HU215179B - Eljárás gomba eredetű fitázaktivitással rendelkező polipeptidek rekombináns úton történő előállítására és felhasználására - Google Patents

Abstract

A találmány gőmba eredetű fitázők termelésére vőnatkőzik. A fitáztkódőló DNS-szekvencia izőlálására és klónőzására speciálisőligőnűkleőtidőkat szintetizáltak. Ezeket a DNS-szekvenciákat elnyösen az Aspergillűs nemzetséghez tartőzó főnalas gőmbákbólizőlálták. A találmány tárgya tővábbá megfelelő vektőrők, gazdasejtekés expressziós kazetták előállítása, valamint a rekőmbináns fitáz álati takarmányők adalékaként való felhasználása. ŕ

Description

A találmány gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvencia, azt tartalmazó expressziós szerkezet és vektor, ezzel transzformált gazdasejtek, valamint a fitáz-aktivitású polipeptid előállítására és felhasználására vonatkozik. Közelebbről a találmány a fitáz mikrobiális előállítására vonatkozik.

Minden szervezet növekedésének egyik lényeges eleme a foszfor. A haszonállat-termelésben szükséges takarmányt szervetlen foszforral kell kiegészíteni, hogy egy-gyomrú állatoknál, például sertésnél, baromfinál és halnál jó növekedési teljesítményt kapjunk.

Ezzel szemben a kérődző állatok takarmányához nem szükséges hozzáadni szervetlen foszfort. A bendőben lévő mikroorganizmusok olyan enzimeket termelnek, amelyek a fitátok (mio-inozithexakisz-foszfát) inozittá és szervetlen foszfáttá való átalakítását katalizálják.

A fitát gyakorlatilag minden növényi eredetű takarmányban mint raktározott foszfor-alapanyag fordul elő [lásd a következő összefoglalást: Phytic acid, chemistry and applications; szerk.: E. Gráf, kiadó: Pilátus Press, Minneapolis, MN., USA (1986)]. A diófélék, gabonafélék, hüvelyesek, olajos magvak, növényi csírák és pollének 1-3% fitátot tartalmaznak. A fitinsav komplex sóit fitineknek nevezik. A fitinsavat anti-tápanyagfaktomak tekintik, minthogy ásványokkal, így kalciummal, cinkkel, magnéziummal, vassal kelátokat képez. Proteinekkel ugyancsak reagálhat, miáltal csökkenti a protein és a táplálék szempontjából fontos ásványok biológiai felhasználhatóságát.

A fitát-foszfor átmegy az egy-gyomrú állatok gyomor-bél csatornáján, és a bélsárral ürül ki. Bár a fitát bizonyos fokú hidrolízise végbemegy a vastagbélben, az így felszabaduló szervetlen foszfornak nincs tápértéke, mivel a szervetlen foszfort csak a vékonybél abszorbeálja. Ennek következtében a táplálék szempontjából fontos foszfor jelentős mennyiségét nem hasznosítják az egy-gyomrú állatok, annak ellenére, hogy benne van a takarmányban.

A fitát-foszfor kiürülésének további következményei vannak. Az utóbbi évtizedekben rendkívüli módon megnövekedett az intenzív élőállat-termelés. Ennek következtében a termelt trágya mennyisége ennek megfelelően nőtt, és környezeti problémákat okozott a világ különböző részein. Ez részben annak tudható be, hogy a trágya eredetű foszfor feldúsult a felületi vizekben, s ez eutrofizálódáshoz vezetett.

A mikroorganizmusok által termelt enzimek, amelyek a fitát inozittá és szervetlen foszforrá való konverzióját katalizálják, mint fitázok, széles körben ismertek. A fitáz-termelő mikroorganizmusok közt vannak baktériumok, mint a Bacillus subtilis [V. K. Paver és V. J. Jagannathan, J. Bacteriol., 151, 1102-1108 (1982)] és a Pseudomonas [D. J. Cosgrove, Austral. J. Bioi. Sci., 23, 1207-1220 (1970)]; élesztők, mint a Saccharomyces cerevisiae [N. R. Nayini és P. Markakis, Lebensmittel Wissenschaft und Technologie, 17, 24—26 (1984)]; és gombák, mint az Aspergillus terreus [K. Yamada, Y. Minoda és S. Yamamoto, Agric. Bioi. Chem., 32, 1275-1282 (1986)]. Ismeretes, hogy más különböző

Aspergillus fajok is termelnek fitázt, s megállapították, hogy ezek közül az Aspergillus ficuum által termelt fitáz specifikus aktivitása a legmagasabb szintű, és hogy hőstabilitása jobb, mint a többi mikroorganizmus által termelt fitázoké.

Azt a felfogást, hogy az egy-gyomrú állatok takarmányához mikrobiális fitázt kell adni, előzőleg már közölték [J. H. Ware, L. Bluff, T. R. Shieh, 3,297,548 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; T. S. Nelson, T. R. Shieh, R. J. Wodzinski és J. H. Ware, J. Nutrition, 101, 1289-1296 (1971)]. Ma azonban ennek a felfogásnak az alkalmazása a mikrobiális enzimek magas termelési költségei miatt kereskedelmi szempontból keresztülvihetetlen [Y. W. Han, Animal Feed Sci., and Technoi., 24, 345-350 (1989)]. Gazdasági okokból még mindig szervetlen foszfort adnak az egygyomrú állatok takarmányához.

A mikrobiális fitázokat más ipari célra is felhasználják. Erre példa egy olyan ipari eljárásban való felhasználás, amelyben gabonaneműekből, így kukoricából és búzából keményítőt állítanak elő. Ezen nedves őrlő eljárás melléktermékeit, amelyek például kukoricaglutén tápanyagokat tartalmaznak, állati takarmányként árusítják. Az áztatási eljárás folyamán a fitázt ki lehet egészíteni. A feltételek (körülbelül 50 °C hőmérséklet és pH = 5,5) ideálisak a gomba eredetű fitázok számára (lásd például az Alko Ltd. 0 321004 számú európai szabadalmi bejelentését). Előnyös, hogy ezen eljárás melléktermékeiből származó takarmányok fitát helyett foszfátot tartalmaznak.

Kidolgozták annak lehetőségét is, hogy fitázokat használjanak a szója feldolgozásánál [lásd az Alko-féle Finase™ enzimeket; Alko Ltd. (Rajamaki, Finnország) által kiadott termékismertető], A szójaliszt nagy mennyiségű anti-tápanyagfaktor fitátot tartalmaz, amely ezt a proteinforrást alkalmatlanná teszi bébiételben való felhasználásra, továbbá halak, valamint borjak és más, nem kérődzők etetésére. Ennek az értékes proteinforrásnak enzimatikus úton való feljavítása megnöveli az anyag tápértékét és kereskedelmi értékét.

Más kutatók a különböző fitázok jobb jellemzésével és e fitázok termelési és felhasználási eljárásainak a javításával foglalkoztak. Ullah eljárást közölt fitáz tisztítására vad típusú Aspergillus ficuumból, és meghatározta a tisztítási eljárással kapott termék több biokémiai paraméterét [A. Ullah, Preparative Biochem., 18, 443-458 (1988a)]. Ullah idevonatkozó adatait alább, az 1. táblázatban közöljük.

Az A. ficuum fitáz protein N-terminusának aminosav-szekvenciájáról Ullah kétszer számolt be: A. Ullah, IX. Enzyme and Engineering konferencia (1987, Santa Barbara, CA) poszter és A. Ullah, Prep. Biochem., 18, 459-471 (1988b). Az Ullah-féle aminosavszekvencia-adatokat alább, az 1A ábra - E szekvencia - tartalmazza.

Ullah közleményeiből számos érdekes megfigyelés olvasható ki. Először is, az Ullah-féle (1988a és 1988b) „tisztított” készítmény SDS-PAGE szerint két proteinsávot tartalmaz. Mi azonban azt találtuk, hogy az A. ficuumból tisztított fitáz egy szennyező anyagot tartal2

HU215 179 Β máz, és hogy az SDS-PAGE egyik sávja, amelyet Ullah mint fitázt azonosított, ebből a szennyező anyagból származott.

Ez a különbség az Ullah által közölt aminosavszekvencia-adatokból is kitűnik (1987, 1988b; vesd össze az IA ábrában az A és B szekvenciát a C szekvenciával). Meghatároztuk egyébként, hogy az Ullah által leírt fitáz belső peptidjeinek egyik aminosavszekvenciája (lásd az IB ábrát, E szekvencia) valójában a szennyező 100 kD proteinhez (IC ábra) tartozik, amely az Ullah által leírt eljárás szerint kapott készítményben van jelen, és amely mint a két sáv egyike látható SDS-PAGE rendszerben (Ullah, 1988a és 1988b). Ullah nem ismeri el egy ilyen szennyező protein jelenlétét és ezt a fitáz egy más formájának tekinti. Egy ilyen szennyezés jelenléte viszont növeli a nehézségét a fitáz aktivitást kódoló tényleges nukleotidszekvencia szelektálásának és izolálásának. A szennyezés jelenléte ezenkívül csökkenti a vizsgált protein specifikus aktivitásának az értékét.

Továbbá az Ullah által közölt szekvenciát tekintve, meg kell jegyezni, hogy a 12-es pozícióban lévő aminosav-csoport Ullah közlése szerint glicin. Protein- és DNS-szekvenáló technikákkal mi következetesen azt találtuk, hogy ez a csoport nem glicin, hanem cisztein (lásd a 6. és a 8. ábrát).

Ullah végül kimondja, hogy a fitáz egy 85 kD protein, amelynek a molekulatömege deglükozilálás után 61,7 kD (Ullah, 1988b). Ez egy sokkal alacsonyabb szám, mint a korábban közölt 76 kD protein esetében. [A. Ullah és D. Gibson, Prep. Biochem., 17 (1), 63-91 (1988)], amelyet a hidrolízissel felszabadított szénhidrátok relatív mennyiségére és a natív proteinnek SDS-PAGE módszerrel meghatározott molekulatömegére alapoztak. Mi azt találtuk ezzel szemben, hogy a glükozilált fitáznak egyetlen valódi molekulatömege van, 85 kD, míg a deglükozilált protein valódi molekulatömege a deglükoziláció fokától függően 48-56,5 kD tartományban van.

Mullaney és munkatársai (Filamentous Fungi Conference, Pacific Grove, Califomia, USA, 1987. április; poszter) ugyancsak ismertették az A. ficuum eredetű fitáz jellemzését. Azonban előadásukban szintén két proteinsávról tettek említést. A „tisztított” proteinkészítmény SDS-PAGE vizsgálattal egy 85 kD-os és egy 100 kD-os sávot tartalmazott. A szerzők mindkét proteinsávot fitáz formákként azonosították. Javasoltak egy módszert mikrobiális gazdasejtek transzformálására, de ezt nem közölték.

Az EP-A-287 152 számú közrebocsátási iratban javasolják ugyan egy bakteriális fitáz gén klónozását, de kitanítást nem adnak a megvalósításra vonatkozóan. A fitázt kódoló DNS-szekvencia klónozását és izolálását eddig még nem írták le.

Egy fitáz termelésére szolgáló gazdaságos eljárás többek között az állati takarmányipar számára jelentős hasznot jelent. A gazdaságosabb fitáztermelő eljárás rekombináns DNS-technikák felhasználásával valósítható meg. Ezekkel a technikákkal különböző olyan mikroorganizmusokban, amelyek köztudottan a peptidek vagy proteinek nagy mennyiségeit termelik, az enzim expressziós szintjét meg lehet növelni. Fitázaktivitást kódoló DNS-szekvencia izolálásáról és klónozásáról azonban eddig nem jelent meg közlemény.

A jelen találmány fitázt kódoló tisztított és izolált DNS-szekvenciára vonatkozik. E fitázt kódoló DNSszekvencia izolálását és klónozását úgy végezzük, hogy specifikus oligonukleotid szondákat használunk, amelyeket speciálisan ezen találmány számára fejlesztettünk ki. A fitázokat kódoló előnyös DNS -szekvenciák gombákból, főként Aspergillus nembéli fonalas gombákból izolálhatok.

A találmány másik tárgya egy olyan expressziós szerkezetet tartalmazó vektor előállítása, amely legalább egy fitázt kódoló, előnyösen homológ DNS-szekvencia legalább egy másolatát tartalmazza, ez funkcionálisan kapcsolódik egy megfelelő szabályozó szakaszhoz, amely fitázaktivitást kifejtő peptidek és proteinek magas szintű kifejezésének irányítására képes alkalmas expressziós gazdasejtben.

A találmány szerint előállított expressziós szerkezetet be lehet építeni olyan vektorba, főként plazmidba, amely mikrobiális gazdasejt transzformálására és genomjába való integrálódásra képes. E találmány további tárgya egy olyan transzformált sejt előállítása, előnyösen egy gazdasejté, amelyet az előző bekezdésben leírt egy vektorral transzformáltunk. A találmány szerint transzformált gazdasejtek a következők lehetnek: Aspergillus, Trichoderma, Mucor és Penicillium nemhez tartozó fonalas gombák, Kluyveromyces és Saccharomyces nembéli élesztők vagy a Bacillus nemhez tartozó baktériumok. Különösen előnyös expressziós gazdasejtek az Aspergillus nemhez tartozó fonalas gombák. A transzformált gazdasejtek a rekombináns fitáz nagy mennyiségben való termelésére képesek gazdaságosan és ipari méretekben.

A találmány továbbá fitázaktivitást kifejtő rekombináns peptidek és proteinek glükozilált és nem glükozilált formáival foglalkozik; továbbá tárgya egy eljárás az említett nem glükozilált peptidek és proteinek termelésére; egyéb olyan fitázaktivitású peptidek és proteinek előállítására, amelyek mentesek szennyeződésektől; és az ezen rekombináns vagy tisztított proteinekkel reagáló monoklonális antitestek előállítására.

Az Ullah szerinti tisztított vad típusú A. ficuum fitáz és a jelen találmány szerint kapott továbbtisztított vad típusú A. ficuum fitáz biokémiai paramétereinek az összehasonlítását alább, az 1. táblázat tartalmazza. Különös figyelmet érdemelnek a specifikusaktivitás-adatok, amelyek megmutatják, hogy a miáltalunk előállított tisztított protein specifikus aktivitása az Ullah által közöltnek kétszerese.

A találmány tárgyát képezi továbbá a fitázaktivitást kifejtő proteineket kódoló nukleotid-szekvenciák előállítása. Ezeket a szekvenciákat olyan oligonukleotid szondák megszerkesztésére használhatjuk, amelyeket ezután hibridizációs szűrővizsgálatokban alkalmazhatunk, más fajok, főként mikrobiális fajok fitáz génjeinek az azonosítására, amelyeket ezt követően izolálhatunk és klónozhatunk.

HU 215 179 Β

A jelen találmány szerinti szekvenciákat felhasználhatjuk kiindulási anyagokként „második generációs” fitázok megszerkesztéséhez. A „második generációs” fitázok olyan fitázok, amelyeket mutagenizáló technikákkal (például helyre irányuló mutagenezissel) módosítottunk, és tulajdonságaik a vad típusú fitázokétól vagy a jelen találmány szerint előállított rekombináns fitázokétól különböznek. A hőmérséklet- vagy pH-optimumot, a specifikus aktivitást vagy a szubsztrátum affinitást például úgy módosíthatjuk, hogy jobban megfeleljenek egy meghatározott eljárásban való alkalmazáshoz.

A találmány szerinti értelmezésben a fitáz kifejezés egy enzimcsaládot ölel fel. Ezek az enzimek a különböző mio-inozitfoszfátokból a szervetlen foszfor eltávolítására irányuló reakciókat katalizálják.

A fitázaktivitás számos vizsgálómódszerrel mérhető, ezek megválasztása nem lényeges a találmány szempontjából. Példaként említjük, hogy a fitázaktivitást úgy határozzuk meg, hogy mérjük az enzim azon mennyiségét, amely 1,5 mM nátrium-fitátból 37 °C-on, pH = 5,50 mellett 1 pmól/perc sebességgel szervetlen foszfátot szabadít fel.

Meg kell jegyezzük, hogy a „fitáz” kifejezést, ahogyan ebben a leírásban mindenhol szerepel, minden fitázaktivitást kifejtő polipeptidre és proteinre vonatkoztatjuk. Ezt a szempontot szemlélteti az 1A ábra, amelyben összehasonlítjuk az A és a B szekvenciát (ezeket a szekvenciákat állítottuk elő e munka folyamán) a C szekvenciával (Ullah közlése, 1988b). Az ábra bemutatja, hogy a találmány szerint olyan proteinek állíthatók elő, amelyekből hiányzik az érett A. ficuum fitázprotein első négy aminosava (az A szekvenciájú proteinből az első hét aminosav hiányzik). Ezek a proteinek azonban megtartották fitázaktivitásukat. A fitázprotein teljes aminosav-szekvenciája, ahogyan azt a megfelelő nukleotidszekvenciából levezettük, a 8. ábrán látható.

A találmány szerint előállított fitáz különböző olyan eljárásokban alkalmazható, amelyekben szükség van a fitátnak inozittá és szervetlen foszfáttá való átalakulására.

A fitázok jelen találmány szerinti termelésénél csökkennek a mikrobiális fitázok termelési költségei, s ez elősegíti a fitázok gazdaságos alkalmazását az állati takarmányokban, tehát végső fokon egy olyan in vivő ár/teljesítmény arányhoz vezet, amely versenyképes a szervetlen foszfátéval. Ennek további haszna az, hogy a trágya foszfortartalma jelentősen csökken.

Előnyt jelent, hogy a szervetlen foszfáttal versenyképes áron kapható fitázok alkalmaza a jó minőségű takarmánytermelésben növelni fogja a takarmányalapanyag-iparban a szabadságfokot. Például ha a tápot fitázzal egészítik ki, el lehet hagyni a szervetlen foszfáttal való kiegészítést, és így a takarmányban a fitátot tartalmazó különböző anyagok mennyisége növelhető.

A találmány szerint előállított fitázt az állati takarmányban és a szójafeldolgozásban való fentiekben tárgyalt felhasználáson kívül fel lehet használni még többféle ipari eljárásban, ilyenek például a következők:

- folyékony táp előállítása sertés és baromfi számára. Általános gyakorlattá vált a takarmány beáztatása az etetés előtt néhány órával. Ezalatt az enzim átalakíthatja a fitátot inozittá és szervetlen foszfáttá;

- ipari eljárást inozit vagy inozit-foszfát termelésére fitátból;

- egyéb ipari eljárások, amelyek fitátot használnak szubsztrátumként, ilyen a keményítőipar. Fitát alkalmazható a fermentációs iparban, például a söriparban. A fémionok és a fitát közötti kelátképződés hozzáférhetetlenné teszi ezeket az ásványokat a mikroorganizmusok számára a tenyészetekben. A fitátok enzimatikus hidrolízise elhárítja ezeket a problémákat.

A találmány fentiekben említett és több más tárgyát, valamint előnyeit az alábbi részletes leírásban adjuk közre.

Az ábrák rövid leírása

1A ábra. Tisztított fitázoknál meghatározott aminosavszekvenciák. Az A és a B jelű aminosav-szekvenciák a jelen találmány szerinti szekvenciák és a fitáz alformáiból származnak, 5,2, illetve 5,4 izoelektromos ponttal. A C szekvencia egy Ullahtól idézett szekvencia (1987,1988b, lásd fentebb). A jelen találmány meghatározása szerint az A és a B szekvencia 12-es pozíciójában elhelyezkedő aminosavcsoport nem glicincsoport (* jelentése: egyértelmű azonosítás; ** jelentése: nincs észlelhető csoport).

IB ábra. Brómciánnal hasított belső fitáz-fragamentumok N-terminális aminosav-szekvenciái. Az A és a B jelű aminosav-szekvenciák (e peptidek feltehető molekulatömege 2,5 kD, illetve 36 kD) a jelen találmány szerinti szekvenciák. A C-től E-ig terjedő szekvenciákat Ullahtól (1988b, lásd fentebb) idéztük.

IC ábra. Egy 100 kD protein N-terminális aminosavszekvenciája. Azt találtuk, hogy ezt a proteint a találmány szerinti nyers fitázminták tartalmazzák.

2Aábra. Az 1A ábra adatai (A-C peptidek) alapján szerkesztett oligonukleotid szondák.

2B ábra. Az IB ábra adatai (A és B peptidek) alapján szerkesztett oligonukleotid szondák.

3. ábra. A savanyú foszfatázt kódoló gén izolálásához használt oligonukleotid szondák.

4. ábra. Az A. ficuum fitáz lokuszát tartalmazó lambda AF201 bakteriofág restrikciós térképe. A nyíl a fitázgén pozícióját és a transzkripció irányát jelzi. A klón jel azokat a szubklónokat mutatja, amelyek a megjelölt restrikciós enzimek segítségével a pAN 8-1ben lévő (pAF 28-1 klón) és a pUC 19-ben lévő (az összes többi klón) AF201 fágból származtak.

5. ábra. Ezen az ábrán a pAF 1-1 fizikai térképét tüntettük fel. A pUC19-be beépített 10 kB

BamHI fragmentum tartalmazza az A. ficuum eredetű savanyú foszfatázt kódoló teljes gént.

HU 215 179 Β

6. ábra. A pAF 2-3, pAF 2-6 és pAF 2-7 plazmid nukleotid szekvenciáinak összeszerkesztése. A szekvencia a kromoszomális fitázgén lokuszt tartalmazza. A fitázt kódoló szakasz a 210. nukleotid pozíciótól a 1713. pozícióig terjed; a kromoszomális gén egy intront tartalmaz a 254. nukleotid pozíciótól a 355. pozícióig; megjelöltük a jelentős jellemzőket, ilyenek a restrikciós helyek, a fitáz start és stop kodonja és az intron helyzete.

7. ábra. A szekvenált kromoszomális fitázlokusz részletes fizikai térképe; a nyilak a fitáz kódoló szakaszában lévő két exont jelzik.

8. ábra. A fitáz cDNS-ffagmentum transzlatált szakaszának a nukleotid szekvenciája és a fitázprotein innen származtatott aminosav-szekvenciája; az érett fitázprotein kezdetét (start) a +1 pozíció jelzi. A 36 kD belső proteinfragmentum amino-terminusza a 241-es aminosav-pozícióban helyezkedik el, míg a 2,5 kD protein-fragmentum a 390. aminosavpozíciónál kezdődik.

9. ábra. A pAF 2-2S fitáz expressziós kazetta fizikai térképe. A nyilak a gének transzkripciójának irányát jelzik.

10. ábra. A fitáz kifejeződés IEF-PAGE bizonyítása egy A. ficuum NRRL 3135 transzformált sejtben. Azonos körülmények között tenyésztett

A. ficuum (1-es sáv) és a pAF 2-2S SP7 transzformált sejt tenyészeteinek felülúszójából azonos mennyiségeket analizáltunk Phast-rendszerben (Pharmacia) IEF-PAGE gélben 4,5-6 pH tartományban. Összehasonlításul egy homogenitásig tisztított A. ficuum fitáz mintát is felvittünk külön is (4-es sáv) és egy tenyészetfelülúszóhoz keverve is (3-as sáv). A géleket foszfatázfestési technikával leírását a szöveg tartalmazza (A) - vagy egy általános proteinfestési eljárással - Coomassie briliáns kék (B) - festettük meg. A fitázsávokat csillaggal jelöltük.

11. ábra. A fitáz kifejeződés IEF-PAGE bizonyítása egy A. niger CBS 513.88 transzformált sejtben. Az eredeti A. niger törzs tenyészetének (1-es sáv), a pAF 2-2S#8 (2-es sáv), pFYT3 #205 (3-as sáv) és #282 (4-es sáv) transzformált sejtek tenyészetének felülúszóiból azonos mennyiségeket analizáltunk IEF-PAGE segítségével, ahogyan ezt a 10. ábra magyarázatánál leírtuk. A géleket vagy általános foszfatázaktivitás-festéssel (A) vagy általános protein festési technikával (B) festettük meg. A fitázsávokat csillaggal jelöltük.

12. ábra. A pA 6-1 fizikai térképe. A pUC19-ben lévő

14,5 kb HindlII DNS inszertum az A. niger eredetű teljes glükoamiláz (AG) lokuszt tartalmazza.

13. ábra. AG promoter/fítáz génfuzionálás polimeráz láncreakcióval (PCR = polymerase chain reaction). A reakció sematikus ábrázolása.

A használt oligonukleotid primerek szekvenciáját a szövegben ismertetjük.

14. ábra. A pAF 2-2SH fitáz expressziós kazetta fizikai térképe.

15. ábra. A pXXFYTl, pXXFYT2 köztes szerkezetek és a pXXFYT3 fitáz expressziós kazetta fizikai térképe, amelyekben az XX a vezérszekvenciát (L = leader) jelzi. A pl8FYT#, illetve p24FYT# plazmidban a 18 aminosav tartalmú, illetve a 24 aminosav tartalmú AG vezérszekvencia van beépítve, míg a pFYT#ben a fitáz vezérszekvenciát használjuk.

16. ábra. A pFYT3AamdS plazmid fizikai térképe.

17. ábra. A pFYT3INT plazmid fizikai térképe.

18. ábra. A fitáz/AG-t helyettesítő pREPFYT3 vektor fizikai térképe.

19. ábra. PvuII-vei (A) és BamHI-gyel (B) emésztett

32p-vel jelzett A. ficuum fitáz cDNS-sel hibridizált kromoszomális DNS-ének autoradiográfiás képe. Az említett DNS-t a következő mikrobiális fajoknál mint szondát használtuk: S. cerevisiae (2-es sáv): B. Subtilis (3-as sáv): K. lactis (4-es sáv): P. crysogenum (5-ös sáv): P. aeruginosa (6-os sáv): S. lividans (7-es sáv): A. niger 1 pg (8-as sáv): A. niger 5pg (9-es sáv): vak (10-es sáv): C. thermocellum (11-es sáv): 1-es sáv: marker DNS.

A mikroorganizmusok által termelt különleges proteineket kódoló gének klónozását különböző eljárásokkal végezhetjük el. Az egyik eljárás szerint a kívánt proteint tisztítjuk, ezután meghatározzuk N-terminális aminosav-szekvenciáját, majd a szóban forgó mikroorganizmus genomtárát az említett N-terminális aminosav szekvencián alapuló DNS-oligonukleotid szonda használatával szűrjük. Ezen eljárás eredményes alkalmazását illetően a következő példákat említjük: az izopenicillin N-szintetáz klónozása Cephalosporium acremoniumból [S. M. Sámson és munkatársai, Natúré, 318, 191-194 (1985)] és az Aspergillus oryzae TAKA amilázt kódoló gén izolálása [Boel és munkatársai, EP-A-0238023 számú európai szabadalmi bejelentés (1986)].

Ennek az eljárásnak az alkalmazásával kíséreltük meg a fitázt kódoló Aspergillus ficuum gén izolálását. A proteint nagymértékben tisztítottuk és számos biokémiai paraméterét meghatároztuk. A kapott adatokat összehasonlítottuk az Ullah által közölt (1988a) adatokkal. A két adatcsoportot alább, az 1. táblázat tartalmazza.

1. táblázat

A tisztított vad típusú A. ficuum fitáz biokémiai paraméterei

Paraméterek	Jelen találmány	Ullah
Specifikus aktivitás*	100 E/mg protein	50 E/mg protein
Tisztaság:
SDS-PAGE	85 kD	85/100 kD
IEF-PAGE	3 vagy 4 sáv	nincs adat

HU 215 179 Β

Paraméterek	Jelen találmány	Ullah
Km (affinitás konstans)	250 μΜ	40 μΜ
Specificitás:
inozit-l-P esetén	nem aktív	nem aktív
inozit-2-Ρ esetén	Km= 3,3 mM	5% aktivitás
pH-optimum	2,5 és 5,5	2,5 és 5,5
Hőmérséklet-optimum (°C)	50	58
Molekulatömeg (kD)**	85	85 és 100
Molekulatömeg
(nem glükozilált)**	56,5	61,7
Izoelektromos pont***	5,0-5,4	4,5

*A specifikus aktivitást Ullah 58 °C-on és nem 37 °C-on mérte. Egy egység fitáz-aktivitású az enzim azon mennyisége, amely 1,5 mM nátrium-fitátból 37 °C-on és pH =5,50 mellett szervetlen foszfátot szabadit fel 1 pmól/perc sebességgel. A fermentáció kihozatalának és a specifikus aktivitásoknak az összehasonlítása érdekében az Ullah által közölt aktivitásokat a hőmérséklet-különbségre való tekintettel korrigáltuk. A korrekció az Ullah-féle III. táblázatban bemutatott (1988b) 37 °C-on és 58 °C-on mért fitázaktivitások különbségén alapult.

**SDS-PAGE analízissel meghatározott valószínű molekulatömeg. ***1EF-PAGE analízissel meghatározva.

(SDS = Sodium dodecyl sulphate = nátrium-dodecil-szulfát) (PAGE = polyacrylamid gél elektrophoresis = políakrilamid gélelektroforézis) (IEF = isoelectric focusing = izoelektromos fókuszálás)

A fítázt kódoló gén izolálása érdekében egy első oligonukleotid szonda készletet hoztunk létre a fent leírt eljárás szerint (2A ábra). Ezeket a szondákat az aminosavszekvencia-adatokra alapozva terveztük meg. Az egész eljárás kontrolljaként hasonló lépésekkel végeztük el a savanyú foszfatázt kódoló gén izolálását, a protein Ullah és Cummins által közölt [Prep. Biochem., 17, 397—422 (1987)] adatai felhasználásával. Ami a savanyú foszfatázt illeti, a megfelelő gént nehézség nélkül izoláltuk. Azonban a fitáznál a helyzet különbözőnek bizonyult. Számos próbálkozás ellenére, amelyekben az N-terminális aminosav-szekvenciából levezetett szondákat használtuk, nem tudtunk a genomkészletből olyan genomiális DNS-ffagmentumokat vagy kiónokat izolálni, amelyeket pozitívnak tudtunk volna azonosítani olyan szempontból, hogy fítázt kódoló gént tartalmaz.

A probléma megoldása érdekében a tisztított fítázt brómciános hasításnak vetettük alá, és a kapott fragmentumokat izoláltuk. Meghatároztuk ezeknek a fragmentumoknak az N-terminális aminosav-szekvenciáját (IB ábra), és új oligonukleotid szondákat állítottunk elő az új adatok alapján (2B ábra). Meglepő módon az új oligonukleotid szondák valóban azonosítottak specifikus DNS-fragmentumokat, és alkalmasak voltak arra, hogy egy genomgyűjteményből egyértelműen azonosítsanak kiónokat. Nem volt megfigyelhető kereszthibridizáció az új kiónok vagy az ezekből izolált DNSfragmentumok és az első oligonukleotid szondakészlet vagy ezen első szonda készlet használatával izolált kiónok között.

Megjegyezzük, hogy e második szondakészlet rokon fitázokat kódoló szekvenciák azonosítására is felhasználható.

Az újonnan izolált kiónokat alkalmaztuk szondák gyanánt a Northern biot hibridizációs vizsgálatokban. Diszkrét mRNS-t csak akkor tudtunk kimutatni, ha a mRNS-t fitáztermelő micéliumból izoláltuk. Ha nem fitáztermelő micéliumból származó RNS-sel próbálkoztunk, nem észleltünk hibridizációs szignált. A mRNS mérete körülbelül 1800 b, amely elméletileg egy körülbelül 60 kD maximális molekulatömegű proteint eredményez. Ez az érték annak a molekulatömegnek felel meg, amelyet a nemglükozilált proteinre határoztak meg, és annak a protein molekulatömegnek, amely a DNS-szekvenciából következtethető.

Ezenkívül ha az új kiónokat gomba sejtbe vezettük be transzformáció révén, a fitázaktivitásban növekedést lehetett észlelni. Ez meggyőzően bizonyítja, hogy valóban a fítázt kódoló nukíeotid szekvenciát izoláltuk. A tisztított fitázenzimre és az ebből kapott brómciánfragmentumokra meghatározott aminosav-szekvenciák egybeesnek a klónozott génre meghatározott szekvenciából levezetett aminosav-szekvenciával. A nukíeotid szekvenciát és a levezetett aminosav-szekvenciát a 6. és a 8. ábrában adjuk meg, amelyek ezenkívül a fítázt kódoló klónozott szekvenciát is bemutatják.

A fítázt kódoló nukíeotid szekvencia izolálása lehetővé teszi a fitáz gazdaságos termelését ipari méretekben, modem rekombináns DNS-technikák - ilyen a génsokszorozás vagy a szabályozó elemek, például a promoterek, a szekréciós szignálok cseréje vagy ezek kombinációja - alkalmazása révén.

A találmány tehát egy olyan transzformált expressziós gazdasejt előállítására is vonatkozik, amely fitázaktivitást kifejtő peptidek vagy proteinek nagy mennyiségben való kifejezésére képes, és ha kívánt, a savanyú foszfatáz hatékony kifejezésére is. Az előnyös expressziós gazdasejtek a következők: az Aspergillus, Trichoderma, Mucor és Penicillium nemből választott fonalas gombák, a Kluyveromyces és Saccharomyces nemből választott élesztők és a Bacillus nembéli baktériumok. Előnyös, ha olyan expressziós gazdasejtet választunk, amely endogén proteinjeinek hatékony szekréciójára képes.

Különösen előnyösek az ipari Aspergillus törzsek, főként a niger, ficuum, awamori vagy oryzae. Használhatók még a Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis vagy a Bacillus licheniformis.

Az expressziós szerkezet tartalmazni fogja a kifejezendő kívánt enzimterméket kódoló nukíeotid szekvenciákat, amelyek rendszerint egy olyan szignál szekvenciát tartalmaznak, amely a gazdasejtben funkcionál és gondoskodik a peptid- vagy proteintermék szekréciójáról.

A találmány szerint különböző szignál szekvenciák használhatók. Használható olyan szignál szekvencia, amely homológ a kifejezendő klónozott nukíeotid szek6

HU 215 179 Β venciával, vagy használható egy olyan szignál szekvencia, amely homológ vagy lényegében homológ a céllokusznál lévő egy gén szignál szekvenciájával, a homológ rekombináció előmozdítása érdekében. Használhatunk továbbá olyan szignál szekvenciákat is, amelyek a választott expressziós gazdasejtből való jobb szekréció elősegítésére alkalmasak. Lásd például: Von Heyne, Eur. J. Biochem., 133, 17-21 (1983); Perlman és Halverson, J. Mól. Bioi., 167, 391-409 (1983). A szignál szekvenciát kódoló DNS-szekvenciát a feldolgozó szignált kódoló szekvencián keresztül (hasított felismerő hely) vagy egy rendszerint kevesebb mint 10 kodonból álló rövid hídon keresztül közvetlenül kapcsolhatjuk a kívánt proteint kódoló szekvenciához.

A jelen találmány oltalmi körén belül használt előnybe helyezett szignál szekvenciák a következők: a kifejezendő klónozott nukleotid szekvenciával homológ szignál szekvencia, a 18 aminosavból álló glükoamiláz (AG) szignál szekvencia és a 24 aminosavból álló glükoamiláz (AG) szignál szekvencia, ez utóbbi kettő a kifejezendő nukleotid szekvenciához képest akár homológ, akár heterológ lehet.

Az expressziós termék vagy a kívánt nukleotid szekvencia az expressziós gazdasejt szempontjából homológ vagy heterológ DNS lehet.

A „homológ” DNS meghatározás itt az azonos fajból származó DNS-t jelenti. Például: Aspergillus DNSsel transzformált Aspergillus. Ilyen módon lehetségessé válik a gombafaj már meglévő tulajdonságainak a javítása olyan új tulajdonságok bevitele nélkül, amelyeket a faj az előbbiekben nem tartalmazott.

A „heterológ” DNS meghatározás több fajból származó DNS-re vonatkozik, azaz amint ez az előző bekezdésből következik, olyan nem Aspergillus fajból származó DNS-ről van szó, amely azután Aspergillusban fejeződik ki.

A fitázt kódoló nukleotid szekvenciákat gombákból állítjuk elő. Előnyösebbek azok a fitázt kódoló nukleotid szekvenciák, amelyeket Aspergillus nemből állítunk elő. A legelőnyösebb szekvenciákat az Aspergillus ficuum vagy az Aspergillus niger fajból állítjuk elő.

A szóban forgó nukleotid szekvenciában a nyitott leolvasási kerethez tartozó 5’ szakasz tartalmazza a transzkripciót indító szabályozó szakaszt (vagy promotert). A gazdasejtben funkcionáló bármely szakaszt felhasználhatjuk, így a kifejezendő fitázkódoló nukleotid szekvenciával homológ promotert is. Azonban az alkalmazott szakasz többnyire a céllokusz szakasszal homológ. Ennek hatására helyettesítődik a céllokusz expressziós terméke a kívánt expressziós termékkel. Amennyiben a cél-lokusz kódolta protein expressziós és szekréciós szintje biztosítja a hatékony termelést, ezt a transzkripciót indító szabályozó szakaszt általában kielégítőnek találjuk. Azonban bizonyos körülmények között magasabb transzkripciós szintet szeretnénk elérni, mint amilyen a céllokusz génjéé, vagy pedig indukálható expressziót szeretnénk biztosítani egy speciális indukciós ágenssel. Ezekben az esetekben egy olyan transzkripciót indító szabályozó szakaszt fogunk alkalmazni, amely a céllokuszgénben lévő szakasztól különbözik. Nagyszámú olyan transzkripciót indító szabályozó szakaszt fogunk alkalmazni, amely a céllokuszgénben lévő szakasztól különbözik. Nagyszámú olyan transzkripciót indító szabályozó szakasz ismeretes, amelyek a fonalas gombákban funkcionálnak. Ezek között található a glükoamilázt (AG), gombaamilázt, savanyú foszfatázt, GAPDH-t, TrpC-t, AmdS-t, AlcA-t, AldA-t, hiszton H2A-t, Pyr4-et, PyrG-t izopenicillin Nszintetázt, PGK-t, savanyú proteázt, acil-transzferázt és hasonlókat kódoló génekből származó szakaszok.

Előnyös, ha a céllokusz egy magas szinten kifejeződő proteingént kódol, azaz egy olyan gént, amelynek az expressziós terméke legalább 0,1 g/1 koncentrációban fejeződik ki a fermentáció befejeződéséig. Az eljárás időtartama többek között a kívánt protein terméktől függően változhat. Ilyen gén például a glükoamilázt (AG) kódoló gén. A további lényeges gének a következők: gomba α-amiláz, savanyú foszfatáz, proteáz, savanyú proteáz, lipáz, fitáz és a cellobiohidroláz. A különösen előnyösbe helyezett céllokuszok a következők: az A. niger glükoamiláz génje, az A. oryzae gombaamiláz génje, a T. reesei cellobiohidroláz génjei, a Mucor miehei savanyú proteáz génje, a Kluyveromyces lactis laktáz génje vagy a Saccharomyces cerevisiae invertáz génje.

A transzkripciót leállító szabályozó szakasz származhat a szóban forgó génből, céllokuszból vagy bármilyen megfelelő szekvenciából. Ahol a szerkezet további lényeges szekvenciákat tartalmaz a szóban forgó géntől 3’ felé (downstream; a transzkripció irányában), a transzkripciót leállító szabályozó szakasznak - ha homológ a céllokusszal - lényegében kisebbnek kell lennie a homológ határoló szakasznál.

Rendszerint szelekciós markert is használunk, amely az expressziós szerkezet része is lehet, de el is különülhet az expressziós szerkezettől úgy, hogy nem a szóban forgó génbe, hanem más helyre épült be. Minthogy a találmány szerinti rekombináns molekulák előnyösen olyan gazdasejtbe vannak transzformálva, amelyet ipari termelésre lehet használni, a transzformációt ellenőrző szelekciós markerek előnyösen domináns jellegű szelekciós markerek, vagyis nem kell mutációkat eszközölni a gazdasejtben, hogy ezeket a szelekciós markereket felhasználhassuk. Az ilyen markerek például képessé teszik a transzformált sejteket arra, hogy meghatározott tápanyagforrásokon növekedjenek (például az A. nidulans amdS génje alkalmassá teszi az A. niger transzformált sejteket, hogy acetamidon mint egyetlen nitrogénforráson növekedjenek), vagy vannak markerek, amelyek antibiotikum-rezisztenciát kölcsönöznek (például a ble gén phleomycin rezisztenciát biztosít, vagy a hph gén a hygromycin B-vel szemben biztosít rezisztenciát).

A szelekciós gén saját transzkripciót és transzlációt indító és leállító szabályozó szakaszokkal rendelkezik, hogy ezek a marker független expresszióját biztosítsák. Nagyszámú transzkripciót indító szabályozó szakaszt ismerünk - mint az előzőekben leírtuk -, amelyeket a marker génnel kapcsolatosan használhatunk. Ahol antibiotikum-rezisztenciát alkalmazunk, a szelekcióhoz

HU 215 179 Β szükséges antibiotikum-koncentráció az antibiotikumtól függően változik, általában ml-enként 30-300 pg tartományba esik.

A különböző szekvenciákat ismert technikák szerint kapcsolhatjuk egymáshoz, ilyen a restrikció, amikor komplementer restrikciós helyeket kapcsolunk össze, a ligálás, amikor tompa végeket hozunk létre a túlnyúló részek betöltésével, és a tompa ligálás, a Bal31 reszekció, a primer repair, az in vitro mutagenezis vagy hasonlók. Alkalmazhatunk polilinkereket és adaptereket, ha ez a helyes megoldás, ezeket bevezethetjük vagy eltávolíthatjuk ismert technikákkal, hogy megkönnyítsük az expressziós szerkezet összeszerelését. A szerkezet összeállításának minden szakaszában a kapott fragmentumot klónozhatjuk, restrikciós enzimmel, szekvenálással, hibridizálással és így tovább analizálhatjuk. Nagyszámú vektor áll rendelkezésre a klónozáshoz, és speciális kiválasztásuk nem lényeges e találmány szempontjából. A klónozás általában E. coliban történik.

A határoló szakaszok magukba foglalhatják a céllokusz nyílt leolvasási keretének legalább egy részét, főleg a szignál szekvenciát, a céllokusz génjének 5’ és 3’ szabályozó szakaszait vagy a szabályozó szakaszokon túlra terjedhetnek. Rendes körülmények között a határoló szakasz legkevesebb 100 bp, rendszerint legalább 200 bp és lehet 500 bp vagy több. A határoló szakaszok úgy vannak megválasztva, hogy megbontsák a célgént és meggátolják az expresszióját. Ezt úgy érhetjük el, ha az expressziós kazettát (ez tartalmazza a kifejezendő nukleotid szekvenciát, és adott esetben magába foglal további elemeket, mint a szignál szekvencia, a transzkripciót indító szabályozó szakasz szekvenciája és/vagy egy transzkripciót leállító szabályozó szakasz szekvenciája) a nyílt leolvasási keretbe, az 5’ szakasz közelébe építjük be oly módon, hogy a teljes cél-gént vagy részét szubsztituáljuk az expressziós szerkezettel, vagy úgy, hogy az expressziós szerkezet a cél-lokusznál lévő transzkripciót indító szabályozó szakasz és a nyílt leolvasási keret közé kerüljön. Mint már rámutattunk, ahol a leállító szabályozó szakasz homológ a céllokusznál lévő szakasszal, a 3’ határoló szakasznak lényegében nagyobbnak kell lennie a szerkezetben jelen lévő egy leállító szabályozó szakasznál.

A találmány tárgyát képezik a „második generációs” fitázok előállításához szolgáló kiindulási anyagok is. Ezek olyan fitázenzimek, amelyeknek a tulajdonságai különböznek az izolált enzim tulajdonságaitól. Egy második generációs fitáznak megváltozott hőmérséklet- és pH-optimuma lehet, más lehet a specifikus aktivitása vagy affinitása szubsztrátumához vagy bármilyen más olyan megváltozott tulajdonsággal rendelkezhet, amely az enzimet alkalmasabbá teszi egy meghatározott eljárásban való alkalmazásra. Az E. coli a legjobb gazdasejt ilyen mutagenezisekhez (például a helyre irányuló mutagenezishez). Minthogy az E. coliban nem működik splicing mechanizmus a fitázgénben feltehetően jelen lévő intronok eltávolítására, a választandó szekvencia egy fitáz cDNS-klón az E. coliban való kifejezéshez. Ezt a cDNS-szekvenciát könnyen mutagenizálhatjuk a szakterület jól ismert eljárásaival, s ezután a mutáns gént bevezethetjük a kívánt expressziós szerkezetekbe.

A szerkezetet klónozó vektorban - amely vagy lineáris vagy cirkuláris lehet - vezethetjük be a gazdasejtbe, vagy ha kívánt, a szerkezetet eltávolíthatjuk a klónozó vektorból. Előnyös, ha a klónozó vektor egy plazmid. A plazmidot rendszerint linearizáljuk, ha a szóban forgó gén körülbelül 1 kbp-on belül van. Előnyös, ha a találmány szerinti fitáz termelésére szolgáló expressziós szerkezetet a kiválasztott expressziós gazdasejt genomjába integráljuk.

A technikák bő választéka áll rendelkezésre a fonalas gombák transzformálására. E technikák magukba foglalják a protoplaszt fúziót vagy transzformációt, az elektroporációt és mikrolövedék belövését a sejtbe. A protoplaszt transzformációt eredményesnek találták, így előnyösen használható.

Az általunk használt gombatörzs micéliumát először protoplasztokká változtatjuk a sejtfal enzimes emésztésével, ozmózis stabilizáló anyag - ilyen a kálium-klorid vagy a szorbit - jelenlétében. A protoplasztok DNS-felvételét CaCl₂ és koncentrált polietilén-glikol oldat hozzáadásával segítjük elő. Ez utóbbi anyag a protoplasztok aggregációját idézi elő, amely folyamat következtében a transzformáló DNS bezáródik az aggregátumokba, ahonnan azután a protoplasztok felveszik. Ezután a protoplasztokat szilárd táptalajon hagyjuk regenerálódni. A táptalaj ozmózis stabilizáló szert és ha szükséges, olyan szelektív ágenst tartalmaz, amely ellen rezisztenciát kódol a transzformáló DNS.

A transzformált sejtek szelektálása után különbözőképpen határozhatjuk meg a számunkra fontos gén jelenlétét. Antitestek alkalmazásával - ahol az expressziós termék a gazdasejthez képest heterológ - ki lehet mutatni, hogy a szóban forgó gén expressziója megtörtént-e. Használhatjuk a Southern vagy Northern biot analízist is az integrált gén vagy a transzkripciós termék jelenlétének kimutatására.

A vizsgált nukleotid szekvencia vagy expressziós szerkezet sokszorozását standard technikákkal valósíthatjuk meg úgy, hogy a szerkezetből sok másolatot vezetünk be a transzformálandó vektorba, vagy szelektív markerként az amdS gént [például: Weinans és munkatársai, Current Genetics, 9, 361-368 (1985)] használjuk. A sokszorozandó DNS-szekvencia az expressziós gazdasejthez viszonyítva akár homológ, akár heterológ DNS-ből állhat, mint fent említettük.

A sejteket ezután megfelelő táptalajon tenyésztjük. Kis koncentrációkban alkalmazhatunk proteáz inhibitorokat, mint a fenil-metil-szulfonil-fluorid, az a₂-makroglobulinok, a pepsztatin vagy hasonlók. A proteáz gént (géneket) inaktiválhatjuk, hogy elkerüljük vagy csökkentsük a kívánt protein degradációját.

A transzformált sejtek tenyésztését vagy sarzsonkénti, vagy folyamatos fermentációval végezhetjük. A táptalajt izoláljuk, és belőle a kívánt terméket kivonjuk.

Különböző módszereket alkalmazhatunk - ha szükséges - a termék tisztítására, ilyen a kromatográfia (például HPLC), az oldószer-oldószer extrakció, az elektroforézis, valamint ezek kombinációja és így tovább.

HU 215 179 Β

A találmány tárgyát képezi egy olyan (downstream) feldolgozási eljárás is, amely szerint a fermentlevet (adott esetben tisztított fermentlevet) megszüljük, ezt követi egy második csíramentesítő szűrés, s ezután a szűrt oldatot koncentráljuk. Az így kapott koncentrált folyadékot a következőképpen használjuk fel:

a) A koncentrált folyadékból kicsapjuk a fitázt és a többi proteint 60% (térf/térf) végső térfogatnyi aceton hozzáadásával állandó keverés mellett. A csapadékot 35 °C-on, vákuumban szárítjuk. A száraz port megőröljük, majd az enzimterméket így használjuk fel az alkalmazási kísérletekben. A kitermelés körülbelül 90%.

b) A koncentrált folyadékot porlasztva szárítjuk, hagyományos porlasztva szárító technikákkal. A kitermelés 80-99% között változik.

c) A koncentrált folyadékot hordozó anyagokkal, például búzakorpával keverjük el. Az így kapott keveréket porlasztó toronyban (spray tower) vagy folyadékrétegben (fluid bed) szárítjuk.

d) A koncentrált folyadék ozmózisát például szorbit hozzáadásával stabilizáljuk, és tartósítószert, például benzoesavat adunk hozzá, hogy meggátoljuk a mikrobiális befertőződést.

Mind a négy készítmény eladható premix gyártók, a takarmányalapanyag-gyártó ipar és más közvetítő kereskedők és farmerek részére.

A találmányt a példákkal szemléltetjük, de ezekkel semmiképpen nem óhajtjuk korlátozni a találmány oltalmi körét. A szakterület gyakorlott szakemberei számára nyilvánvaló, hogy a találmány szerinti fitáz gén felhasználható olyan heterológ hibridizációs kísérletekben, amelyek a fitázt kódoló gének más mikroorganizmusokból való izolálását célozzák.

1. példa

Az A. ficuum NRRL 3135 fermentálása

Az Aspergillus ficuum NRRL 3135 törzset a Northern Region Research Laboratóriumtól (USDA, 1815 Nort University Street, Peoria, Illinois, USA) szereztük be [Prep. Biochem. 18, 459^471 (1988)]. A gombaspóra készítményeket standard technikák szerint készítettük el.

A spórák, majd a sejtek tenyésztését egy sorozat nem folyamatos (batch, tételenkénti) fermentációs lépésen keresztül végeztük, Erlenmeyer lombikoktól 10 1-es fermentorig. Tenyésztés után (batch) ennek a fermentomak a tartalmát használtuk inokulum gyanánt a végső 500 literes (batch) fermentációhoz.

A használt táptalaj összetétele: 91 g/1 búzakeményítő (BDH Chemicals Ltd.); 38 g/1 glükózxH₂O; 0,6 g/1 MgSO₄x7H₂O; 0,6 g/1 KC1; 0,2 g/1 FeSO₄x7H₂O; 12 g/1 KN0₃. A pH-t 4,6±0,3 értéken tartottuk 4 n HaOH-val vagy 4 n H₂SO₄-gyel való automatikus titrálással.

A sejteket 28 °C-on tenyésztettük. A 25% oldott oxigén koncentrációjú levegő telítettségének ellenőrzése automatikusan történt. A fítáztermelés 10 napon át tartó fermentáció után érte el az 5-10 E/ml maximális szintet.

2. példa

Az A. ficuum fitáz tisztítása és jellemzése

A. Fitázaktivitás vizsgálata

100 μΐ leves szűrletet (ha szükséges, hígítva) vagy felülúszót vagy kontrollként 100 μΐ vizet adunk a következő összetételű inkubálandó elegyhez:

- 0,25 mólos nátrium-acetát puffer, pH = 5,5 vagy

- glicinxHCl puffer, pH =2,5

- 1 mM fitinsav nátriumsó

- ionmentes víz ad 900 μΐ.

A kapott elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk. A reakciót 1 ml 10%-os TCA (triklór-ecetsav) hozzáadásával állítjuk le. Miután a reakció befejeződött, 2 ml reagenst {3,66 g FeSO₄x7H₂O 50 ml ammóniummolibdát oldatban [2,5 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ ^x4H₂O és 8 ml H₂SO₄ 250 ml-re hígítva ionmentes vízzel]} adunk az elegyhez.

A kék szín intenzitását spektrofotometriásán, 750 nm-en méljük. A mérések a felszabaduló foszfor mennyiségét foszfátkalibrációs görbéhez viszonyítva, 0-1 mM/Ι tartományban adják meg. Foszfatázfestés.

A foszfatáz aktivitású komponenseket izoelektromos fókuszálással mutatjuk ki, általános foszfatázfestési módszer alkalmazásával. A gélt a-naftil-foszfát és Fást Gamet GBC só [Sigma; 0,1%, illetve 0,2% (tömeg/térf)] tartalmú 0,6 mólos nátrium-acetát pufferben (pH =5,5) inkubáljuk. A reakciót, amely fekete csapadék megjelenését eredményezi, vagy metanokecetsav (30:10 térf/térf%) eleggyel állítjuk le, vagy ha a fitáz aktivitású proteinre tovább is szükség van, desztillált vizes öblítést végzünk.

B. Az A. ficuum fitáz tisztítása

Az A. ficuum NRRL 3135 leves tenyészetből a fitázt homogenitásig tisztítjuk. A levest először csíramentesre szűrjük. A kapott tenyészlé szűrletét ezután Filtron ultraszűrő egységgel (a szűrők kizárási molekulatömege 30 kD) koncentráljuk. A tisztítási eljáráshoz úgy állítjuk be a minta pH-ját és ionerősségét, hogy a mintát 10 mmólos nátrium-acetát pufferrel (pH =4,5) mossuk. Az ultraszűrés utáni végső koncentráció közel 20-szoros volt.

A mintát ezután egy kationcserélő oszlopra (SSepharose Fást Flow; HR 16/1020 ml-es oszlop; mindkettő Pharmacia gyártmány) visszük fel [Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System (Waters-féle preparatív magas szintű proteintisztítási rendszer)]. A megkötött proteint nátrium-acetát pufferben készített 0-1 M nátrium-klorid gradiensben oldjuk le. A fitáz körülbelül 250 mM NaCl-nél oldódik le. A fitázaktivitást tartalmazó frakciókat egyesítjük, koncentráljuk, majd ultraszűréssel sótalanítjuk. A kapott oldatot anioncserélő oszlopra (Q-Sepharose Fást Flow; HR 16/1020 ml-es oszlop; Pharmacia) visszük fel, és a proteineket újból nátrium-acetát pufferben készített 0-1 M nátrium-klorid gradiensben eluáljuk. A fitáz körülbelül 200 mM NaCl-nél oldódik le az oszlopról.

Ez a tisztítási lépés egy részben tisztított fitázkészítményt eredményez, körülbelül 40-50 E/mg proteinspecifikus aktivitással, ami 25-szörös tisztasági fokot jelent.

HU 215 179 Β

A részlegesen tisztított fitáz analízise egy fő szennyező anyag jelenlétét mutatta ki, amelynek a molekulatömege körülbelül 100 kD (IB ábra, E szekvencia). Izoelektromos fókuszálással számos foszfatáz-aktivitást kifejtő enzim jelenlétét mutattuk ki, valamint 3—4 fitáz alcsoportot (izoelektromos pontjuk 5,0-5,4 között változott) (IA ábra, A és B szekvencia).

Annak érdekében, hogy homogén fitázkészítményt kapjunk, további kétszeres tisztítást értünk el a részlegesen tisztított fitáz komponenseinek izoelektromos fókuszálásával LKB Multiphor rendszerben Ampholine PAG lemezeken (pH tartomány = 4—6,5) végzett kiegészítő elválasztással. A foszfatáz aktivitású proteineket (a fitázzal együtt) a fent leírt általános foszfatázfestési eljárással mutattuk ki. A megfelelő sávokat egymás után kivágtuk a gélből és az aktív proteint úgy eluáltuk, hogy a gélszeleteket 16 órán át inkubáltuk 10 mmólos nátrium-acetát pufferben (pH =5,5). A proteinfrakciókat specifikus fitázaktivitási vizsgálattal analizáltuk a 2. példában leírtak szerint, s így különítettük el a fitáz tartalmú frakciókat a savanyú foszfatázoktól. Fitázra nézve a végső tisztítási faktor körülbelül 60-szoros volt (a végső készítmény specifikus aktivitása 100 E/mg protein volt). Ebben az utolsó tisztítási lépésben lehetőség nyílt arra, hogy a fitáz különböző alfajait is izoláljuk (1A ábra, A és B szekvencia).

Monoklonális antitesteket állítottunk elő A. ficuum fitáz ellen, s így hatékony tisztítási eljáráshoz jutottunk. Az antitestet brómciánnal aktivált Sepharose 4B-hez kötöttük (5 mg/ml gél), és ezt a mátrixot használtuk fel egy immunaffinitás-oszlop elkészítésére. Megállapítottuk, hogy a mátrix körülbelül 1 mg fitázt köt meg mlenként. A fitázt egy pH =2,5 pufferrel (100 mM glicinxHCl, 500 mM NaCl) oldjuk le az affinitásoszlopról aktivitásveszteség nélkül. Ezt az eljárást használhatjuk homogén fitáz izolálására nyers szűrletből egyetlen lépésben, 80%-os kitermeléssel és 60-szoros tisztítással.

C. A fitáz deglükozilálása

A. ficuum fitázt (70 pg protein) inkubálunk 2,5 E N-glükanázzal (Genzyme) 0,2 mólos nátrium-foszfát pufferben (pH =8,6) és 10 mM 1,10-fenantrolinnal, 30 pl összmennyiségben.

Az elegyet 16 órán át 37 °C-on tartjuk, majd a deglükozilációt elektroforézissel (Phast System, Pharmacia) ellenőrizzük. Azt találtuk, hogy a fitáz valószínű molekulatömege 85 kD-tól körülbelül 56,5 kD-ig terjed. Schiff perjódsavas (PÁS) cukorfestéssel, amely a natív fitázt mint glükoproteint azonosította, nem sikerült kimutatni semmiféle proteinhez kötött szénhidrátmaradékot. A szénhidrát teljes eltávolítását a továbbiakban az érzékeny lektin-blotting módszerrel igazoltuk. Natív és deglükozilált fitázt (1,5-1,5 pg) futtattunk standard SDS-PAGE gélben, és elektroforézis segítségével vittük át PVDF membránra (Immobilon, Millipore) 25 mM trisz-glicin pufferben (pH =8,3) 20% (térf/térf) metanolban 16 óra időtartam alatt, 30 V mellett.

A membránt ezután PBS-ben készített 1%-os (tömeg/térf) marhaszérum-albuminnal és PBS-ben pg/ml konkanavalin A - peroxidáz készítménnyel (Sigma) ínkubáljuk. A peroxidázt 4-klór-1-naftollal (Sigma) festjük.

Ezzel az érzékeny módszerrel szintén nem tudtunk kimutatni semmi olyan szénhidrátmaradékot, ami a deglükozilált fitázhoz kapcsolódott.

Deglükozilálás után a fitáz teljesen elveszti aktivitását, feltehetően az enzim aggregálódása következtében.

3. példa

A fitáz aminosav-szekvenciájának a meghatározása és oligonukleotid szondák szerkesztése

A. Az N-terminális aminosav-szekvencia meghatározása

A fitázt SDS-PAGE vagy IEF-PAGE rendszerből elektroforetikus úton vittük át PVDF blotting membránra (Immobilin, Millipore). Az elektroblottingot 10% (térf/térf) metanol tartalmú CAPS (3-ciklohexil-aminopropán-szulfonsav) pufferben (pH =11,0) végeztük 16 órán át 4 °C-on, 30 V mellett.

A proteineket Coomassie briliáns kék festéssel lokalizáltuk. A megfelelő sávot kivágtuk, metanolban színtelenítettük, és gáz fázisú szekvenálást végeztünk. Az eljárást többször végeztük el számos egyedi készítményt használva. A kapott eredményeket az 1A ábra tartalmazza (A és B szekvencia).

A nyers készítményekben jelen lévő egy 100 kD protein aminosav-szekvenciáját szintén meghatároztuk. A proteinre kapott adatokat az 1C ábra tartalmazza. Ez a szekvencia jelentős homológiát mutat az Aspergillus nigerből izolált savanyú foszfatázzal [MacRae és munkatársai, Gene, 71, 339-348 (1988)].

B. A belső aminosav-szekvenciák meghatározása Proteinfragmentálás brómciánnal

A homogenitásig tisztított fitázt 100 mmólos NaHCO₃-ba visszük át ultraszűréssel (Centricon 30 mikrokoncentrátor, Amicon). A proteint ezután liofilizáljuk, 70%-os trifluor-ecetsavban (térf/térf) feloldjuk, és 6 órán át mintegy 300-szoros moláris feleslegben lévő brómciánnal ínkubáljuk. A reakciót az elegy vízzel való felhígításával állítjuk le. A kapott fragmentumokat újra liofilizáljuk. A mintát ezután DTT (ditiotreitol) tartalmú SDS-PAGE mintapufferben oldjuk fel, és a fragmentáció mértékét PAGE segítségével határozzuk meg. Az analitikai PAGE-t egy Pharmaciaféle Phast-System egységben végezzük el, 20%-os SDS-PAGE gélben. A géleket előfüttatjuk, hogy folytonos pufferrendszert hozzunk létre a kis peptidek elválasztásának a javítására (a kézikönyvnek megfelelően). A proteineket a szakterületen ismert ezüstfestéses technika használatával mutatjuk ki, mivel a Coomassie briliáns kék nem tudta kimutatni a legkisebb peptideket. Az eljárás a fitáz <2,5 kD, 36 kD, 57 kD és 80 kD molekulatömegű peptidekre való teljes lebomlását eredményezte.

A peptideket a gázfázisú szekvenáláshoz a Schagger és Jagow [Anal. Biochem., 166, 368-379 (1987)] által leírt SDS-tricin-PAGE módszerrel izoláltuk, s ezt követte az elektroblotting a fent leírtak szerint.

HU 215 179 Β

Az 57 kD fragmentum N-terminusa azonos az Ullah (1988b, lásd fent) által fitázra meghatározott N-terminussal, az első négy amínosav kivételével, amelyek hiányoztak (1A ábra, B szekvencia). A 2,5 kD és a 36 kD peptid N-terminális szekvenciája (A és B szekvencia) az IB ábrán látható.

C. Oligonukleotid szondák

Az oligonukleotid szondákat az 1A és IB ábrán közölt aminosav-szekvenciákra alapozva terveztük meg, és egy Applied Biosystems-féle ABI 380B DNSszintetizátorral készítettük el. Az oligonukleotidokat a 2A és 2B ábra ábrázolja.

4. példa

Genomiális biotok és genomtárak hibridizálása az oligonukleotid szondák egy első készletével

A. ficuumból genomiális DNS-t izoláltunk standard eljárások alkalmazásával [például: Yelton és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 1470-1474 (1984)] oly módon, hogy a micéliumot folyékony nitrogénben megőröltük. A lambda EMBL3 bakteriofág vektorban [J. Mól. Bioi. 170, 827-842 (1983)] egy genomgyűjteményt hoztunk létre az A. ficuum NRRL 3135 kromoszomális DNS-ének Sau3A-val való részleges emésztése segítségével, standard technikák használatával [például: Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ν. Y. USA (1982)]. Az így kapott genomgyűjtemény az A. ficuum genom 60-70-szeresét tartalmazta. A gyűjteményt az inszertum nélküli plakkok előfordulására vonatkozóan vizsgáltuk a lambda EMBL3-at töltő fragmentummal való hibridizálás segítségével. A plakkok kevesebb mint 1 %-ánál volt észlelhető, hogy a lambda EMBL3 szondával hibridizál. Az inszertum nagysága 13-17 kb volt.

Hogy megállapítsuk azokat a feltételeket és hogy azonosítsuk azokat a szondákat, amelyek alkalmasak genomtár szűrésére, a genomiális DNS-t számos restrikciós enzimmel emésztettük, agaróz gélben elválasztottuk és Genescreen plus-ra cseppentettük a gyártó cég előírásai szerint. A biotokat az összes oligonukleotid szondával hibridizáltuk. A hibridizálást különböző szigorúságú feltételek mellett végeztük el (6*SSC, 40-60 °C a hibridizáláshoz; 0,2*SSC-ig, 65 °C a mosáshoz). Az 1068-as és az 1024-es szondát (2A ábra) választottuk ki a genomgyűjtemény szűrésére, bár nem tudtunk olyan közös DNS-fragmentumokat azonosítani, amelyek specifikusan hibridizáltak volna mindkét szondával. Az 1025-ös savanyú foszfatáz szonda specifikus és diszkrét hibridizációs szignált adott, és ezért ezt a szondát választottuk arra a célra, hogy a genomgyűjteményt a savanyú foszfatáz gén jelenlétére szűrjük.

A három szonda használatával hibridizáló plakkokat lehetett azonosítani a genomgyűjteményben. Az 1025ös szondának megfelelő hibridizációs szignál (savanyú foszfatáz) erős és reprodukálható volt. Az 1024-es és 1068-as szondák (fitáz) használatakor változó intenzitású hibridizációs szignálokat figyeltünk meg. A két sorozat között nem észleltünk kereszthibridizációt. Mindhárom plakksorozatot újra szűrtük, és nyolc egyedi, pozitívan hibridizáló plakkból izoláltunk DNS-t (Maniatis és munkatársai, lásd fentebb). Minden sorozatban azonosan hibridizáló fragmentumokat tartalmazó kiónokat tudtunk azonosítani, ami arra utalt, hogy az említett kiónok inszertumai rokonságban vannak egymással, és valószínűleg ugyanazon genomiális DNS-szakaszt fedik. Ugyancsak nem lehetett kereszthibridizációt kimutatni a két fitáz specifikus sorozat (1024-es és 1068-as szonda) között, ami jelezte, hogy bár a két sorozat klón izolálására használt mindkét szondát a protein N-terminális aminosav-szekvenciájából kaptuk, mégis különböző genomiális DNS-fragmentumokat azonosítottunk és klónoztunk.

Az indukált és nem indukált micéliumból izolált mRNS tartalmú Northern biotokkal mindhárom klónsorozatot hibridizáltuk (6. példa). A savanyú foszfatáz specifikus klón, valamint az ezen klónból izolált belső 3,1 kb Sáli fragmentum kizárólag az indukált mRNS mintákkal hidridizált. A savanyú foszfatáz-specifikus szondákkal azonosított mRNS körülbelül 1800 bp hosszú, ami egyezik a protein ismert méretével [68 kD, Ullah és Cummins, Prep. Biochem., 17, 397-422 (1987)]. Nem volt kimutatható hibridizáció a fitáz-specifikus kiónok és a specifikus mRNS-ek között. Ebből azt következtettük, hogy a fent leírt módszer eredménytelen a fitázt kódoló gén klónozásában. Még arra is lehet következtetni, hogy ez a sikertelenség nem a használt módszer hibájának tudható be, minthogy a módszert eredményesen tudtuk alkalmazni a savanyú foszfatázt kódoló gén azonosítására. A savanyú foszfatáz gént tartalmazó lambda kiónt 1989. április 24-én helyeztük letétbe a Centraal Bureau voor Schimmelcultures (Baam, Hollandia) intézményben CBS 214.89 letéti számmal. A 10 kb BamHI fragmentumot a Z1 fágból izoláltuk és a pUC 19-be szubklónoztuk. Ez a szubklón tartalmazza a teljes savanyúfoszfatáz-kódoló gént. A pAF 1-1 szubklónt (5. ábra) 1989. április 24-én helyeztük letétbe CBS 213.89 letéti számon.

5. példa

Fitázt kódoló gén izolálása az oligonukleotid szondák egy második készletével

A brómciánnal előállított fragmentumok N-terminális aminosav-szekvenciájának a felhasználásával szondákat állítottunk össze (2B ábra; 1295-ös, 1296-os és 1297-es szondák), amelyeket a fent leírt módon genomiális DNS-sel hibridizáltunk. E szondáknak a fitázkódoló gén izolálásában való alkalmazhatóságát újból vizsgáltuk a genomiális biotok és a szondák Southern hibridizálásával. Ezúttal megfelelő hosszúságú hibridizáló fragmentumokat tudtunk azonosítani a három szonda használatával, annak ellenére, hogy a szondák nem átfedő szakaszokból származtak. Nem volt hibridizáció az új szondakészlet és az első szonda készlet (4. példa) használatával izolált kiónok között. Ezért a genomtárat újraszűrtük mind a három szondával, külön kísérletekben. A kiónok egy alcsoportja (lambda AF201, 219, 241 és 243), amelyet az egyedi szondákkal izoláltunk, szintén hibridiziált más szondákkal, ami azt mutatta, hogy ebben az esetben a három

HU 215 179 Β különböző szonda használatával egyetlen genomíális szakaszból történt a kiónok izolálása. Megkíséreltük, hogy az újonnan izolált kiónokat az 1024-es és az 1068as szondával hibridizáljuk. Egy esetben sem észleltünk hibridizációt az újonnan izolált kiónokkal olyan körülmények között, amelyekben mindkét szonda eredményesen hibridizált azokkal a kiónokkal, amelyeket ezen szondákkal izoláltunk (lásd a 4. példát). Ez igazolta azt, hogy az újonnan izolált kiónok nem homológok azokkal a szondákkal, amelyek a tisztított fitáz N-terminusából származnak.

A lambda EMBL3 kiónt, amely mind a három szondával (1295, 1296, 1297) hibridizált, lambda AF201nek neveztük el (4. ábra), és letétbe helyeztük 1989. március 9-én CBS 155.89 letéti szám alatt.

A lambda AF201 5,1 kb BamHI fragmentumát (pUC 19-be szubklónoztuk és pAF 2-3 jelzéssel láttuk el; lásd a 4. ábrát), amely mind a három oligonukleotid szondával hibridizált, arra használtuk, hogy egy Northern blotot megszondázzunk. Ebben az esetben egy 1800 bázis nagyságú diszkrét mRNS-t azonosítottunk. Ez az mRNS csak indukált micéliumban volt fellelhető. Hasonló eredményeket kaptunk, ha az oligonukleotidokat használtuk szondák gyanánt. Az új szondakészlet használatával tehát egy olyan közös DNS-ffagmentumot azonosítottunk, amely speciálisan hibridizált indukált mRNS-sel. Ennek az mRNS-nek a hossza (1800 b) elégséges arra, hogy egy körülbelül 60 kD proteint kódoljon, ami körülbelül a nemglükozilált protein méretének felel meg. Az izolált fragmentumok természetesen tartalmazzák a fitázkódoló génnek legalább egy részét.

6. példa

Az „indukált és „nemindukált’’ mRNS izolálása

Ismert a szakirodalomból, hogy az A. ficuumban a fitáz szintézise szigorúan foszfátfüggő szabályozás alá esik [Han és Callagher, J. Indust. Microbiol., 1, 295-301 (1987)]. Tehát ha kimutatjuk, hogy egy izolált gén hasonló szabályozásnak van alávetve, ezt úgy tekinthetjük, mint annak bizonyítékát, hogy a szóban forgó gént klónoztuk.

A termelés nemtermelő feltételek mellett szintetizálódott mRNS izolálása céljából az A. ficuum NRRL 3135 sejteket a következőképpen tenyésztettük. A spórákat először egy éjszakán át nem indukciós táptalajban tenyésztjük. A következő napon a micéliumokat learatjuk, steril vízzel mossuk, és beoltjuk vagy indukciós, vagy nem-indukciós táptalajba. A használt táptalaj összetétele (literenként) a következő:

kukoricakeményítő	20 g
glükóz	7,5 g
MgSO4*7H2O	0,5 g
FeSO4*7H2O	0,2 g
kno3	7,2 g
A fitáz indukálására 2 g/l kukoricalekvárt adunk a

táptalajhoz, míg a nem indukciós táptalaj 2 g/l K₂HPO₄-et tartalmaz. A micéliumot legalább még további 100 órán át tenyésztjük. Meghatározott időközönként mintát veszünk. A fitáztermelést a fitáz meghatározásával követjük, ahogyan ezt a 2A. példában leírtuk.

A denaturált mRNS-t elektroforézissel választjuk el és Genescreen plus-ra cseppentjük. A biotokat ³²P-vel jelzett pAF 2-2-mal vagy - a 4. példa szerinti - pAF 1-1-bői (savanyú foszfatáz) izolált 3,1 kb Sáli fragmentummal hibridizáljuk. Az eredményeket a 2. táblázat tartalmazza.

A fitáz-specifikus 5,1 kb BamHI fragmentumnak és a savanyú foszfatáz specifikus 3,1 kb Sáli fragmentumnak az izolált mRNS-sel való pozitív hibridizációját csak akkor észleltük, ha a sejteket olyan körülmények között tenyésztettük, amelyekről tudtuk, hogy a fitáz és a savanyú foszfatázok szintézisét indukálják. Ezekből az eredményekből azt a következtetést vontuk le, hogy az izolált gének szabályozottak, ahogyan ezt a fitáznál és a savanyú foszfatáznál elvártuk.

2. táblázat

Northern biotok hibridizációja a fitáz specifikus 5,1 kb BamHI fragmentummal (A) vagy a savanyú foszfatáz specifikus 3,1 kb Sáli fragmentummal (B) mint szondákkal; a + jel az 1800 bp fitáz mRNS vagy az 1800 bp savanyú foszfatáz mRNS jelenlétét jelzi. A relatív fitázaktivitást a 24 órás mintákból határoztuk meg; az indukált tenyészetekben 10-szer nagyobb volt a fitázaktivitás, mint a nem indukált tenyészetekben.

A beoltás után eltelt idő	Indukált	Nem indukált
A	24 óra	+	-
B	24 óra	+	-

7. példa

A fitázgén klónozásának bizonyítása

Ahhoz, hogy döntő bizonyítékot szerezzünk a fitázkódoló gén eredményes izolálásáról és hogy tanulmányozhassuk a klónozott gén expressziója növelésének a lehetőségét, a fitázgént megfelelő vektorba szubklónoztuk. A vektorral A. niger 402 (ATCC 9092) [Bős C. J. (1986) Thesis Agricultural University, Wageningen, Hollandia] sejteket transzformáltunk. E célból a fitázgént az AF201 lambda kiónból izoláltuk mint 10 kb Nrul fragmentumot, s ezt beklónoztuk a pAN 8-1 vektor Stul helyére [I. E. Mattem és P. J. Punt, Fungal Genetics Newsletter, 35, 25 (1988)]. A vektor a ble gént tartalmazza szelekciós markerként (a ble gén fleomicinrezisztenciát ad át). A kapott szerkezetet pAF 28-1 (4. ábra) jelzéssel láttuk el, s ezzel A. niger 402 sejteket transzformáltunk a 9. példában leírt eljárás szerint, azzal a különbséggel, hogy a protoplasztokat 30 pg/ml fleomicin és 0,75% agar tartalmú szilárd Aspergillus minimál táptalajra kentük ki. Egyedi transzformált sejteket tisztítottunk és izoláltunk, ezeket rázott lombikokban vizsgáltuk termelés szempontjából az 1. és 2. példában leírtak szerint. Kontroll gyanánt olyan transzformált sejteket használtunk, amelyek csak a vektort tartalmazták. A transzformálatlan gazdasejteket szintén teszteltük (3. táblázat). Csak a pAF 28-1-et tartalmazó A. niger 402nél észleltük, hogy fitázt termel, amely egy A. ficuum fitáz elleni specifikus monoklonális antitesttel reagált. A monoklonális antitesttel reagáló fitázt pH = 2,5-nél le

HU 215 179 Β lehetett oldani egy immunaffinitás oszlopról, majd kimutattuk, hogy molekulatömege, glükozilációs foka, izoelektromos pontja és specifikus aktivitása azonos az A. ficuum fitázéval. Ez a megállapítás világos bizonyítékot szolgáltatott arra vonatkozóan, hogy a pAF 28-1 plazmiddal transzformált A. niger 402 sejtek egy olyan fitázt fejeznek ki, amely gyakorlatilag azonos az A. ficuum fitázzal. Hasonló expressziót nem észleltünk a kontrollsejtek egyetlen típusánál sem.

3. táblázat

Törzs	Fitáz- aktivitás E/ml	Immun affinitásoszlopra abszorbeált fitázaktivitás (%)
A. niger 402	0,5	0
A. niger 402 pAF 28-1	0,7	10
A. niger 402 pAN 8-1	0,5	0

A törzseket indukciós körülmények között tenyésztettük (6. példa). A mintákat 96 órás tenyésztés után vettük.

8. példa

A fitázgén jellemzése

A fitázgént tartalmazó lambda kiónokat különböző restrikciós enzimes emésztéssel analizáltuk. A 4. ábra mutatja be a fitázgént magába foglaló genomiális szakasz térképét. A pUC19 klónozó vektorba [Yanisch-Perron et al.: Gene 33, 103-119 (1985)] meghatározott restrikciós fragmentumokat szubklónoztunk, s ezeket a 4. ábrán megjelöltük.

Előzőleg kimutattuk (5. példa), hogy a pAF 2-3-ban jelen lévő 5,1 kb BamHI fragmentum magába foglalja a fitázgén legalább egy részét. Ezenkívül kimutattuk, hogy az 1295-ös és 1297-es oligonukleotid szondák a pAF 2-7-ből származó Sáli inszertummal hibridizálnak (a pAF 2 kiónok pozícióit a 4. ábra mutatja), míg az 1296-os szonda valószínűleg áthidalja a pAF 2-6ban és a pAF 2-7-ben lévő fragmentumok közti Sáli helyet. A kísérletek eredménye arra mutat, hogy a fitázkódoló szekvencia a pAF 2-3 BamHI inszertumának bal oldali részében helyezkedik el.

Azután pontosan meghatároztuk a pAF 2-3, pAF 2-6 és pAF 2-7 plazmidok inszertumainak nukleotid szekvenciáját didezoxi láncterminációs módszerrel [Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5467 (1977)] és a Messing és munkatársai által leírt [Nucl. Acids Rés., 9, 309-32 (1981)] Shotgun stratégia alkalmazásával. Ezenkívül specifikus oligonukleoti-. dókat szintetizáltunk a szekvenálási eljárással kapott nukleotid szekvenciából származó információ alapján.

A pAF 2-3, pAF 2-6 és pAF 2-7 kiónok teljes nukleotid szekvenciáját, amely a kromoszomális fitázgénlokuszt tartalmazza, a 6. ábrán mutatjuk be, a grafikus ábrázolás a 7. ábrán látható.

A teljes szekvencia proteinkódoló kapacitásának az analízise felfedte, hogy az érett protein N-terminális aminosav-szekvenciájának kódolása a 381 -es pozíciótól kezdődik (az Ullah által közölt N-terminus a 369. pozíciónál helyezkedik el). Ezenkívül azt találtuk, hogy a 36 kD és a 2,5 kD belső peptidfragmentumok N-terminális aminosav-szekvenciájának (lásd az IB ábrát - B és A szekvencia) a kódolása az 1101, illetve a 1548. nukleotid pozíciónál kezdődik. A nyílt leolvasási keret az 1713-as pozícióban lévő nukleotidnál fejeződik be.

Ezek az eredmények világosan bizonyítják a jellemzett kromoszomális lokusz azonosságát, s eszerint ez a fitázkódoló DNS-szekvenciát tartalmazza.

Az érett fitáz proteint kódoló kromoszomális szekvenciától közvetlenül 5’ irányban nem található ATG start kodon az érett protein nyílt leolvasási keretével érintkező leolvasási kereten belül, azonban az intron-exon határ jellemzői figyelembevételével feltételezhetünk egy intront a 254-es és 355-ös nukleotid pozíciók között, s hogy a 210-es nukleotid pozíciónál lévő ATG kodon az érett fitázt kódoló nyílt leolvasási kerettel együttműködik. Ezen N-terminális toldalékból származó aminosav-szekvencia szigorúan megfelel a von Heyne szerinti [Eur. J. Biochem. 133, 17-21 (1983)] szekréciós szignál szekvencia szabályainak.

E feltevések megerősítése céljából izoláltunk fitáz cDNS-t PCR-sokszorozással, specifikus fitázprimerek és egy teljes mRNS/cDNS populációnak templátként való alkalmazásával, az alább leírt eljárásnak megfelelően. Poli A RNS izolálása Aspergillus ficuumból

Ossz RNS-t izoláltunk a 6. példában említett indukciós körülmények között tenyésztett A. ficuum NRRL 3135 sejtekből. A száraz micéliumot folyékony nitrogénben lefagyasztjuk s megőröljük. A port ezután Ultra-Turrax készülékben homogenizáljuk (teljes sebesség 1 percen át) 0 °C-on, 3 M lítium-klorid, 6 M karbamid elegyében. A homogenizált anyagot 4 °C-on tartjuk egy éjszakán át Auffrey és Rougeon [Eur. J. Biochem., 107, 303-314 (1980)] közlése szerint. Az ossz sejt RNS-t úgy izoláljuk, hogy 16 000 g mellett 30 percig centrifugáljuk és kétszer egymás után fenol:kloroform:izoamilalkohol (50:48:2) elegyével extraháljuk. Az RNS-t etanollal csapjuk ki, majd 1 ml 0,5% SDS tartalmú 10 mmólos triszixHCl-ben (pH =7,4) feloldjuk. A poliA⁺ szelekciójához az ossz RNS mintát 5 percig 60 °C-on hevítjük, 0,5 M NaCl tartalmat állítunk be, majd ezután felvisszük egy oligo(dT)-cellulóz oszlopra. Az elegyet többször mossuk 10 mM triszxHCl (pH = 7,4), 0,5% SDS és 0,1 M NaCl tartalmú oldattal, ezután a poliA⁺ RNS-t 10 mM triszi-HCl (pH =7,4) és 0,5% SDS tartalmú oldattal eluáljuk.

mRNS/cDNS komplex készítése

Az első cDNS szál szintéziséhez 5 gg poliA⁺ RNS-t feloldunk 16,5 μΐ vízben, és ehhez hozzáadjuk a következő komponenseket: 2,5 μΐ Rnasin (30 E/ml), 10 μΐ puffer, amely 50 mM triszxHCl-t (pH =7,6), 6 mM MgCl₂-t és 40 mM KCl-t tartalmaz, 2 μΐ 1 M KC1, 5 μΐ 0,1 M DTT, 0,5 μΐ oligo(dT)₁₂_₁₈ (2,5 g/ml), 5 μΐ 8 mM dNTP-keverék, 0,5 μΐ BSA (1 mg/ml), 2,5 μΐ Moloney MLV reverz transzkriptáz (200 E/ml). Az elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk és a reakciót 10 μΐ 0,2 mólos EDTA és 50 μΐ H₂O hozzáadásával állítjuk le. Kloroformos extrakciót végzünk, majd centrifugálás

HU 215 179 Β

Fitáz cDNS-fragmentumok klónozása

A cDNS-kódoló fitázszekvenciák izolálását polimeráz láncreakció (PCR = polymerase chain reaction) segítségével végezzük két fragmentumban. Négy szinteti5 kus oligonukleotid prímért terveztünk meg a 6. ábrában bemutatott genomiális fitázszekvenciára alapozva:

után a felülúszóhoz hozzáadunk egymás után 110 μΐ 5 M ammónium-acetátot és 440 μΐ etanolt. Az mRNS/cDNS komplex kicsapását szárazjég/etanol oldatban végezzük 30 percig. A mRNS/cDNS-t centrifugálással gyűjtjük össze, ezután 70%-os jéghideg etanollal mossuk és 20 μΐ vízben oldjuk.

Oligo

1:

5’-GGG

TAG

AAT

TCA

AAA

ATG

GGC

GTC

TCT

GCT

GTT

CTA-3'

Oligo

2:

5’-AGT

GAC

GAA

TTC

GTG

CTG

GTG

GAG

ATG

GTG

TCG·

-3'

Oligo

3:

51-GAG

CAC

CAA

GCT

GAA

GGA

TCC-

-3'

Oligo

4 :

5 1 -AAA

CTG

CAG

GCG

TTG

AGT

GTG

ATT

GTT

TAA

AGG

G-3'

Az oligo 1 tartalmazza azt a nukleotid szekvenciát, amely a fitáz ATG start kodontól 3’ irányban (downstream) helyezkedik el (210-231 pozíció), s 5’ végét egy EcoRI hely határolja; az oligo 2 azt a nukleotid szekvenciát tartalmazza, amely a Sáli helytől 5’ irányban (upstream) közvetlenül mellette helyezkedik el (1129-1109 pozíció) és amelyet szintén egy további EcoRI hely határol; az oligo 3 a BamHI hely körüli nukleotid szekvenciát tartalmazza (845-865 pozíció) és az oligo 4 a fitáz stop kodontól 3’ irányban (upstream) elhelyezkedő nukleotid szekvenciát tartalmazza (1890-1867 pozíció), amelyet egy további PstI hely határol.

A polimeráz lánc reakciót a Taq polimerázt gyártó cég (Cetus) előírásai szerint végeztük el. Templátként a mRNS/cDNS hibrideket (leírását lásd fentebb) tartalmazó oldatot (1,5 μΐ) használtuk. A fitáz N-terminális cDNS részének a meghosszabbítására irányuló reakcióban az oligo 1-ből is és az oligo 2-ből is mint primerekből 0,3-0,3 pg-ot és a fitáz C-terminális cDNS részének a meghosszabbítását szolgáló reakcióban az oligo 3-ból és az oligo 4-ből mint primerekből szintén 0,3-0,3 pg-ot használtunk (lásd a 8. ábrát). Denaturálás után (7 perc 100 °C-on) és 2 egység Taq polimeráz hozzáadása után a reakcióelegyet 25 sokszorozó ciklusnak vetettük alá (2’ 55 °C-on, 3’ 72 °C-on, 1’ 94 °C-on minden ciklusban) egy Perkin-Elmer/Cetus DNS-sokszorozó készülékben. Az utolsó ciklusban elhagytuk a denaturáló lépést. Emésztés után (az N-terminális cDNS részhez EcoRI-et és a C-terminális cDNS részhez BamHI és Pstl-et használtunk) mindkét cDNS-fragmentumot a pTZl 8R (Promega) megfelelő helyeire klónoztuk be.

A kapott két PCR-fragmentum nukleotid szekvenciáját a didezoxi láncterminációs technikával (Sanger, lásd fent) határoztuk meg, a kromoszomális fitázgén szekvencia alapján előállított szintetikus oligonukleotidok mint primerek használatával, templátként pedig a teljes meghosszabbított DNS-t, valamint a klónozott cDNSfragmentumokat használtuk. A fitázproteint kódoló cDNS-szakasz szekvenciáját és a fitázprotein ebből eredő aminosav-szekvenciáját a 8. ábra tartalmazza.

A cDNS-szekvencia megerősítette a feltételezett intron (lásd fent) helyzetét, és megmutatta, hogy más intronokat nem tartalmaz a kromoszomális génszekvencia.

A fitázgén egy 467 aminosavból álló transzlációs terméket kódol (molekulatömege: 51091), a szignál peptid lehasítása révén feldolgozott elsődleges transzlációs termékből keletkezik az érettfitáz protein, amely 444 (molekulatömeg: 48 851) vagy 448 (az Ullah által közölt első négy N-terminális aminosavat tartalmazza; molekulatömeg: 49 232) aminosavat tartalmaz.

9. példa

Fitáz intenzív kifejlődése Aspergillusokban további fitáz genomiális DNS-másolatok bevezetése révén A pAF 2-2S expressziós vektor szerkesztése

Minden szerkezetet standard molekuláris biológiai eljárásokkal állítottunk elő, Maniatis és munkatársai leírása szerint [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., USA (1982)].

A pAF 2-2S expresszió vektort úgy készítettük, hogy a lambda AF201 fitáz genomiális klón 6 kb PvuII DNSffagmentumát a pUC19 Smal helyére klónoztuk be. A kapott plazmidot pAF 2-2 jelzéssel láttuk el (4. ábra). Ezután a homológ Aspergillus nidulans amdS gént tartalmazó pGW325 plazmid [K. Wemars, Tézisek, Mezőgazdasági Egyetem, Wageningen, Hollandia (1986)] EcoRI/KpnI DNS-fragmentumát mint szelekciós markert az Aspergillus transzformációjához, beépítettük a pAF 2-2 EcoRI/KpnI helyére. A keletkezett expressziós vektort pAF 2-2S-nek neveztük el és a 9. ábrán mutatjuk be. A. A fitáz intenzív kifejeződése A. ficuum NRRL 3135 sejtekben

A pAF 2-2S plazmidot A. ficuum NRRL 3135 sejtekbe vezettük be J. Tilbum és munkatársai [Gene, 26, 205-221 (1983)] és J. Kelly és M. Hynes [EMBO I, 4, 475—479 (1985)] által leírt transzformációs eljárások használatával, a következő módosításokkal:

- protoplasztképzéshez Novozym 234-et (NOVO Industri) használunk és nem helikázt;

- a 90 percen protoplasztképzés után 1 térfogat STC puffért (1,2 M szorbit, 10 mM trisz*HCl, pH = 7,5, 50 mM CaCl₂) adunk a protoplaszt szuszpenziójához, amelyet 2500 g mellett 4 °C-on 10 percig centrifugálunk, lengőhüvelyű rotorban. A protoplasztokat mossuk, majd STC pufferben reszuszpendáljuk úgy, hogy koncentrációja 10⁸ sejt/'ml legyen;

- a protoplaszt-szuszpenzió 100 μΐ-éhez TE pufferben (10 mM triszxHCl, pH = 7,5, 0,1 mM EDTA) készített 10 μΐ plazmid DNS-t adunk;

- a DNS-protoplaszt szuszpenziót 0 °C-on 25 percig inkubáljuk, és ezután cseppenként 200 μΐ PEG

HU 215 179 Β oldatot (25% PEG 4000 Merck, 10 mM triszxHCl, pH =7,5, 50 mM CaCl₂) adunk hozzá. Ezután 1 ml PEG oldatot (60% PEG 4000, 10 mM triszxHCl, pH =7,5, 50 mM CaCl₂) adunk hozzá lassan, a csöveket ismételten keverve. Szobahőmérsékleten való inkubálás után a szuszpenziót STC pufferrel hígítjuk, összekeverjük a csövek átfordítgatásával, és 2000 g mellett 4 °C-on 10 percig centrifugáljuk. A protoplasztokat 200 ul STC pufferben óvatosan reszuszpendáljuk, majd lemezre szélesztjük Aspergillus minimál táptalajra, amely 10 mM acetamidot tartalmaz egyetlen nitrogénforrásként, továbbá 15 mM CaCl-t, 1 M szaccharózt. A szilárd táptalajt 0,75% bakterológiai agar (Oxoid Nr. 1) hozzáadásával készítjük el. A tenyésztés 33 °C-on 6-10 napig tart.

Egyedi transzformált sejteket - jelzésük: SP4, SP7 és SP8 - izoláltunk, tisztítottunk és fítáztermelésre vizsgáltunk rázott lombikokban, az 1. és 2. példában leírt eljárást használva. Kontrollként olyan transzformáit sejteket teszteltünk, amelyek csak a vektort (amdS gén a pUC 19-ben) tartalmazták, továbbá a transzformálatlan gazdasejtet.

A törzseket indukciós körülmények között (lásd a 6. példát) tenyésztettük, a mintavétel 96 órás tenyésztés után történt. Az analíziseket a fítázaktivitás mérésével (4. táblázat) és izoelektromos fókuszáló poliakrilamid gél elektroforézissel (IEF-PAGE) végeztük.

Az A. ficuum és az A. ficuum pAF 2-2S SP7 azonos körülmények között végzett fermentációs tenyészeteiből egyenlő mennyiségű mintákat veszünk, s ezeket IEF-PAGE gélre (pH-tartomány: 4,5-6; Fast-System; Pharmacia) visszük. Az elektroforézist a gyártó cég utasításai szerint végezzük. Ezután a géleket vagy az általános proteinfestő Coomassie briliáns kékkel festjük (10B ábra), vagy az általános foszfátaktivitás festéssel, amelyet a 2. példában írtunk le (10A ábra).

Gélre viszünk egy homogenitásig tisztított (immunaffinitás kromatográfiával, a 7. példában leírtak szerint) A. ficuum fitázmintát vagy egyedül vagy tenyészet-felülúszóhoz keverve.

A különböző mintákban a fitáz számos izoformája volt jelen (csillaggal jelezzük), amint ezt a találmányban megemlítettük. A két fő izoenzim világosan látszik a tisztított fitázban, a 3-as és a 4-es sávban, mindkét festési módszerrel (A és B). A fitázfoltok alig láthatók az eredeti A. ficuum törzsnél, de jelentősen erősebbek a pAF 2-2S SP7 transzformált törzsnél.

4. táblázat

Törzs	Fítázaktivitás (E/ml)
A. ficuum	0,6
A. ficuum + kontrollplazmid	0,6
A. ficuum pAF 2-2S SP8	7,6
A. ficuum pAF 2-2S SP7	6,7
A. ficuum pAF 2-2S SP4	4,3

B. A fitáz intenzív kifejlődése A. niger CBS

513.88 sejtekben

A pAF 2-2S expressziós vektort A. niger CBS

513.88 sejtekbe (deponálva 1988. 08. 10-én a Centraal Burean voor Schimmelcultures-nél, Baam, Hollandia) is bevezettük olyan transzformációs eljárásokkal, mint amilyeneket az A. ficuumnál leírtunk. Egyedi transzformáit sejteket izoláltunk, tisztítottunk és fítáztermelésre vizsgáltunk rázott lombikokban, a 6. példában leírt indukciós tenyésztési körülmények között.

Megvizsgáltuk néhány transzformált sejt (jelük: A. niger pAF 2-2S, Nr. 8, Nr. 20 és Nr. 33) és kontrolitörzs expressziós szintjét a 9A példa szerint. Az eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.

Az A. niger transzformált sejtek fitázexpressziós szintje az A. ficuum transzformált sejtekéhez hasonlítható. Ezenkívül ez az eredmény azt is mutatja, hogy az A. ficuum fitáz promotere A. nigerben is működik.

A pAF 2-2 S Nr. 8 transzformált sejtek tenyészetét további analízisnek vetettük alá IEF-PAGE gélben való elektroforézissel, 4,5-6 pH tartományban, a fent leírt Fast-System (Pharmacia) használatával. Az eredeti A. niger törzs és a pAF 2-2S Nr. 8 transzformált sejtek tenyészetének - a tenyésztést azonos körülmények között végeztük — felülúszóiból egyenlő mennyiségeket vittünk a gélre. A géleket megfuttattuk, majd mint fent, megfestettük.

Az eredeti A. niger nagyon kis mennyiségű fitázt termel, s így gél-elektroforézissel nem lehetett kimutatni. A pAF 2-2 S Nr. 8 mintegy 90-szer több fitázt termel, és a különbség világosan látható all. ábrán.

A fitázenzim számos izoformáját mutattuk ki (csillaggal jelezve). Az általános proteinfestés jelezte, hogy a fitázproteinsávok intenzitása erősen megnőtt, ugyanakkor más fő proteinsávok nem jelentek meg.

5. táblázat

A pAF 2—2S-sel transzformált A. niger CBS

513.88 fitáz termelése

Törzs	Fítázaktivitás (E/ml)
A. niger	0,2
A. niger + kontrollplazmid	0,2
A. niger pAF 2-2S Nr. 8	14
A. niger pAF 2-2S Nr. 33	5
A. niger pAF 2-2S Nr. 20	4

10. példa

Fitázkifejeződés az A. niger amiloglükozidáz (AG) gén promoterével és/vagy szignál szekvenciáival fuzionált A. ficuum fitázgént tartalmazó expressziós vektorokkal transzformált A. nigerben

Az expressziós vektorok szerkesztése

Annak érdekében, hogy az A. nigerben intenzív fitázexpressziót kapjunk, további expressziós kazettákat szerkesztettünk, amelyekben az A. ficuum fitázgént az A. niger amiloglükozidáz (AG) promotemek különböző szignál szekvenciákkal való kombinációja szabályozza.

HU 215 179 Β

Az A. nigerből származó AG gén 18, illetve 24 aminosavból (as) álló vezérszekvenciáit, amelyeket a pl 8FYT3, illetve a p24FYT3 tartalmaz, az érett proteint kódoló fitázgén-fragmentummal fuzionáltuk. A pFYT3 expressziós kazettában az AG promoter szekvencia a fitáz-vezérszekvenciát magába foglaló fitázt kódoló szekvenciához van fuzionálva.

A pl8FYT3 szerkesztése

Az AG promotemek és a 18 as AG vezérszekvenciának az érett proteint kódoló fitázszekvenciához való fuzionálását PCR módszerrel végeztük el. A PCR reakciókban két különböző templátot használtunk: a pAF

2-2S-t, amely a teljes fitázgént tartalmazza (lásd fent) és a pAB6-l plazmidot, amely az A. niger teljes AG lokuszát tartalmazza, s amelyet egy A. niger plazmidgyűjteményből izoláltunk. A gyűjtemény pUC 19-ben 13-15 kb HindlII fragmentumokat tartalmaz. Az izoláláshoz AG-specifikus oligonukleotidokat (oligo) használtunk:

AG-1: 5 '-GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACATTGTTTGGCCC-3 ’ AG-2: 5 ’-AAGCAGCCATTGCCCGAAGCCGAT-3 ’

Mindkét szekvencia alapját az A. nigerre közölt [Boel és munkatársai, EMBO J., 3, 1097-1102 (1984)] nukleotid szekvencia képezi. Az oligonukleotid szondák az intron2 körüli szekvenciából származnak: az AG-1 oligo az intron 3’ része felé helyezkedik el, és polaritása azonos az AG mRNS-ével. Az AG-2 az

Oligo 1: 5 ’-CTCTCtCAGGAATTCAAGCTAG-3 ’ (egy AG specifikus szekvencia az ATG iniciációs kodontól 5’ felé mintegy 250 bp-ral, egy EcoRI hely körül helyezkedik el).

Oligo 18-2: 5 ’-CGAGGCGGGGACTGCCAGTGCCAACCCTGTGCAGAC-3’

I érett fitáz <-> 18 as AG vezérszekvencia

Oligo 18-3: 5 -GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3’

I as vezérszekvencia <-> érett fitáz

Oligo 4: 5 ’-GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3 ’ (a 861. pozícióban lévő BamHI helynél elhelyezkedő fitázspecifikus szekvencia)

A PCR-t Saiki és munkatársai [Science, 239, EcoRI/BamHI fragmentumához ligáltuk, végül bekló487^491 (1988)] szerint végeztük, kisebb módosításokkal (lásd a 8. példát).

Abból a célból, hogy az AG szekvenciákat a fitázkódoló szekvenciákkal fuzionáltuk, két külön PCR-t végeztünk: az első reakcióban, amelyben a pAB6-l templátként és az oligo 1 és az oligo 18-2 primerekként szerepeltek, megsokszoroztunk egy 300 bp DNS-fragmentumot, amely az AG promoter 3’ részét és a 18 as AG vezérszekvenciát tartalmazza, amelyet 3’ szélén a fitázgén határol, és a második reakcióban, amelyben a pAF 2-2S mint templát és az oligo 18-3 és az oligo 4 mint primerek szerepelnek, megsokszoroztunk egy 600 bp DNS-fragmentumot, amely a fitázgén 5’ részét tartalmazza, amelyet 5’ szélén az AG szignál peptid 18 nukleotidja határol. A sokszorozások sematikus képe a 13. ábrán látható.

A két DNS-fragmentumot gél-elekroforézissel tisztítottuk, etanollal csaptuk ki, és templátként használtuk fel egy harmadik PCR-ben az oligo 1 és oligo 4 primerekkel együtt, hogy létrehozzuk az AG-fitáz fúziót. A kapott DNS-fragmentumot EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztettük és p-TZ18R-be klónoztuk be. A kapott fuzionált szekvenciát szekventáltuk és pl8FYTl jelzéssel láttuk el.

Az AG promoter kimaradt 5’ szakaszát (3,5 kb) úgy kaptuk meg, hogy pAB6-l-et KpnI-gyel és részlegesen EcoRI-gyel emésztettünk, majd a pl8FYTl 1,1 kb intron 2-höz képest 5 ’ felé (upstream) helyezkedik el és úgy van megválasztva, hogy az AG mRNS-sel antiparallel fusson. A pAB6-l egy 14,5 kb HindlII fragmentumon tartalmazza az AG gént (lásd a 12. ábrát).

A PCR-sokszorozásokhoz négy szintetikus oligonuk20 leotid prímért terveztünk a következő szekvenciákkal:

noztuk a pTZ18R KpnI/BamHI helyére. Az így kapott pl8FYT2 plazmidot a 15. ábrán mutatjuk be.

A pAF 2-2 S EcoRI helyére (az amdS génnel határos) egy további HindlII restrikciós helyet vezettünk be az alábbi szintetikus fragmentum beépítésével:

5’ AATTCAAGCTTG 3’

GTTCGAACTTAA 5’

A kapott plazmidot pAF 2-2SH-nak (14. ábra) neveztük el, és start plazmidként használtuk abban a reakcióban, amelyben a fitázpromoter szekvenciákat kicserél45 tűk a PCR-rel készített AG-fitáz fúziós DNS-ffagmentumokra.

A végső szerkesztéshez a pl8FYT2-t és a pAF 2-2SH-t KpnI-gyel és részlegesen BamHI-gyel emésztettük. A pl8FYT2 4,6 kb DNS-fragmentumát és a pAF

2-2SH 11 kb DNS-fragmentumát izoláltuk, gélelektroforézissel tisztítottuk, majd ligáltuk és bevittük E. coliba. Az így készített expressziós kazettát pFYT3nak neveztük el (15. ábra).

A p24FYT3 szerkesztése

Az AG promotemek és a 24 as AG vezérszekvenciának az érett fitázt kódoló szekvenciával való fuzionálását PCR-amplifikációs módszerrel végeztük el, ahogyan ezt a pl8FYT3 szerkesztésénél fent leírtuk, azzal a különbséggel, hogy más primereket használtunk. Két új prímért szintetizáltunk az alábbi szekvenciákkal:

HU 215 179 Β

Oligo 24-2: 5 ’ -CGAGCCGGGGACTGCC AGGCGCTTGGAAATC AC ATT-3 ’

I érett fitáz <-> 24 as AG vezérszekvencia

Oligo 24-3: 5 '-AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG-3’ as vezérszekvencia

Két külön PCR-t végeztünk: az első reakcióban a pAB6-l-et templátként és az oligo 1-et és az oligo 24-2-t primerként használtuk, hogy megsokszorozzunk egy 318 bp DNS-fragmentumot, amely az AG promoter 3’ részét és a 24 as AG vezérszekvenciát tartalmazta, amelyet 3’ végén a fitázgén 18 nukleotidja határolt. A második reakcióban, amelyben a pAF 2-2S mint templát és az oligo 24-3 és oligo 4 mint primerek vettek részt, egy olyan DNS-fragmentumot sokszoroztunk meg, amely a fitázgén 5’ részét tartalmazta, amelyet a 24 as AG vezérszekvencia határolt az 5’ végén. Az amplifikációk sematikus képe a 13. ábrán látható.

<-> érett fitáz

A p24FYT3 végső expressziós kazettának a p24FYTl és a P24FYT2 közti plazmidokon keresztül ) végzett szerkesztésében ugyanazt a klónozó folyamatot/eljárást használtuk, mint amit a pl8FYTl és pl8FYT2-nél használtunk a pl8FYT3 expressziós kazetta megszerkesztése céljából (lásd a 15. ábrát).

A pFYT3 szerkesztése i Az AG promoter és a fitázgén (a fitáz-vezérszekvenciával együtt) fúzióját ugyancsak PCR-amplifikációs módszerrel hajtottuk végre, ahogyan azt a pl8FYT3 szerkesztésénél leírtuk, kivételt képeztek a használt primerek. Két további prímért készítettünk a ) következő szekvenciákkal:

Oligo fyt-2: 5-AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGATG-3’ I fitáz-vezérszekvencia <-> AG promoter

Oligo fyt-3: 5’-CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3’

I

AG promoter <-> fitáz-vezérszekvencia

Két külön PCR-t végeztünk: az első reakcióban a pAB6-l-et templátként és az oligo 1-et és az oligo fyt-2-t primerekként használtuk, hogy megsokszorozzunk egy 282 bp DNS-fragmentumot, amely az AG promoter 3’ részét tartalmazta, amelyet 3’ végén a fitázvezérszekvencia 18 nukleotidja határolt, és a második reakcióban, amelyben a pAF 2-2S mint templát és az oligo fyt-3 és oligo 4 mint primerek vettek részt, egy olyan DNS-fragmentumot sokszoroztunk meg, amely a fitázgén 5’ részét (a fitáz-vezérszekvenciával együtt) tartalmazta, amelyet 5’ végén az AG promoter 18 nukleotidja határolt. Az amplifikációk sematikus képét a 13. ábrán mutatjuk be.

A pFYT3 végső expressziós kazettának a pFYTl és pFYT2 közti plazmidokon keresztül végzett megszerkesztéséhez ugyanazon klónozó folyamatot/eljárást használtuk, mint amit a pl8FYTl és a pl8FYT2-nél alkalmaztunk a pl8FYT3 expressziós kazetta megszerkesztése végett.

A fitázgén kifejeződése az AG promoter szabályozása alatt A. nigerben

A fent leírt expressziós kazettákból E. coli szekvenciákat távolítottunk el HindlII-mal való emésztéssel. Ezután az A. niger CBS 513.88 törzset 10 pg DNSfragmentummal transzformáltuk a 9. példában leírt eljárás szerint. Minden egyes expressziós kazettának megfelelően egyedi A. niger transzformált sejteket izolál30 tünk, és a spórákat szelektív acetamid-agar lemezekre szélesztettük. A 3 napon át 37 °C-on 0,4% krumplidextróz agar lemezeken (Oxoid, Anglia) tenyésztett sejtek közül az egyes transzformált sejtek spóráit összegyűjtöttük. A fitáztermelést rázott lombikokban vizs35 gáltuk az alábbi tenyésztési feltételek mellett:

Körülbelül lxlO⁸ spórát oltunk be 100 ml előtenyésztő táptalajba, amely literenként a következőket tartalmazza: 1 g KH₂PO₄, 30 g maltóz, 5 g élesztókivonat, 10 g kazein-hidrolizátum, 0,5 g MgSO₄*7H₂O és

3 g Tween 80. A pH-t 5,5-re állítjuk be.

A tenyésztést 34 °C-on végezzük egy éjszakán át forgó rázógépben, majd ezután ebből a tenyészetből 1 ml-rel oltjuk be a főtenyésztéshez szolgáló 100 ml táptalajt, amelynek összetétele literenként a következő:

2 g KH₂PO₄, 70 g malto-dextrin (Maldex NDO₃, Amylum), 12,5 g élesztőkivonat, 25 g kazeinhidrolizátum, 2 g K₂SO₄, 0,5 g MgSO₄*7H₂O, 0,03 g ZnCl₂, 0,02 g CaCl₂, 0,05 g MnSO₄*4H₂O és FeSO₄. A pH-t 5,6-ra állítjuk be.

A micéliumot legalább 140 óra hosszat tenyésztjük. A fitáztermelést a 2. példában leírtak szerint végezzük. Az egyes expressziós kazettákból kapott néhány találomra kiválasztott transzformált sejt termelési eredményeit a 6. táblázat tartalmazza.

HU 215 179 Β

6. táblázat

Különböző vezérszekvenciákkal kombinált A. niger AG promoter által szabályozott A. fícuum fitázgént tartalmazó plazmidokkal transzformált néhány A. niger CBS 513.88 törzs fitáztermelése

Expressziós kazetta	Transzformált sejt	Fitáz- aktivitás (E/ml)
	pl8FYT3 #240	82
	pl8FYT3#242	84
pl8FYT3	pl8FYT3#243	62
(AG promoter/	pl8FYT3#244	43
18 aa AG-vezér)	pl8FYT3#245	80
	pl8FYT3#246	82
	pl8FYT3#250	110
	p24FYT3 # 256	8
	p24FYT3 # 257	30
p24FYT3 (AG promoter/ 24 aa AG-vezér)	p24FYT3 # 258 p24FYT3 # 259 p24FYT3 # 260 p24FYT3 # 261	13 33 17 28
	p24FYT3 # 262	18
	p24FYT3 # 265	12
	pFYT3 # 205	50
	pFYT3 # 282	280
pFYT3 (AG promoter/ fitáz-vezér)	pFYT3 # 299	96
pFYT3 #302 pFYT3 # 303 pFYT3 # 304	220 175 150
	pFYT3 # 305	150
	pFYT3#312	140

Az adatok világosan mutatják, hogy az A. niger AG promotere irányítása alatt álló fitázgént tartalmazó A. niger transzformált sejtekben magas szintű az expresszió. Az adatokból az is kitűnik, hogy a legnagyobb fitáztermelést a fitázvezérszekvenciát tartalmazó pFYT3 expressziós vektorral kapjuk. Intron nélküli fitázgént tartalmazó hasonló expressziós vektorokkal transzformált A. nigemél a kapott fitázexpressziós szint a pFYT3 A. niger transzformált sejtekéhez hasonlítható.

Ezenkívül a pFYT3 Nr. 205 és Nr. 282 transzformáit sejtek tenyészetének felülúszóját elektroforézissel analizáltuk IEF-PAGE gélben, 4,5-6 pH tartományban. Azonos körülmények között tenyésztett eredeti A. niger törzs és a két transzformált törzs sejtjei tenyészetének felülúszójából azonos mennyiségeket vittünk a gélre, megfuttattuk, majd a 9. példában leírtak szerint megfestettük. Az eredeti A. niger igen kis mennyiségű fitázt termelt, amelyet ez a kísérlet nem mutatott ki. A pFYT3 Nr. 205 és Nr. 282 törzs körülbelül 250-szer és 1400-szor több fitázt termelt (a fitázszintek összehasonlítását lásd az 5. és 6. táblázatban). Ez a különbség jól látható a 11. ábrában. A fitázenzim számos izoformáját észleltük (csillaggal jelölve). Általános proteinfestéssel kimutattuk, hogy a fitázproteinsávok intenzitása nagymértékben megnőtt, míg más nagyobb proteinsáv nem jelent meg.

11. példa

Intenzív fitázkifejeződés ipari méretekben tenyésztett A.ficuumban és A. nigerben A. A.ficuum

Az A. fícuum pAF 2-2S Nr. 4 (azonos a 9A példa szerinti pAF 2-2S SP4-gyel) és az A. fícuum NRRL 3135 törzset az 1. példában leírt módon tenyésztettük. A transzformált törzs közel 50-szer több fitázt termelt, mint a vad típusú törzs.

7. táblázat

Fitáz intenzív kifejeződése sok fitázgént tartalmazó A. fícuum transzformált sejtekben. A sejteket az 1. példa szerint tenyésztettük.

A beoltás után eltelt órák	Fitázaktivitás (E/ml fermentlé)
A. fícuum NRRL 3135	A. fícuum pAF 2-2SH Nr. 4
0	0	0
24	0	0
92	2	142
141	5	270

B. A. niger

Az A. niger pAF 2-2SH Nr. 8 törzset (azonos a 9B példa szerinti A. niger pAF 2-2SH Nr. 8 transzformánssal) és magát az eredeti A. niger törzset az 1. példa szerint tenyésztettük. A transzformált törzs körülbelül 1000-szer több fitázt termelt, mint az eredeti A. niger szülőtörzs (8. táblázat).

8. táblázat

Fitáz intenzív kifejeződése sok fitázgént tartalmazó A. niger (CBS 513.88) transzformált sejtekben. A sejteket az 1. példa szerint tenyésztettük.

A beoltás után eltelt órák	Fitázaktivitás (E/ml fermentlé)
A. niger CBS 513.88	A. niger pAF 2-2SH Nr. 8
0	0	0
24	0	5
92	0,1	65
141	0,1	95

12. példa

A pREPFYT3 vektor szerkesztése céljából, amellyel egyidejűleg valósítható meg a fitáz expressziója és az AG génnel való helyettesítés, a pFYT3-at KpnI-gyel emésztjük. A kapott lineáris KpnI DNS-fragmentummal két külön ligálást végzünk.

1. számú ligálás KpnI-HindlII adapterrel:

5’- CGGGGA -3’ ’-CATGGCCCCTTCGA -5’

KpnI HindUI

2. számú ligálás KpnI HindUI* adapterrel, amelyben a HindlII restrikciós helyet a ligálás után nem állítjuk helyre:

HU 215 179 Β

5’- CGGGGG -3’

3’-CTAGGCCCCCTCGA -5’

KpnI HindlII*

Az 1. számú ligáíást követően részleges emésztés következik HindlII-mal. Az amdS-t tartalmazó fragmentumot gél-elektroforézissel távolítjuk el, a megmaradt DNS-fragmentumot recirkularizáljuk Íigálással és bevisszük E. coliba. A kapott plazmid pFYT3AamdS elnevezést kapott (lásd aló. ábrát).

A 2. számú ligálás anyagát szintén HindlII-mal emésztjük, és az amdS-t tartalmazó 4 kb HindlII/HindlII* DNS-fragmentumot gél-elektroforézissel izoláljuk, majd a pFYT3 amdS egy HindlIImal részlegesen emésztett részéhez ligáljuk, végül E. coliba visszük be. A píazmidot, amely a fitázgén 3’ végén az amdS gént tartalmazza, pFYT3INT jellel láttuk el (lásd a 17. ábrát).

Hogy bevezessük a pAB6-l mintegy 6 kb Sall/HindlII DNS-ffagmentumát, amely 3’ végénél az AG szekvenciát tartalmazza, a pFYT3INT píazmidot részlegesen emésztjük HindlII-mal, ezután először az alábbi adapterhez ligáljuk:

5’-AGCTAGGGGG -3’ _TCCCCCAGCT-5 ’

HindlII* Sáli (itt a HindlII* restrikciós helyet nem állítjuk vissza a ligálás után), majd ezt követően a pAB6-l Sall/HindlII fragmentumához ligáljuk. Az E. coli transzformálása után kapjuk meg a kívánt pREPFYT3 píazmidot, amely 3’-végén a korrekt pozícióban tartalmazza az AG szekvenciát (18. ábra).

Fitáz kifejeződése A. nigerben az AG gén helyettesítésével

Mielőtt az A. nigert a pREPFYT3-mal transzformáljuk, a plazmidban az E. coli szekvenciákat eltávolítjuk HindlII-mal való emésztéssel és gél-elektroforézissel. Az A. niger CBS 513.88 törzset 10 pg DNS-fragmentummal transzformáljuk a 9. példában leírt eljárásokkal. A transzformált sejtek szelekcióját és tenyésztését a 9. példában leírtak szerint végezzük. A szelektált transzformáit sejteknek csak egy igen csekély része vesztett AG aktivitásából (körülbelül 20%-a). Az AG negatív és fitázpozitív transzformált törzseknél elvégeztük a kromoszomális DNS Southem-analízisét annak bizonyítására, hogy az AG gént valóban helyettesítette-e a fitázgén.

13. példa

A fitázgén állandósága a különböző fajokban

A fitázgénnek mikrobiális fajokban való nagyfokú állandósága meghatározása céljából elvégeztük tíz különböző faj kromoszomális DNS-ének Southem-analízisét, amelyben szondaként az A. ficuum fitáz cDNS-t használtuk.

E kromoszomális DNS-analíziseket a következő fajoknál végeztük el: fonalas gombák, élesztők és baktériumok. Minden csoportból példaként csak korlátozott számú törzset választottunk, a fonalas gombák közül a Penicillium chrysogenumot és az Aspergillus nigert; élesztők közül a Saccharomyces cerevisiae-t és a

Kluyveromyces lactist és a prokarióta mikroorganizmusok közül a Gram-pozitív fajokat, a Bacillus subtilist, Clostridium thermocellumot és a Streptomyces lividanst, végül a Gram-negatív baktériumok közül a Pseudomonas aeruginosát választottuk.

Az ezekből a fajokból származó nagy molekulatömegű DNS-t külön-külön PvuII-vel és BamHI-gyel emésztettük, és ezután 0,7%-os agaróz gélben elektroforetizáltuk.

Nitrocellulóz szűrőkre való átvitel után a hibridizálást egy éjszakán át alacsony szigorúsági feltételek mellett (6xSSC; 50 °C) végeztük ³²P-vel jelzett 5’-fitáz cDNS-fragmentummal (lásd a 8. példát). A biotokat 6xSSC-ben mostuk szobahőmérsékleten, majd 18 óra hosszat röntgensugárral kezeltük.

A 19A és a 19B ábrán diszkrét sávokat észleltünk majdnem minden nyomsávban, ami a mikrobiális fajokban lévő fitázgének nagyfokú homológiáját jelenti.

Claims (19)

1. Eljárás DNS-szekvencia előállítására, amely egy gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptidet kódol, azzal jellemezve, hogy (i) átvizsgálunk egy gomba eredetű genomiális vagy cDNS könyvtárat egy, a 6. vagy 8. ábrából származó nukleotid-szekvenciákat tartalmazó hibridizációs próbával, (ii) az (i) lépésben azonosított kiónokat tenyésztjük, és (iii) izoláljuk az azonosított kiónokból a fitáz aktivitású polipeptidet kódoló, klónozott DNS-szekvenciát.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gomba genomiális vagy cDNS könyvtár egy Aspergillus könyvtár.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gomba genomiális vagy cDNS könyvtár egy Aspergillus niger vagy Aspergillus ficuum könyvtár. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

4. Eljárás expressziós szerkezet előállítására egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapott, egy gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvencia kifejezésére, azzal jellemezve, hogy az említett klónozott DNS-szekvenciát legalább egy promoter-szekvenciával és adott esetben egy szekréciós vezérszekvenciával működőképesen összekapcsoljuk.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amiloglükozidáz génből származó vagy fitáz génnel homológ promoter-szekvenciát alkalmazunk. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amiloglükozidáz génből származó vagy fitáz génnel homológ szekréciós vezérszekvenciát alkalmazunk. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

7. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas vektorba beépítünk egy, a

HU 215 179 Β

4-6. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós szerkezetet.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy plazmid vektort állítunk elő.

Elsőbbsége: 1989. 09.27.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pAF 28-1, pAF 2-2S, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2—4, pAF 2-6 vagy pAF 2-7 plazmidot állítjuk elő. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pl8FYT3, p24FYT3 vagy pFYT3 plazmidot állítjuk elő.

Elsőbbsége: 1990. 08. 17.

11. Eljárás egy transzformált gazdasejt előállítására, amely képes egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárással kapott, egy gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptidet kódoló DNS-szekvencia kifejezésére, azzal jellemezve, hogy (i) egy gazdasejtet egy, a 4—6. igénypontok bármelyike szerint előállított expressziós szerkezetet tartalmazó vektorral transzformálunk, és (ii) szelektáljuk az expressziós szerkezetet tartalmazó gazdasejteket.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztő-, gomba- vagy bakteriális sejtet alkalmazunk.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Kluyveromyces vagy Saccharomyces nemzetséghez tartozó sejtet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae,

Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis vagy Saccharomyces cerevisiae fajba tartozó sejtet alkalmazunk.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

15. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Bacillus nemzetséghez tartozó sejtet alkalmazunk

Elsőbbsége: 1990.08. 17.

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként Bacillus subtilis vagy Bacillus licheniformis fajba tartozó sejtet alkalmazunk. Elsőbbsége: 1990. 08. 17.

17. Eljárás egy gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy, a 7. igénypont szerinti eljárással kapott expressziós vektorral transzformált gazdasejtet a fitáz aktivitású, gomba eredetű polipeptid expresszióját biztosító körülmények között tenyésztünk, és (ii) a tenyészetből a fitáz aktivitású, gomba eredetű polipeptidet kinyerjük.

Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan gomba eredetű fitázaktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő, amely

a) Aspergillus gazdasejtben kifejeződve SDS-PAGE rendszerben 85 kD-nál egyetlen sávot mutat,

b) deglükoziláció utáni molekulatömege 48-56,5 kD tartományban van, és

c) specifikus aktivitása mintegy 100 E/mg fehérje. Elsőbbsége: 1989. 09. 27.

19. Eljárás állatok növekedését elősegítő takarmány előállítására, azzal jellemezve, hogy a szokásos állati takarmányt egy, a 17. igénypont szerint előállított gomba eredetű, fitázaktivitással rendelkező polipeptiddel összekeverjük.