený s fytázami in vivo bude konkurence schopný s poměrem dosaženým anorganickým fosfátem. Další výhodou bude značné snížení obsahu fosforu v mrvě.

Aplikace cenově dostupných fytáz, které budou schopné konkurovat anorganickému fosfátu, zvýší míru volnosti průmyslu výroby krmivových směsí při výrobě kvalitních krmív. Například když se do krmivá dodá fytáza, přídavek anorganického fosfátu se může vynechat a obsah různých materiálů, obsahujících fytát, se může zvýšit.

Kromě použití v krmivech a při zpracování sóji, jak bylo diskutováno výše, se může fytáza, získaná postupem podle tohoto vynálezu, také použít v různých průmyslových aplikacích jako např.:

-jako tekuté krmivo pro prasata a drůbež. Existuje obecná praxe máčet krmivo po několik hodin před krmením. Během této doby může enzym konvertovat fytát na inositol a anorganický fosfát;

- v průmyslovém procesu pro výrobu inositolu nebo inositol-fosfátů z fytátu;

- v jiných průmyslových procesech, které používají substráty, obsahující fytát, např. ve škrobárenském průmyslu a fermentačních průmyslech např. pivovarství. Fytát chelatuje kovové ionty, a to může způsobovat nedostupnost těchto iontů pro produkční mikroorganismy. Enzymatická hydrofýza fytátu odstraní tyto problémy.

Tyto a jiné předměty a výhody tohoto vynálezu se stanou zřejmými z následujícího podrobného popisu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. IA-Sekvence N-terminálních aminokyselin, stanovené pro purifikovanou fytázu. Sekvence aminokyselin, označené A a B, jsou podle tohoto vynálezu a pocházejí z různých forem fytázy. A má izoelektrický bod 5,2, B 5,4. Sekvence C je sekvence, citovaná Ullahem (1987, 1988b viz výše). Při tomto vynálezu bylo stanoveno, že aminokyselinový zbytek, umístěný v poloze 12 u sekvencí A a B, není zbytkem glycinu.

(* označuje nejednoznačnou identifikaci.

** označují, že žádný zbytek nebyl detekován.)

Obr. 1B - Sekvence N-terminálních aminokyselin vnitřních fragmentů fytázy po štěpení CNBr. Sekvence aminokyselin, označené A a B (molekulová hmotnost peptidu A je přibližně 2500, molekulová hmotnost peptidu 3 je přibližně 36 000, jsou podle vynálezu. Sekvence C až E jsou citované v práci Ullaha (1988b, viz výše).

Obr. 1C- Sekvence N-terminálních aminokyselin proteinu o molekulové hmotnosti 100 000, přítomnost kterého byla zjištěna při práci na tomto vynálezu v surových vzorcích fytázy.

Obr. 2A - Oligonukleotidové próby, vytvořené na základě údajů z obr. 1 A, peptidy A až E.

Obr. 2B - Oligonukleotidové próby, vytvořené na základě údajů z obr. 1B, peptidy A a B.

-5CZ 289014 B6

Obr. 3 - Oligonukleotidové próby, použité pro izolaci genu, kteiý kóduje kyselou fosfatázu.

Obr. 4- Restrikční mapa bakteriofága lambda AF 201, obsahující lokus fytázy z A. ficuum. Šipka ukazuje umístění fytázového genu a směs transkripce. Sloupec číslo klonu ukazuje subklony, které byly odvozeny uvedenými restrikčními enzymy zfágu AF 201 v pAN 8-1 (pro pAF 28-1) a v pUC 19 (pro všechny ostatní subklony).

Obr. 5 - Fyzická mapa pAF 1-1. Fragment 10 kb Bam HI, vložený do pUC 19, obsahuje celý gen, kódující kyselou fosfatázu z A. ficuum.

Obr. 6 - Kompilace nukleotidových sekvencí plazmidů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, zahrnující chromozomální lokus fytázového genu. Oblast, kódující fytázu, je lokalizována na nukleotidových pozicích 210 až 1713; intron je přítomen v chromozomálním genu od pozice 254 až k pozici 355. Důležité části jako jsou restrikční místa, start a stop kodóny pro fytázu a umístění intronu jsou označené.

Obr. 7 - Podrobná fyzická mapa sekvenovaného chromozomálního lokus pro fytázu; šipky ukazují umístění dvou exonů části, kódující fytázu.

Obr. 8 - Sekvence nukleotidů přeložené části fragmentu cDNA pro fytázu a odvozená sekvence aminokyselin pro fytázový protein; začátek maturovaného fytázového proteinu je označen jako pozice +1. N-konec vnitřního proteinového fragmentu o molekulové hmotnosti 36 000 je lokalizován na aminokyselinové pozici 241, zatímco proteinový fragment o molekulové hmotnosti 2500 začíná od aminokyselinové pozice 390.

Obr. 9 - Fyzická mapa kazety pro expresi fytázy pAF 2-2S. Šipky ukazují směr přepisu genů.

Obr. 10 - Důkaz o nadprodukci fytázy v transformantu A. ficuum NRRL 3135 na IEF - PAGE.

Stejné objemy supematantu kultury A. ficuum (pruh l) a transformantu pAF 2-2S SP7 (pruh 2), narostlé za stejných podmínek, byly analyzovány ve Phast-systému (Pharmacia) s gelem IEF-PAGE v pH rozmezí 4,5 až 6. Pro srovnání, vzorek fytázy z A. ficuum, purifikovaný do homogenního stavu, byl analyzován buď odděleně (pruh 4), nebo smíšený se supematantem kultury (pruh 3). Gely byly barveny buď fosfatázovým barvivém, uvedeným v textu (obr. 10A), nebo obvyklým barvivém pro proteiny (Coomassie Brilliant Blue, obr. 10B). Fytázové pásy jsou označené hvězdičkou.

Obr. 11 - Důkaz o nadprodukci fytázy v transformantech. A. niger CBS 513,88 na IEF - PAGE. Stejné objemy supematantů kultury rodičovského kmene A. niger (pruh 1) nebo transformantů pAF 2-2S č. 8 (pruh 2), pFYT3 č. 205 (pruh 3) a č. 282 (pruh 4) byly analyzovány na IEF-PAGE stejně, jako je popsáno v legendě k obr. 10. Gely byly barveny buď obvyklým barvivém pro látky s fosfatázovou aktivitou (obr. 11A), nebo obvyklým barvivém pro proteiny (obr. 11B). Fytázové pásy jsou označené hvězdičkou.

Obr. 12- Fyzická mapa pAB 6-1. Inzert DNA Hind III o molekulové hmotnosti 14,5 kb v pUC 19 obsahuje celý lokus pro glukoamylázu (AG) z A. niger.

Obr. 13- Schéma generace genových fúzí AG promotoru s fytázovým genem řetězovou polymerační reakcí (PCR). Sekvence všech použitých oligonukleotidových primerů jsou udány v textu.

Obr. 14 - Fyzická mapa fytázové expresní kazety pAF 2-2 SH.

-6I

Obr. 15 - Fyzické mapy intermediálních konstruktů pXXFYTl, pXXFYT2 a kazet pro expresi fytázy pXXFYT3 v nichž XX označuje vedoucí sekvenci (L). Do pl8FYT je vložena vedoucí AG sekvence 18aa a do p24FYT. Vedoucí AG sekvence 24aa, zatímco do pFYT je vložena fytázová vedoucí sekvence.

Obr. 16 - Fyzická mapa plazmidů pFYT3 amd S.

Obr. 17 - Fyzická mapa plazmidů pFYT 3INT.

Obr. 18 - Fyzická mapa vektoru pREPFYT3, který nahradil AG vektor.

Obr. 19- Autoradiogramy chromozomální DNA, štěpené Pvu II (Obr. a) a Bam HI (obr. b) a hybridizované s cDNA. Tato cDNA označená ³²P, kóduje fytázu u A. ficuum a je próbou mikrobiálních druhů S. cerevisiae (pruh 2); B. subtilis (pruh 3); K. lactis (pruh 4); P. chrysogenum (pruh 5); P. aeruginosa (pruh 6); S. lividans (pruh 7); A. niger 1 gg (pruh 8); A. niger 5 gg (pruh 9); blank (pruh 10); C. thermocellum (pruh 11). Pruh 1: markér DNA.

Klonování genů, kódujících vybrané proteiny, které jsou produkovány mikroorganismy, se může provádět různými způsoby. Jednou metodou je purifikace proteinu, o který je zájem, dále určení sekvence jeho N-koncových aminokyselin a potom screening genomové knihovny daného mikroorganismu za použití DNA oligonukleotidové próby, která je založena na dané sekvenci Nkoncových aminokyselin. Příklady úspěšné aplikace tohoto postupu jsou klonován genu pro isopenicilin N-syntetázu u Cephalosporium acremonium (S. M. Samson et al. (1985) Nátuře 318, 191-194) a izolace genu, kódujícího TAKA amylázu u Aspergillus oryzae (Boel et al. (1986) EP-A-0238023).

Byl proveden pokus o izolaci genu, který kóduje fytázu u Aspergillus ficuum, tímto postupem. Protein byl rozsáhle čištěn a byly stanoveny některé jeho biochemické parametry. Získané údaje jsou srovnány s údaji, které publikoval Ullah (1988a). Oba soubory dat jsou předloženy v tabulce 1, níže.

Tabulka 1

Biochemické parametry purifíkované fytázy divokého kmene A. ficuum

Parametr	Tento vynález	Ullah
Specifická aktivita*	100 U/mg proteinu	50 U/mg proteinu
čistota: SDS-PAGE	85 000	85/100 000
: IEF-PAGE	3 nebo 4 pásy	neprovedeno
Km (afinitní konstanta)	250 gM	40 gM
Specifita pro:
Inositol-l-P	neaktivní	neaktivní
Inositol-2-P	Km = 3,3 mM	5% aktivita
pH optimum	2,5 a 5,5	2,5 a 5,5
Tepl. optimum (°C)	50	58
molekulová hmotnost
♦ *	85 000	85 a 100 000
molekulová hmotnost
(neglykosylovaná)**	56,5	61,7
izoelektrický bod***	5,0-5,4	4,5

* Aktivitu fytázy měřil Ullah spíše při 58 °C než při 37 °C. Jednotka aktivity fytázy je definovaná jako množství enzymu, které uvolní anorganický fosfor z 1,5 mM fytázu sodného rychlostí 1 pmol/min při 37 °C a pH 5,5. Pro srovnání fermentačních výtěžků a specifických aktivit byly aktivity, zjištěné Ullahem, korigovány s ohledem na teplotní rozdíl. Korekce je založena na rozdílu v aktivitě fytázy, měřené při 37 °C a při 58 °C, jak ukazuje Ullah (1988b) v tabulce III.

** Molekulová hmotnost určená na SDS-PAGE.

*** Stanoveno na IEF-PAGE.

Pro izolaci genu, kódujícího fytázu byla sestavena první sada oligonukleotidových prób výše popsanou metodou (obr. 2A). Sestavení těchto prób je založeno na údajích o sekvenci aminokyselin. Pro kontrolu celého tohoto postupu byly podrobné kroky učiněny při izolaci genu, kódujícího kyselou fosfatázou, při čemž bylo využito údajů, které o tomto proteinu publikovali Ullah a Cummins (1987) Prep. Biochem. 17, 397-422). Odpovídající gen pro kyselou fosfatázu byl izolován bez obtíží. Avšak v případě fytázy byla situace odlišná. I když bylo provedeno mnoho pokusů, ve kterých byly použity próby, odvozené ze sekvencí N-koncových aminokyselin, nepodařilo se izolovat žádné fragmenty genomu DNA nebo klony z genomové knihovny, které by mohly být pozitivně identifikovány, že obsahují geny, kódující fytázu.

Pro vyřešení tohoto problému byla purifikovaná fytáza štěpena CNBr. Vzniklé proteinové fragmenty byly izolovány u těchto fragmentů byla stanovena sekvence N-koncových aminokyselin (obr. 1B). Na základě těchto nových údajů byly sestaveny oligonukleotidové próby (obr. 2B). Tyto nové oligonukleotidové próby se překvapivě daly ztotožnit se specifickými fragmenty DNA a byly vhodné k jednoznačné identifikaci klonů z genomové knihovny. Nebyla pozorována žádná křížová hybridizace mezi novými klony nebo fragmenty DNA, které z nich byly izolovány a první sadou oligonukleotidových prób nebo klony, které byly izolovány s použitím této první sady prób.

Tato druhá sada prób se může také použít k identifikaci sekvencí, kódujících významné fytázy.

Nově izolované klony byly použity jako próby v hybridizacích „Northem blot“. Diskrétní mRNA mohla být detekována pouze, když mRNA byla izolována z mycelia, produkujícího fytázu. Když byla RNA získána z mycelia, neprodukujícího fytázu, nebyl zjištěn žádný hybridizační signál. Teoretickým výtěžkem mRNA, o hmotnosti 1800b, je protein s maximální molekulovou hmotností okolo 60 000. Tato hodnota odpovídá molekulové hmotnosti, která byla stanovena pro neglykosylovaný protein a molekulové hmotnosti proteinu, která byla odvozena ze sekvence DNA.

Kromě toho, když byly tyto próby transformací zavedeny do houbové buňky, projevil se vzrůst fytázové aktivity. To nezvratně ukazuje, že byla skutečně izolována nukleotidová sekvence, kódující fytázu. Sekvence aminokyselin, které byly stanoveny pro purifikovaný fytázový enzym a pro CNBr fragmenty, z něj získané, se shodují s aminokyselinovou sekvencí, která byla stanovena pro klonovaný gen. Sekvence nukleotidů a odvozená sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obrázcích 6 a 8 a dále popisují klonovanou sekvenci, která kóduje fytázu.

Izolace nukleotidové sekvence, která kóduje fytázu, umožňuje ekonomickou produkci fytázy v průmyslovém měřítku pomocí aplikace moderních technik rekombinace DNA jako jsou genová amplifikace, výměna regulátorových elementů jako např. promotorů, sekrečních signálů nebo kombinací těchto metod.

Proto tento vynález také zahrnuje transformovaného hostitele, který je schopný účinné exprese vysokých úrovní peptidů nebo proteinů s fytázovou aktivitou a popřípadě také účinné exprese kyselé fosfatázy. Zajímavými hostiteli, jsou buňky, selektované z vláknitých hub rodu Aspergillus, Trichoderma, Mucor a Penicillium, kvasinek rodu Kluyveromyces a Saccharomyces a bakterií rodu Bacillus. Přednostně je selektován ten hostitel, který je schopen efektivní sekrece svých endogenních proteinů.

-8CZ 289014 B6

Zvláště zajímavé jsou průmyslové kmeny Aspergillus, zejména niger, ficuum, awamori nebo oryzae. Nebo se mohou použít Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomycas caravisiae, Bacillus subtilis nebo Bacillus Iicheniformis.

Konstrukt pro expresi bude obsahovat sekvence nukleotidů, které kódují požadovaný enzymový produkt, jenž má být exprimován. Obvykle obsahuje signální sekvenci, která funguje v hostitelské buňce a umožňuje sekreci produktu, peptidu nebo proteinu.

Podle tohoto vynálezu se mohou použít různé signální sekvence. Může se použít signální sekvence, která je homologní s klonovanou nukleotidovou sekvencí, jež má být přepsána. Nebo se může použít signální sekvence, která je homologní nebo částečně homologní se signální sekvencí genu v cílovém lokusu štěpu, aby se usnadnila homologní rekombinace. Dále se také mohou použít signální sekvence, které byly sestaveny pro umožnění lepší sekrece ze selektovaných hostitelských buněk. Například viz Von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133, 1721; a Perlman a Halverson (1983) J. Mol. Biol. 167, 391-409. Sekvence DNA, kódující signální sekvenci, může být připojena přímo pomocí sekvence, která kóduje proces signálu (rozštěpení rozpoznávacího místa) k sekvenci kódující požadovaný protein. Nebo může být připojena pomocí krátkého můstku, obvykle méně než 10 kodónů.

Preferované signální sekvence pro sekreci, použité podle tohoto vynálezu, jsou signální sekvence homologní skloňovanou nukleotidovou sekvencí, která má být exprimována. Dále jsou to signální sekvence pro glukoamylázu (AG) obsahující 18 aminokyselin a signální sekvence pro glukoamylázu (AG), obsahující 24 aminokyselin, přičemž tyto dvě sekvence jsou buď homologní, nebo heterologní s nukleotidovou sekvencí, která má být exprimována.

Produkt exprese nebo významná sekvence nukleotidů může být DNA, která je homologní nebo heterologní s expresním hostitelem.

„Homologní“ DNA je zde definována jako DNA, která pochází ze stejného rodu. Např. Aspergillus se transformuje DNA z Aspergillus. Takto je možné, zlepšit již existující vlastnosti houbového rodu bez zavedení nových vlastností, dříve v tomto rodu nepřítomných.

„Heterologní“ DNA je definována jako DNA, která pochází zvíce než jednoho rodu tj. jak vyplývá z příkladu, uvedeného v předchozím odstavci, DNA, pocházející z jiného rodu než Aspergillus, která se dále exprimuje v Aspergillu.

Nukleotidovými sekvencemi, kódujícími fytázovou aktivitu, jsou přednostně sekvence získané z houbového zdroje. Více ceněné jsou nukleotidové sekvence, kódující fytázu, které byly získány z rodu Aspergillus. Nejvíce ceněné sekvence jsou získané z druhů Aspergillus ficuum nebo Aspergillus niger.

Oblast od 5' k počátku otevřeného čtecího rámce v nukleotidové sekvenci, která je pro vynález významná, obsahuje regulační úsek pro iniciaci transkripce (nebo promotor). Kterýkoliv funkční úsek v hostitelské buňce, včetně promotoru, který je homologní s nukleotidovou sekvencí, kódující fytázu, jež má být exprimována, může být využit. Avšak většinou je využitý úsek homologní s oblastí cílového lokusu. Uvedené skutečnosti mají vliv na substituci produktu exprese cílového lokusu, za požadovaný produkt exprese. Pokud úroveň exprese a sekrece proteinu, kódujícího cílový lokus, bude zajišťovat efektivní produkci, bude obvykle regulační úsek pro iniciaci transkripce považován za uspokojivý. Avšak v některých případech je požadována vyšší úroveň transkripce než má gen cílového lokusu. Někdy také chceme mít induktivní expresi, kterou způsobuje zvláštní indukční činidlo. V těchto případech se používá regulační úsek pro iniciaci transkripce, který je odlišný od úseku v genu cílového lokusu. Je znám velký počet regulačních úseků pro iniciaci transkripce, které jsou funkční ve vláknitých houbách. Tyto úseky jsou z genů, které kódují glukoamylázu (AG), houbovou amylázu, kyselou fosfatázu,

-9CZ 289014 B6

GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, histon H2A, Pyr4, PyrG, isopenicilin N syntetázu, PGK, kyselou proteázu, acyl transferázu a podobně.

Cílovým lokusem je nejlépe gen s vysokou úrovní exprese proteinu tj. gen, který způsobí, že koncentrace exprimovaného produktu na konci fermentačního procesuje alespoň 0,1 g/1. Trávní tohoto procesu se může měnit mimo jiné v závislosti na požadovaném proteinovém produktu. Příkladem takového genu je gen, kódující glukoamylázu (AG). Jiné zajímavé geny jsou pro houbovou α-amylázu, kyselou fosfatázu, proteázu, kyselou proteázu, lipázu, fytázu a cellobiohydrolázu. Zvláště ceněnými cílovými lokusy jsou gen pro glukoamylázu z A. niger, gen pro houbovou amylázu z A. oryzae, geny pro cellobiohydrolázu zT. raesei, gen pro kyselou proteázu zMucor miehei, gen pro laktázu z Kluyveromyces lactis nebo gen pro invertázu z Saccharomyces ceravisiae.

Regulační úsek pro terminaci transkripce může být z požadovaného genu z cílového lokusu nebo zjiné vhodné sekvence. Když konstrukt obsahuje další důležité sekvence za (ve směru transkripce) požadovaným genem, tak by regulační úsek pro terminaci transkripce, v případě že je homologní s cílovým lokusem, měl být podstatně menší než homologní zdvojený úsek.

Obvykle se používá selekční markér, který může být částí konstrukce pro expresi nebo může být oddělen od tohoto konstruktu, tak aby se mohl integrovat na odlišné místo než zaujímá požadovaný gen. Protože rekombinantní molekuly podle vynálezu se s výhodou transformují do hostitelského kmene, kterého se může použít pro průmyslovou výrobu, selekční markéry pro sledování transformace jsou dominantní selekční markéry, což znamená, že do hostitelského kmene nesmějí být zavedeny žádné mutace, aby se mohlo těchto selekčních markérů použít. Příkladem jsou markéry, které umožňují transformantům růst na definovaných zdrojích živin (např. gen amdS z A nidulans umožňuje transformantům z A. niger růst na acetamidu jako jediném zdroji dusíku) nebo markéry které udělují rezistenci vůči antibiotikům (např. gen ble způsobuje rezistenci k pleomycinu nebo gen hph způsobuje rezistenci k hygromycinu B).

Selekční geny mají své vlastní regulační úseky pro iniciaci a terminaci transkripce a translace, které dovolují nezávislou expresi markem. Jak bylo popsáno dříve, je znám velký počet regulačních úseků pro iniciaci transkripce a ty mohou být použity ve spojení s markerovými geny. Když selekční markéry způsobují rezistenci k antibiotikům, koncentrace antibiotika pro selekci se mění v závislosti na antibiotiku. Obvykle se pohybuje asi v rozmezí od 30 do 300 pg/l.

Různé sekvence mohou být připojeny známými technikami jako je restrikce, připojení komplementárních restrikčních míst a ligace, zakončení „natupo“ vyplněním překryvů a ligace „natupo“, Bal 31 resekce, oprava primem, mutageneze in vitro a podobně. Když je to vhodné, mohou se použít polylinkery a adaptéry, které se mohou zavést nebo odstranit známými technikami, aby se usnadnilo sestavení, konstruktu pro expresi. V každém stupni syntézy konstmktu se fragment může klonovat, analyzovat pomocí restrikčních enzymů, sekvenovat nebo hybridizovat a podobně. Pro klonování je použitelný velký počet vektorů, ale přesná volba nemá rozhodující význam při provádění tohoto vynálezu. Normálně se klonování provádí v E. coli.

Flanking úseky mohou obsahovat alespoň část otevřeného rámce čtení cílového lokusu, zejména signální sekvenci, regulační úseky pro 5' a 3' oblasti genu cílového lokusu. Také mohou být umístěny za regulační úseky. Normální flanking úsek obsahuje alespoň 100 párů bází, obvykle alespoň 200 bp a může obsahovat 500 bp nebo více. Flanking úseky se volí tak, aby roztrhly cílový gen a zabránily jeho expresi. Tohoto může být dosaženo vložením kazety pro expresi (obsahující sekvenci nukleotidů, která má být přepsána a popřípadě obsahující přídavné prvky jako signální sekvenci, sekvenci regulačního úseku pro iniciaci transkripce a/nebo sekvenci regulačního úseku pro terminaci transkripce) do otevřeného čtecího rámce blízko úseku 5'. Vložení se provádí substitucí celého cílového genu nebo jeho části za konstmkt pro expresi nebo intervencí konstmktu pro expresi mezi regulačním úsekem pro iniciaci transkripce v cílovém lokusu a otevřeným čtecím rámcem. Jak již bylo řečeno, když je regulační úsek pro terminaci

-10CZ 289014 B6 homologní s úsekem v cílovém lokusu, 3'flanking úsek by měl být podstatně větší než regulační úsek pro terminaci, přítomný v konstruktu.

Tento vynález také poskytuje startovací materiál pro konstrukci fytáz „druhé generace“ tj. fytáz s vlastnostmi, které se liší od vlastností enzymů, které zde byly izolovány. Fytázy druhé generace mohou mít změněné teplotní nebo pH optimum, změněnou specifickou aktivitu nebo afinitu ke svým substrátům nebo mají změněnou jakoukoliv jinou kvalitativní vlastnost, která způsobuje, že enzym je vhodnější pro aplikaci v daném procesu. E. coli je nejlepší hostitel pro takovou mutagenezi (např. pro mutagenezi cílenou na určité místo). Protože u E. coli chybí štěpící proces pro odstranění intronů, které by mohly být ve fytázovém genu přítomné, je klon cDNA pro fytázu zvolenou sekvencí, která se má přepsat v E. coli. Tato sekvence cDNA může být snadno mutována pomocí běžně známých postupů. Po mutaci může být mutovaný gen zaveden do žádaných konstruktů pro expresi.

Konstrukt může být transformací včleněn do hostitele jako klonující vektor buď lineární, nebo cirkulámí nebo může být z klonujícího vektoru odstraněn, podle přání. Klonujícím vektorem je nejlépe plazmid. Plazmid se obvykle linearizuje v rozsahu asi 1 kbp genu, o který jde. Přednostně se konstrukt pro expresi při produkci fytáz postupem podle tohoto vynálezu začleňuje do genomu hostitele vybraného pro expresi.

Pro transformaci vláknitých hub existuje velké množství technik. Tyto techniky zahrnují fúzi nebo transformaci protoplastú, elektroporaci a „microprojectile firing“ do buněk. Bylo zjištěno, že transformace protoplastú je úspěšná a může být s výhodou použita.

Mycelium houbového kmene, se kterým pracujeme, je nejprve převedeno na protoplasty enzymatickým štěpením buněčné stěny v přítomnosti osmotického stabilizátoru jako např. KC1 nebo sorbitolu. Zadržení DNA v protoplastech je způsobeno přídavkem CaCI₂ a koncentrovaného roztoku polyethylenglykolu. Polyethylenglykol způsobuje agregaci protoplastú, při níž dochází k transformaci DNA v agregátech a k zadržení DNA v protoplastech. Dále jsou protoplasty nechány regenerovat na tuhém médiu, které obsahuje osmotický stabilizátor a, když je to vhodné, selekční činidlo, proti kterému je zakódována rezistence pomocí transformující DNA.

Po selekci transformantů může být přítomnost požadovaného genu určena různými způsoby. Když je produkt exprese heterologní k hostiteli, může se exprese požadovaného genu zjistit pomocí protilátek. Nebo se může použít metody „Southem nebo Northem blot“ pro určení přítomnosti integrovaného genu nebo jeho transkripčního produktu.

Amplifíkace sekvence nukleotidů nebo konstruktu pro expresi může být dosaženo standardními postupy jako je zavedení mnohonásobných kopií konstruktu do transformujícího vektoru nebo použití genu amdS jako selekčního markéru např. Weinans et al. (1985) Current Genetics, 361— 368). Sekvence DNA, která má být rozšířena, může obsahovat DNA, která je buď homologní, nebo heterologní k hostiteli pro expresi, jak bylo diskutováno výše.

Buňky se potom mohou nechat růst na vhodném živném médiu. Mohou se použít nízké koncentrace inhibitoru proteázy jako fenylmethylsulfonyl fluorid, a2-makroglobuliny, pepstatin, a podobně). Obvykle je tato koncentrace v rozmezí od 1 gg/ml do 1 mg/ml. Gen (geny) pro proteázu mohou být inaktivovány, aby se zabránilo degradaci nebo aby se snížila degradace požadovaného proteinu.

Transformanty se mohou nechat růst buď ve vsádkovém, nebo v kontinuálním fermentoru, přičemž se izoluje živné prostředí a požadovaný produkt se získává extrakcí.

Pro čištění produktu se může použít, je-li to nezbytné, různých metod jako je chromatografie (např. HPLC), extrakce mezi dvě rozpouštědla, elektroforéza, kombinace uvedených metod a podobně.

-11 CZ 289014 B6

Předmětem vynálezu je také způsob dalšího zpracování fermentačního média. Při tomto způsobu se fermentační médium (popřípadě purifikované) přefiltruje, dále následuje druhá filtrace pro odstranění mikroorganismů a potom se přefiltrovaný roztok zahustí. Takto získaný kapalný koncentrát se může zpracovat následujícími způsoby na různé přípravky:

a) Fytáza a jiné proteiny mohou být vysráženy z kapalného koncentrátu přidáváním acetonu až na koncentraci 60 % obj. za stálého míchání. Precipitát se vysuší za vakua při 35 °C. Enzymový produkt se může použít pro další aplikace po rozemletí na suchý prášek. Výtěžnost je okolo 90 %.

b) Kapalný koncentrát se může sušit rozprašováním za použití obvyklých způsobů rozprašovacího sušení. Výtěžnost se pohybuje od 80 do 99 %.

c) Kapalný koncentrát se může smísit s nosičovými materiály např. s pšeničnými otrubami. Takto získaná směs se suší v rozprašovací věžové sušárně nebo v sušárně s fluidním ložem.

d) Kapalný koncentrát se může osmoticky stabilizovat např. přídavkem sorbitolu. Dále se přidá konzervační činidlo např. kyselina benzoová, aby se zabránilo mikrobiální kontaminaci.

Všechny čtyři přípravky se mohou prodávat výrobcům premixů, krmivových směsí, jiným distributorům a farmářům.

Zde uvedené příklady slouží ilustraci a nejsou v žádném směru zamýšlené jako omezení rozsahu tohoto vynálezu. Odborníkům v tomto oboru bude jasné, že genu pro fytázu podle vynálezu se může použít při heterologních hybridizačních pokusech, zaměřených na izolaci genů, které kódují fytázu, z jiných mikroorganismů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentace A. ficuum NRRL 3135

Aspergillus ficuum kmen NRRL 3135 byl získán zNorthem Region Research Lab, USDA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, USA. Preparáty spor byly připraveny pomocí standardních postupů.

Spory a následně buňky byly převedeny sérií vsádkových fermentací v Erlenmeyerových buňkách do 10 1 fermentoru. Po nárůstu ve vsádkové kultivaci byl obsah tohoto fermentoru použit jako inokulum pro finální vsádkovou fermentací v objemu 500 1.

Použité médium obsahovalo: 91 g/1 kukuřičného škrobu (BDH Chemicals Ltd.); 38 g/1 glukóza.H₂O; 0,6 g/1 MgSO₄.7H₂O; 0,6 g/1 KC1; 0,2 g/1 FeSO₄.7H₂O a 12 g/1 KNO₃. pH bylo udržováno na hodnotě 4,6 ± 0,3 automatickou titrací buď 4N NaOH nebo 4N H₂SO₄.

Buňky rostly při 28 °C za automatické regulace koncentrace rozpuštěného kyslíku, která byla udržována na 25 % nasycení vzduchem. Produkce fýtázy dosáhla maximální úrovně 5-10 U/ml po 10 dnech fermentace.

- 12CZ 289014 B6

Příklad 2

Purifikace a charakterizace fytázy z A. ficuum

A. Stanovení aktivity fytázy

100 μΐ filtrátu média (zředěného je-li to nutné) nebo 100 μΐ supematantu nebo 100 μΐ demineralizované vody při slepém pokusu se přidá k inkubační směsi, která má následující složení:

- 0,25 M octanu sodného, pufr pH 5,5 nebo

- glycin - HC1, pufr pH 2,5

- 1 mM sodné soli kyseliny fytové

- demineralizovaná voda do 900 μΐ

Výsledná směs se 30 min inkubuje při 37 °C. Reakce se zastaví přidáním 1 ml 10% TCA (kyselina trichloroctová). Po skončení reakce se přidá 2 ml reakčního činidla 3,66 g FeSO4./H₂O v 50 ml roztoku molybdenanu amonného (2,5 g (NH4)6Mo₇O₂4.4H₂O a 8 ml H₂SO₄, zředěné na 250 ml demineralizovanou vodou.

Intenzita modrého zbarvení se měří spektrofotometricky při 750 nm. Naměřené hodnoty ukazují množství uvolněného fosfátu, které se odečte z kalibrační křivky pro fosfát v koncentračním rozmezí 0-1 mmol/1.

Barvivo pro fosfatázu

Komponenty s fosfatázovou aktivitou byly stanoveny pomocí izoelektrické fokuzace s použitím obvyklého barviva pro fosfatázu. Gel byl inkubován s roztokem a - naftylfosfátu (Sigma, lg/1) a soli Fast Gamet GBC (Sigma, 2g/l) v pufru (0,6 M acetát sodný, pH 5,5). Reakce, jejímž výsledkem je vznik černého precipitátu, se zastaví buď směsí methanol: kyselina octová (30: 10 % obj.), nebo protřepáváním s destilovanou vodou, jestliže se dále požaduje protein s fytázovou aktivitou.

B. Purifikace fytázy z A. fícuum

Fytáza z kultivačního média kmene A. fícuum NRRL 3135 se čistí až do homogenního stavu. Nejprve se médium zbaví filtrací mikroorganismů. Výsledný filtrát se dále koncentruje v ultrafiltrační jednotce Filtron s filtry oddělujícími produkt o molekulové hmotnosti 30 kD. pH a iontová síla vzorku se upraví pro purifikační proces promytím vzorku pufrem 10 mM acetát sodný pH 4,5. V tomto ultrafiltračním procesu se vzorek přibližně 20 krát zkoncentruje.

Potom se vzorek nastříkne na měnič kationtů (S-Sepharose Fast-Flow v koloně HR 16/10 20 ml, obojí získáno od firmy Pharmacia v systému Waters Preparative 650 Advanced Protein Purifícation Systém. Navázané proteiny se eluují gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru z octanu sodného. Fytáza se eluuje přibližně při koncentraci 250 mM NaCl. Frakce s fytázovou aktivitou se spojí, zkoncentrují a ultrafíltrací odsolí. Získaný roztok se nastříkne na měnič aniontů (Q-Sepharose Fast-Flow v koloně HR 16/10 20 ml, Pharmacia). Proteiny se opět eluují gradientem chloridu sodného od 0 do 1 M v pufru z octanu sodného, jak je popsáno výše. Fytáza se eluuje z této kolony přibližně při 200 mM NaCl.

Výsledkem těchto purifikačních kroků je částečně vyčištěná fytáza o specifické aktivitě přibližně 40-50 μ/mg proteinu. To značí 25-násobné vyčištění.

Analýza čistoty této částečně vyčištěné fytázy ukázala, že je přítomna hlavní nečistota o molekulové hmotnosti přibližně 100 kDa (obr. 1B, sekvence E). Při izoelektrické fokuzaci se

-13CZ 289014 B6 zjistilo, zeje přítomno množství enzymů s fosfatázovou aktivitou včetně 3-4 subforem fytázy (jejich izoelektrické body se pohybují od 5,0 do 5,4) (obr. IA, sekvence A a B).

Aby se získal homogenní preparát fytázy, byla provedena další dvojnásobná purifíkace a následná separace složek částečně vyčištěné fytázy pomocí izoelektrické fokuzace v systému LKB Multiphor na deskách Ampholine PAG (pH rozsah 4 - 6,5). Proteiny s fosfatázovou aktivitou (včetně fytázy) byly stanoveny pomocí obecného postupu pro barvení fosfatázy, který je popsán výše. Požadované pásy byly vyříznuty z gelu. Aktivní protein byl eluován 16 h inkubací gelových proužků v pufru tvořeném 10 mM octanem sodným, pH 5,5. Proteinové frakce byly analyzovány pomocí postupu pro stanovení specifické aktivity fytázy, který je popsán v příkladu 2. Tímto způsobem byly rozlišeny fytázové frakce od jiných kyselých fosfatáz. Konečný faktor purifíkace pro fytázu byl přibližně 60 (specifická aktivita finálního preparátu lOOU/mg proteinu). V tomto posledním purifikačním kroku je také možné izolovat různé subformy fytázy (obr. 1 A, sekvence A a B).

Pro efektivní purifikační postup byly připraveny monoklonální protilátky proti fytáze z A. ficuum. Protilátka se naváže na gel Sepharose 4B, aktivovaný bromkyanem (5 mg/ml gelu). Této matrice se použije v imunoafmitní koloně. Matrice je schopná navázat přibližně 1 mg fytázy na ml. Fytáza se může zafmitní kolony eluovat pufrem (100 mM glycin-HCl, 500 mM NaCl) při pH 2,5 bez jakékoliv ztráty aktivity. Tento postup se může použít pro izolaci homogenní fytázy ze surového filtrátu média. Izolace proběhne v jediném stupni s 80 % výtěžností a 60 násobnou purifikací.

C. Deglykosylace fytázy

Fytáza z A. ficuum (70 pg proteinu) byla inkubována s 2,5 U N-Glycanase (Genzyme) v pufru tvořeném 0,2 M fosforečnanem sodným pH 8,6 a 10 mM 1,10 - fenantrolinem v celkovém objemu 30 μΐ.

Po 16 h inkubaci při 37 °C byl zkoumán rozsah deglykosylace pomocí elektroforézy (Phast Systém Pharmacia). Bylo zjištěno, že zdánlivá molekulová hmotnost fytázy se snížila z 85 000 na přibližně 56 500. Při barvení cukrů podle Schiffa kyselinou jodistou, při němž byla fytáza identifikována jako glykoprotein, se nepodařilo stanovit žádný zbytek cukru, navázaný na protein. Kompletní odstranění cukrů bylo dále dokázáno citlivou „lectin-blotting“ metodou. Nativní a deglykosylovaná fytáza (obě v množství 1,5 pg) byly naneseny na standardní gel SDSPAGE a elektroforeticky převáděny po dobu 16 h při 30 V na membránu PVDF (Immobilon, Millipore) v pufru 25mM TRIS-glycin pH 8,3 a v methanolu (20 % obj.).

Membrána byla dále inkubována s hovězím sérum albuminem (10 g/1) ve fyziologickém roztoku, pufřovaném fosforečnanovým pufrem a skonkavalin A-peroxidázou. (Sigma, 10pg/ml ve fyziologickém roztoku, pufřovaném fosforečnanovým pufrem). Peroxidáza byla potom obarvena 4-chloro-l-naftolem (Sigma).

Ani touto citlivou metodou se nepodařilo stanovit žádné zbytky cukrů, navázané na deglykosylovanou fytázu.

Po deglykosylaci fytáza zcela ztratila svou aktivitu, možná vzhledem k agregaci enzymu.

-14CZ 289014 B6

Příklad 3

Stanovení sekvence aminokyselin fytázy a sestavení oligonukleotidových prób

A. Stanovení N-koncové sekvence aminokyselin

Fytáza byla elektroforeticky převedena z SDS-PAGE nebo z IEF-PAGE na PVDF blotting membránu (Immobilon, Millipore). Eiektroblotting byl prováděn v pufru 10 mM CAPS (3cyklohexylamin-propansulfonová kyselina) pH 11,0 s methanolem (10 % obj.) po dobu 16 h při 30Va4°C.

Protein byl lokalizován obarvením modří Coomassie Brilliant Blue. Obarvený pás byl vyříznut, dále odbarven v methanolu a podroben sekvenování v plynné fázi. Postup byl prováděn několikrát za použití několika jednotlivých preparátů. Získané výsledky udává obr. IA (sekvence A až D).

Byla také stanovena sekvence aminokyselin pro protein o molekulové hmotnosti 100 000, který je přítomný v surových preparátech. Údaje, získané pro tento protein, udává obr. IC. Tato sekvence vykazuje značnou podobnost s kyselou fosfatázou, která byla izolována z Aspergillus niger (MacRae et al. (1988) Gene 71,339-348).

B. Stanovení vnitřních sekvencí aminokyselin

Fragmentace proteinu bromkyanem

Vyčištěná homogenní fytáza byla převedena do 100 mM NaHCO₃ ultrafiltrací (Microconcentrator Centricon 30, Amicon). Dále byl protein lyofilizován, rozpuštěn v kyselině trifluoroctové (70% obj.) a inkubován 6h s přibližně 300 násobným molámím přebytkem bromkyanu. Reakce byla ukončena zředěním směsi vodou. Získané fragmenty byly opět lyofilizovány. Potom byl vzorek rozpuštěn v pufru pro vzorky SDS-PAGE, obsahujícím DTT (dithiothreitol). Rozsah fragmentace byl stanoven pomocí PAGE. Analytické PAGE bylo provedeno ve Pharmacia Phast-System unit, na 20 % SDS-PAGE gelech. Gely byly upraveny tak, aby tvořily kontinuální pufrovací systém pro zlepšení separace malých peptidů (podle návodu). Peptidy byly stanoveny pomocí techniky barvení stříbrem, známé v tomto oboru. Barvením modří Coomassie Brilliant Blue se totiž nepodařilo stanovit nejmenší peptid. Výsledkem tohoto postupu je kompletní degradace fytázy na peptidy s molekulovými hmotnostmi menšími než 2500, 36 000, 57 000 a 80 000.

Peptidy byly izolovány pro sekvenování v plynné fázi pomocí SDS-Tricine-PAGE jak je popsáno v Schagger a Jagow (1987) Anal. Biochem. 166, 368-379. Následoval eiektroblotting, jak je popsáno výše.

N-konec 57 000 fragmentu je stejný jako N-konec fytázy, kterou stanovil Ullah (1988 b, viz výše), s výjimkou prvních čtyř aminokyselin, které chybějí (obr. IA, sekvence D). N-konce sekvencí 2500 a 36 000 peptidů jsou uvedeny na obr. 1B jako sekvence A a B.

C. Oligonukleotidové próby

Oligonukleotidové próby byly sestaveny na základě sekvencí aminokyselin, uvedených na obr. IA a 1B. Byly připraveny za použití DNA syntetizátoru Applied Biosystems ABI 380B DNA synthesizer. Tyto oligonukleotidy jsou uvedeny na obr. 2A a AB.

-15CZ 289014 B6

Příklad 4

Hybridizace genomových bloků a genomových knihoven s první sadou oligonukleotidových prób

Genomová DNA z A. fícuum byla izolována mletím mycelia v kapalném dusíku za použití standardních postupů např. Yelton a další (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. - U.S.A. 1470-1474). Genomová knihovna byla zkonstruována v bakteriofágovém vektoru lambda EMBL3 za použití neúplného štěpu Sau3A chromozomální DNA z A. fícuum NRRL3135 podle standardních technik (např. Maniatis a další. (1982) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratoiy, New York. Takto vytvořená genomová knihovna obsahovala 60 až 70 krát genom A. fícuum. Knihovna byla testována na výskyt plaků bez inzertu, kteiý by vznikl hybridizací s přiloženým fragmentem lambda EMBL3. Bylo pozorováno, že spróbou lambda EMBL3 hybridizuje méně než 1 % plaků. Velikost inzertu činila 13 až 17 kb.

Aby se zjistili podmínky a próby, které jsou vhodné pro screening genomové knihovny, byla genomová DNA rozštěpena několika restrikčními enzymy. Dále byla separována na agarosových gelech a rozdělena na bloky na Genescreen plus, podle pokynů výrobce. Bloky byly hybridizovány se všemi oligonukleotidovými próbami. Hybridizace byla prováděna při různě přísných podmínkách (6 x SSC, 40 až 60 °C pro hybridizaci; více než 0,2 x SSC, 65 °C pro promývání). Pro screening genomové knihovny byly vybrány próby 1068 a 1024 (obr. 2A), přestože nebyly zjištěny žádné společné fragmenty DNA, které by specificky hybridizovaly s oběma próbami. Próba 1025 (obr. 3) pro kyselou fosfatázu dává specifický a diskrétní hybridizační signál, a proto byla tato próba vybrána pro screening genomové knihovny pro gen kyselé fosfatázy.

Hybridizační plaky byly zjištěny v genomové knihovně při použití všech tří prób. Hybridizační signál, odpovídající próbě 1025 (kyselá fosfatáza) byl silný a reprodukovatelný. Při použití prób 1024 a 1068 (fytáza) byly pozorovány hybridizační signály různé intenzity. Mezi dvěma sadami nebyla pozorována žádná křížová hybridizace. Všechny tři série plaků byly opět podrobeny screeningu a DNA byla izolována z osmi jednotlivých pozitivních hybridizačních plaků (Maniatis a další, viz výše). V každé sérii mohou být určeny klony, které obsahují identické hybridizační fragmenty. To znamená, že inzerty řečených klonů jsou příbuzné a pravděpodobně překrývají stejnou oblast genomové DNA. Opět se neukázala žádná křížová hybridizace při použití dvou specifických sérií pro fytázu (próby 1024 a 1068). To znamená, že ačkoliv obě próby, použité pro izolaci dvou sérií klonů, byly získány zN-koncové sekvence aminokyselin daného proteinu, byly identifikovány a klonovány odlišné fragmenty genomové DNA.

Všechny tři série klonů byly hybridizovány s Northem blots, obsahujícími mRNA, která byla izolována z indukovaného a neindukovaného mycelia (příklad 6). Specifické klony pro kyselou fosfatázu, stejně jako vnitřní fragment 3,1 kb Sáli, izolovaný z těchto klonů se hybridizovaly výhradně se vzorky s indukovanou mRNA. mRNA, stanovená pomocí specifických prób pro kyselou fosfatázu, je dlouhá asi 1800 b, což souhlasí se známou velikostí proteinu (68 000, Ullah a Cummins (1987) Prep. Biochem. 17, 397-422). Neukázala se žádná hybridizace specifických klonů pro fytázu se specifickými mRNA. Z toho se vyvozuje, že výše popsaná metoda je neúspěšná pro klonování genu, kódujícího fytázu. Dále z toho vyplývá, že tento neúspěch není způsoben neúspěšností použité metody, protože tato metoda byla s úspěchem použita pro identifikaci genu, který kóduje kyselou fosfatázu. Klon lambda, obsahující gen pro kyselou fosfatázu, byl uložen 24. dubna 1989 vCentraal Bureau voor Schimmelcultures, Baam, The Netherlands a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo CBS 214,89, Fragment 10 kb BamHI byl izolován zfágu a klonován do pUC19. Tento subklon obsahuje celý gen, kódující kyselou fosfatázu. Subklon pAF 1-1 (obr. 5) byl uložen 24. dubna pod číslem CBS 213,89.

-16CZ 289014 B6

Příklad 5

Izolace genu, kódujícího fytázu, za použití druhé sady oligonukleotidových prób

Próby byly sestaveny s použitím N-koncové sekvence aminokyselin fragmentů, které vznikly štěpením CNBr (obr. 2B, próby 1295, 1296 a 1297). Byly hybridizovány s genomovou DNA, jak je popsána výše. Vhodnost použití těchto prób pro izolaci genu, kódujícího fytázu, byla opět studována pomocí Southem hybridizace genomových blotů s těmito próbami. Tentokrát bylo možno při použití všech tří prób určit hybridizované fragmenty odpovídajících délek, a to přesto, že próby byly odvozeny z nepřekrývajících se úseků. Nebyla zjištěna žádná hybridizace mezi novou sadou prób a klony, které byly izolovány s použitím první sady prób (příklad 4). Proto byla genomová knihovna podrobena screeningu při použití všech tří prób v oddělených experimentech. Subsada klonů (lambda AF 201, 219, 241 a 243), izolovaná z každé jednotlivé próby, také hybridizovala s oběma zbývajícími próbami. To znamená, že v tomto případě při použití tří odlišných prób byly klony izolovány z jediné genomové oblasti. Byly učiněny pokusy hybridizovat nově izolované klony s próbami 1024 a 1068. V obou případech nebyla pozorována žádná hybridizace snově izolovanými klony za podmínek, kdy obě próby byly úspěšně hybridizovány s klony, které byly izolovány při použití těchto prób (viz příklad 4). To ukazuje, že nově izolované klony nejsou homologní s próbami, které byly odvozeny z N-konce purifikované fytázy.

Klon lambda EMBL-3, který hybridizuje se všemi třemi próbami (1295-1297), byl pojmenován lambda AF 201 (obr. 4) a byl uložen 9. března 1989 pod číslem CBS 155,89.

5,1 kb BamHI fragment z lambda AF201 (klonovaný v pUC19 a označený pAF 2-3, viz obr. 4), který hybridizuje se všemi třemi oligonukleotidovými próbami, byl použit pro testování Northem blotu. V tomto případě byla zjištěna diskrétní mRNA o velikosti 1800 bází. Tato mRNA byla nalezena pouze v indukovaném myceliu. Podobné výsledky byly získány, když byly jako próby použity oligonukleotidy. Proto byl při použití nové sady prób identifikován společný fragment DNA, který hybridizuje specificky s indukovanou mRNA. Délka této mRNA (1800 b) je dostatečná pro kódování proteinu o velikosti asi 60 000, což je asi velikost neglykosylovaného enzymu. Z toho plyne, že izolované fragmenty obsahují alespoň část genu, který kóduje fytázu.

Příklad 6

Izolace indukované a neindukované mRNA

Z literatury je známo, že syntéza fytázy v A. ficuum je podrobena přísné regulaci v závislosti na fosfátu (Han a Callagher (1987) J. Indust. Microbiol. 1, 295-301). Proto ukázka toho, že izolovaný gen se podrobuje podobné regulaci, může být pokládán za podporu tvrzení, že je klonován kýžený gen.

Pro izolaci mRNA, která byla syntetizována jak za produkčních, tak za neprodukčních podmínek byl pěstován A. ficuum NRRL 3135 následujícím způsobem. Nejprve byly přes noc vypěstovány spory v neprodukčním médiu. Další den bylo sebráno mycelium, promyto sterilní vodou a naočkováno buď do indukčního, nebo do neindukčního média. Použité médium obsahovalo (v litru): 20 g kukuřičného škrobu; 7,5 g glukózy; 0,5 g MgSC>4.7 H₂O; 0,2 g FeSC>4.7 H₂O; a 7,2 g KNO3. Pro indukci fytázy byly do média přidány více než 2 g/1 coru steep liquor, zatímco neindukční médium obsahovalo 2 g/1 K2HPO4. Mycelium bylo pěstováno alespoň 100 hodin. Vzorky byly odebírány ve zvolených intervalech. Produkce fytázy byla sledována stanovením fytázy, způsobem popsaným v příkladu 2A. Denaturovaná mRNA byla oddělena elektroforézou a blotována na Genescreen plus. Bloty byly hybridizovány s pAF 2-3, kteiý byl značen ³²P nebo s fragmentem 3,1 kb Sáli, izolovaným zpAF 1-1 (kyselá fosfatáza) z příkladu 4. Výsledky ukazuje tabulka 2.

-17CZ 289014 B6

Pozitivní hybridizace specifického fragmentu fytázy 5,1 kb BamHI a specifického fragmentu kyselé fosfatázy 3,1 kb Sall s izolovanou mRNA se dá pozorovat pouze, když se buňky pěstují za podmínek, známých pro indukci syntézy fytázy a kyselých fosfatáz. Z těchto výsledků vyvozujeme, že izolované geny podléhají regulaci, jak bylo očekáváno pro fytázu a kyselé fosfatázy.

Tabulka 2

Hybridizace Northem blotů s použitím specifického fragmentu fytázy 5,1 kb BamHI (A) nebo specifického fragmentu kyselé fosfatázy 3,1 kb Sall (B) jako próby; + znamená přítomnost 1800 b mRNA pro fytázu nebo 1800 b mRNA pro kyselou fosfatázu. Relativní aktivita fytázy byla stanovena ve vzorcích, odebraných po 24 h; indukované kultury mají 10 krát větší aktivitu fytázy než neindukované kultury.

Doba po očkování(h)	Indukováno	Neindukováno
A 24	+	—
B24	+	-

Příklad 7

Důkaz skutečnosti, že klonovaný gen je genem pro fytázu

Pro získání definitivního důkazu o úspěšnosti izolace genu, kódujícího fytázu a pro studium možnosti zvyšování exprese klonovaného genu byl gen pro fytázu klonován do vhodného vektoru. Vzniklý vektor byl transformací převeden do A. niger 402 (ATCC 9092). Gen pro fytázu byl izolován z klonu AF201 jako 10 kb Nrul fragment a klonován do místa Stul vektoru pAN 8-1 (Mattem, I.E. a Punt, P. J. (1988) Fungal Genetics Newsletter 35, 25). Tento vektor obsahuje gen ble (způsobující rezistenci k pleomycinu) jako selekční markér. Výsledný konstrukt byl nazván pAF 28-1 (obr. 4). Dále byl transformován do A. niger 402 postupem, popsaným v příkladu 9 s výjimkou toho, že protoplasty byly naočkovány na minimální médium pro Aspergillus. Toto médium bylo doplněno 30 pg pleomycinu/ml a ztuženo 0,75 % agarem. Jednotlivé transformanty byly vyčištěny a izolovány. Potom byly testovány na produkci v třepaných baňkách, jak je popsáno v příkladech 1 a 2. Pro kontrolu byly testovány také transformanty, které měly pouze vektor a také netransformované buňky hostitele (tabulka 3). Pouze A. niger 402, obsahující pAF 28-1, produkuje fytázu a reaguje se specifickou monoklonální protilátkou, která byla vyvinuta pro fytázu - z A. ficuum. Fytáza, reagující s touto monoklonální protilátkou, může být eluována z imunoafinitní kolony při pH 2,5. Ukázalo se, že tato fytáza má stejnou molekulovou hmotnost, stupeň deglykosylace, izoelektrický bod a specifickou aktivitu jako fytáza z A. ficuum. Tato zjištění poskytují jasný důkaz skutečnosti, že buňky A. niger 402, transformované pAF 28-1, produkují fytázu, která je skutečně totožná s fytázou z A. ficuum. Podobná produkce nebyla pozorována v žádném jiném typu sledovaných buněk.

-18CZ 289014 B6

Tabulka 3

Kmen	aktivita fytázy	% aktivity fytázy, která se adsorbovala v imunoafinitní koloně
A. niger 402	0,5	0
A. niger 402
pAF 28-1	0,7	10
A. niger 402
pAN 8-1	0,5	0

Kmeny byly pěstovány za podmínek indukce (příklad 6). Vzorky byly odebrány po 96 h růstu.

Příklad 8

Charakterizace genu pro fytázu

Klony lambda, obsahující fytázu byly analyzovány štěpením různými restrikčními enzymy. Mapa oblasti genomu, která obsahuje gen pro fytázu, je uvedena na obr. 4. Definované restrikční fragmenty byly klonovány jako součást klonovacího vektoru pUC 19, jak ukazuje obr. 4.

Již bylo ukázáno (příklad 5), že 5,1 kb BamHI fragment, přítomný v pAF 2-3, obsahuje alespoň část genu pro fytázu. Kromě toho bylo ukázáno, že oligonukleotidové próby 1295 a 1297 (obr. 2B) hybridizují s inzertem Sáli zpAF 2-7 (umístění klonů pAF 2 je uvedeno na obr. 4). Próba 1296 pravděpodobně zaujímá místo Sáli mezi fragmenty v pAF 2-6 a pAF 2-7. Výsledky těchto pokusů ukazují, že sekvence, kódující fytázu, je umístěna na levé straně části inzertu Bam HI v pAF 2-3.

Dále byly v celém rozsahu stanoveny nukleotidové sekvence inzertů plazmidů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7 pomocí terminační řetězové dideoxymetody. (Sanger et al. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) a postupů shotgun, které popsali Messing a další (1981, Nucl. Acids Res. 2, 309-321). Dále byly syntetizovány specifické oligonukleotidy. Jejich syntéza je založena na informacích, získaných při procesu sekvenování.

Kompletní sekvence nukleotidů klonů pAF 2-3, pAF 2-6 a pAF 2-7, která zahrnuje chromozomální lokus genu pro fytázu, je uvedena na obr. 6. Grafické zobrazení uvádí obr. 7.

Analýza kompletní sekvence na schopnost kódovat daný protein ukázala, že N-koncová sekvence aminokyselin maturovaného proteinu je kódována, počínajíc od nukleotidové pozice 381 (podle Ullaha je kódovací pozice pro N-konec 369). Dále bylo zjištěno, že Nkoncová sekvence aminokyselin 36 kDa vnitřního peptidového fragmentu je zakódována na nukleotidové pozici 1101 (viz obr. 1B, sekvence B). Pro N-koncovou sekvence aminokyselin 2500 vnitřního peptidového fragmentu jde o pozici 1548 (viz obr. 1B, sekvence A). Otevřená čtená konstrukce končí na nukleotidové pozici 1713.

Tato zjištění jasně dokazují, že charakterizovaný chromozomální lokus obsahuje sekvenci DNA, která kóduje fytázu.

Jestliže se postupuje směrem proti přepisu u chromozomální sekvence, kódující maturovaný protein, nelze najít žádný startovací ATG kodón ve čtené konstrukci, která sousedí s otevřeným čtecím rámcem maturovaného proteinu. Avšak na základě intron-exon hraničních charakteristik je možno předpokládat, že intron leží mezi nukleotidovými pozicemi 254 a 355. Potom tedy ATG kodón leží na nukleotidové pozici 210 v konstrukci společně s otevřeným čtecím rámcem, která kóduje maturovanou fytázu. Odvozená sekvence aminokyselin tohoto prodloužení N-konce je

-19CZ 289014 B6 v dobrém souhlasu s pravidly pro signální sekvenci pro sekreci, která publikoval von Heyne (1983, Eur. J. Biochem. 133,17-21).

Pro potvrzení těchto hypotéz byla izolována cDNA pro fytázu pomocí PCR-amplifíkace se specifickými primery pro fytázu. Také byl izolován celkový komplex mRNA/cDNA, jako matrice, podle postupů, které jsou popsány níže.

Izolace póly A⁺ RNA z Aspergillus ficuum

Veškerá RNA byla izolována z kmene A. ficuum NRRL 3135, který byl pěstován za podmínek indukce viz příklad 6. Suché mycelium bylo zmraženo kapalným dusíkem a rozemleto. Potom byl prášek homogenizován v zařízení Ultra-Turrax (plná rychlost po 1 minutu) v 3M LiCl, 6M močovině při 0 °C a homogenát byl udržován přes noc při 4 °C, jak popsal Auffrey a Rougeon (Eur. J. Biochem., 107, 303-314, 1980). Všechna buněčná RNA byla získána po centrifugaci při 16 000 g po 30 minut a dvou následných extrakcích směsí fenol:chloroform:isoamylalkohol (50:48:2). RNA byla srážena ethanolem a rozpuštěna v 1 ml 10 mM TrisHCl (pH 7,4), 0,5 % SDS. Pro selekci póly A⁺ byl vzorek s celkovým množstvím RNA zahříván 5 min při 60 °C, dále byl upraven 0,5 M NaCl. Potom byl nastříknut do kolony s oligo (dT) - celulózou. Po několikerým promytí roztokem, který obsahoval 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,5 % SDS a 0,1 M NaCl, byla póly A⁺ RNA eluována roztokem 10 mM Tris-HCl pH 7,4 a 0,5 % SDS.

Příprava komplexu mRNA/cDNA

Pro syntézu prvního vlákna cDNA bylo 5 pg póly A⁺ RNA rozpuštěno v 16,5 μΐ vody a dále bylo přidáno: 2,5 μΐ RNasin (30 U(pl); 10 μΐ pufru, který obsahoval 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM MgCl₂ a 40 mM KC1; 2 μΐ 1 M KC1; 5 μΐ 0,1 M DTT; 0,5 μΐ oligo (dT)i₂_i₈ (2,5 mg/ml); 5 μΐ 8mM dNTP-mix; 5 μΐ BSA (1 mg/ml) a 2,5 μΐ Moloney MLV reverzní transkriptázy (200U/ml). Směs byla inkubována 30 min při 37 °C a reakce byla zastavena přidáním 10 μΐ 0,2 M EDTA a 50 μΐ H₂O. Extrakce byla provedena chloroformem a po centrifugaci bylo k supematantu postupně přidáno 110 μΐ 5 M NH₄Ac a 440 μΐ ethanolu. Komplex mRNA/cDNA byl srážen 30 min v roztoku ledového bezvodého ethanolu. Komplex mRNA/cDNA byl odseparován centrifugaci. Dále byl promyt 70% ledovým ethanolem a rozpuštěn ve 20 μΐ H₂O.

Klonování fragmentů cDNA pro fytázu

Izolace sekvencí cDNA, kódujících fytázu byla provedena pomocí řetězové polymerační reakce (PCR) ve dvou fragmentech. Na základě genomové sekvence pro fytázu viz obr. 6 byly sestaveny čtyři syntetické oligonukleotidové primery.

Oligo 1: 5'-GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA-3'

Oligo 2: 5-AGT.GAC.GAA.TTC.GTC.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG-3'

Oligo 3: 5'-GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC-3'

Oligo 4: 5'-AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.GTT.TAA.AGG.G.3'

Oligo 1 obsahuje sekvenci nukleotidů za ATG start kodónem, směrem po přepisu, (pozice 210 až 231), připojenou k 5' konci pomocí EcoRi místa. Oligo 2 obsahuje bezprostředně před Sáli místem směrem proti přepisu, (pozice 1129 až 1109) nukleotidovou sekvenci, také připojenou pomocí přídavného EcoRI místa. Oligo 3 obsahuje sekvenci nukleotidů okolo Bam Hl místa (pozice 845 až 865). Oligo 4 obsahuje sekvenci nukleotidů, umístěnou za stop kodónem pro fytázu, směrem po přepisu, (pozice 1890 až 1867), připojenou pomocí přídavného Pstl místa.

Řetězové polymerační reakce se provádějí podle předpisu dodavatele Taq - polymeráze (Cetus). Jako templátu se používá roztoku (1,5 μΐ), obsahujícího hybridy mRNA/cDNA (popsaná výše). V reakci, vedoucí k rozšíření části cDNA pro N-konec fytázu, se jako primery používají oligo 1

-20CZ 289014 B6 a 2 (každý v množství 0,3 pg); viz obr. 8. V reakci, vedoucí k rozšíření části cDNA pro C-konec fytázy, se jako primery používají oligo 3 a 4 (každý v množství 0,3 pg); viz obr. 8. Po denaturaci (7 min při 100 °C) a po přídavku 2U Taq - polymerázy se reakční směsi podrobí 25 rozšiřovacím cyklům (každá: 2' při 55 °C, 3' při 72 °C, Γ při 94 °C) v DNA-amplifikátoru Perkin Elmer/Cetus. V posledním cyklu se vynechá denaturační krok. Po rozštěpení (EcoRI pro část cDNA, kódující N-konec a BamHI a Pstl pro část cDNA, kódující C-konec) se oba fragmenty cDNA klonují do vhodných míst pTZ18R (Promega).

Nukleotidové sekvence obou fragmentů, získaných PCR reakcí, byly stanoveny pomocí terminační řetězové dideoxyreakce (Sanger, viz výše). Při tom byly použity jako primery syntetické oligonukleotidy, sestavené podle chromozomální sekvence genu pro fytázu. Jako templát byla použita celá rozšířená DNA a také klonované fragmenty cDNA. Sekvence oblasti cDNA, která kóduje fytázu a odvozená sekvence aminokyselin pro fytázový protein jsou zobrazeny na obr. 8.

Sekvence cDNA potvrdila hypotézu o umístění intronu, uvedenou výše. Ukázala také, že v chromozomální sekvenci genu nejsou obsaženy žádné jiné introny.

Gen pro fytázu kóduje primární translační produkt o délce 467 aminokyselin (molekulová hmotnost 51091). Zpracováním primárního translačního produktu, pomocí odštěpení signálního peptidu se získá maturovaný protein o délce 444 aminokyselin (m.h. 48851) nebo 448 aminokyselin (obsahující první čtyři N-koncové aminokyseliny, jak publikoval Ullah, m.h. 49232).

Příklad 9

Nadprodukce fytázy u rodu Aspergillus pomocí zavedení přídavných genomových kopií DNA pro fytázu

Konstrukce vektoru pro expresi pAF 2-2S

Všechny konstrukty byly vytvořeny pomocí standardních molekulárně biologických postupů, jak je popsáno v Maniatis et al., (1982) Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y..

Vektor pro expresi pAF 2-2S byl vytvořen klonováním 6 kb Pvu Π fragmentu DNA v genomovém klonu lambda AF 201 pro fytázu na Smál místě pUC19. Odvozený plazmid byl nazván pAF 2-2 (obr. 4). Jako selekční markér pro transformaci do Aspergilla byl na EcoRI/KnpI místa pAF 2-2 včleněn EcoRI/KpnI fragment DNA plazmidu pGW325 (Wemars K. (1986), diplomová práce na zemědělské univerzitě, Wageningen, Nizozemsko) obsahující homologní Aspergillus nidulans amdS gen. Výsledný vektor pro expresi byl nazván pAF 2-2S a je uveden na obr. 9.

A. Nadprodukce fytázy u kmene A. ficuum NRRL 3135

Plazmid pAF 2-2S byl zaveden do A. ficuum NRRL 3135 za použití transformačních postupů, které popsal Tilbum, J. a další (1983) Gene 26. 205-221 a Kelly, J. a Hyneš, M. (1985) EMBO

J., 4, 475-479 s následujícími modifikacemi:

- mycelium bylo pěstováno na minimálním médiu pro Aspergillus (Cove, D. (1966) Biochem. Biophys. Acta, 113, 51-56), doplněném 10 mM argininu a 10 mM prolinu po 16 hodin při 30 °C na rotační třepačce při otáčkách 300 min^-1;

- přidán pouze Novozym 234 (NOVO Industri), helikáza nebyla použita při tvorbě protoplastů;

-21 CZ 289014 B6

- po 90 minutách tvorby protoplastů byl přidán 1 objem STC pufru (1,2 M sorbitol, 10 mM TrisHCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂ k suspenzi protoplastů a suspenze byla odstřeďována při 2500 g, při 4 °C po 10 min v rotační kolébavé nádobkové odstředivce. Protoplasty byly promyty a resuspendovány v STC-pufru na koncentraci 10⁸ buněk/ml;

- plazmid DNA byl přidán v objemu 10 μΐ v TE pufru (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA) ke 100 μΐ suspenze protoplastů;

- po inkubaci suspenze DNA-protoplasty při 0 °C po 25 minut bylo po kapkách přidáno 200 μΐ PEG roztoku (25%PEG 4000 (Měrek), 10 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM CaCl₂). Dále byl pomalu přidán 1 ml PEG roztoku (60% PEG 4000 v 10 mM Tris-HCl pH 7,5 50 mM CaCl₂) za opakovaného míchání zkumavek. Po inkubaci při laboratorní teplotě byly suspenze zředěny STC pufrem, promíchány převrácením a odstředěny při 2000 g, 4 °C, 10 min. Protoplasty byly opatrně resuspendovány ve 200 μΐ STC pufru a naočkovány na minimální médium pro Aspergillus. Minimální médium obsahovalo 10 mM acetamidu jako jediný zdroj dusíku, 15 mM CsCl, 1 M sacharózy a bylo ztuženo 0,75 % bakteriologickým agarem č. 1 (Oxoid). Nárůst trval 6-10 dní při 33 °C.

Jednotlivé transformanty označené SP4, SP7 a SP8 byly izolovány, vyčištěny a testovány v třepaných baňkách na produkci fytázy. Přitom byl použit postup, popsaný v příkladech 1 a 2. Pro kontrolu byly také testovány transformanty, obsahující pouze vektor (amdS gen vpUC19) a netransformované buňky hostitele.

Kmeny byly pěstovány za podmínek indukce (viz obr. 6) a vzorky byly odebrány po 96 hodinách růstu. Analýzy byly provedeny měřením aktivity fytázy (tabulka 4) a pomocí izoelektrické fokuzace na polyakrylamidovém gelu (IEF-PAGE).

Vzorky stejného objemu byly odebrány z fermentací s A. fícuum a A. fícuum pAF 2-2S SP7, pěstovaných za stejných podmínek a byly aplikovány na IEF-PAGE gel (pH-rozsah 4,5-6, Phast-Systém, Pharmacia). Elektroforéza byla prováděna podle pokynů výrobce. Dále byly gely obarveny buď obecným barvivém pro proteiny Coomassie Briliant Blue (obr. 10B), nebo obecným barvivém pro stanovení aktivity fosfatázy, (obr. 10A), které je popsáno v příkladu 2.

Vzorek fytázy z A. fícuum, vyčištěný na homogenní preparát (pomocí imunoafinitní chromatografie, jak je popsáno v příkladu 7) byl také aplikován na IEF-PAGE buď samotný, nebo smíšený se supematantem kultury.

Jak již bylo uvedeno, fytáza je v různých vzorcích přítomná v četných izoformách (které jsou označeny na obr. 10 hvězdičkou). Dva hlavní izoenzymy jsou v purifikované fytáze jasně viditelné v pruzích 3 a 4 při použití obou barvicích postupů (obr. 10 A a B). Fytázové pásy jsou u rodičovského kmene A. fícuum stěží viditelné, ale u transformovaného kmene pAF 2-2S SP7 jsou zřetelně mohutnější.

-22CZ 289014 B6

Tabulka 4 zvýšení produkce fytázy transformací kmene A. fícuum NRRL 3135

Kmen	Aktivita fytázy (U/ml)
A. fícuum	0,6
A. fícuum + kontrolní plazmid	0,6
A. fícuum pAF 2-2S SP8	7,6
A. fícuum pAF 2-2S SP7	6,7
A. fícuum pAF 2-2 S SP4	4,3

B. Nadprodukce fytázy u kmene A. niger CBS 513.88

Vektor pro expresi pAF 2-2S byl také transformačními postupy, popsanými pro A. fícuum, zaveden do A. niger CBS 513.88. Jednotlivé transformanty byly izolovány, vyčištěny a testovány na produkci fytázy. Testování bylo provedeno ve třepaných baňkách za růstových podmínek indukce, jak je popsáno v příkladu 6.

Podle postupu z příkladu 9A byla provedena stanovení úrovně exprese fytázy některých transformantů (označených jako A. niger pAF 2-2S č. 8, č. 20 a č. 33) a u kontrolních kmenů. Výsledky ukazuje tabulka 5.

Transformanty A. niger vykazují srovnatelnou úroveň exprese pro fytázu jako transformanty A. fícuum. To mimo jiné znamená, že promotor pro fytázu z A. fícuum je aktivní v A. niger.

Další analýza byla provedena s kultivačním médiem transformantů pAF 2-2S č. 8 pomocí elektroforézy na IEF-PAGE gelu v pH rozsahu 4,5-6 v Phast-Systém (Pharmacia) jak je popsáno výše. Stejné objemy supematantů kultivačních médií rodičovského kmene A. niger a transformantů pAF 2-2S č. 8, pěstovaných za stejných podmínek, byly naneseny na gel. Po proběhnutí analýzy byly gely obarveny, jak je uvedeno výše.

Rodičovský kmen A. niger produkuje velmi malé množství fytázy, které se nedalo stanovit gelovou elektroforézou. Kmen pAF 2-2S č. 8 produkuje přibližně 90 krát více fytázy. Tento rozdíl je jasně zřetelný z obr. 11.

Bylo stanoveno několik izoforem fytázy (jsou označeny hvězdičkou na obr. 11). Obvyklé vybarvení proteinu ukázalo, že intenzita fytázových pásů je výrazně zvýšena, přičemž se neukázaly žádné jiné hlavní proteinové pásy.

Tabulka 5

Produkce fytázy kmene A. niger CBS 513.88, transformovaného vektorem pAF 2-23

Kmen	Aktivita fytázy (U/ml)
A. niger	0,2
A. niger + kontrolní plazmid	0,2
A. niger pAF 2-2S č. 8	14
A. niger pAF 2-2S č. 33	5
A. niger pAF 2-2S č. 20	4

-23CZ 289014 B6

Příklad 10

Exprese fytázy v kmeni A. niger, transformovaném vektory pro expresi, které obsahovaly gen pro fytázu z A. ficuum fúzovaný s promotorem a/nebo se signálními sekvencemi genu pro amyloglukosidázu (AG) z A. niger

Konstrukce vektorů pro expresi

Pro získání nadprodukce fytázy v A. niger byly připraveny odvozené přídavné kazety pro expresi. V těchto kazetách je gen pro fytázu z A. ficuum řízen promotorem pro amyloglukosidázu (AG) z A. niger v kombinaci s různými signálními sekvencemi: v pl8FYT3 je 18 aminokyselin (aa) a v p24FYT3 je 24 aminokyselin (aa) z vedoucích sekvencí genu AG z A. niger fúzováno s fragmentem genu pro fytázu, který kóduje maturovaný protein. V kazetě pro expresi pFYT3 je sekvence promotoru AG fúzována se sekvencí, kódující fytázu, která obsahuje vedoucí sekvenci pro fytázu.

Konstrukce pl8FYT3

Fůze AG-promotoru a 18 aa AG - vedoucí sekvence se sekvencí pro fytázu, která kóduje maturovaný protein, se provádí pomocí řetězové polymerační reakce. VPCR reakcích byly použity dva rozdílné templáty: pAF 2-2s, obsahující celý gen pro fytázu, jak bylo popsáno výše apAB6-l, plazmid, obsahující celý AG-lokus z A. niger; tento lokus byl izolovaný zplazmidové knihovny A. niger, která obsahuje 13-15 kb HindlII fragmenty vpUC19. Pro izolaci byly použity AG-specifické oligonukleotidy:

AG-1: 5'-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3'

AG-2: 5'-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3' oba založené na nukleotidové sekvenci, publikované pro A. niger (Boel a další. (1984), EMBO J. 3, 1097-1102; Boel a další (1984), Mol. and Cell. Biol. 4, 2306-2315). Oligonukleotidové próby byly odvozeny od sekvence, obklopující intron 2. Oligo AG-1 je umístěna na 3'konci intronu a má totožnou polaritu s AG mRNA. Oligo AG-2 je umístěna směrem proti přepisu intronu 2 a je antiparalelní s AG mRNA. Plazmid pAB 6-1 obsahuje gen AG v 14,5 kb Hind III fragmentu (viz obr. 12).

Jako primery pro rozšíření pomocí PCR byly sestaveny čtyři syntetické oligonukleotidy s následujícími sekvencemi:

Oligo 1: 5'-CTCTGCAGGATTCAAGCTAG-3' (AG-specifická sekvence okolo EcoRI místa přibližně 250 bp proti směru přepisu od ATG iniciačního kodonu).

Oligo 18-2: 5'-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3' maturovaná fytáza > 18 AA AG-leader

Oligo 18-3: 5'-GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3' aa AG-leader < > maturovaná fytáza

Oligo 4: 5'-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3' (specifická sekvence pro fytázu, lokalizovaná na BamHI místě na pozici 861)

PCR byla provedena, jak popsali Saiki a další (1988), Science 239, 487-491, s menšími modifikacemi (viz obr. 8).

Za účelem fúze AG sekvencí se sekvencemi, kódujícími fytázu, byly provedeny dvě oddělené PCR reakce. První reakce byla provedena spAB6-l, jako templátem, a oligo 1 a 18-2, jako primery, a vedla k rozšíření 300 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahoval 3'- oblast AG promotoru a 18aa AG vedoucí sekvenci, která byla připojena na 3'-konci pomocí nukleotidů

-24CZ 289014 B6 fytázového genu ke genu pro fytázu. Druhá reakce byla provedena s pAF 2-2S, jako templátem, a oligo 18-3 a 4, jako primery, a vedla k rozšíření 600 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahoval 5'- oblast genu pro fytázu, připojenou na 5'-konci pomocí 18 nukleotidů AG signálního peptidu. Schematické znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 13.

Tyto dva vytvořené fragmenty DNA byly vyčištěny gelovou elektroforézou a ethanolovým srážením. Potom byly použity jako templáty při třetí PCR reakci s oligo 1 a 4 jako primery. Reakce vedla k fúzi AG-fytáza. Získaný fragment DNA byl rozštěpen pomocí EcoRI a BamHI. Dále byl klonován jako součást pTZ18R. Výsledek fuze byl sekvenován a byl sestaven P18FYT1.

Zbývající (3,5 kb) oblast AG-promotoru, směrem proti přepisu, byla získána štěpením pAB6-l pomocí Kpn 1 a částečně také EcoRI. Po štěpení následovalo připojení ligací k 1,1 kb EcoRI/Bam HI fragmentu pl8FYT 1 a dále klonování na Kpn 1/Bam HI místech pTZ18R. Takto získaný plazmid 18FYT2 ukazuje obr. 15.

Přídavné HindlII restrikční místo bylo vytvořeno inzercí syntetického fragmentu:

5' AATTCAAGCTTG 3'

3' GTTCGAACTTAA 5' do EcoRI místa (připojení genu amd S) pAF 2-2S. Získaný plazmid byl pojmenován jako pAF 2-2SH (obr. 14). Používá se jako počáteční plazmid pro výměnu sekvencí promotoru pro fytázu pomocí fuze DNA fragmentů AG-fytáza při PCR reakci.

Pro získání konečné konstrukce byly pl8FYT2 a pAF 2-2 SH štěpeny KpnI a částečně také Bam HI. 4,6 kb DNA fragment pl8FYT2 a 11 kb DNA fragment pAF 2-2SH byly izolovány a čištěny gelovou elektroforézou. Dále byly podrobeny ligaci a přeneseny do E. coli. Odvozená kazeta pro expresi se nazývá pl 8FYT3 (obr. 15).

Konstrukce p24FYT3

Fúze AG-promotoru a 24 aa AG vedoucí sekvence se sekvencí, kódující zralou fytázu, byla provedena pomocí PCR rozšiřovací reakce způsobem, který je popsán výše pro konstrukci pl8FYT3. Výjimkou jsou však použité primery. Byly syntetizovány dva nové primery s těmito sekvencemi:

Oligo 24-2: 5'CGAGCCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT-3' maturovaná fytáza < > 24 AA AG-leader

Oligo 24-3: 5'-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3' aa AG-leader < > maturovaná fytáza

Byly provedeny dvě oddělené PCR reakce. První reakce byla provedena spAB 6-1, jako templátem, a oligo 1 a 24-2, jako primery, a vedla k rozšíření 318 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahuje 3'oblast promotoru a 24 aa AG vedoucí sekvenci, která je doplněna na dvouvlákno na 3'- konci pomocí 18 nukleotidů genu pro fytázu. Druhá reakce byla provedena s pAF 2-2S, jako templátem, a oligo 24-3 a 4, jako primery, a vedla k rozšíření fragmentu DNA, který obsahuje 5'oblast genu pro fytázu. Tato 5'oblast je na 5'konci doplněna na dvouvlákno pomocí 18 nukleotidů 24 aa AG leaderu. Schematické znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 15.

-25CZ 289014 B6

Konstrukce pFYT3

Fúze AG promotoru se sekvencí genu pro fytázu (včetně leaderu pro fytázu) byla také provedena pomocí FOR rozšiřovací reakce, jak je to popsáno výše pro konstrukci pl8FYT3. Výjimku tvoří použité primery. Byly vytvořeny dva přídavné primery s těmito sekvencemi:

Oligo fyt-2: 5'-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3' leader pro fytázu <—*- > AG-promotor

Oligo fyt-3: 5'-CATGATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3'

AG-promotor < > leader pro fytázu

Byly provedeny dvě oddělené PCR reakce. První reakce s pAB 6-1, jako templátem, a oligo 1 a fyt-2, jako primery, vedla k rozšíření 282 bp fragmentu DNA. Tento fragment obsahuje 3'oblast AG promotoru, která je na 3'konci doplněna na dvouvlákno pomocí 18 nukleotidů leaderu pro fytázu. Druhá reakce byla provedena s pAF 2-2S, jako templátem, a oligo fyt-3 a 4, jako primeiy, a vedla k rozšíření fragmentu DNA, který obsahoval 5'oblast genu pro fytázu (včetně leaderu pro fytázu). Tato 5'oblast byla na 5'konci doplněna na dvouvlákno pomocí 18 nukleotidů AG promotoru. Schematické znázornění těchto reakcí ukazuje obr. 13.

Pro konstrukci výsledné kazety pro expresi pFYT3 podél intermediálních plazmidů pFYTl apFYT2 byl použit stejný postup klonování jaký je popsaný pro pl8FYTl a pl8FYT2. Tak se odvodí i kazeta pro expresi pl8FYT3 (obr. 15).

Exprese genu pro fytázu za řízení AG promotoru v A. niger

Sekvence E. coli byly odstraněny z kazet pro expresi fytázy výše popsaným štěpením pomocí HindlII. Potom byl kmen A. niger CBS 513,88 (uložený 10. října, 1988) transformován 10 pg fragmentu DNA pomocí postupů, popsaných v příkladu 9. Jednotlivé transformanty z každé kazety pro expresi byly izolovány. Spory byly načárkovány na selektivní plotny s acetamidovým agarem. Spory každého transformantu byly sebrány z buněk, které rostly 3 dny při 37 °C na agarových plotnách s 0,4 % bramboro-dextrózovým médiem (Oxoid, England). Produkce fytázy byla testována ve třepaných baňkách za těchto růstových podmínek:

Přibližně 1 x 10⁸ spor bylo naočkováno do 100 ml inokulačního média, které obsahovalo (na litr): 1 g KH₂PO₄; 30 g maltózy; 5 g kvasničného extraktu; 10 g kaseinového hydrolyzátu; 0,5 g MgSO₄.7H₂O a 3 g Tween 80. pH bylo upraveno na 5,5.

Po 24 h růstu přes noc při 34 °C na rotační třepačce, byl 1 ml rostoucí kultury zaočkován do 100 ml kultivačního média, které obsahovalo (na litr): 2 g KH₂PO₄; 70 g maltodextrinu (Maldex MDO₃, Amylum); 12,5 kvasničného extraktu; 25 g kaseinového hydrolyzátu; 2 g K₂SO₄; 0,5 g MgSO₄.7H₂O; 0,03 g ZnCl₂; 0,02 g CaCl₂; 0,05 g MnSO₄.4 H₂O a FeSO₄. pH bylo upraveno na 5,6.

Mycelium bylo pěstováno alespoň 140 h. Produkce fytázy byla měřena způsobem, popsaným v příkladu 2. Výsledky produkce několika náhodných transformantů, získaných z každé kazety pro expresi, ukazuje tabulka 6.

-26CZ 289014 B6

Tabulka 6

Produkce fytázy několika kmenů A. niger CBS 513.88, které byly transformovány plazmidy, obsahujícími gen pro fytázu z A. ficuum řízený AG promotorem z A. niger a kombinovaný s různými vedoucími sekvencemi.

Kazeta pro expresi	Transformant č.	Aktivita fytázy (U/ml)
	pl8FYT3 240	82
P18FYT3	P18FYT3 242	84
(AG-promotor/	pl8FYT3 243	62
18 aa AG-leader)	P18FYT3 244	43
	P18FYT3 245	80
	P18FYT2 246	82
	P18FYT3 250	110
	p24FYT3 256	8
p24FYT3	p24FYT3 257	30
(AG-promotor/	P24FYT3 258	13
24 aa AG-leader)	P24FYT3 259	33
	P24FYT3 260	17
	P24FYT3 261	28
	p24FYT3 262	18
	p24FYT3 265	12
	pFYT3 205	50
pFYT3	pFYT3 282	280
(AG-promotor/	pFYT3 299	96
leader pro fytázu)	pFYT3 302	220
	pFYT3 303	175
	pFYT3 304	150
	pFYT3 305	150
	pFYT3 312	140

Tyto údaje jasně ukazují vysoké úrovně exprese fytázy v transformantech A. niger, které obsahují gen pro fytázu, řízený AG promotorem z A. niger. Dále tyto údaje ukazují, že nejvyšší produkce fytázy se získá s použitím pFYT3 vektoru pro expresi, který obsahuje vedoucí sekvenci pro fytázu. Podobné vektory pro expresi, obsahující gen pro fytázu, bez intronu, poskytují po transformaci do A. niger srovnatelné výsledky, pokud se týče úrovní exprese fytázy, jako pFYT3 transformanty A. niger.

Kromě toho byla provedena elektroforéza na IEF-PAGE gelu v pH rozmezí 4,5 až 6 se supematanty kultury transformantů pFYT3 č. 205 a č. 282. Na gel byly nastříknuty stejné objemy supematantů kultur rodičovského kmene A. niger a obou transformantů, které byly pěstovány za stejných podmínek. Po proběhnutí elektroforézy byly vzorky obarveny tak, jak je popsáno v příkladu 9. Rodičovský kmen A. niger produkuje velmi malé množství fytázy, které se nedá tímto pokusem stanovit. Kmen pFYT3 č. 205 produkuje přibližně 250 krát více fytázy, kmen pFYT3 č. 282 zhruba 1400 krát více fytázy (srovnej množství fytázy v tabulkách 4 a 5). Tento rozdíl je zřetelně vidět na obr. 11. Bylo také stanoveno několik izoforem enzymu fytázy (označeny hvězdičkou). Barvení obvyklým barvivém pro proteiny ukázalo, že intenzita fytázových proteinových pásů se výrazně zvýšila, přičemž se neobjevily žádné jiné hlavní proteinové pásy.

-27CZ 289014 B6

Příklad 11

Nadprodukce fytázy u A. ficuum a A. niger, pěstovaných v průmyslovém měřítku

A. A. ficuum

Kmen A. ficuum pAF 2-2S č. 4 a

A. ficuum NRRL3135 byly pěstovány za podmínek, udaných v příkladu 1. Transformant produkoval ve srovnání s kmenem divokého typu 50 krát více fytázy.

Tabulka 7

Nadprodukce fytázy u transformantu A. ficuum, který obsahoval znásobené geny pro fytázu. Buňky byly pěstovány za podmínek, popsaných v příkladu 1.

Hodiny po inokulaci	Aktivita fytázy	(U/ml fermentačního média A. ficuum pAF 2-2S č. 4
0	0	0
24	0	0
92	2	142
141	5	270

B. A. niger

Kmen A. niger pAF 2-2S 8, transformant kmene A niger CBS 513.88 a samotný rodičovský kmen A. niger byly pěstovány podle příkladu 1. Transformant produkoval zhruba 1000 krát více fytázy ve srovnání s původním rodičovským kmenem A. niger (tabulka 8).

Tabulka 8

Nadprodukce fytázy u transformantu A. niger (CBS 513.88), který obsahoval znásobené geny pro fytázu. Buňky rostly za podmínek, popsaných v příkladu 1.

Hodiny po inokulaci	Aktivita fytázy	(U/ml fermentačního A. niger pAF 2-2S č. 8
0	0	0
24	0	5
92	0,1	65
141	0,1	95

Příklad 12

Pro vytvoření vektoru pREPFYT3, s nímž se dosahuje současně exprese fytázy a náhrady AG genu, se rozštěpí pFYT3 pomocí KpnI. Získaný lineární KpnI fragment DNA se podrobí dvěma odděleným ligacím.

-28CZ 289014 B6

Ligace 1 s KpnI-HindlII adaptorem:

5'- CGGGGA -3'

3'- CATGGCCCCTTCGA-5'

KpnI HindlII

Ligace 2 s KpnI-HindlII* adaptorem, v němž HindlII restrikční místo není po ligaci obnoveno: 5'- CGGGGG -3'

3'- CTAGGCCCCCTCGA-5'

KpnI HindlII*

Dále je produkt ligace 1 částečně štěpen pomocí HindlII. Po odstranění fragmentu, který obsahuje amdS, pomocí gelové elektroforézy se zbývající fragment DNA recykluje pomocí ligace a transformuje se do E. coli. Získaný plazmid se nazývá pFYT3 amdS (viz obr. 16).

Produkt ligace 2 se také štěpí pomocí HindlII. Fragment DNA 4 kb HindlII/HindlII*, který obsahuje amdS gen, se izoluje gelovou elektroforézou. Dále se ligaci spojí s digestem pFYT3 amdS, štěpeným částečně pomocí HindlII. Nakonec se transformuje do E. coli. Tento plazmid, který obsahuje amdS gen na 3'konci genu pro fytázu, se nazývá pFYT3INT (viz obr. 17).

Cílem dalšího postupu je vytvořit přibližně 6 kb Sall/HindlII fragment DNA zpAB6-l, který obsahuje 3' flanking AG sekvenci. Proto je pFYT3INT částečně štěpen pomocí HindlII. Nejprve je však ligaci spojen s adaptorem:

5-AGCTAGGGG -3'

3'₌_____TCCCCCAGCT-5'

HindlII* Sáli (po této ligaci není HindlII* restrikční místo znovu obnoveno). Následuje ligace s Sall/HindlII fragmentem p AB6-1. Po transformaci do E. coli se získá žádaný plazmid pREPFYT3 (obr. 18), kteiý obsahuje 3'AG flanking sekvencí na správném místě.

Exprese fytázy v A. niger nahrazením AG genu

Před transformací A. niger pREPFYT3 se sekvence plazmidu z E. coli odstraní štěpením HindlII a gelovou elektroforézou. Kmen A. niger CBS 513.88 se transformuje 10 pg DNA fragmentem podle postupů z příkladu 9. Selekce a růst transformantů se provádí stejně jako v příkladu 9. Pouze menšina vybraných transformantů ztrácí AG aktivitu (přibližně 20 %). Byla provedena Southem analýza chromozomální DNA s AG negativními a fytáza pozitivními transformanty, aby se ověřilo, že AG gen je skutečně nahrazen genem pro fytázu.

Příklad 13

Konzervace genu pro fytázu v různých mikrobiálních druzích

Souhrn analýzy deseti různých druhů byly provedeny s cDNA pro fytázu z A. ficuum jako próbou, aby se zjistilo, jak je gen pro fytázu v různých mikrobiálních druzích konzervován.

Tyto analýzy chromozomální DNA byly provedeny u mikrobiálních druhů vláknitých hub, kvasinek a bakterií. Z každé skupiny byl vybrán pouze omezený počet zástupců jako příklad pro vláknité houby: Penicillium chrysogenum a Aspergillus niger; pro kvasinky: Saccharomycas ceravisiae a Kluyveromyces lactis; a pro prokaryotní organismy gram-pozitivní druhy, jako Bacillus subtilis, Clostridum thermocellum a Streptomyces lividans a gram-negativní bakterie, jako Pseudomonas aeruginosa.

-29CZ 289014 B6

Chromozomální DNA o vysoké molekulové hmotnosti z těchto druhů byla odděleně štěpena pomoci PvuII a BamHI. Dále byla podrobena elektroforéza na 0,7 % agarózovém gelu.

Po přenesení na nitrocelulózové filtry byla provedena hybridizace s 5'fytázovým cDNA fragmentu (popsaný v příkladu 8), který byl značený ³²P. Hybridizace byla prováděna 24 h za mírných podmínek (6x SSC, 50 °C). Bloty byly promyty v 6x SSC roztoku při laboratorní teplotě. Dále byly po 18 h vystaveny X-záření.

Jak ukazují obr. 19a a 19b, objevily se v téměř každém pruhu diskrétní pásy, které značí vysoký stupeň homologie genu pro fytázu mezi mikrobiálními druhy.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (22)

1. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, která katalyzuje uvolňování alespoň jednoho anorganického fosfátu z myoinositolfosfátu, zvolená ze souboru sestávajícího ze sekvence DNA, která kóduje polypeptid s fytázovou aktivitou, a je znázorněna na obr. 8 a sekvence DNA, která je schopna hybridizovat za podmínek nízké stringence, 6 x SSC, 50 °C přes noc, s próbou zahrnující nukleotidové polohy 1 až 818 z obr. 8.

2. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, která katalyzuje uvolňování alespoň jednoho anorganického fosfátu z myoinositolfosfátu podle nároku 1, kterou je sekvence DNA kódující polypeptid s fytázovou aktivitou, znázorněná na obr. 8.

3. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, která katalyzuje uvolňování alespoň jednoho anorganického fosfátu z myoinositolfosfátu podle nároku 1, kterou je sekvence DNA, jež je schopna hybridizovat za podmínek nízké stringence, 6 x SSC, 50 °C přes noc, s próbou zahrnující nukleotidové polohy 1 až 818 z obr. 8.

4. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 2, odvozená ze zdroje z rodu Aspergillus.

5. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 3, odvozená ze zdroje zrodu Aspergillus.

6. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 4, odvozená ze zdroje Aspergillus ficuum nebo Aspergillus niger.

7. Vyčištěná a izolovaná sekvence DNA podle nároku 5, odvozená ze zdroje Aspergillus ficuum nebo Aspergillus niger.

8. Konstrukt pro expresi zahrnující sekvenci DNA podle některého z nároků 2, 4 a 6 operabilně spojenou s regulační oblastí schopnou řídit expresi fytázy ve vhodném hostiteli pro expresi, v němž je regulační oblast odvozena od genu zvoleného ze souboru zahrnujícího geny kódující glukoamylázu, fytázu, amylázu, kyselou fosfatázu a GAPDH.

9. Konstrukt pro expresi zahrnující sekvenci DNA podle některého z nároků 3, 5 a 7 operabilně spojenou s regulační oblastí schopnou řídit expresi fytázy ve vhodném hostiteli pro expresi, v němž je regulační oblast odvozena od genu zvoleného ze souboru zahrnujícího geny kódující glukoamylázu, fytázu, amylázu, kyselou fosfatázu a GAPDH.

-30CZ 289014 B6

10. Konstrukt pro expresi podle nároku 8, v němž sekvence DNA také obsahuje sekvenci DNA kódující vedoucí sekvenci sekrece zajišťující sekreci fytázy, přičemž posledně uvedená sekvence DNA je zvolena ze souboru zahrnujícího homologní fytázovou vedoucí sekvenci a sekvence DNA kódující 18-aminokyselinovou a 24-aminokyselinovou vedoucí sekvenci glukoamylázy.

11. Konstrukt pro expresi podle nároku 9, v němž sekvence DNA také obsahuje sekvenci DNA kódující vedoucí sekvenci sekrece zajišťující sekreci fytázy, přičemž posledně uvedená sekvence DNA je zvolena ze souboru zahrnujícího homologní fytázovou vedoucí sekvenci a sekvence DNA kódující 18-aminokyselinovou a 24-aminokyselinovou vedoucí sekvenci glukoamylázy.

12. Vektor pAF 28-1 obsahující vyčištěnou a izolovanou sekvenci DNA odvozenou ze zdroje Aspergillus ficuum, podle nároku 7, který je definován restrikční mapou znázorněnou na obr. 4 a který je schopen transformovat hostitelskou buňku.

13. Vektor schopný transformovat hostitelskou buňku, přičemž tento vektor obsahuje konstrukt pro expresi podle nároku 8 nebo 10 a je zvolen ze souboru zahrnujícího vektor pAF 2-2S definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 9, vektory pl8FYT3, p24FYT3 a pFYT3, z nichž každý je definován restrikční mapou znázorněnou na obr. 15c, vektor pFYT3INT definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 17 a vektor pREPFYT3 definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 18.

14. Vektor schopný transformovat hostitelskou buňku, přičemž tento vektor obsahuje konstrukt pro expresi podle nároku 9 nebo 11 a je zvolen ze souboru zahrnujícího vektor pAF 2-2S definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 9, vektory pl8FYT3, p24FYT3 a pFYT3, z nichž každý je definován restrikční mapou znázorněnou na obr. 15c, vektor pFYT3INT definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 17 a vektor pREPFYT3 definovaný restrikční mapou znázorněnou na obr. 18.

15. Hostitelská buňka, zejména zvolená ze skupiny bakterií, kvasinek a hub, zvláště pak ze skupiny rodů Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces a Saccharomyces a s výhodou ze skupiny kmenů Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis a Bacillus licheniformis, která je transformována vektorem podle některého z nároků 12 až 14 nebo konstruktem pro expresi podle některého z nároků 8 nebo 10 nebo 9 nebo 11.

16. Hostitelská buňka podle nároku 15, která je transformována vektorem podle nároku 14.

17. Hostitelská buňka podle nároku 15 zvolená ze souboru zahrnujícího Aspergillus ficuum NRRL 3135, Aspergillus niger CBS 513.88 a Aspergillus niger ATCC 9092, která je transformována konstruktem pro expresi podle nároku 8 nebo 10 nebo vektorem podle nároku 12.

18. Hostitelská buňka podle nároku 15 zvolená ze souboru zahrnujícího Aspergillus ficuum NRRL 3135, Aspergillus niger CBS 513.88 a Aspergillus niger ATCC 9092, která je transformována konstruktem pro expresi podle nároku 8 nebo 10 nebo vektorem podle nároku 13.

19. Hostitelská buňka podle nároku 15 zvolená ze souboru zahrnujícího Aspergillus ficuum NRRL 3135, Aspergillus niger CBS 513.88 a Aspergillus niger ATCC 9092, která je transformována konstruktem pro expresi podle nároku 9 nebo 11 nebo vektorem podle nároku 12.

20. Hostitelská buňka podle nároku 15 zvolená ze souboru zahrnujícího Aspergillus ficuum NRRL 3135, Aspergillus niger CBS 513.88 a Aspergillus niger ATCC 9092, která je transformována konstruktem pro expresi podle nároku 9 nebo 11 nebo vektorem podle nároku 13.

-31 CZ 289014 B6

21. Způsob produkce fytázy, vyznačující se tím, že se transformovaná hostitelská buňka podle některého z nároků 15 až 20 pěstuje za podmínek vedoucích k produkci fytázy.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že se použije transformované 5 hostitelské buňky podle nároku 16.