KR20000016576A - 반추동물 미생물의 피타아제를 발현하는 디엔에이 서열 - Google Patents

Abstract

반추동물로부터 유도된 피타아제가 구비되어 있다. 이 피타아제는 피테이트로부터 무기인의 분리를 촉매한다. 피타아제의 주요 공급원은 세레노모너스, 프레보텔라, 트레포네마, 마가스패라이다. 세레노모너스 루미넌티움 JY (ATCC 55785) 피타아제를 복제하여 정제분리된 DNA가 구비되어 있다. 피타아제를 복제하는 DNA를 함유하는 재조합 벡터와 피타아제를 복제하는 DNA와 함께 형질전환하는 숙주세포가 준비된다. 이 피타아제는 피테이트의 탈인산화와 관련된, 특히 동물사료 보충물로서 광범위하게 이용된다.

Description

반추동물 미생물의 피타아제를 발현하는 디엔에이 서열

가축사료의 식물구성분은 인이 풍부하지만, 단위동물의 효율적 성장률을 위해서 무기인의 보충이 요구된다. 피테이트(미오-이노시토헥사인산)는 일반적으로 칼슘염, 마그네슘염, 칼륨염 그리고/또는 단백질의 복합체로 존재하며, 귀리, 오일씨와 콩에 있는 인의 지배적 형태이고, 오일씨의 건량의 1 내지 3%를 차지하며, 씨에 존재하는 전체 인의 60 내지 90%를 차지한다(Graf, 1986). 그러나, 단위동물들(예를 들면 집돼지, 가금과 어류)은 피테이트를 가수분해시킬 수 있는 위장관효소가 부족하기 때문에, 그들은 피테이트를 거의 또는 전혀 사용하지 못한다. 피테이트는 상부 위장관을 거의 원상태로 통과한다. 이 상부 위장관에서 피테이트가 무기질(예를 들면, 칼슘과 아연)을 킬레이트하고, 아미노산과 단백질에 결합하고, 효소를 저해하므로 영양분의 생체이용성을 감소시킨다. 비료에 있는 피테이트인은 단위가축 생산이 많은 세계의 지역들에 있어서 물의 부영양화 등, 심각한 오염문제를 야기한다.

피테이트에 의해 야기된 생산성 저하와 인 오염은 단위동물의 사료에 피타아제를 보충함으로서 효과적으로 해결될 수 있다. 피타아제는 피테이트를 미오-이노시톨과 무기인산으로의 가수분해를 촉매하고 미오-이노시톨과 무기인산은 소장에서 흡수된다. 피타아제는 인 보충의 필요성을 감소시키고 피테이트 오염물 양을 감소시킴과 함께 피테이트의 반영양효과를 감소시킨다.

피타아제는 동물과 식물(주로 씨)과 여러 종류의 미생물에서 생성된다(미국 특허번호 제3,297,548호; Shiehhh과 Ware, 1968, 1967). 잠재적인 피타아제 공급원들에도 불구하고, 단지 토양진균( 아스페르질러스 니거(Aspergillus niger) 또는 아스페르질러스 피쿰(Aspergillus ficuum))만이 최근에 피타아제의 상업적 생산을 위해 사용된다. A.피쿰에 의해서 생성된 피타아제는 큰 특이성(단백질의 100단위/mg(여기서 단위란 분당 방출된 μ몰 인산으로 정의됨))과 다른 미생물들로부터 생성된 다른 피타아제들과 비교되는 열적 안정성을 갖는다(유럽 특허 출원번호 제0,420,358호(van Gorcum 등, 1991)와 미국 특허번호 제5,436,156호(van Gorcum 등, 1995년 7월 25일 등록됨)). A.피쿰의 피타아제는 산성이고 pH 5.5 이상에서는 낮은 활성도를 나타낸다(Howson 과 Davis, 1983; van Gorcum 등, 1991). 결과적으로 활성은 pH 범위가 2 내지 3(위에서)으로부터 4 내지 7(소장에서)까지인 단위동물의 소화관 중 상대적으로 매우 적은 지역으로 제한된다.

단위동물의 먹이에 피타아제를 보충한다는 생각은 25년 전부터 제안되었지만 (미국 특허번호 제3,297,548호, Ware 와 Shieh, 1967), 효소생성의 높은 비용은 가축산업에서 피타아제의 사용을 제한하여 오고 있다. 북아메리카에서 보충용 피타아제는 일반적으로 인보충보다 비싸다. 만약 이 효소들의 사용이 칼슘과 같은 제2영양소의 보충의 필요성을 감소시킨다면, 어떤 환경에서 피타아제의 이용 비용은 부분적으로 상세될 수 있다. 북아메리카에서 집돼지와 가금의 숫자가 증가하고, 대중들의 압력이 가축생산과 관련된 오염의 감소를 강제함에 따라 피타아제의 사용이 증가할 것 같다. 인보충의 보다 높은 비용과 피타아제의 사용을 요구하는 법안은 북아메이카보다 유럽과 동양의 일부분에서 이 피타아제의 사용을 더욱 일반화시키고 있다. 네덜란드, 독일, 한국과 대만의 정부에서는 단위동물의 가축생산에 의해서 발생되는 인 오염을 감소시키는 법안이 통과되었거나 계류중이다.

피타아제의 사용을 증가시킬 수 있는 가장 효과적인 수단은 비용감소를 통해서이다. 생산단가를 감소시키고 보다 활성이 큰 효소를 생산함으로서 피타아제의 비용은 적어질 수 있다. 최근 생명공학의 발달은 대체적이며 비용절감에 효과적인 효소 생산방법을 제공함으로서 상업효소산업을 변혁할 수 있다. 재조합 DNA기술의 응용은 제조업자들이 효소의 생산양과 효율을 증가시키고 새로운 생산물을 창출할 수 있게 하고 있다. 본래의 공급원 생물은 더 이상 상업효소의 생산을 제한할 필요가 없다. 보다 우수한 효소를 발현시키는 유전자들은 상업적 생산에 있어서 전형적으로 사용되지 않던 혐기성 박테리아나 진균과 같은 생물체로부터 잘 특화된 산업적 미생물 생산숙주들(예를 들면 아스페르질러스(Aspergillus) 와 바실러스(Bacillus) 속)의 내부로 전이될 수 있다. 또한 이러한 유전자들은 새로운 식물과 동물발현계로 전이될 수도 있다.

단위동물들과 달리, 반추동물들(예를 들면, 소, 양)은 피테이트의 인을 쉽게 사용한다. 피타아제가 반추동물의 제1위(rumen)에 존재한다는 것이 입증되었으며, (피테이트가 풍부한) 곡물사료들에 의해 사육된 반추동물들은 이 피타아제 때문에 사료용 인보충을 필요로 하지 않는다는 것이 제안되었다. 한 보고서가 이 피타아제의 생성을 반추동물의 미생물 때문이라고 주장하였다(Raun 등, 1956). 그러나 이 미생물들이 피테이트를 사용할 수 있는 유일한 능력은 거의 무시되었다. 라운(1956)은 원심분리 침전법에 의해 미생물 현탁액을 만들었다(정(Cheng) 등, 1955). 이 미생물 현탁액들은 식물의 미세입자들에 의해서 거의 대부분 오염되었다. 식물들이 피타아제를 생산하기 때문에, 그 연구는 식물 피타아제들 또는 미생물 피타아제들이 관찰된 활성을 갖고있는가를 결정하지 못했다. 라운 등은 반추동물의 제1위의 피타아제 생산이 제1위 미생물들에 의해서 가능하다는 가능성을 제기하였지만 이 가능성은 연구되지 않았다.

앞서 말한 바와 같이, 동물 먹이 보충에 사용되기 적합한 생화학적 특성을 가진 낮은 가격의 피타아제에 대한 요구가 존재한다.

본 발명은 반추동물 미생물로부터 추출한 피타아제에 관한 것이다.

도1은 피테이트를 포함하는 대비염색 한천배지가 산 생성과 피타아제 활성에 의해 생성된 투명대에 미치는 효과를 나타내는 사진이다. 피테이트 한천은 S. 보비스(bovis, 왼쪽 페트리디쉬의 상부)와 S. 루미넌티움 JY35(왼쪽 피트리디쉬의 바닥부)에 의해 접종되고, 5일 동안 37℃에서 항온배양했다. 콜로니들은 제거됐고 염화코발트와 몰리브덴산 암모늄/바나드산 암모늄 수용액(오른쪽 페트리 평판)에 의해 대비염색되었다.

도2는 변형된 스콧(Scott)과 데홀리티(Dehority, 1965) 육즙배지에서 S.루미넌티움 JY35의 성장(단백질)과 피테이트 생성을 나타내는 선도이다.

도3A와 3B, 3C는 기질로 피테이트 나트륨을 사용한 피타아제에 의해 반응생성물 축적 동안 항온배양된 S.루미넌티움 JY35 미드-익스포넨셜 페이스(mid-exponential phase) 배양체로부터의 세포들의 전이 전자 사진을 나타낸다. 비교하기 위해 미처리 조절 세포들이 그림 3D와 3E, 3H에 도시되었다.

도4는 5개의 다른 버퍼들에 있는 세척된 S.루미넌티움 JY35 세포에 대한 피타아제 pH 프로필을 나타내는 선도이다.

도5는 5개의 다른 버퍼들에 있는 S.루미넌티움 JY35 MgCl₂세포 추출물에 대한 피타아제 pH 프로필을 나타내는 선도이다.

도6은 S.루미넌티움 JY35 세포 추출물에 대한 온도 프로필을 나타내는 선도이다.

도7은 이온들(10mM)이 S.루미넌티움 JY35 피타아제 활성에 미치는 효과를 나타내는 선도이다(Ctr=조절).

도8은 피테이트 나트륨 농도가 S.루미넌티움 JY35 피타아제 활성에 미치는 효과를 나타내는 선도이다.

도9는 피테이트 활성을 확인하기 위해 발달된 지모그램이다. S.루미넌티움 JY35 MgCl₂세포 추출물(선 B 내지 E)의 농축물(10×)과 낮은 분자량 마커들(선F, BioRad Laboratories Canada Ltd, Mississauga, Ontario), A. 피쿰 피타아제(시그마, 1.6 U, 선A는 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 선A로부터 선E는 피타아제 활성에 대해 염색되었고 선F는 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue)에 의해 염색되었다.

도10은 pSrP.2(위)와 pSrP.2ΔSphl(아래 왼쪽), pSrPf6(아래 오른 쪽)에 의해 형질전환된 E.coli DH5α의 피타아제 활성에 대한 피테이트 가수분해 평판 분석의 사진이다. 투명대(zones of clearing)는 37℃에서 48시간 동안 평판을 항온배양한 후 볼 수 있었다.

도11은 Sph1에 의해 분해된 pSrp.2 DNA(레인B)와 S.루미넌티움 JY35로부터 분리된 Hindlll에 의해 분해된 게놈 DNA(레인C)에 대하여, 탐침으로 pSrP.2로부터의 2.7kb 단편을 이용한 서던 블롯 분석이다. 디고시제닌(Digoxigenin)에 의해 표지된 Hindlll에 의해 분해된 람다 DNA는 레인A에 분자량 표본으로 러닝되었다.

도12는 pSrP.2의 물리적 지도이다. S.루미넌티움 JY35 게놈으로부터 Sau3에 의해 부분 분해된 DNA2.7kb 단편은 pUC18의 BamHl 사이트 내에서 클론된다. 이 단편들은 S.루미넌티움 JY35로부터의 피타아제를 발현하는 전체 유전자를 함유한다. 이음(ligation)의 결과로써 상실된 BamHl사이트의 위치가 사각형 괄호 속에 표시된다.

도13은 S.루미넌티움 피타아제 유전자의 삭제분석의 체계도이다. phyA의 위치는 화살표로 나타냈다. 평행선이 그어진 박스들은 다른 플라스미드 변이들에 의해 운반된 2.7kb Sau3A단편의 조각을 나타낸다. 피타아제 활성은 오른 쪽에 나타난다.

도14는 피타아제 활성을 위해 발달된 지모그램이다. E. coli DH5α(PSrP.2)세포(레인A)와 E. coli DH5α(pSrP.2ΔSphl) 세포(레인B), 낮은 분자량 마커(레인C, BioRad Laboratories)는 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 레인A와 레인B는 피타아제 활성에 의해 염색되었고 레인C는 쿠마시 브롤리언트 블루에 의해 염색되었다.

도15는 S.루미넌티움 JY35 피타아제 유전자(phyA)(서열번호.1)의 뉴클레오티드 서열과 이것에 의해 추론된 아미노산 서열(서열번호.2)이다. 추론된 리보좀 결합 사이트는 밑줄이 그어져 서열 위에 R.B.S라고 표시되었다. 본 헤이즌(1986)의 방법에 의해 예상된, 신호 펩티다제 균열 사이트가 번호1에 의해 표시된다. E.coli(pSrPf6)에 의해 분비된 피타아제의 N-말단 아미노산 서열이 밑줄 그어져 있다.

발명자는 반추동물의 제1위는 동물 먹이 보충물이나 이노시톨 처럼 산업응용에 적당한 생화학적 특성(온도나 pH 안전성, 낮은 금속이온 민감성과 높은 특성과 같은)을 갖는 피타아제를 생성하는 풍부한 미생물의 공급원임을 발견했다. 반추동물의 제1위 미생물은 혐기성 상태를 견디며 특정환경이나 모든 환경에서 생활할 수 있는 미생물이다. 반추동물의 제1위 미생물은 원핵생물(예를 들면 박테리아) 또는 진핵생물(예를 들면, 진균이나 원생동물)일 수 있다. 여기에서 사용된 용어 " 제1위 미생물"은 제1위 미생물의 소화물 또는 배설물로부터 분리된 미생물을 포함한다.

매우 활성이 큰 피타아제들을 생산하는 것으로 분류된 제1위 박테리아 종은 세레노모너스 루미넌티움(Selenomonas ruminantium), 프레보틸라 종(Prevotella sp), 트레포네마 브리언티(Treponema bryantii)와 메가스패라 엘스데니(Megasphaera elsdenii)를 포함한다. 프레보텔라와 세레노모너스는 박테이오데이시(Bacteriodaceae) 목의 그램-음성 혐기성 자손이다.

본 발명에 따르면, 제1위 미생물로부터 추출된 새롭고 유용한 피타아제를 발현하는 DNA 서열이 제공된다.

세레노모너스 루미넌티움 균주 JY35로부터의 피타아제 유전자(phyA)는 클론되고 서열이 확인되고, phyA유전자의 뉴크레오티드 서열이 제공된다. 본 발명은 피타아제를 발현하고 DNA 서열들과 엄격한 조건 하에서(under stringent conditions) phyA유전자 서열과 혼성화할 수 있는 DNA 서열들까지 확장된다. 여기에서 사용되는 "엄격한 조건 하에서 혼성화할 수 있음"은 무관한 서열들을 연결하기가 불리한 표준조건(예를 들면 높은 온도 그리고/또는 낮은 염도)하에서 대상 핵산 서열을 연결함을 의미한다. 여기에서 사용된 "조금 절박한 조건(conditions of low stringency) "란 40 내지 50℃와 6×SSC, 0.1% SDS(약 50 내지 80%동질성을 의미함)의 혼성화와 세척조건을 의미한다. 여기에서 사용된 "중간정도 절박한 조건(conditions of medium stringency)"란 50 내지 65℃와 1×SSC, 0.1% SDS(약 80 내지 95% 동질성을 의미함)의 혼성화와 세척조건을 의미한다. 여기에서 사용된 "매우 절박한 상태(conditions of high stringency"란 65 내지 68℃와 0.1×SSC, 0.1% SDS(약 95 내지 100%동질성을 의미함)의 혼성화와 세척조건을 의미한다.

여기에서 사용되는 용어 "피타아제"는 미오-이노시톨 인산으로부터 무기인의 제거를 촉매할 수 있는 효소를 의미한다.

여기에서 사용되는 용어 "미오-이노시톨 인산"은 미오-이노시톨 6인산, 미오-이노시톨 5인산, 미오-이노시톨 4인산, 미오-이노시톨 3인산, 미오-이노시톨 2인산, 미오-이노시톨 1인산을 제한없이 포함한다.

여기에서 사용되는 "피테이트"는 미오-이노시톨 6인산의 염을 의미한다.

발명은 S.루미넌티움 JY35(ATCC55785) 생물체 그 자체와 탐침으로서 phyA 유전자 서열의 일부나 모두를 사용하는 피타아제 활성을 나타내는 제1위 미생물로부터의 피타아제 유전자들을 분리, 클로닝과 발현하는 방법 뿐만이 아니라 피타아제 활성을 나타내는 다른 제1위 미생물을 동정하고 분리하는 방법까지 확장된다.

발명은 미생물 산 생성(acid production)에 의해 위양성 결과들이 제거된 미생물에 의한 피테이트 생성을 분석하는 방법까지 확장된다. 미생물 콜로니는 피테이트를 포함한 배지 상에서 성장된다. 그 배지는 염화코발트의 수용액과 접촉한 후 투명대에 대해 조사된다. 바람직하기로는 그 배지를 직접 조사하기보다, 염화코발트 용액이 제거되고 그 배지가 몰리브덴산 암모늄 수용액과 바나드산 암모늄 수용액들과 접촉한 후 투명대에 대해 조사된다. 산 형성 미생물들이 투명대를 생성할 때, 나타나는 위양성 결과들을 피하게 된다.

발명은 적합한 숙주세포에서 피타아제의 발현을 지시할 수 있는 조절서열에 결합된 본 발명의 피타아제를 발현하는 DNA를 구성하는 발현 구성체(expression construct)를 포함한다.

발명은 형질전환되어, 본 발명의 피타아제를 발현하는 DNA를 발현하는 숙주세포와 그렇게 형질전환된 숙주세포들을 생성하는 방법까지 확장된다. 여기에서 사용된 "숙주세포"는 동물, 식물, 효모, 진균, 원생동물, 원핵의 숙주세포들을 포함한다.

발명은 형질전환된 식물이 피타아제를 발현할 수 있도록 하기 위해 본 발명의 피타아제를 발현하는 DNA에 의해 형질전환된 돌연변이 식물(transgenic plant)과 이렇게 형질전환된 식물을 생산하는 방법에까지 확장된다. 여기에서 사용된 "돌연변이 식물"은 돌연변이 식물, 조직과 세포를 포함한다.

본 발명의 피타아제는 피테이트의 탈인산화를 포함하여 다양한 응용분야에 이용된다. 그러한 응용분야는 동물먹이보충, 가축조절, 인간영양과 피테이트으로부터 이노시톨의 생성에의 사용을 포함한다. 본 발명의 피타아제는 피테이트 금속 킬레이션의 악영향을 최소화하기 위해 사용될 수 있다. 콩과 같은 일부 사료의 높은 피테이트함량은 어류와 단위동물, 젊은 반추동물, 어린 반추동물에 대하여 단백질 공급원으로서 사료들의 가치를 떨어뜨린다. 왜냐하면 피테이트는 미네럴들을 킬레이트화하고 아미노산과 단백질에 결합하므로 영양분의 생체 이용성을 감소시킨다. 이 사료들을 본 발명의 피타아제들로 처리함으로서, 피타아제에 의해 중재된 탈인산화로 사료들의 피테이트함량을 감소시킨다. 따라서, 발명은 본 발명의 피타아제로 처리된 사료들을 구성하는 새로운 먹이 조성물과 본 발명의 피타아제를 포함하는 먹이 첨가물까지 확장된다. 이 먹이 조성물과 첨가물은 프로티아제(proteases), 셀루라제(cellulase) 질라나제(xylanases)와 액시드 포스파타제(acid phosphatases)와 같은 효소들을 또한 포함할 수 있다. 피타아제는 미처리되거나 작은 알갱이로 만들어 지거나 달리 가공된 사료에 직접 첨가될 수도 있다. 또한 피타아제는 사료와 분리되어 미네럴 블록(mineral blocks), 알약(pill), 겔형(gel formulation), 액체형(liquid) 또는 마시는 물 속에 공급될 수 있다. 발명은 통상의 성장조건 하에서 본 발명의 피타아제를 발현하는 동결건조된(lyophilized) 미생물로 구성된 먹이 접종 제제까지 확장된다. 이 먹이 접종 제제들에 대하여, "통상의 성장조건"은 미생물의 수확과 동결건조 이전의 배양조건을 의미한다. 이 미생물들은 대규모 발효기에서 미생물의 배양체의 성장동안 피타아제를 발현한다. 미생물에서 피타아제의 활성은 피타아제를 함유하는 수확된 미생물 농축물의 동결건조에 의해 유지된다.

발명은 동물에 충분한 양의 본 발명의 피타아제를 먹이므로 동물 사료의 인산의 이용을 증가시키는 방법까지 확장된다. 여기서 사용된 "파타아제의 충분한 양"이란 동물에 인을 이용함에 있어 통계적으로 의미있는 개선을 야기하는 양을 의미한다. 피테이트 인 이용은 예를 들면 개선된 동물 성장과 동물 비료에 감소된 피테이트 양에 의해 입증될 수 있다.

반추동물의 제1위는 300종 이상의 박테리아와 진균, 원생동물이 살고 있는 복잡한 생태계이다. 피타아제 활성을 위해 이 생명체들을 스크린하는 것은 개별 분리체의 피타아제 활성을 식별할 수 있는 능력이 필요하다. 이것은 배양기술(예를 들면, 스트리크 평판, 회석과 미세조작법)을 통하여 개개 세포들의 배양 또는 분리, 수집함으로써 순수 배양체의 분석할 수 있다. 표준적인 무균, 혐기 기술이 이 목표를 위해 사용될 수 있다.

적절한 효소분석이 제1위의 액체 샘플 속이나 배양체로부터의 미생물 분리체를 스크린하거나 피타아제 유전자를 클로닝하기 위해 요구된다. 용액의 피타아제 활성을 측정하는 분석법은 문헌에 기재되어 있다. 샘플 용액은 피테이트로부터 무기인의 제거를 측정하므로 피타아제 활성에 대해 전형적으로 분석된다(Raun 등, 1956: van Hartingsveldt 등, 1993). 피타아제는 고체 배지 상에서 조사될 수 도 있다. 피타아제를 발현하는 미생물들은 피테이트 나트륨 또는 피테이트 칼슘을 포함하는 한천 배지 상에서 투명대를 생성한다(Shieh와 Ware, 1968: Howson과 Davis, 1983). 그러나, 문헌에 기재된 고체배지 조사법은 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis)와 같은 산-생성 박테리아의 위양성 반응 때문에, 피타아제 활성에 대한 제1위 박테리아를 스크린하는 것은 만족스럽지 못함을 발견한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 고체 배지를 포함하는 페트리 디쉬들이 먼저 염화코발트 수용액에 의해서 세척된 후 몰리브덴산 암모늄/바나듐산 암모늄 수용액에 의해 세척되는 2단계 오염방지 과정이 발달되었다. 이러한 처리를 한 뒤, 효소활성에 의해 생성된 투명대가 확인된다(그림1).

상기 용액들과 고체 배지 분석법들을 사용하므로, Lethbridge Research Centre(Lethbridge, 알버트, 캐나다) 배양 컬랙션으로부터의 345개의 분리체들이 피타아제 활성에 대해 스크린된다(표1). 실제적인 피타아제 활성을 가진 총 29개 배양체들이 동정됐고, 여기에는 24개의 세레노모너스 속과 5개의 프레보텔라(Prevotella ) 속이 포함됐다. 12개의 배양체들(11개의 세레노모너스 분리체들과 1개의 프레보텔라 분리체)은 다른 양성 배양체들보다 실제적으로 높은 피타아제 활성들을 가졌다.

S.루미넌티움 JY35의 피타아제(American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852-1776에 ATCC로 1996년 5월 24에 기탁됨)은 더욱 조사하기 위해 선별됐고, A. 피쿰 NRRL 3135로부터의 상업적인 피타아제(Gist-brocades nv, Delft, 네덜란드)와 비교됐다(van Gorcum 등, 1991과 1995). S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제의 pH(도5)와 온도(도6)가 A. 피쿰 NRRL 3135로부터의 상업적인 피타아제보다 산업적 생산에 적합한지 비교되었다. 이 결과들은 산업에 의해 최근에 생성된 피타아제들보다 우수한 특성을 가진 피타아제의 공급원으로 제1위나 혐기성 미생물들의 가능성을 입증했다.

선택된 효소들을 발현하는 미생물 유전자들은 다양한 방법들에 의해 클론될 수 있다. 유전자 라이브러리(게놈 DNA와/또는 cDNA)는 표준적인 방법들에 의해 구성된 원하는 유전자들에 대해 스크린된다. 스크린 방법은 이형성 탐침과 효소 활성, 또는 N-말단과 내부 아미노산 서열과 항체들과 같은 유전자 생성물을 정제하는 동안 발생된 결과들을 이용한다.

제1위 미생물들에 의해 생성된 피타아제 활성을 조사하기 위해 발달된 고체 배지 피타아제 분석법을 사용하여, S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 유전자 라이브러리가 양성 클론들에 대해 스크린됐다. 조사된 6000개 콜로니들 중 단 한 개의 콜로니만이 콜로니 주위에 거대한 클로닝에 의한 피타아제 양성 클론으로 동정됐다. 이 클론은 클로닝 벡터 pUC18 속에 첨가된 2.7-kb Sau3A 단편을 갖는 5.5kb 플라스미드를 운반했다. 새로 분리된 2.7-kb Sau3A DNA 단편은 서던 브롯 혼성화에서 탐침으로 사용됐다. 매우 높은 절박함 하에서, 분비된 밴드(띠)가 S.루미넌티움에 대해 나타났으나 프레보텔라 종.46/5², E.coli DH5α또는 A.피쿰 NRRL 3135에 대해서는 나타나지 않았다.

새로 분리된 클론으로부터 분리되어 형질전환에 의해 E.coli 내에 도입된 플라스미드 DNA는 암피실린-내성, 피타아제-양성 CFU들을 생성했다. S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)로부터의 2.7-kb Sau3A의 DNA 단편을 운반하는 E.coli DH5α 세포들로부터의 세포 추출물에 대해서 효소측정법은 평균 37kDa의 분자량을 가진 유일한 활성 밴드를 나타냈다. 유전자 제거법과 DNA 서열분석들은 재조합 E.coli 클론에서 관찰된 활성들에 원인이 되는 피타아제를 발현하는 유전자(phyA)를 동정하기 위해 사용됐다. phyA를 운반하는 E.coli 세포들에서 발현된 정제된 37kDa 피타아제의 N-말단 아미노산 서열은 클론된 phyA 서열로부터 예상된 완전한 피타아제의 N-말단 아미노산 서열과 일치했다. 이것은 피타아제를 발현하는 뉴클레오티드 서열이 분리되었음을 결정적으로 나타낸다. 뉴클레오티드 서열과 추론된 아미노산 서열은 도15에 표시되었다.

다른 유전자들처럼 상업적인 효소생산을 위한 다양한 발현체계에서 특화된 피타아제 코딩 서열을 사용하는 것은 가능한다. 재조합 DNA 기술의 응용은 효소 제조자들이 효소 생성의 양과 수율을 증가시키고 새로운 생산품을 창조할 수 있게 한다. 원 공급 미생물들은 더 이상 상업적인 효소들의 생성에 제한될 필요가 없다. 보다 우수한 효소들을 발현하는 유전자들은 전통적으로 상업적 생산에 쓸모없는 혐기성 박테리아나 진균으로부터 잘 특화된 산업적 미생물 생산숙주들(예를 들면, 아스페르질러스 피치아(Aspergillus, Pichia), 트리코데르마(Trichoderma), 바시러스 종(Bacillu s spp.))에 형질전이될 수 있다. 또한 이 유전자들은 새로운 식물과 동물의 발현체계들에 형질전이될 수도 있다.

미생물은 산업적 균주들(예를 들면, Aspergillus niger, Aspergillus fucuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis)이나 식물 숙주들(예를 들면, 카놀라(canola), 콩, 우수수, 감자)은 피타아제를 생성하기 위해 사용될 수도 있다. 모든 체계들은 동일한 유전자 발현방법을 사용한다. 발현 구성체는 관심있는 단백질 코딩 서열과, 프로모터, 인핸서, 터미네이터와 같은 조절 서열들을 포함하도록 조립되었다. 신호 서열이나 선택할 수 있는 마커와 같은 다른 서열들도 포함될 수 있다. 피타아제의 세포외 발현을 이루게 하기 위해 본 발명의 발현 구성체는 분비 신호 서열을 사용한다. 이 신호 서열은 세포내 발현이 바람직하다면 발현 구성체 상에 포함되지 않는다. 프로모터와 신호서열은 숙주세포에서 기능할 수 있고, 코딩 서열 생성물의 발현과 분비를 제공한다. 전사 터미네이터들은 효율적인 전사를 확실히 하기 위해 포함된다. 발현 또는 단백질 정제를 촉진하는 보조 서열들도 이 발현 구성체 속에 포함될 수 있다.

피타아제 활성을 위해 단백질을 코딩하는 서열들은 제1위 미생물 공급원으로부터 얻어진다. 이 DNA는 발현 숙주와 상동적이거나 이형적일 수 있다. 상동적 DNA는 여기에서 같은 종으로부터 얻은 DNA로 정의된다. 예를 들면, S.루미넌티움은 그 종에 존재하지 않는 특성들을 도입하지 않은 채 존재하는 특성들을 개선하기 위하여 S.루미넌티움으로부터의 DNA로 형질전환될 수 있다. 이형적 DNA는 다른 종으로부터 기원한 DNA로 정의한다. 예를 들면, S.루미넌티움 phyA는 E.coli에서 클론되어 발현될 수 있다.

일부 아미노산 서열 치환이 단백질의 기능에 영향을 미치지 않고 단백질 서열들에서 행해질 수 있다는 것은 생물 분야에서는 잘 알려졌다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질에 영향을 미치지 않고 행해진다. 유사한 아미노산들은 크기나 전하 특성이 유사한 것들이다. 예를 들면, 아스파테이트와 글루타메이트, 이소루신과 발린은 유사한 아미노산 쌍들이다. 이 아미노산 쌍들 사이의 유사성은 많은 방법들에 의해 이 분야에서 연구되어 왔다. 예를 들면, 데이호프(dayhoff 등, 1978)는 참고문헌에 첨부된 "단백질 서열과 구조의 도해서" 제5권 추보3, 22와 345쪽부터 352쪽에서, 아미노산 유사성에 대해 사용될 수 있는 아미노산 치환에 대한 빈도표를 제공한다. 데이호프 등의 빈도표들은 진화적으로 다른 다양한 공급원들로부터 같은 기능을 갖는 단백질들에 대한 아미노산 서열들의 비교에 기초를 두고 있다.

흔히 전체 단백질의 길이보다 짧은 단백질이 완전한 단백질 기능을 갖는다는 것도 잘 알려졌다. 예를 들면, N-말단, 내부 또는 C-말단 단백질이 결여된 절단형 단백질이 완전한 자연 단백질의 생물학적 그리고/또는 효소적 활성을 갖는다. phyA을 포함하는 유전자 절단 실험은 절단된 단백질이 완전한 달백질의 기능을 유지할 수도 있다는 것을 확인한다. N-말단 아미노산 1-37 또는 1058이 없는 phyA을 발현한 E. coli 클론들은 피타아제 양성 표현형을 나타냈다. 반대로, 아미노산들 307-346이 없는 phyA을 발현하는 클론은 어떠한 피타아제 활성도 나타내지 않았다. 이 분야에서 통상의 지식을 가진 사람들은 절단된 단백질이나 내부가 결여된 단백질을 만드는 방법을 알고 있다. 본 발명에 있어서, 절단된 피타아제 단백질 또는 내부가 결여된 피타아제 단백질은 아래에서 기재된 분석법을 사용하거나 이 분야에서 일반적으로 알려진 방법으로 쉽게 시험될 수 있다.

여기에서 특별히 기재된 피타아제와 같은 효소적 활성을 실질적으로 유사한 치환되었거나, 내부가 결여되었거나 절단된 제1위 피타아제 변이체들은 예시된 피타아제의 등가물로 생각되고 본 발명의 범위 내에 있다. 특히 본 발명의 범위에서는 치환되었거나, 내부가 결여되었거나 절단된 제1위 피타아제 변이체의 비활성은 특별히 예시된 피타아제의 적어도 10%이다. 숙련자들은 쉽게 여기에서 알 수 있는 분석법을 사용하거나 이 분야에서 일반적으로 알려진 것에 의해 제1위의 절단된 피타아제, 내부가 결여된 피타아제 또는 치환된 피타아제들의 활성을 측정할 수 있다.

본 발명은 이 분야에서 일반적으로 알려진 것에 의해 여기에서 개시된 방법에 의한 파타아제와 실제적으로 기능이 등가인 제1위 미생물의 피타아제로부터 추출된 구조적인 변이 피타아제들, 특히 여기에서 특별히 개시된 피타아제로부터 추출된 것들을 포함한다. 본 발명의 피타아제의 구조적 변이, 기능적 등가물들은 여기에서 개시된 피타아제 아미노산 서열(서열번호2)에서 처럼 근접한 아미노산 서열을 갖는 제1위 미생물들의 피타아제를 포함한다. 특히 본 발명은 적어도 약 25개의 아미노산에 있어 근접한 서열인 제1위 미생물의 피타아제의 근접한 아미노산 서열을 갖는 변이 피타아제를 포함한다.

본 발명은 또한 여기에서 분리된 효소들의 특성들과는 다른 특성들은 갖는 피타아제 구성을 위한 출발물질을 제공한다. 유전자들은 변성된 특성들(예를 들면, 온도 또는 pH 적정도, 비활성 또는 기질 특이성)을 갖는 유전자 생성물을 창조하는 알려진 방법들(화학적, 사이트가 지정된, 임의의 폴리머라제 사슬반응 돌연변이)에 의해 쉽게 돌연변이된다.

다양한 프로모터들(전사 개시 조절부)은 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 적절한 프로모터의 선택은 제시된 발현숙주에 달려있다. 프로모터 선택들은 이들이 선택된 숙주들에서 기능을 발휘하는 한, 클론된 단백질을 코딩하는 서열과 관련된 프로모터 또는 이형적인 공급원들로부터의 프로모터들을 포함한다. 이형적인 프로모터들의 예들은 E.coli tac와 trc 프로모터들(Brosius 등, 1985), 바시루스 서브틸러스 sacB 프로모터와 신호 서열(Wong, 1989), 피치아 패스토리스(Pichia pastoris) aox1과 aox2(Ellis 등, 1985)와 프라시카 네이퍼스(Brassica napus) 또는 아라비톱시스 테리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 오레오신(oleosin) 씨 특이성 프로모터(van Rooijen과 Moloney)이다. 프로모터 선택은 또한 바람직한 효율과 펩타이드 순도(level), 단백질의 생산량에 달려있다. tac 및 aox1과 같은 유발성 프로모터는 단백질 형성의 순도를 극적으로 증가시키기 위해 종종 사용된다. 단백질들의 과잉발현은 숙주 세포들에 해로울 수 있다. 결과적으로, 숙주 세포의 성장은 제한될 수 있다. 유도성 단백질 체계의 사용은 숙주 세포들이 유전자발현의 유도 전에 받아들일 수 있는 밀도로 키워지는 것을 허용하여, 결국 보다 높은 생산량을 향상시킨다. 단백질을 코딩하는 서열이 유전자 대치(오메가 삽입)를 통해 목표위치에 통합되면, 프로모터 선택은 목표위치 프로모터와의 상동성의 정도에 의해 영향을 받을 수 있다.

다양한 신호서열들이 본 발명에 의해 사용될 수 있다. 발현되기 위해 단백질을 코딩하는 서열들과 상동적인 신호 서열이 사용될 수 있다. 대신에, 발현 숙주에 개선된 분비를 위해 선택되거나 고안된 신호서열이 사용될 수 있다. 예를 들면, B. 서브틸러스에 있는 분비를 위한 B. 서브티러스 sauB 신호서열, 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) α- 메이팅 인자 또는 P. 패스토리스 분비를 위한 P.패스토리스 산 포스파타제 phol 신호서열이 사용될 수 있다. 단백질을 코딩하는 서열이 오메가 삽입을 통해 통합되면, 목표위치와 매우 높은 상동성을 갖는 신호서열이 요구된다. 신호서열은 신호 펩티다제 균열 사이트를 발현하는 서열을 통해 보통 10개 이하의 코돈들에 직접 결합될 수 있다.

발현 전사(프로모터 활성)와 해독을 증진시키는 요소들은 진핵생물의 단백질 발현 체계에 대하여 동정된다. 예를 들면 cauliflower mosaic virus(CaMV) 프로모터를 이형적인 프로모터의 어느 쪽 사이트에든지 위치시키는 것은 전사율을 10배에서 400배 상승시킬 수 있다. 발현 구성체는 또한 적절한 해독 개시 서열을 포함한다. 적절한 해독 개시를 위해 Kozak consensus 서열을 포함하는 발현 구성체의 변형은 해독율을 10배 증가시킬 수 있다.

단백질의 정제를 향상시키는 요소들도 발현 구성체에 포함될 수 있다. 오레오신유전자 융합의 생산물은 관심이 있는 유전자 생산물에 결합된 오레오신 유전자를 포함하는 혼성 단백질이다. 융합 단백질은 오레오신들의 친지질성을 유지하며 오일체의 막에 결합된다(van Rooijen과 Moloney, 1994). 오일체들과의 결합은 재조합 오레오신 융합 단백질의 정제를 향상시키기 위해 사용될 수 있다(van Rooijen과 Moloney, 1994).

선택 마커는 보통 사용되며, 그것은 발현 구성체의 일부분이거나 별개의 것일 수 있다(예를 들면, 발현 벡터에 의해 운반된). 그러므로 마커는 관심이 있는 유전자와 다른 사이트에 통합된다. 발명의 재조합 DNA 분자들로 숙주세포들을 형질전환하는 것은 선택 마커들의 사용을 통해 모니터링된다. 이 예들은 항생제들에 대한 내성을 부여(예를 들면, bla는 E.coli 숙주세포들에 엠피실린 내성을 부여하고, nptll은 B.네이퍼스 세포들에 카나마이신 내성을 부여함)하거나 숙주들이 최소 배지에서도 성장(예를 들면, HIS4는 P.pastoris GS115 His가 히스티딘이 결여되어도 성장할 수 있게 함)할 수 있는 마커들이다. 선택 마커는 독립된 마커의 발현을 위해 그 자체의 전사나 해독의 개시나 종결 조절부위를 갖는다. 항생제 내성이 마커로써 사용될 때, 선택을 위한 항생제의 농도는 항생제에 따라 다양하며, 보통 10 내지 600μg(항생제)/mL(배양체)이다.

발현 구성체는 알려진 재조합 DNA 기술들을 사용하므로 통합된다. 제한 효소의 분해와 연결은 DNA 단편들을 결합하기 위해 사용되는 기초적 단계들이다. DNA 단편들의 끝들은 연결 전에 변형이 필요하며, 이것은 돌출부에 채워넣거나 뉴클리아제들(예를 들면 Exolll)이나 사이트가 지정된 돌연변이에 의해 단편(들)의 끝부분을 제거하거나 폴리머라제 연쇄반응(PCR)에 의해 새 염기쌍을 첨가하므로서 향상시기 위해 사용될 수 있다. 발현 구성체는 E.coli의 결여, 잇기와 형질전환들을 사용하는 단계들에서 전형적으로 통합된다. 발현 구성체의 구성을 위해 사용되는 많은 클로닝 벡터들이 있으며 특별한 선택은 본 발명에 중요하지 않다. 클로닝 벡터의 선택은 숙주세포 안에 발현 구성체를 도입하기 위해 선택된 유전자 전이 체계에 의해 영향받는다. 각 단계의 마지막에 결정적인 구조는 제한, DNA 서열분석법, 혼성화와 PCR 분석들에 의해 분석될 수 있다.

발현 구성체는 선형이거나 환형이든지 클로닝 벡터 구조로서 숙주에 형질전환될 수 있고 클로닝 벡터로부터 제거되거나 배달벡터로 사용되거나 배달벡터 상에 도입될 수 있다. 배달벡터는 숙주세포 안에 발현 구성체를 도입하고 유지하는 것을 향상시키는 기능을 한다. 발현 구성체는 많은 유전자 전이 체계들을 이용함으로서 숙주세포 내에 도입된다(예를 들면, 자연적 적응력, 화학적으로 중재된 형질전환, 원형질 전환, 일렉트로포레시스, 바이오리스틱 형질전환, 형질전이와 접합). 선택된 유전자 전이 체계는 사용된 숙주세포들과 벡터 체계들에 달려 있다.

예를 들면, 발현 구성체는 원형질 형질전환 또는 일렉트로포레이션에 의해 P.패스토리스(pastoris) 세포들 내에 도입될 수 있다. P.패스토리스의 일렉트로포레이션은 쉽게 이루어지고, 스페로프라스트(spheroplast) 형질전환과 비교되는 형질전환 효율을 나타낸다. P.패스토리스 세포들은 무균액으로 세척하고 낮은 전이도 수용액(예를 들면 1M 소르비톨 용액) 안에서 재현탁된다. 세포 현탁액에 가해진 높은 전압 충격은 형질전환 DNA(예를 들면 발현 구성체)가 세포에 들어가는 세포막에 통과할 수 있는 구멍들을 만든다. 발현 구성체는 상동적 재조합을 통해 aoxl(알코올 옥시다제) 로커스에 통합되므로 안정적으로 유지된다.

대신에 sacB 프로모터와 단백질 코딩 서열과 연결된 신호서열로 구성된 발현 구성체는 B.서브틸러스 세포들 내에서 자발적인 복제가 가능한 플라스미드, pUB10 상에 운반된다. 결과적인 플라스미드 구조는 형질전환에 의해 B.서브틸러스 세포들 안에 도입된다. B. 서브틸러스 세포들은 영양분이 부족한 상태 하에서 성장될 때 자연 적응력을 발달시킨다.

세 번째 실시예에서, 브라시카 네이퍼스(Brassica napus) 세포들은 아그로박테리움(Agrobacterium)에 의해 중재되어 형질전환된다. 발현 구성체는 A.투메페이션스(A.tumefaciens)에서 복제할 수 있고, 식물 세포 내로 운반할 수 있는 바이너리 벡터 상에 삽입된다. 결과적인 구조는 감쇄된 Ti 또는 "헬퍼 플라스미드"를 운반하는 A.투메페이션스 세포들에 의해 감염될 때 발현 구성체는 바이너리 벡터::발현 구성체의 동반이동에 의해 B.네이퍼스 세포들 내에 전이된다. 발현 구성체가 식물세포 게놈 내에 임의로 통합한다.

발현 구성체(예를 들면 형질전환된 세포들)를 운반하는 숙주세포들은 발현 구성체 또는 벡터에 의해 운반된 선택 마커의 사용을 통해 동정되고, 관심있는 유전자의 존재는 혼성화, PCR과 항체를 포함하는 다양한 기술들에 의해 확인된다.

형질전환 미생물 세포들은 액체 또는 반고체 배지 상에서 배치(batch)와 연속 발효(continuous fermentation)를 포함하는 다양한 기술들에 의해 성장될 수 있다. 형질전환된 세포들은 최대 생산-비용 비율을 위해 최적화된 상태 하에서 증식된다. 생산량은 온도, pH, 공기조절과 배지 조성과 같은 파라메터의 조작으로 극적으로 증가시킬 수 있다. 재조합된 과잉발현하는 E.coli 세포들에 대한 성장조건들의 조심스런 조작과 모니터링은 단위L 당 150g의 세포 배양 생체량과 5g의 불용성 단백질량을 야기할지 모른다. 프로티아제 인히비터(inhibitor, 예를 들면 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride) 또는 펩스타틴(pepstatin))의 낮은 농도는 과잉발현된 펩티드 또는 단백질의 분해를 감소하기 위해 사용될 수 있다. 대신, 원하는 단백질의 분해를 감소 또는 제거하기 위해 프로티아제 결여 숙주세포들이 사용될 수 있다.

선택과 스크리닝 후에, 형질전환된 식물세포들은 알려진 방법들을 사용하여 발달되고 배양된 전체 식물들이나 돌연변이 식물들의 변종 내에서 재생될 수 있다. 여기서 사용된 "돌연변이 식물(transgenic plant)"은 돌연변이 식물들, 식물 조직들과 식물 세포들을 의미한다.

발효한 후, 미생물의 세포들은 원심분리나 여과와 같은 다운 스트림 과정들을 통해 배지로부터 제거될 수 있다. 만약 원하는 생성물이 분비되면, 그것은 영양분이 많은 배지로부터 추출될 수 있다. 세포내 생성의 경우에, 세포들은 수확되고 기계적 힘들, 초음파, 효소들, 화학물질 그리고/또는 높은 압력을 이용하므로, 생성물은 세포들을 터트려 배출된다. 과잉발현 E.coli 체계들에서 일어나듯이, 불용성 생성물의 생산은 정제를 향상시킬 수 있다(0.5 내지 6M 우레아, O.1 내지 1% SDS(sodium dodecyl sulfate) 또는 0.5 내지 4M 구아니딘-HCl). 세척된 함유물들은 6 내지 8M 우레아, 1 내지 2% SDS 또는 4 내지 6M 구아니딘-HCl을 함유하는 용액에서 안정화될 수 있다. 안정화된 생산물은 투석하는 동안 변성체들을 서서히 제거하므로 재변성될 수 있다.

피타아제는 분쇄, 균질화(homogenization), 그리고/또는 화학적 처리에 의해 수확된 일부분이나 전체 식물들로부터 추출될 수 있다. 씨 특이성 친지질 오레오신 융합의 사용은 분쇄된 카노라-씨(canola seed)들의 오일부분에서, 수용성 단백질로부터, 오레오신 융합 단백질을 구획하므로 정제를 향상시킬 수 있다(von Rooijen과 Moloney, 1994).

필요하다면, 미생물, 발효나 식물 추출물로부터 생산물을 정제하기 위한 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 이것들은 침전(예를 들면, 황산 암모늄 침전), 크로마토그래피(겔 여과, 이온교환법, 친화적 액체 크로마토그래피), 초여과, 전기영동, 용매-용매 추출(예를 들면 아세톤 침전), 재조합 등등을 포함한다.

미생물 배양들이나 식물들의 전부 또는 일부는 피타아제의 이용을 필요로 하는 응용분야에 직접 사용될 수 있다. 다양한 조제(formulation of the crude) 또는 정제된 피타아제 제제가 또한 준비될 수 있다. 효소들은 다른 단백질(예를 들면 겔라틴, 탈지 분유)과 화학제(예를 들면 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 환원제나 알데히드들)를 첨가하므로 안정화시킬 수 있다. 효소 현탁액들은 알려진 과정들을 통해 액체들, 가루들, 입자들, 알약들, 미네럴 블록들과 겔들로 농축되거나(예를 들면, 탄젠셜 프로우 여과(tangential flow filtration) 건조되거나(스프레이와 드럼 건조, 동결건조) 제제화될 수 있다. 겔라틴, 알긴산, 콜라젠, 한천, 펙틴과 카라기닌과 같은 겔화제가 사용될 수 있다.

더더욱, 피타아제의 완전한 탈인산화는 피타아제만으로 이루어질 수 없다. 피타아제는 보다 낮은 미오-이노시톨 인산을 탈인산화하지 못한다. 예를 들면, 미국 특허번호 제5,536,156호(van Gorcum 등, 1995년 7월 25일 등록)에 기재된 A.피쿰 피타아제는 미오-이노시톨 2-인산 또는 미오-이노시톨 1-인산에 대하여 낮은 포스파타제 활성을 나타내거나 전혀 나타내지 않는다. 피타아제를 함유하는 본 발명의 먹이 첨가물에 산 포스파타제와 같은 다른 종류의 포스파타제의 첨가는 미오-이노시톨 2-인산과 미오-이노시톨 1-인산을 인산화하는 것을 돕는다.

원하는 생산물의 제제화는 피타아제의 활용을 필요로 하는 응용분야에 직접 사용될 수 있다. 액체 농축액들, 가루들과 입자들(granules)은 반응 혼합물, 발효물, 적은 알갱이들과 정미된 쓰레기에 직접 추가될 수 있다. 피타아제는 마시는 물에, 미네럴 블록에, 염으로써 또는 먹이통들 안에 뿌리거나 사료와 혼합될 수 있도록 가루 보충물로서 동물들에게 제공될 수 있다. 그것은 또한 알려진 과정들을 통해 다른 사료와 혼합되거나 뿌려지거나 펠릿화할 수 있다. 대신, 적절한 프로모터-인핸서 서열을 갖는 피타아제 유전자는 식물 게놈 내에 통합되어 피타아제 효소들이 위장관계 안에 분비되므로 기관 또는 조직(침샘, 췌장 또는 상피 세포들) 내에서 선택적으로 발현되므로, 피타아제를 보충적으로 추가할 필요가 없다.

바람직한 제제화에서, 본 발명의 피타아제는 미생물 먹이 접종물(inoculants)의 형태를 가질 수 있다. S.루미넌티움 JY35(ATCC55785)와 같은 천연 피타아제를 발현하는 미생물들의 배양들이나 이형적인 피타아제 유전자에 의해 발현되는 피타아제를 발현하는 재조합 미생물 배양체들은 발효기 내에서 높은 농도로 성장된 후 수확되어 원심분리에 의해 농축된다. 먹이-등급 유장(whey) 그리고/또는 다른 항냉동제들이 그후 세포 농축액과 혼합된다. 결과적인 혼합물은 피타아제 활성을 유지하기 위해 표준적인 동결건조법으로 극저온에서 냉동건조된다. 냉동건조된 배양체는 이 배양체를 생산물의 강도를 향상시키는 불활성의 운반체와 혼합되는 추가단계들에 의해 더욱 가공되어 최종 생산물을 형성할 수 있다.

본 발명에 의해 생산된 미생물 배양체들이나 식물들 모두 또는 일부분은 피타아제의 활용을 필요로 하는 많은 산업 과정들에 사용될 수 있다. 그러한 응용분야들은, 제한없이, 사람의 영양분들과 피테이트 함유 먹이 사료를 포함하는 다른 산업물들(콩, 옥수수 공정, 전분, 발효)에서 미오 이노시톨 포스페이트, 이노시톨, 먹이성분의 제공, 비반추동물(예를 들면, 돼지, 가금, 어류, 사료)의 첨가물 생성과 같은 최종 생산물의 제조를 포함한다. 피테이트의 분해는 무기인과 킬레이트된 금속들이 동물들이나 미생물에 사용되도록 만든다. 피타아제의 활용은 피테이트가 풍부한 먹이원료 그리고/또는 발효기질의 질, 가치와 유용성을 향상시킨다. 피타아제의 활용은 또한 옥수수의 습식 정미에 관여하는 담금(steeping) 과정이나 분리과정들을 가속화할 수 있다.

본 발명의 피타아제 유전자는 이형적 혼성화나 폴리머라제 연쇄 반응 실험에 의해 다른 미생물로부터의 피타아제 코딩 유전자 분리에 이용될 수 있다. 여기의 예들은 설명을 위해 사용된 것이고 어떠한 경우에도 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자들(예를 들면, 온도, pH, 수량)에 대해 정확도를 기하기 위해 노력했으나 일부 실험적 변이나 오차의 가능성은 인정하여야만 한다.

실시예1

제1위 박테리아의 분리

캐뉼라된(cannulated) 홀수타인 소로부터 제1위액이 Whirlpak(상표)백에 모아진다. 제1위액은 구위 튜브(orogastric tube)를 의해 제1위로부터 회수될 수도 있다. 적절한 혐기성 대기(예를 들면 90% Co₂와 10% H₂) 하에서 제1위액을 10배로 희석하고, 고체 배지(예를 들면 90% 스콧과 데호리티, 1965)의 표면 위에 뿌리고, 그 평판들을 39℃에서 18시간 내지 72시간 항온배양된다. 분리된 콜로니들을 무균 루프로 골라잡고(따고), 세포들은 신선한 한천 배지의 표면 위에 뿌려져 분리된 콜로니들을 생성한다. 단일 콜로니로부터의 세포들은 순수 배양을 나타내기 위해 형태적 조사에 의해 확인되고, Lethbridge Research Centre("LRC") 배양 콜렉션에서 배양되고 저장되거나 효소적 활성 또는 유전물질의 공급원으로 사용된다.

실시예 2

피타아제 활성에 대한 제1위 박테리아 스크리닝

A. 피타아제 분석들

샘플 용액들은 (배양 여과액, 세포 현탁액, 용해질, 세정액, 공시험용 증류수(washes or distilled water blanks)) 600 mL 기질용액 [0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼 내의 0.2 % (w/v) 피테이트 나트륨, pH 5.0]으로 37℃에서 30분 동안 150 ㎖ 샘플용액을 항온배양하여 피타아제 활성에 대해 분석되었다. 이 반응은 5% (w/v) 트리염화아세트산 750 ㎕를 첨가하면 멈춰진다. 이 반응 혼합체에서 방출된 오르소포스파타아제는 피스크(Fiske)와 서바로우(Subbarow, 1925)법에 의해 측정된다. 즉시 준비된 착색제 [5.5% 황산용액에 1.5% (w/v) 몰리브덴산 암모늄 4 볼륨 및 2.7 %(w/v) 황산철용액을 함유하는 용액 750 ㎕]이 이 반응 혼합체에 첨가되고 몰리브덴산인의 생성이 700 nm에서 광학분석적으로 측정된다. 그 결과들은 무기인산에 의해 준비된 표준곡선과 비교된다. 피타아제의 1단위("단위")는 분석조건 하에서 분당 1μM의 무기인산을 방출하기 위해 요구되는 효소의 양으로 정의된다.

미생물 산생성에 의해 야기된 위양성 결과들을 제거하는 개선된 피타아제 평판분석이 발달됐다. 박테리아 분리체들은 5%(v/v) 제1위액, 1.8%(w/v)한천과 2.0 %(w/v) 피테이트 나트륨을 함유하는 변형된 스콧과 데호리티(1965) 한천배지에서 5일 동안 37℃에서 혐기성 조건 하에서 배양되었다. 콜로니들은 한천 표면으로부터 세척되었고 페트리 평판들은 2% (w/v) 염화코발트에 의해 세척되었다.

실온에서 5분 항온배양 후에, 염화코발트 용액은 같은 부피의 6.25 %(w/v) 몰리브덴산암모늄과 0.42 % (w/v) 바나듐산암모늄을 함유하는 새로 준비된 용액에 의해 대치되었다. 5분 항온배양 후에 몰리브덴산 암모늄 용액/바나듐산 암모늄 용액이 제거되고 투명대를 위해 조사되었다. 대비염색법의 효과는 도1에서 증명되었다. 염색 전에, 피테이트를 함유하는 한천 배지에서 성장된 피테이트-생성 S.루미넌티움 JY 35 (ATCC 55785)와 젖산- 생성 S.보비스(S. bovis)의 콜로니들 주위에서 투명대가 나타났다(도1 왼쪽 페트리 평판). S.보비스 콜로니들에 의해 산-생성을 야기하는 클로닝의 위양대(false positive zones)는 염화코발트와 몰리브덴산암모늄/바나듐산암모늄 용액에 의해 평판들을 대비염색하므로 제거되었다(도1 오른쪽 페트리 평판).

B. 제1위 박테리아의 피타아제 활성

LRC 배양 콜렉션으로부터의 345개 제1위 박테리아의 피타아제 활성들이 측정되었다.(표1) 브리언트(Bryant)와 버르키(Burkey)(1953)에 의해 변형된 헝게이트 혐기법(1950) 또는 90 % 이산화탄소와 10 % 수소를 갖는 혐기성 챔버 LRC 배양콜렉션에서 미생물을 배양하기 위해 사용된다. 피타아제 스크리닝이 행해졌고 분리체들은 5%(v/v) 제1위액, 0.2%(w/v) 포도당, 0.2% (w/v) 셀로비오스와 0.3%(w/v) 전분을 포함하는 5mL의 변형된 스콧과 데호리티 배지(1965)를 갖는 헝게이트(Hungate) 튜브들에서 혐기적으로(100% 이산화탄소 ) 성장되었다. 39℃에서 18 내지 24시간 항온배양 후에 전체 세포들 또는 배양 상등액은 피타아제 활성에 대해 측정되었다. 세레노모나드들은 우수한 피타아제 생성자이다(실험된 93 % 분리체들이 피타아제 활성을 가졌다. 표1). 프레보텔라(Prevotella)는 많은 양성 배양체들이 동정되는 유일한 다른 속이다(실험된 40개 중 11개 피타아제 분리체들이 양성임). 실제적인 피타아제 활성을 갖는 총 29개 배양체가 동정되었다. 이들은 24개의 세레노모너스 속과 5개의 프레보텔라 속을 포함한다. 12개의 이 배양체들(11개 세레노모너스와 1개 프레보텔라 분리체)은 다른 양성 배양체들보다 실질적으로 높은 피타아제 활성들을 갖는다(표2). 모든 예에서, 피타아제 활성은 지배적으로 세포와 연관되어 있다.

실시예3

세레노모나 루미넌티움 JY35(ATCC 55785)의 피타아제 활성

A. 성장과 피타아제의 생성

S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)의 성장동안, 피타아제 생성이 조사되었다. S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)는 5%(V/W) 제1위액을 함유하는 변형된 스콧과 데호리트 육즙 배지(1965) 5mL를 갖는 헝게이트 튜브들에서 39℃로 성장되었다. 성장(단백질 농도)과 피타아제 활성(세포와 연관됨)은 24시간 주기 이상의 간격을 가지고 모니터링되었다. S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)의 최대 성장과 피타아제 활성은 항온배양 후 8 내지 10시간 이루어졌다. 세포성장은 피타아제 활성의 증가에 의해 반영되었다.

B. 피타아제 활성의 위치측정

S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제 활성은 지배적으로 세포와 연관된 것으로 측정되었다. 피타아제 활성은 배양 상등액과 세포 세척액들에서 거의 검출되지 않았다. S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)의 활성은 정과 코스터튼(1973)에 의해 기재된 전자현미경에 의해 위치측정되었다. 세포들은 원심분리에 의해 수확되고, 버퍼에 의해 세척되고, 4%(W/V) 한천 내에 봉매(embedded)되고, 30분 동안 0.5% 글루타르 알데히드 용액에서 예비고정되고, 5%(V/V) 글루타르 알데히드 용액에서 2시간 동안 고정되었다. 샘플들은 카코딜산 버퍼(0.1M, pH 7.2)에 의해 5회 세척되고 2% 오스뮴 테트로사이트(osmium tetroxide)에 의해 처리되고 카코딜산 버퍼에 의해 5회 세척되고 등급이 매겨진 에탄올 계열에서 탈수화되고, 스퓨르 수지(J. B. EM Services Inc)에 의해 봉매되었다. 초박편이 라이커트 모델 OMU3 초미세 절단기에 의해 절단되고 2%(W/V) 아세트산 우라늄과 구연산 납에 의해 염색되었다. 표본들(specimens)은 75kV 가속 전압에서 히타치 H-500TEM이 의해 관찰되었다. 반응 생산 침전을 위한 기질에 의해 항온배양된 S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 세포들과 미처리된 세포들 간의 비교는 피타아제 활성이 세포 외벽면과 관련되었음을 분명하게 나타내었다. 처리된 세포들의 세포 외벽 상에 전자 고밀집 물질의 침전은 피타아제 활성의 결과이다(도 3A, B와 C).

C. 피타아제 pH 최적화

S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제의 pH 최적화의 초기 결정은 전체 세포들에 의해 행해진다. 피타아제 활성은 4.0 내지 5.5 pH 범위 이상에서 최적이다(도4). 두 번째 pH 곡선은 Mgcl₂세포 추출물에 의해 생성된다(도5). 100mL 오버나이트 배양체로부터의 세포들은 무균 증류수에 의해 2배 희석되고 0.2M Mgcl₂수용액의 0.3 볼륨에서 재현탁되고 0℃에서 오버나이트 항온배양된다. 이 용액은 원심분리에 의해 정제되고, 결과적인 추출물은 피타아제 분석에 사용되었다. 글리신(pH 1.5 내지 3.0), 포름산(pH 3.0 내지 4.0), 아세트산( pH 4.0 내지 5.5)과 숙신산(pH 5.5 내지 6.5) 4개의 버퍼들이 pH 범위를 포괄하기 위해 사용되었다.

D. 최적의 피타아제 온도

S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제 활성의 최적 온도가 Mgcl₂세포 추출물로 pH 5.0(0.1M 아세트산 나트륨 버퍼)에서 측정되었다. 이 효소는 37 내지 55℃의 온도범위에서 50% 이상의 활성을 유지했다(도6).

E. 이온과 기질 농도가 피타아제 활성에 미치는 효과

여러 가지 이온들(10mM)과 기질의 온도가 전체 세포 피타아제 활성에 미치는 효과는 pH 5.0에서 측정되었다(0.1M 아세트산 나트륨 버퍼). 피타아제 활성들은 Ca++, Ni⁺, K⁺,Mg⁺⁺의 첨가에 의해서는 강화되었고, Fe⁺⁺, Za⁺⁺, Mn⁺⁺의 첨가에 의해서는 억제되었고, Co⁺⁺, Ni⁺⁺의 첨가에 의해서는 영향을 받지 않았다(도7). 기질 농도가 S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제 활성에 미치는 효과가 도8에 나타난다.

F. 분자량

S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제의 분자 크기는 지모그램 분석법에 의해 측정된다. 10배 농축된 비정제 MgCl₂가 분비된 추출물은 샘플 로딩 버퍼 20μL과 함께 미세 시험관에 혼합되었다(LAEMMLI, 1970). 이 미세 시험관은 5분간 끊은 수욕 상에 놓아 두었다. 이 변성된 MgCl₂추출물은 4% 고정겔이 상부에 놓여진 10% 분리겔에서 SDS-PAGE에 의해 분해되었다. 전기영동 후에 피타아제는 실온에서 1시간 1% 트리톤 X-100(Triton X-100)과 4℃에서 1시간 동안 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)에 겔을 담그므로 재변성되었다. 피타아제 활성은 0.4% 피테이트 나트륨을 함유하는 0.1M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.0)에서 16시간 동안 겔을 항온배양하므로서 검출되었다. 그 겔은 실시예2에서 피타아제 평판 분석법에 대해 기재된 염화코발트와 모리브덴산 암모늄/바나드산 암모늄 염색법으로 처리되었다. 대략 35 내지 45kDa의 분자량에 대응하는 단 하나의 우세한 활성 밴드가 관찰되었다(도9).

실시예4

세레노모너스 루미넌티움 JY35(ATCC 55785)로부터의 피타아제 유전자(phyA)의 클로닝

A. 피타아제 양성 E.coli 클론의 분리

게놈 DNA 라이브러리가 공지된 방법(Hu 등, 1991; Sambrook 등, 1989)에 의해 S. 루미넌티움 JY35(ATCC55785)에 대해 준비되었다. 게놈 DNA는 프리퍼(Priefer) 등에 의해 기재된 프로토콜의 변형을 사용하므로 S. 루미넌티움 JY35의 신선한 오버나이트 배양체로부터 추출되었다(1984). S. 루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 게놈DNA는 Sau3A에 의해 부분적으로 분해되고 겔은 2 내지 10kb 범위 내의 DNA 단편을 생산하기 위해 정제되었다. 게놈 라이브러리는 BamHl가 분해된, 탈인산화된 pUC18을 S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) Sam3A 게놈 DNA 단편들과 이음으로써 구성되었다(Gibco BRL, Missisauga, ON). E.coli DH5α 적응 세포들(Gibco BRL, Missisauga, ON)은 이음 혼합물에 의해 형질전환되고 6,000개 클론들을 운반하는 삽입체들은 암피실린(100㎍/㎖)을 함유하는 LB 피타아제 스크리닝 한천[LB, 1.0% 피테이트 나트륨(멸균여과된), 100mM HEPES(pH 6.0 -6.5)와 0.2% CaCl₂] 상에서 피타아제 활성(투명대)에 대해 스크린되었다. 피타아제-양성 클론 SrP.2는 분리되고 피타아제 활성은 효소분석법을 통해 입증되었다(도10). 매우 높은 수준의 피타아제 활성이 E.coli 세포들과 관련되었을 때 배지 내에서 잘 발견되었다. 클론 SrP.2로부터 분리된 플라스미드 DNA가 5.5kb 플라스미드를 운반하고, pSrP.2를 지정하고, 2.7kb Sau3A 첨가물을 함유하는 pUC18로 구성되었다.

B. 2.7kb 첨가물의 세레노모너스 루미넌티움 JY35(ATCC55785) 원천(origin)의 확인

pSrP.2에서 2.7-kb 첨가물의 S.루미넌티움 JY35 (ATCC 55785)의 원천은 서던 블롯 혼성화에 의해 확인되었다(Sambrook 등, 1989). S.루미넌티움 JY 35(ATCC 55785)로부터 분리되고 EcoR1 또는 Hind Ⅲ에 의해 분해된 DNA는 0.8 % 한천겔 상에서 분해되었다. 제타(Zeta)-탐침(등록상표)막 (Biorad 실험실)에 전이된 후, 혼성화는 높은 엄격함(2x SSC, 65℃) 하에서 디곡시게닌(DIG DNA 라벨 및 검출 킷, Boeringer Mannhein 캐나다. Laval, PQ)에 의해 표지된 pSrP.2 로부터 2.7 kb단편에 의해 수행되었다. 이 블롯들은 식물에서 2 x SSC로 2회 세척되었다.; 0.1 % SDS에서 5분 및 0.1 xSSC 2회; 65℃에서 0.1% SDS 20분). 이 블롯들은 DIG DNA 라벨 및 검출 킷(Boeringer Mannhein 캐나다.)에 의해 제공된 프로토콜에 의해 전개되었다.

탐침은 14-kb Hindhill(도11)과 23-kb EcoRI(데이터 없음) 단편과 반응했고 게놈 DNA의 2.7 kb 단편은 S.ruminanticum JY 35 (ATCC 55785)로부터 온 것이고 동질서열이 게놈에 존재함이 입증되었다. S.루미넌티움 JY 35 (ATCC 55785)로부터의 2.7 kb 단편에 상동적인 서열의 복제품이 게놈에 존재하였다(데이터 없음). 그러나 제한단편길이의 다형성은 S.루미넌티움 HD86(9- 및 23-kb EcoRI 단편)과 S.루미넌티움 HD₄(3-kb EcoRI와 20-kb Hindill 단편)으로 잘 알려져 있다. pSrP.2로부터 표지된 2.7-kb 단편은 프레보텔라 종. 46/5², E.coli DH5α 또는 A.피쿰 NRRL 3135로부터 분리된 게놈 DNA와 혼성화되지 못했다(데이터 없음).

실시예 5

피타아제 유전자의 특성

A. 피타아제 유전자의 클로닝의 증거

E. Coli DH5α 적응 세포들(Gibco BRL, Mississauga, ON) 은 플라스미드 pUC 18과 pSrP.2에 의해 형질전환되었다. 궁극적인 암피실린 내성 전환체들은 LB 피타아제 스크리닝 한천 상에서 피타아제 활성에 대해 시험되었다. pSrP.2에 의해 형질전환된 E.coli DH5α세포들만이 LB 피타아제 스크리닝 한천 상에 투명대들을 생성했다.

B. pSrP.2의 제한과 삭제 분석법

피타아제 유전자는 제한 효소와 삭제 분석법에 의해 2.7 kb Sau3A 삽입물 상에 위치한다(Ausubel 등, 1990 ; Sambrook 등, 1989). 플라스미드 pSrP.2△SphI 을 운반하며, pSrP.2로부터 1.4-kb Spb1단편을 제거함으로서 형성된 세포들은 피타아제 활성이 부족되었다(도12와 도13, 표3).

C. 지모그램 분석법

E.coliDH5α에 의해 생성된 피타아제의 분자량은 지모그램 분석법에 의해 측정된다. 오버나이트 배양체 1mL는 1.5mL 미세관에 옮겨졌다. 이 세포들은 원심분리에 의해 수확되고 0.1 M 아세트산 나트륨 버퍼(pH 5.5)에 의해 세척되었다. 세포 펠렛은 80μL 샘플 로딩 버퍼에서 재현탁되었다 (Laemmli, 1970). 그리고 미세관은 5분 동안 끓는 수욕 상에 방치한다. 결과적인 세포 추출물은 상부에 4% 고정겔을 갖는 10% 분리겔 상에서 SDS-PAGE 에 의해 분해된다 (Laemmli, 1970). 이 겔은 실시예3F에서 기재한 바와 같이 피타아제 활성을 위해 염색되었다. 대략 37 kDa에 대응하는 단일의 눈에 띠는 활성 밴드가 관찰되었다(도14, 레인 A). 대응하는 활성밴드가 E.coli DH5α(pSrP.2△Sphl)세포들에서는 관찰되지 않았다(도14, 레인 B).

D. pSrP.2의 DNA 서열 분석법

pSrP.2의 2.7-kb 삽입물의 완전한 서열이 결정되었다. 샘플들은 Taq DyeDeoxy^TMTerminator Cycling Kit (Applied Biosystems, Inc.)을 사용함으로서 Applied Biosystems 모델 373A DNA 서열 구조 (Applied Biosystems, Inc., Mississauga, ON) 상에서 DNA 서열분석법을 위해 준비되었다. 주형 DNA는 Wizard(상표) 미니프렙스 DNA 정제체계로 E.ColiDH5α오버나이트 배양체들로부터 추출되었다. 중첩서열은 프라이머 위킹에 의해 만들어졌다. 이 DNA서열 데이터는 MacDNA sis DNA 소프트 (Hitachi Software Engineering 사, San Bruno, CA)를 사용함으로서 분석되었다.

2,7-kb DNA 삽입물의 서열이 측정되었고, DNA 구조 분석이 2.7-kb의 Sau3A 첨가물의 Sphl 사이트를 중첩하며 37 kDa 피타아제를 발현하기에 충분히 큰 오픈 리딩 프레임(ORF2 : bp 1493-2504)을 동정하였다. 피타아제 활성은 2.7 kb Sau3A 단편의 말단 bp 1518까지 제거되므로 나타내지 못했다. 이것은 프라이머 SrPr6 (CGG GAT GCT TCT GCC AGT AT, 서열 번호 3, bp 1518 - 1538의 역보체)과 포워드 프라이머(CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC)를 pGEM-T9(Promega Corp.)에 연결시킨 pSrP.2의 PCR 생성물을 클로닝하므로서 형성된다. 프라이머 SrPr6(bp 1232 - 1252, CGT CCA CGG AGT CAC CCT AC) 서열번호 4 및 M13 역프라이머(AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA)에 연결되었으며, Sphl 절단부위 상향에 의해 252 bp 및 ORF2를 함유하는 pSrP.2의 PCR 생성물 서브클론(pSrPf6)은 피타아제 활성을 유지한다. (표3, 도13).

S.루미넌티움 피타아제 유전자(phy A)의 서열과 해독이 도15에 도시되어 있다. ORF2의 해독은 39.6 kDa의 예상된 분자량을 가진 346-아미노산 폴리펩티드의 발현을 야기한다. 처음 31개 잔기들은 원핵생물 신호서열의 전형이며, 기초 N-말단과 중심부 소수성 핵을 포함했다(von Heijne, 1986). 본 헤이즌법의 응용은 신호서열 절단위치는 Ala²⁸또는 Pro³¹앞에 나타날 것이라고 예견했다. 이것은 E.coli DH5α(pSrPf6) 배양 상등액으로부터 정제된 겔의 N-말단 아미노산 서열을 결정하므로 확인되었다(도15). 분비된 완전한 단백질은 36.5 kDa의 추정량을 갖는다.

phy A 아미노산 서열을 MasDNASIS SWISSPROT 데이터베이스로부터의 알려진 단백질 서열들과 비교하였을 때 아스페르질러스 니거 피타아제 유전자들 phy A와 phy B를 함유하는 공지된 서열들과 어떤 유사점도 나타내지 않았다.

실시예 6

E.coli에 의해 발현된 phy A 생성물들의 부분정제와 특성화

E.coli 오버나이트 배양체들로부터 준비된 세포가 없는 상등액들은 체적비 3 : 1로(3:1 v/v)) 0.1 M Tris (pH 7.9), 0.3 M NaCl 버퍼에 의해 3회 세척되었다. 피타아제 활성은 0.1 M 아세트산 나트륨(pH 5.0)과 0.3 M NaCl 1 볼륨을 갖는 수지로부터 나타난다. 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)에 의해 염색된 SDS-폴리아크릴아미드 상에서 분해될 때, 추출된 단백질의 70 % 이상은 단일 37-kDa 밴드를 형성했다. 지모그램과 N-말단 아미노산 서열 분석법들은 37-kDa 밴드는 클론된 S.루미넌티움 JY 35(ATCC 55785) phy A 에 의해 발현된 피타아제와 대응됨을 확인했다. Ni⁺⁺-NTA한천-정제된 피타아제의 비활성은 단백질 mg 당 방출된 인산 200 내지 400 μ몰 범위였다. 이것은 정제된 A.피쿰 NRRL 3135 피타아제(van Gorcum 등, 1991, 1995; van Hartingsveldt 등; 1993)에 의해 기록된 비활성의 2배 내지 4배보다 크다(van Gorcum 등, 1991; van Hartingsveldt 등; 1993).

실시예 7

세레노모너스 루미넌티움 phy A 유전자의 과잉발현

S. 루미넌티움 JY 35(ATCC 55785)로부터의 분리 및 특성화는 기존의 방법을 사용하여 원핵(예를 들면, E.coli 및 B. subtilis) 또는 진핵(예를 들면, 진균 - Pichia, Saccharomyces, Aspergillus, Trichoderma; 식물-Brassica, Zea, Solanum ; 동물-가금, 돼지, 어류) 발현 체계 다수에 존재하는 단백질 phy A의 대량생산을 가능하게 한다. E.coli, P.패스토리스 및 B.네이퍼스에 존재하는 phy A의 구조 및 발현에 대한 설명은 다음과 같다. 같은 방법들이 다른 원핵생물과 진핵생물들에 있는 S.루미넌티움의 발현에 적용될 수 있다.

A. E.coli 특이적 발현 구성체에서의 세레노모너스 루미넌티움 phy A의 클로닝

발현 구성체는 tac 프로모터와 전사적으로 융합한 완전한 Phy A를 발현하는 지역(region)에서 형성된다(Brosius 등, 1985). 프로모터 서열은 E.coli에서 효율적인 발현을 제공하는 다른 프로모터로부터의 서열들에 의해 대치될 수 있다. 발현 구성체는 형질전환에 의해 E.coli세포들에 도입된다.

ⅰ. E.coli 발현벡터의 형성

tac 또는 관련된 프로모터들에 기초한 많은 E.coli 발현 벡터들이 상업적으로 사용된다. 본 실시예에서 이 구조는 Pharmacia Biotech Inc. (웁살라, 스웨덴)로부터 사용 가능한 pKK 223-3으로 준비된다. 완전한 phyA(신호 서열을 제거한 후 분비된 펩타이드)를 발현하는 phyA 지역은 올리고뉴클레오티드 프라이머들 MATE2 (GC GAA TTC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(서열번호5)와 M13 Reverse에 의해 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 MATE 2(서열번호5)와 증폭된 생산물을 pKK223-3과 직접 조합하기 위해 그것의 말단에 적절한 제한위치를 포함하도록 고안되었다. MATE 2(서열번호 5)와 M13 Reverse에 의해 증폭된 phyA 위치는 EcoR1 과 SmaI에 의해 분해되고 유사하게 절단된 pKK223-3 안에 삽입되었다.

ⅱ.E.coli의 형질전환과 Phy A 발현

pKK223-3::phyA 이음 혼합은 적응 E.coli세포들을 형질전환하기 위해 사용된다. SG13009, CAG926 또는 CAG 929(pREP4와 같은 플라스미드 상에 lacl을 운반함)와 같은 높은 수준의 단백질 발현에 적당한 균주들이 사용된다. 형질전환된 세포들이 암피실린(100 mg/mL)을 함유하는 LB한천배지 상에 뿌려지고 37℃에서 오버나이트 항온배양된다. 암피실린 내성 콜로니들은 pDNA를 추출하고 이 DNA를 한천 겔 전기영동과 제한분석에 사용하므로 원하는 pKK223-3::phyA 구조의 존재가 스크린된다. 양성 클론들은 PCR과 DNA 서열분석에 의해 더욱 특성화된다.

형질전환된 E.coli세포들에 의해 S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785)피타아제의 발현은 적절한 항생제를 선택한 적당한 액체 배지(예를 들면 LB 또는 2xYT)에 37℃의 잘 환기된 상태에서 흡광도(600 nm)가 0.5-1.0일 때까지 세포들을 배양함으로서 시험된다. 최종농도가 0.1과 2 mM사이가 될 때까지 tac 프로모터가 이소프로필-β-D-치오갈락토사이드(IPTG)를 첨가하므로 유도된다. 이 세포들은 2시간 내지 4시간 더 배양된 후에 전기영동에 의해 수확될 수 있다. 단백질 발현은 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯/면역검출법에 의해 모니터링된다. 발현된 PhyA는 E.coli 세포들을 파괴(초음파 분해 또는 기계적 파괴)함으로 추출될 수 있다. PhyA의 단백질 포괄체(Protein inclusion)들은 원심분리되어 얻어지고 1 내지 2 % SDS에 의해 용해될 수 있다. 이 SDS는 투석, 전기용리(electroelution) 또는 초여과에 의해 제거된다. 준비된 세포추출물의 피타아제 활성은 실시예 2에서 기재된 표준방법들에 의해 분석될 수 있다.

B. 피치아 패스토리스 -특이적 발현 구성체에서 세레노모너스 루미넌티움 phy A의 클로닝

S. 루미넌티움 피타아제를 분비 생산물로 발현하기 위해 완전한 PhyA를 발현하는 지역에서 P.패스토리스 발현 벡터들(Pichia Expression Kit Instruction Manual, invitrogen Corporation, San Diego, CA) 상에서 발견되는 분비 신호서열과 전사적으로 융합된 발현 구성체가 형성된다. 프로모터와 분비 신호서열들은 피치아에서 효율적 발현을 제공하는 다른 프로모터로부터의 것들에 의해 대체될 수 있다. 발현 구성체는 형질전환에 의해 P.패스토리스 내에 도입된다.

ⅰ. P.패스토리스 발현 벡터의 형성

aox 1 프로모터, α인자 또는 pho1 신호 서열에 기초한 많은 P.패스토리스 발현 벡터들이 상업적으로 사용된다. 본 실시예에서 이 구조는 Invitrogen Corporation 로부터 사용 가능한 pPIC9로 준비된다. 완전한 phy A(신호 서열을 제거한 후 분비된 펩타이드)를 발현하는 phyA 지역은 올리고뉴클레오티드 프라이머들 MATE (GC GAA TTC GCG AAG GCG CCG GAG CAG AC)(서열번호6)와 M13 Reverse에 의해 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 MATE(서열번호6)와 증폭된 생산물을 pPIC9와 직접 조합하기 위해, 그것의 말단에 적절한 제한위치를 포함하도록 고안되었다. MATE (서열번호 6)와 M13 Reverse에 의해 증폭된 phyA 위치는 EcoR1 과 SmaI에 의해 분해되고 유사하게 절단된 pPIC9 안에 삽입된다.

ⅱ. P.패스토리스의 형질전환과 PhyA 발현

pPIC9::phyA 이음 혼합은 적응 E.coli DH5αα 세포들을 형질전환하기 위해 사용된다. 형질전환된 세포들이 암피실린(100 mg/mL)을 함유하는 LB한천배지 상에 뿌려지고 37℃에서 오버나이트 항온배양된다. 암피실린 내성 콜로니들은 pDNA를 추출하고 이 DNA를 한천 겔 전기영동과 제한분석에 사용하므로 원하는 pPIC9::phyA 구조의 존재가 스크린된다. 양성 클론들은 PCR과 DNA 서열분석에 의해 더욱 특성화된다. 플라스미드 DNA는 원하는 pPIC9:: phyA 구조를 운반하는 E.coli클론의 1L 배양으로부터 준비된다. pDNA 는 Bg/Ⅱ에 의해 분해되고 벡터의 완전한 분해를 확인하기 위해 한천 겔 전기영동에 의해 분석된다. 분해된 pDNA는 페놀:클로로포름의 침전된 에탄올에 의해 추출되고 무균의 증류수에서 1 ㎍/mL 의 최종농도까지 재현탁된다. 형질전환을 위한 준비에 있어 P.패스토리스 GS115 또는 KM71세포들은 30℃로 YPD육즙배지에서 24시간동안 발육되었다. 100μL 배양체로부터의 세포들은 원심분리에 의해 수확되고 10㎍ 연어정자 DNA와 10㎍ 선형화된 pPICα::phyA를 함유하는 100μL의 형질전환 버퍼(0.1 M 염화리튬, 0.1 M 디치오스레이톨, 45 % 폴리에틸렌글리콜 4000)에서 재현탁된다. 이 혼합물은 37℃에서 1시간 항온배양되고, P.패스토리스 최소 한천배지에 뿌려져 2 - 5일 동안 항온배양된다. 최소 한천배지 상에서 성장한 콜로니들은 순도를 위해 스트리크(Streaking)되고 PCR과 서던 블롯 혼성화에 의해 통합된 phyA의 존재가 분석된다. 형질전환된 P.패스토리스 세포들에 의해 S.루미넌티움 JY35(ATCC 55785) 피타아제의 발현은 적당한 액체 배지(예, BMGY같은 완충 복합 글리세롤 배지)에 30℃의 잘 환기된 상태에서 흡광도가 2 - 6일 때까지 세포들을 배양함으로써 실험된다. 세포들은 수확되고 유도배지(예를 들면 완충 복합 메탄올 배지, BMMY)에서 OD₆₀₀이 1.0일 때까지 재현탁되고 3내지 5일 동안 더 항온배양된다. 세포와 세포 없는 배양 상등액이 수집되고 단백질 발현은 효소분석, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯법에 의해 검사된다.

C. Pichia 패스토리스에서 세레노모너스 루미넌티움 phyA의 클로닝 - 특징적 발현 형성 - 추가실시예

S. 루미넌티움 피타아제를 분비생산물로 발현하기 위해 완전한 PhyA를 발현하는 지역에서 P.패스토리스 발현 벡터들(Pichia Expression Kit Instruction Manual, invitrogen Corporation, San Diego, CA) 상에서 발견되는 분비 신호서열과 전사적으로 융합된 발현 구성체가 형성된다. 프로모터와 분비 신호서열들은 피치아에서 효율적 발현을 제공하는 다른 프로모터로부터의 것들에 의해 대체될 수 있다. 발현 구성체는 형질전환에 의해 P.패스토리스 내에 도입된다.

ⅰ. P.패스토리스 발현 벡터의 형성

aox 1 프로모터, α인자 또는 pho1 신호 서열에 기초한 많은 P.패스토리스 발현 벡터들이 상업적으로 사용된다. 본 실시예에서 이 구조는 Invitrogen Corporation 로부터 사용 가능한 pPICZαA로 준비된다. 완전한 phyA(예를 들면 신호 서열을 제거한 후 분비된 펩타이드)를 발현하는 phyA 지역은 올리고뉴클레티드 프라이머들 MATE (GC GAA TTC GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(서열번호6)와 M13 Reverse에 의해 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 MATE(서열번호6)와 증폭된 생산물을 pPICZαA와 직접 조합하기 위해 그것의 말단에 적절한 제한위치를 포함하도록 고안되었다. M13 Reverse에 의해 증폭된 phyA 위치는 EcoR1 과 SmaI에 의해 분해되고 유사하게 절단된 pPICZαA 안에 삽입된다.

ⅱ. P.패스토리스의 형질전환

pPIZαA::phyA 이음 혼합은 적응 E.coli DH5α 세포들을 형질전환하기 위해 사용된다. 형질전환된 세포들이 제오신(25 mg/mL)을 함유하는 LB한천배지 상에 뿌려지고 37℃에서 오버나이트 항온배양된다. 제오신 내성 콜로니들은 pDNA를 추출하고 이 DNA를 한천 겔 전기영동과 제한분석에 사용하므로 원하는 pPICZαA::phyA 구조의 존재가 스크린된다. 양성 클론들은 PCR과 DNA 서열분석에 의해 더욱 특성화된다. 플라스미드 DNA는 원하는 pPICZαA:: phyA 구조를 운반하는 E.coli클론의 1L 배양으로부터 준비된다. pDNA 는 Bg/Ⅱ에 의해 분해되고 벡터의 완전한 분해를 확인하기 위해 한천 겔 전기영동에 의해 분석된다. 분해된 pDNA는 페놀:클로로포름의 침전된 에탄올에 의해 추출되고 무균의 증류수에서 1 ㎍/mL 의 최종농도까지 재현탁된다.

형질전환을 위한 준비에서 P.패스토리스 GS 115 세포들은 50mL 육즙배지에 주입되고 28℃, 250 RPM에서 하룻동안 항온배양된다. 대신 5 mL 1일 배양은 신선한 YPD 육즙배지 50 mL 을 주입하기 위해 사용되었다. 배양은 28℃, 250 RPM에서 오버나이트 증폭되었다. 다음날 아침, 5 mL 배양액이 50 mL 신선한 YPD 육즙을 주입하기 위해 사용되었다. 이 배양은 배양 OD₆₀₀이 대략 1.2(6시간)에 도달할 때까지 28℃, 250 RPM에서 항온배양되었다. 20mL 신선한 배양액으로부터 효모세포들이 원심분리에 의해 수확되고 한차례 세척된 후 실온의 10mM Tris, 1mM EDTA, 0.1M 염화리튬, 0.1M 디치오레이톨 버퍼(pH 7.4). 30℃에서 1시간 항온배양 후 세포 현탁액은 얼음물로 한 번, 1M 소르비톨 160mL로 한 번 세척된다. 이 세포들은 1M 어름처럼 차가운 소르비톨 160μL에서 재현탁된다(10¹⁰cells/mL에 달하는 세포 농도를 얻기 위해). 선형화된 pPICZαA::phyA( 5 내지 10 ㎍ )은 세포 80μL과 혼합되고 선냉동처리된 일렉트로포레이션 큐벳들( 0.2 cm 간극거리)에 얹혀지고 5분 동안 어름위에서 항온배양된다. 높은 전압 펄스(1.5 kV, 25 μF, 250 ohms)가 Bio-Rad Gene Pulser^TM을 갖는 큐벳에 사용된다. 펄스 직후 1M 어름띄운 소르비톨 1mL가 큐벳에 첨가되고 이 큐벳은 게속해서 30℃에서 2시간 항온배양된다. 이 세포 현탁액은 제오신(100 ㎍/mL)을 함유하는 YDD한천배지 상에 뿌려지고(평판당 100~200μL) 30℃에서 2~4일 항온배양된다. 선택배지에서 자란 콜로니들은 순도를 위해 스트리크되고 PCR과/또는 서던 블롯 혼성화에 의해 통합된 phyA의 존재가 분석된다.

ⅲ. S.루미넌티움 JY 35 피타아제 유전자의 피치아 패스토리스의 발현

형질전환된 P.패스토리스 세포들에 의한 S.루미넌티움 JY 35 피타아제의 발현은 형질전환된 세포들을 완충된 복합 글리세롤 배지(예를 들면 완충된 복합 글리세롤 배지,BMGY, Pichia 발현 kit Instruction Manual) 에서 28℃, 250 RPM으로 성장하고 그것을 유도배지(예를 들면 복합 메탄올 배지, BMMY)에 옮겨짐으로 시험된다. BMGY배지로부터 수확된 세포들은 BMMY 배지에 의해 세척되고 OD₆₀₀이 1.0이 될 때까지 BMMY에서 재현탁되고 3-5일 동안 28℃, 250 RPM 에서 항온배양된다. 메탄올(0.005 볼륨)이 24시간마다 첨가된다. 세포들과 세포 없는 배양 상등액은 수집되고 피타아제 활성에 대해 분석된다.

16 P.패스토리스 pPICZαA::MATE 형질전환체들은 BMMY 배지에서 96시간 성장한 후 피타아제 활성에 대해 시험된다. 클론 17이라 명명된 가장 활동적인 형질 전환체는 보다 진보된 연구를 위해 선택되어졌다. P.패스토리스 pPICZαA::MATE과 음성 클론(P.패스토리스 pPICZαA)에 의한 성장과 피타아제 생성은 9일 이상의 주기로 점검된다. 출발 배양체가 BMGY(글리세롤) 배지 10mL에서 분리체들을 오버나이트(28℃, 250 RPM) 배양하기 위해 준비된다. 세포들은 수확되고 배가된 배양체들이 대략 OD₆₀₀이 2.5가 될 때까지 BMMY(메탄올) 배지 500mL에서 재현탁하여 준비된다. 결과적 배양체들은 500mL 플라스크에 옮기고 28℃, 250 RPM에서 항온배양된다. 메탄올은 0.5% 최종농도까지 매 24시간마다 첨가된다. 흡광도와 피타아제 활성은 실험시간 이후에도 측정되었다. 그 결과들이 표4에 표시되었다. 피타아제 활성은 S.루미넌티움 phyA 유전자를 운반하는 배양체들에서만 검출되었다. 이 배양체들은 210.5시간 배양 후 mL당 22.5 단위 피타아제 활성을 나타냈다.

흔들 플라스크 배양체들의 피타아제 활성은 유도 프로토콜과 배지 조성을 변형시키므로 증가되었다. 클론17의 피타아제 활성이 유도배양의 초기세포밀도 (OD₆₁₀= 36.0)를 증가시키므로 현저하게 개선되었다. 거의 4일(91.5시간) 성장 후 40 및 20 단위/mL 이상의 활성들이 전체 배양체와 세포가 없는 상등액 샘플에서 관찰되었다. 이 배양체들의 흡광도 (OD₆₁₀)는 62와 69 사이였다. 실험 결과들은 메탄올 유도시간에 배양 생체량이 크면 클수록, 제조합 피타아제의 양이 많아진다는 것을 나타낸다. 150 g/L(건량) 또는 흡광도 1500만큼 높은 생체량은 산소가 풍부한 잘 조절된 발효계에서 최적의 성장조건 하에서 배양된 피치아에 대해 보고되었다.

피치아 피타아제 생산량은 트윈-80을 배지에 첨가하였을 때 또한 증가하였다. 계면활성제들은 아스페르질러스 카르보나이어스(Aspergillus carbonarius)(Al-Ash와 Duvnjak, 1994)에 의해 피타아제 생성에 영향을 미친다는 것이 이미 알려져 있다. 0, 0.02, 0.1 또는 0.5 % 트윈-80의 첨가가 P.패스토리스 pPICZαA::MATE 클론 17 BMMY 배양체의 피타아제 생산에 미치는 효과가 표5에 도시되었다. 2일 동안 YPD배양체들로부터의 세포들은 수확되어 BMMY( OD₆₁₀= 8.3)에서 재현탁되었다. 각 트윈-80의 농도에 대한 3배의 플라스크들이 준비되어 280℃ 250 RPM에서 항온배양되었다. 메탄올(0.005 볼륨)이 매일 플라스크에 첨가되었다. 피타아제 활성은 높은 농도의 트윈-80을 함유하는 배양체에서 매우 빠른 속도로 증가하였다. 더욱 피타아제 활성의 많은 부분이 보다 높은 농도의 트윈-80 농축액이 사용되었을 때 상등액에서 관찰되었다. 흔들 플라스크 배양체 298단위/mL만큼 많은 피타아제의 양이 0.5% 트윈-80에 의해 수정된 BMMY배지에서 배양된 클론 17의 9일 배양체에 의해 얻어졌다.

세포 및 상등액 단백질은 P.패스토리스에 대한 PhyA의 생산을 확증하기 위해 SDS-PAGE gel에 용해되었을 때 즉시 나타난다. 37kDa 단백질 밴드의 존재는 5mL의 상등액에 12% 37kDa 밴드는 세포 단백질 샘플에서 관찰되었으나, 상등액 샘플에서 발견된 대응하는 양의 10% 이하만이 나타났다. PhyA와 함께 클론 17로부터의 상등액은 단백질들(피치아 발현의 유효한 특성)을 거의 포함하지 않았다. 재조합 PhyA 단백질은 95% 이상(SDS-PAGE gel로부터 측정된) 분비 단백질로 구성한다. 37kDa 단백질 밴드는 음성 조절 배양(P.패스토리스 pPICZαA)의 상등액 또는 세포들에서는 나타나지 않았다.

S.루미넌티움 피타아제(PhyA)를 발현하는 재조합 P.패스토리스 세포에 의한 흔들 플라스트 실험은 이 단백질 생산 체계의 가능성을 시사했다. 피타아제 생산의 충분한 양은 발효기에서 클론 17을 배양하고 유도하므로 얻어질 것이다. 피타아제 생산의 추가량은 독립적인 형질전환체의 스크리닝 또는 다복제 벡터 체제들의 사용을 통해 유전자 복제수를 증가시키므로 얻어질 수 있다. 자발적인 다중 플라스미드 통합이 피치아에서 형질전환체의 1/10 또는 1//100의 빈도로 나타난다. 틀림없이 피타아제 생산량의 10배 증가는 피타아제 유전자 복제수의 조작과 발효 파라메터의 조절을 통해 쉽게 이루어질 수 있다. 이것은 상업적 A 피큠 피타아제 생산체계에 비교될 수 있는 생산수준을 야기할 것이다. 이 체계들의 생산량은 배양체 단위 L당 피타아제 활성 약 3,000,000단위에 도달될 것이다.

iv. 곡물 기질들 상에서 재조합 S.루미넌티움 피타아제(PhyA)의 활성

피타아제 패스토리스에 의해 생성된 재조합 S.루미넌티움 JY35 피타아제에 의해 옥수수로부터 인산이 제거됨이 조사되었다. 사료 옥수수는 입자 크기가 1-3mm가 되도록 분쇄되어 체로 쳤다. 분쇄된 옥수수(0.5g)는 0.1M아세트산 나트륨(pH 5.0)이 첨가된 무균의 15mL 팔콘 튜브(Falcon tubes)에서 측량되었다. 피타아제 첨가 후 반응 혼합물들은 37℃에서 항온배양되었다. 인산 방출은 상등액 인산을 측정하므로 결정되었다. 반응에 나타나지 않는 인산을 측정하기 위해 반응혼합물이 준비되고 5%(W//V) TCA의 첨가를 통해 즉시 터미네트되었다. 모든 실험은 3배수로 진행되었다.

아세트산 나트륨에서 옥수수를 항온배양한 것은 시간에 대하여 증가된 양의 인산 방출을 야기했다(표6). 피타아제 활성의 첨가가 방출된 인산양을 증가시켰지만, 인산 방출율은 시간에 대하여 감소되었다.

또한 항온배양 혼합물에 첨가된 피타아제 농도는 방출된 인산량에 영향을 미친다. 인산 농도가 옥수수 g당 0.08 단위로부터 0.48단위로 상승한 것은 상등액에서 인산 수준의 증가를 야기했다. 0.32로부터 0.48단위로 피타아제 농도를 증가한 것은 방출된 인산에 있는 단지 약간 증가시켰음은 주목되어야 한다.

D. 브라시카 네이퍼스(Brassica napus) 특이적 발현 구성체에서의 세레노모너스 루미넌티움 phyA의 클로닝

형질전환과 유전자 발현방법들이 많은 외떡잎과 쌍떡잎 농작물 종들에 대해 발달되어 왔다. 이 실시예에서, 완전한 PhyA를 발현하는 지역(region)이 S.루미넌티움 피타아제의 씨오일 특이적 발현을 할 수 있도록, 오레오신 코딩 서열과 전사적으로 융합되는 S.루미넌티움 JY35 피타아제 발현 구성체는 형성된다. 프로모터 그리고/또는 분비 신호서열은 B.네이퍼스 또는 다른 형질전환 가능한 식물 종들에서 효율적인 발현을 제공하는 다른 프로모터로부터의 서열들에 의해 대치될 수 있다. 발현 구성체는 아그로박테리움-중재된 형질전환에 의해 B.네이퍼스 세포들에 도입된다.

ⅰ. E.coli 발현벡터의 형성

B.네이퍼스에 작용할 수 있는 많은 벡터가 문헌에 기재되었다(Gelvin 등, 1993). 본 실시예에서 이 구성체는 pCGOBPGUS(von Rooijen과 Moloney, 1994)의 E.coli-β-글루쿨로니타제 CDS를 phyA 완전한 CDS를 발현하는 단편으로 교체하므로 준비된다. 이것은 오레오신 프로모터::오레오신 CDS::β-글루크로니타제 CDS::NOS 지역을 함유하는 Pstl Kpnl-분해된 pUCBM20(Boehringer Mannheim 캐나다, Laval, PQ)을 서브-클로닝함으로서 이루어진다. 이 플라스미드를 pBMOBPGUS라 부른다.

완전한 phyA(신호 서열을 제거한 후 분비된 펩타이드)를 발현하는 phyA 지역은 올리고뉴클레오티드 프라이머들 MATN(GA GGA TCC ATG GCC AAG GCG CCG GAG CAG AC)(서열번호7)와 M13 리버스에 의해 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 MATN(서열번호7)와 증폭된 생산물을 분해된 pBMOBPGUS와 직접 조합하기 위해 그것의 말단에 적절한 제한위치를 포함하도록 고안되었다. MATN(서열번호 7)와 M13 리버스에 의해 증폭된 phyA 단편은 Ncol Sstl에 의해 분해되고 유사하게 절단된 pBMOBPGUS 안에 삽입되어 플라스미드 pBMOBPphyA를 생성했다. B.네이퍼스 발현벡터, pCGOBPphyA는 Pstl Kpnl단편을 오레오신 프로모터::오레오신CDS::NOS단편을 함유하는 pBMOBPphyA로부터의 Pstl Kpnl 단편을 대치하므로 형성된다.

ii. B.네이퍼스의 형질전환과 안정된 PhyA 발현

돌연변이 B.네이퍼스는 본 로이즌과 몰로니에 의해 기재된 대로 준비되었다. 아그로박테리움 투메페이션스 균주 EHA101DL pCGOBPphyA에 의해 일렉트로포레이션에 의해 형질전환되었다. B.네이퍼스의 떡잎을 가진 꽃병은 A.투메페이션스EHA101(pCGOBPphyA)에 의해 형질전환되었다. 돌연변이 식물들은 20Mg/mL 카나마이신을 포함하는 호르몬 없는 MS배지 상에 뿌리를 두고있는 외식체로부터 재생되었다. 젊은 식물체들은 NPTll활성에 대해 분석되고, 형질전환되지 않은 식물들로부터의 씨들과 비교되었다. 제2세대 식물들(T2)은 가장 높은 수준의 피타아제 활성을 갖는 클론들의 씨로부터 번식되었다. NPTll(그러므로 phyA)과 동질의 T2식물들로부터의 씨들이 선별되어 가장 많은 양의 피타아제를 생산할 수 있는 식물(T3)의 대량 번식을 위해 사용되었다.

실시예8

다른 미생물에 관련된 피타아제 유전자들의 동정

phyA에 관련된 피타아제 유전자들을 동정하기 위해, 혼성화 분석법이 (Sambrook, 1989: ausubel, 1990) 실시예 4B에 알려진 기술에 의해 phyA(서열번호.1) 또는 그 일부분을 탐침으로 사용한 흥미있는 하나 또는 하나 이상의 분리체들로부터의 핵산을 스크린하기 위해 사용되었다. 관련된 핵산은 알려진 기술들을 사용하여 클론되었다. 동위원소(예를 들면, 인32)가 분석의 민감도를 증가시키기 위해 복합 게놈들을 갖는 생물체들을 스크리닝할 때 요구된다. PCR증폭은 또한 phyA와 관련된 유전자들을 동정하기 위해 사용될 수 있다. 순수하거나 혼합된 배양체들에서 발견된 관련된 서열들은 고안된 서열들은 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 서열번호.1을 사용하며 PCR(그리고 역전사 PCR과 같은 다른 방법들)에 의해 바람직하게 증폭되었다. 증폭된 생산물들은 한천 겔 전기영동에 의해 바람직하게 증폭되었다. 증폭된 생산물들은 한천 겔 전기영동에 의해 눈으로 볼 수 있고 알려진 기술을 사용하여 클론될 수 있다. 세포들, 콜로니들, 플라그들과 추출된 핵산들(예를 들면 DNA, RNA)을 포함하는 다양한 물질들이 연관된 서열들의 존재를 위해 이 기술들에 의해 조사될 수 있다. 대신에, phyA(서열번호2)에 특이적인 항생제들을 사용하는 면역검출법들이 관련된 피타아제(들)의 존재를 위해 전체 세포들이나 흥미있는 추출된 단백질들을 스크린하기 위해 사용될 수 있다.

[표 1]

반추동물의 제1위 박테리아들에 대한 피타아제 활성

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피타아제 활성 미생물 시험된 분리체들의 수

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매우 강함 Prevolleta sp. 1

Selenomonas ruminantium 11

강함 Prevotella ruminicola 4

S.ruminanticum 13

적당함 Bacillus sp. 1

Megasphaera elsdenii 7

P. ruminicola 6

S. ruminantium 37

Treponema sp. 1

없음 Anaerovivibrio lipolytica 2

Bacillus sp. 4

Butyrovibrio fibrisolvens 47

Clostridium sp. 1

Coprococcus sp. 3

Enterococcus sp. 4

Eubacterium sp. 7

Fibrobacter succinogenes 8

Fusobacterium sp. 3

Lachnospira multiparus 4

Lactobacillus sp. 20

M. elsdenil 7

Peptostreptococccus sp. 1

P. ruminicola 41

Ruminobacter amylophilus 4

Ruminococcus albus 7

Ruminococcus flavefaciens 10

S. ruminantium 4

Streptococcus bovis 48

Streptococcus milleri 1

Streptococcus sp. 6

Succinovibrio dextrisolvens 12

Treponema sp. 12

Unknown 8

스크린의 총 분리체 345

[표 2]

선택된 반추동물의 제1위 박테리아 분리체들의 피타아제 활성

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분리체 피타아제 활성

(mU^*/mL)

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Selenomonas ruminantium JY35 646

Selenomonas ruminantium KF118 485

Selenomonas ruminantium BS131 460

Selenomonas ruminantium HD141 361

Selenomonas ruminantium HD86 286

Selenomonas ruminantium JY135 215

Selenomonas ruminantium D 69

Selenomonas ruminantium HD16 52

Selenomonas ruminantium BS114 47

Selenomonas ruminantium JY4 27

Prevotella sp.46/5²321

Prevotella rumimicola JY97 68

Prevotella rumimicola KJ182 61

Prevotella rumimicolaJ Y106 49

Megasphaera elsdenii JY91 5

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U^*=μ몰(배출된 무기인)/분

[표 3]

재조합체 E. Coli DH 5α속에 있는 S.ruminanticum 피타아제의 과잉발현

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균주 샘플조성 단위²/mL 비활성

(단위/mg단백질)

-------------------------------------------------------------------

E. coli(pSrP.2) 세포들 0.30(0.08)³ 1.56 (0.41)

상등액 0.308(0.21) 2.64 (1.51)

E.coli(pSrPf6) 세포들 0.91 (0.41) 6.42 (0.64)

상등액 5.10 (0.58) 22.83(1.67)

E.coli(pSrP.2 Sphl) 세포들 ND⁴ ND

상등액 ND ND

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¹S.루미넌티움 JY35는 크레센트 형태의 자손이며, 포도당으로부터 프로피온산을 생성하는 특정한 환경에서 자라는 혐기성균으로서 유당을 생성하나 글리세롤, 만니톨을 형성하지는 않는다(참조. Bergey 입문서, John G. Holt, Williams and Wilkins, Baltimore, 1984).

²단위 = 분당 방출되는 무기인의 마이크로몰수

³괄호안의 숫자는 표준오차이다.

⁴ND = 검출 안됨

[표 4]

pPICZαA(음성조절) 또는 pPICZαA：：MATE(클론 17)에 의한 형질전환된 P.패스토리스 세포들의 성장과 피타아제 활성.

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배양 시간 흡광도 피타아제 활성(μ몰/mL)

(610nm) 배양 상등액

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P.pastoris(pPICZαA) 0.0 2.6 0.0 0.0

20.5 10.1 0.0 0.0

42.5 17.8 0.0 0.0

68.0 17.0 0.0 0.0

91.0 28.5 0.0 0.0

138.5 39.3 0.0 0.0

210.5 46.7 0.0 0.0

P.pastoris

(pPICZαA：:Z) 0.0 2.5 0.0 0.0

20.5 11.3 1.9 0.1

42.5 13.9 4.4 1.5

68.0 12.9 8.0 2.7

91.0 15.7 4.7 0.5

138.5 18.3 12.6 5.3

210.5 18.7 22.5 12.5

-------------------------------------------------------------------

[표 5]

트윈80 농도가 pPICZαA：：MATE(클론17)에 의해 형질전환된 P.패스토리스 의 성장과 피타아제 활성에 미치는 효과 (클론 17)

-------------------------------------------------------------------

시간(일) 샘플(%트윈80) 흡광도 피타아제활성 상등액/

(610nm) (μ몰/분/mL) 배양활성

2 0.0 24.3 4.1 2.2 0.55

0.02 24.4 4.8 2.7 0.57

0.1 25.1 5.2 3.2 0.61

0.5 24.4 4.9 3.2 0.65

4 0.0 31.2 6.9 4.7 0.69

0.02 31.0 8.2 5.5 0.67

0.1 31.8 10.3 9.1 0.88

8 0.0 32.8 10.6 5.9 0.55

0.02 30.4 14.8 9.8 0.67

0.1 33.9 20.2 17.2 0.86

0.5 33.8 22.1 18.9 0.86

-------------------------------------------------------------------

[표 6]

배양주기와 재조합체 S.루미넌티움 JY35 피타아제(2단위/옥수수의g)

-------------------------------------------------------------------

샘플 배양시간(시) 인산농도(μ몰/mL)

-------------------------------------------------------------------

피타아제 없음 1 0.85

2 1.72

3 2.56

4 3.77

5 4.35

피타아제 1 4.76

2 6.83

3 7.72

4 8.41

5 8.49

-------------------------------------------------------------------

[표 7]

재조합체 S.루미넌티움 JY35 피타아제 농도가 옥수수로부터 인산제거 에 미치는 효과

-------------------------------------------------------------------

피타아제 활성 인산농도

(단위/옥수수의g) (μ몰/옥수수의 g)

-------------------------------------------------------------------

0.08 11.8

0.16 14.8

0.24 22.5

0.32 23.0

0.40 23.2

0.48 23.8

0.56 23.8

0.64 23.6

0.72 23.8

-------------------------------------------------------------------

[참고문헌]

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여기에 언급된 모든 출판물은 이 발명이 관계하는 최첨단의 기술 수준을 나타내는 것들이다. 모든 출판물들은 여기에서 각각의 출판물은 참고자료로서 활용되도록 지시된 정도까지만 참고자료로서 사용되었다. 전술한 발명은 명료성과 이해를 돕기 위한 실시예로서 어느 정도 자세히 설명되었지만 이것은 명확히 명세서 범위 안에서 이루어진 변경 및 수정이다.

[서열목록]

일반적 정보

출원인 : Cheng, Kuo-Joan, Selinger, Leonard B., Bae, Hee-Dong, Zhou, Lu Ming, Forsberg, Cecil W

발명의 명칭 : 반추동물 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 DNA 서열

서열의 수 : 7

연락처 : (A) 수신인 : Mckay-Carey ＆ Company, (B) 주소 : 2125, 10155-102 가, (C) 도시 : 에드몬튼, (D) 주 : 알버타, (E) 국가 : 캐나다, (F) 우편번호 : T5J 4G8

컴퓨터 가독 형태 : (A) 매체타입 : 플로피 디스크, (B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종, (C) 작동체계 (OS) : PC-DOS/MS-DOS, (D) 소프트웨어 : Patent in release #1.0, #1.30 버전

최근의 출원자료 : (A) 출원번호, (B) 출원일 : 1997년 5월 23일, (C) 분류,

대리인 및 정보 : (A)이름 : Mary Jane Mckay-Carey, (B) 등록번호: , (C) 참고번호 /판결번호 : 37003WOO

통신정보 : (A)전화번호 : (403) 424 - 0222, (B) 팩스 : (403) 421 - 0834,

서열 번호 : 1

서열의 길이 : 1401 염기쌍

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 2본쇄

토폴로지 : 환형

분자의 타입 : DNA (게놈)

추정서열 : 없음.

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움(Selenomonas ruminantium )

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA

클론명 : pSrp. 2

서열의 특성

특징을 나타내는 기호 : CDS

존재위치 : 231..1268

특징을 결정하는 : E(실험)

기타 정보 : 코돈 시작 = 231, 기능 = 피타아제 분비, 생성물 = 피타아제, 증명 = 실험, 유전자 = phyA, 번호 = 1, 주명 = 미오 이노시톨 헥사포스페이트 포스포하이드로라아제, 인용 = ( [1] )

서열의 특성

특징을 나타내는 기호 : sig 펩타이드

존재위치 : 231..311

특징을 결정하는 방법 : E

기타 정보 : 코돈 시작 = 1, 기능 = 피타아제 분비, 생성물 = 신호 펩타이드, 증명 = 실험, 인용 = ( [1] )

서열의 특성

특징을 나타내는 기호 : mat 펩타이드

존재위치 : 312..1268

특징을 결정하는 방법 : E

기타 정보 : 코돈 시작 = 312, 생성물 = 피타아제, 증명 = 실험, 번호 = 2, 인용 = ( [1] )

[서열 1]

CGTCCACGGA GTCACCCTAC TATACGACGT ATGTGAAGTT CACGTCGAAG TTCTAGGGAA 60

TCACCGATTC GTGCAGGATT TTACCACTTC CTGTTGAAGC GGATGAGAAG GGGAACCGCG 120

AAGCGGTGGA AGAGGTGCTG CACGACGGAC GATCGCGCTG AATGAATCAG TGCTTCCTAA 180

CTATTGGGAT TCCGCGCAGA CGCGCGGATG GAGTAAAGGA GTAAGTTGTT ATG AAA 236

Met Lys

-27

TAC TGG CAG AAG CAT GCC GTT CTT TGT AGT CTC TTG GTC GGC GCA TCC 284

Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly Ala Ser

-25 -20 -15 -10

CTC TGG ATA CTG CCG CAG GCC GAT GCG GCC AAG GCG CCG GAG CAG ACG 332

Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu Gln Thr

-5 1 5

GTG ACG GAG CCC GTT GGG AGC TAC GCG CGC GCG GAG CGG CCG CAG GAC 380

Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro Gln Asp

10 15 20

TTC GAG GGC TTT GTC TGG CGC CTC GAC AAC GAC GGC AAG GAG GCG TTG 428

Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu Ala Leu

25 30 35

CCG CGT AAT TTC CGC ACG TCG GCT GAC GCG CTG CGC GCG CCG GAG AAG 476

Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro Glu Lys

40 45 50 55

AAA TTC CAT CTC GAC GCC GCG TAT GTA CCG TCG CGC GAG GGC ATG GAT 524

Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly Met Asp

60 65 70

GCA CTC CAT ATC TCG GGC AGT TCC GCA TTC ACG CCG GCG CAG CTC AAG 572

Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln Leu Lys

75 80 85

AAC GTT GCC GCG AAG CTG CGG GAG AAG ACG GCT GGC CCC ATC TAC GAT 620

Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile Tyr Asp

90 95 100

GTC GAC CTA CGG CAG GAG TCG CAC GGC TAT CTC GAC GGT ATC CCC GTG 668

Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile Pro Val

105 110 115

AGC TGG TAC GGC GAG CGC GAC TGG GCA AAT CTC GGC AAG AGC CAG CAT 716

Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser Gln His

120 125 130 135

GAG GCG CTC GCC GAC GAG CGG CAC CGC TTG CAC GCA GCG CTC CAT AAG 764

Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu His Lys

140 145 150

ACG GTC TAC ATC GCG CCG CTC GGC AAG CAC AAG CTC CCC GAG GGC GGC 812

Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu Gly Gly

155 160 165

GAA GTC CGC CGC GTA CAG AAG GTG CAG ACG GAA CAG GAA GTC GCC GAG 860

Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val Ala Glu

170 175 180

GCC GCG GGG ATG CGC TAT TTC CGC ATC GCG GCG ACG GAT CAT GTC TGG 908

Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His Val Trp

185 190 195

CCA ACG CCG GAG AAC ATC GAC CGC TTC CTC GCG TTT TAC CGC ACG CTG 956

Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg Thr Leu

200 205 210 215

CCG CAG GAT GCG TGG CTC CAT TTC CAT TGT GAA GCC GGT GTC GGC CGC 1004

Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val Gly Arg

220 225 230

ACG ACG GCG TTC ATG GTC ATG ACG GAT ATG CTG AAG AAC CCG TCC GTA 1052

Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro Ser Val

235 240 245

TCG CTC AAG GAC ATC CTC TAT CGC CAG CAC GAG ATC GGC GGC TTT TAC 1100

Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly Phe Tyr

250 255 260

TAC GGG GAG TTC CCC ATC AAG ACG AAG GAT AAA GAT AGC TGG AAG ACG 1148

Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp Lys Thr

265 270 275

AAA TAT TAT AGG GAA AAG ATC GTG ATG ATC GAG CAG TTC TAC CGC TAT 1196

Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr Arg Tyr

280 285 290 295

GTG CAG GAG AAC CGC GCG GAT GGC TAC CAG ACG CCG TGG TCG GTC TGG 1244

Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser Val Trp

300 305 310

CTC AAG AGC CAT CCG GCG AAG GCG TAAAAGCGCA GGCGGCGGCT CGGAGTCAGG 1298

Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala

315

GAAATGGCGC TGCCAGCACG GGACGCGCGG CGGCGGATGC TGCGCCGGTC AGGGATGATT 1358

GACGACAGCC AGAGAAGAAA GGATGGTTTT ATGAGGTGGA TCC 1401

서열번호 : 2

서열의 길이 : 346 아미노산

서열의 타입 : 아미노산

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 단백질

[서열 2]

Met Lys Tyr Trp Gln Lys His Ala Val Leu Cys Ser Leu Leu Val Gly

-27 -25 -20 -15

Ala Ser Leu Trp Ile Leu Pro Gln Ala Asp Ala Ala Lys Ala Pro Glu

-10 -5 1 5

Gln Thr Val Thr Glu Pro Val Gly Ser Tyr Ala Arg Ala Glu Arg Pro

10 15 20

Gln Asp Phe Glu Gly Phe Val Trp Arg Leu Asp Asn Asp Gly Lys Glu

25 30 35

Ala Leu Pro Arg Asn Phe Arg Thr Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Pro

40 45 50

Glu Lys Lys Phe His Leu Asp Ala Ala Tyr Val Pro Ser Arg Glu Gly

55 60 65

Met Asp Ala Leu His Ile Ser Gly Ser Ser Ala Phe Thr Pro Ala Gln

70 75 80 85

Leu Lys Asn Val Ala Ala Lys Leu Arg Glu Lys Thr Ala Gly Pro Ile

90 95 100

Tyr Asp Val Asp Leu Arg Gln Glu Ser His Gly Tyr Leu Asp Gly Ile

105 110 115

Pro Val Ser Trp Tyr Gly Glu Arg Asp Trp Ala Asn Leu Gly Lys Ser

120 125 130

Gln His Glu Ala Leu Ala Asp Glu Arg His Arg Leu His Ala Ala Leu

135 140 145

His Lys Thr Val Tyr Ile Ala Pro Leu Gly Lys His Lys Leu Pro Glu

150 155 160 165

Gly Gly Glu Val Arg Arg Val Gln Lys Val Gln Thr Glu Gln Glu Val

170 175 180

Ala Glu Ala Ala Gly Met Arg Tyr Phe Arg Ile Ala Ala Thr Asp His

185 190 195

Val Trp Pro Thr Pro Glu Asn Ile Asp Arg Phe Leu Ala Phe Tyr Arg

200 205 210

Thr Leu Pro Gln Asp Ala Trp Leu His Phe His Cys Glu Ala Gly Val

215 220 225

Gly Arg Thr Thr Ala Phe Met Val Met Thr Asp Met Leu Lys Asn Pro

230 235 240 245

Ser Val Ser Leu Lys Asp Ile Leu Tyr Arg Gln His Glu Ile Gly Gly

250 255 260

Phe Tyr Tyr Gly Glu Phe Pro Ile Lys Thr Lys Asp Lys Asp Ser Trp

265 270 275

Lys Thr Lys Tyr Tyr Arg Glu Lys Ile Val Met Ile Glu Gln Phe Tyr

280 285 290

Arg Tyr Val Gln Glu Asn Arg Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Pro Trp Ser

295 300 305

Val Trp Leu Lys Ser His Pro Ala Lys Ala

310 315

서열번호 : 3

서열의 길이 : 20 염기쌍

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 다른 핵산, (A) 기재(DESCREPTION) : /desc = "올리고뉴클레오사이드 SrPr 6"

추정서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움(Selenomonas ruminantium)

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA 라이브러리

클론명 : pSrP. 2

[서열 3]

CGGGATGCTT CTGCCAGTAT

서열번호 : 4

서열의 길이 : 20 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 다른 핵산, (A) 기재 : /desc = "올리고뉴클레오사이드 SrPf 6"

추정서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA 라이브러리

클론명 : pSrP. 2

[서열 4]

CGTCCACGGA GTCACCCTAC

서열번호 : 5

서열의 길이 : 31 염기쌍

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 다른 핵산, (A) 기재: /desc = "올리고뉴클레오타이드 MATE2"

추정서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA 라이브러리

클론명 : pSrP. 2

[서열 5]

GCGAATTCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C

서열번호 : 6

서열의 길이 : 28 염기쌍

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 다른 핵산, (A)기재 : /desc = "올리고뉴클레오타이드 MATE"

추정서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA 라이브러리

클론명 : pSrP. 2

[서열 6]

GCGAATTCGC CAAGGCGCCG GAGCAGAC

서열번호 : 7

서열의 길이 : 31 염기쌍

서열의 타입 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

토폴로지 : 선형

분자의 타입 : 다른 핵산, (A) 기재 : /desc = "올리고뉴클레오타이드 MATE"

추정서열 : 없음

안티센스 : 없음

기원

생물명 : 세레노모너스 루미넌티움

주명 : JY35

직접적인 기원

라이브러리 : 게놈 DNA 라이브러리

클론명 : pSrP. 2

[서열 7]

GAGGATCCAT GGCCAAGGCG CCGGAGCAGA C

Claims (77)

1. 반추동물의 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 정제, 분리된 DNA.
2. 제1항에 있어서, 상기 제1위 미생물인 원핵생물인 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
3. 제1항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 Selenomonas, Prevotella, Treponema 또는 Megasphaera 속인 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
4. 제1항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움, 프로델라 루미니콜라, 트레포네마 브리언티(Treponema bryantii) 또는 메가스패 엘스데니(Megasphaera elsdenii)인 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
5. 제1항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
6. 제1항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움 JY35(ATCC 55785)인 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
7. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 엄격한 조건 하에서 뉴클레오티드 서열 서열번호.1의 적어도 25개의 연속 뉴클레오티드를 구성한 탐침과 혼성화할 수 있는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
8. 제1항에 있어서, 상기 피타아제는 아미노산 서열번호.2를 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
9. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 뉴클레오티드 서열번호.1을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
10. 제1항에 있어서, 상기 DNA는 서열번호.1의 312-1268의 뉴클레오티드를 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
11. 제1항에 있어서, 상기 피타아제는 다음과 같은 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.

    a) 약 37kDa의 분자량;

    b) 3.0 내지 6.0의 pH 범위 내에서 활성을 가짐;

    c) 4 내지 55℃의 온도 범위 내에서 활성을 가짐
12. 제11항에 있어서, 상기 발현된 피타아제는 20 내지 55℃의 온도 범위 내에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
13. 제11항에 있어서, 상기 발현된 피타아제는 35 내지 40℃의 온도 범위 내에서 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.
14. 제11항에 있어서, 상기 발현된 피타아제는 다음과 같은 추가적인 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 정제, 분리된 DNA.

    d) 무기인산의 방출에 의해 측정될 때 아스페르질러스 피쿰 NRRI 3135 phyA의 비활성보다 적어도 2배 이상의 비활성을 가짐.
15. 숙주세포들과 호환성을 갖는 조절 세포들에 연결된 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 DNA로 구성된 적절한 숙주 세포 속에서 피타아제의 발현을 지시할 수 있는 발현구성체.
16. 제15항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 발현 구성체.
17. 제15항에 있어서, 상기 발현된 피타아제는 아미노산 서열 서열번호.2로 구성된 것을 특징으로 하는 발현 구성체.
18. 숙주세포들이 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 DNA에 의해 발현되는 피타아제를 발현할 수 있도록 상기 DNA에 의해 형질전환된 숙주
19. 제18항에 있어서, 상기 제1위 미생물이 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
20. 제18항에 있어서, 상기 발현된 피타아제는 아미노산 서열 서열번호.2를 구성하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
21. 제18항에 있어서, 상기 숙주세포는 진핵생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
22. 제18항에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵생물인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
23. 제18항에 있어서, 상기 숙주세포는 피치아 패스토리스 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
24. 제18항에 있어서, 상기 숙주세포는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
25. 제18항에 있어서, 상기 숙주세포는 E.coli 세포인 것을 특징으로 하는 형질전환된 숙주.
26. 세레노모너스 루미넌티움 JY35(ATCC 55784).
27. 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 DNA에 의해 발현된 피타아제가 식물에 의해 발현될 수 있도록 상기 DNA에 의해 형질전환된 돌연변이 식물.
28. 제27항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 돌연변이 식물.
29. 제27항에 있어서, 상기 발현된 피타아제가 아미노산 서열 서열번호.2로 구성된 것을 특징으로 하는 돌연변이 식물.
30. 제1위 미생물의 피타아제.
31. 제30항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 피타아제.
32. 제30항에 있어서, 상기 피타아제이 다음과 같은 특징을 갖는 피타아제

    a) 약 37kDa의 분자량;

    b) 약 3.0 내지 6.0의 pH 범위 내에서 활성을 가짐;

    c) 4 내지 55도의 온도범위 내에서 활성을 가짐.
33. 제32항에 있어서, 다음의 추가적 특성을 갖는 피타아제

    d) 무기인산의 제거에 의해 측정될 때 아스페르질러스 피쿰 NRRI 3155 phyA의 비활성보다 적어도 2배 이상의 비활성을 가짐.
34. 제30항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호.2 내에 존재하는 연속적 아미노산 서열로 구성된 피타아제.
35. 제30항에 있어서, 아미노산 서열 서열번호.2로 구성된 피타아제.
36. 제1위 미생물의 피타아제에 의해 처리된 먹이 사료로 구성된 먹이 조성물.
37. 제36항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 먹이 조성물.
38. 제36항에 있어서, 상기 피타아제는 아미노산 서열 서열번호2로 구성된 먹이 조성물.
39. 제36항에 있어서, 먹이 조성물 kg 당 약 2000단위의 피타아제 활성까지 생산할 수 있는 충분한 양의 상기 피타아제를 포함하는 먹이 조성물.
40. 제36항에 있어서, 먹이 조성물 kg 당 약 1000단위의 피타아제 활성까지 생산할 수 있는 충분한 양의 상기 피타아제를 포함하는 먹이 조성물.
41. 제36항에 있어서, 먹이 조성물 kg 당 약 50 내지 800단위의 피타아제 활성까지 생산할 수 있는 충분한 양의 상기 피타아제를 포함하는 먹이 조성물.
42. 제36항에 있어서, 먹이 조성물 kg 당 약 300 내지 800단위의 피타아제 활성까지 생산할 수 있는 충분한 양의 상기 피타아제를 포함하는 먹이 조성물.
43. 동결건조된 미생물들의 제제를 구성되되, 상기 미생물은 보통의 성장 조건 하에서 제1위 미생물의 피타아제를 발현하는 먹이 첨가물.
44. 제43항에 있어서, 상기 미생물이 세레노모너스 루미넌티움인 먹이 첨가물.
45. 제43항에 있어서, 상기 미생물이 상기 제1위 미생물의 상기 피타아제를 발현하는 DNA에 의해 형질전환된 재조합 미생물인 것을 특징으로 하는 먹이 첨가물.
46. 제45항에 있어서, 상기 제1위 미생물이 세레노모너스 루미넌티움인 먹이 첨가물.
47. 제45항에 있어서, 상기 발현된 피타아제가 아미노산 서열 서열번호.2로 구성된 먹이 첨가물.
48. 제1위 미생물의 피타아제를 갖는 먹이 사료의 처리용 먹이 첨가물.
49. 제48항에 있어서, 상기 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 먹이 첨가물.
50. 제48항에 있어서, 상기 피타아제는 아미노산 서열 서열번호.2를 갖는 것을 특징으로 하는 먹이 첨가물.
51. (a) 적어도 하나의 숙주세포가 제1위 미생물 피타아제를 발현할 수 있도록 상기 숙주세포를 상기 피타아제를 발현하는 DNA로 형질전환하는 단계와,

    (b) 상기 숙주세포들에 의해 상기 피타아제의 발현을 행할 수 있는 조건 하에서 상기 숙주세포 배양체를 성장하는 단계를 갖는 피타아제 생산방법.
52. 제51상에 있어서, 상기 피타아제를 상기 배양체로부터 추출하는 단계를 더 갖는 피타아제 생산방법.
53. 제51항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 피타아제 생산방법.
54. 제51항에 있어서, 상기 피타아제는 아미노산 서열 서열번호.2를 갖는 피타아제 생성방법.
55. (1) 식물이 제1위 미생물 피타아제를 발현할 수 있도록 상기 식물을 상기 피타아제를 발현하는 DNA로 형질전환하는 단계와,

    (b) 상기 식물에 의해 상기 피타아제의 발현을 행할 수 있는 조건 하에서 상기 식물을 성장하는 단계를 갖는 돌연변이 식물을 생산하는 방법.
56. 제55항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 돌연변이 식물을 생산하는 방법.
57. 제55항에 있어서, 상기 피타아제가 아미노산 서열 서열번호.2를 갖는 돌연변이 식물을 생산하는 방법.
58. 동물들에 제1위 미생물의 피테이트의 효과적인 양을 함유한 사료를 먹이는 단계를 갖는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
59. 상기 제58항에 있어서, 상기 제1위 미생물은 세레노모너스 루미넌티움인 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
60. 상기 제58항에 있어서, 상기 피테이트가 아미노산 서열 서열번호2를 갖는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
61. 제58항에 있어서, 상기 사료는 마시는 물을 포함하고, 상기 피테이트는 상기 마시는 물에 섞여지는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
62. 제58항에 있어서, 상기 피테이트는 상기 동물에 의해 소비되기 위해 미네럴 블록에 공급되는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
63. 제58항에 있어서, 상기 피테이트는 상기 동물에 의해 소비되도록 알약으로 공급되는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
64. 제58항에 있어서, 상기 피테이트는 상기 동물에 의해 소비되도록 액체 제제에 공급되는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
65. 제58항에 있어서, 상기 피테이트는 상기 동물에 의해 소비되도록 사료 위에 액체 제제에 공급되는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
66. 제58항에 있어서, 상기 피테이트는 상기 동물에 의해 소비되도록 작은 입자화된(pelletized) 사료에 공급되는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
67. 제58항에 있어서, 상기 동물에 의해 소비되기 위한 사료는 동결건조된 미생물의 제제에 의해 처리되되, 상기 미생물은 보통의 성장조건 하에서 상기 피타아제를 발현하는 것을 특징으로 하는 동물에 의해 사료 피테이트 이용을 개선하는 방법.
68. (a) 미생물의 콜로니들이 성장하는 성장 배지를 공급하되, 상기 배지는 피테이트 공급원을 함유하는 단계와,

    (b) 상기 배지를 염화코발트의 수용액과 접촉하는 단계와,

    (c) 상기 배지를 투명대에 대해 검사하는 단계를 갖되, 미생물 산생성에 의해 야기되는 위양성 결과들이 제거되는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
69. 제68항에 있어서, 상기 (b) 단계 후에, 상기 배지를 몰리브덴산 암모늄 수용액과 바나듐산 암모늄 수용액과 접촉되는 단계를 더 갖는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
70. 제68항에 있어서, 상기 배지는 상기 염화코발트 수용액과 적어도 약 5분 동안 접촉하는 것을 특징으로 하는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
71. 제68항에 있어서, 상기 배지가 몰리브덴산 암모늄 수용액과 바나듐산 암모늄 수용액과 적어도 약 5분 동안 접촉되는 단계를 더 갖는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
72. 제68항에 있어서, 상기 배지가 몰리브덴산 암모늄 수용액과 바나듐산 암모늄 수용액과 동시에 접촉되는 단계를 더 갖는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
73. 제68항에 있어서, 상기 염화코발트의 수용액의 농도가 약 2%(W/V)인 것을 특징으로 하는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
74. 제69항에 있어서, 상기 몰리브덴산 암모늄 수용액의 농도가 약 6%(W/V)이고 상기 바나듐산 암모늄 수용액의 농도가 약 0.5%(W/V)인 것을 특징으로 하는 미생물 피타아제 활성을 분석하는 방법.
75. (a) 생물체로부터 핵산을 분리하는 단계와,

    (b) 적당한 엄격함에서 높은 엄격함 하에서 상기 핵산 분자량을 핵산 혼성화하 단계와 표지된 혼성화 탐침이 서열번호.1의 적어도 25개 연속 뉴클레오티드를 갖는 단계를 가지되, 상기 핵산이 피테이트를 발현하는 생물체로부터 핵산분자를 동정하는 방법.
76. 제75항에 있어, 상기 혼성화의 조건이 적당한 엄격함인 것을 특징으로 하는 생물체로부터 핵산분자를 동정하는 방법.
77. 제75항에 있어서, 상기 혼성화의 조건이 매우 엄격함인 것을 특징으로 하는 생물체로부터 핵산분자를 동정하는 방법.