KR20030050524A - 바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 - Google Patents
바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20030050524A KR20030050524A KR1020010080964A KR20010080964A KR20030050524A KR 20030050524 A KR20030050524 A KR 20030050524A KR 1020010080964 A KR1020010080964 A KR 1020010080964A KR 20010080964 A KR20010080964 A KR 20010080964A KR 20030050524 A KR20030050524 A KR 20030050524A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- phytase
- gene
- strain
- present
- bacillus coagulans
- Prior art date
Links
- 108010011619 6-Phytase Proteins 0.000 title claims abstract description 169
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 title claims abstract description 42
- 229940054340 bacillus coagulans Drugs 0.000 title claims abstract description 42
- 229940085127 phytase Drugs 0.000 claims abstract description 124
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical group OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 abstract description 38
- BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N hydridophosphorus(.) (triplet) Chemical compound [PH] BHEPBYXIRTUNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 57
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 38
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 36
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 34
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 34
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 29
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 19
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 19
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 9
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 101100190440 Bacillus subtilis (strain 168) phy gene Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 8
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical group O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 7
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N Glycerol 2-phosphate Chemical compound OCC(CO)OP(O)(O)=O DHCLVCXQIBBOPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- 235000019621 digestibility Nutrition 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthyl dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=C2C(OP(O)(=O)O)=CC=CC2=C1 YNXICDMQCQPQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 3
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 2
- 101100267710 Bacillus subtilis (strain 168) yotM gene Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 101000608734 Helianthus annuus 11 kDa late embryogenesis abundant protein Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101150110933 PHY gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012564 Q sepharose fast flow resin Substances 0.000 description 2
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- -1 inositol phosphates Chemical class 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 2
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- MRVYFOANPDTYBY-UZAAGFTCSA-N 1D-myo-inositol 3,4,5,6-tetrakisphosphate Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H]1OP(O)(O)=O MRVYFOANPDTYBY-UZAAGFTCSA-N 0.000 description 1
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 6-[3-[4-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]piperidin-1-yl]-3-oxopropyl]-3H-1,3-benzoxazol-2-one Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1CCN(CC1)C(CCC1=CC2=C(NC(O2)=O)C=C1)=O DEXFNLNNUZKHNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000143060 Americamysis bahia Species 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 240000000298 Elaeagnus multiflora Species 0.000 description 1
- 235000009245 Elaeagnus multiflora Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 241001373560 Humicola sp. Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 239000006154 MacConkey agar Substances 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 241000235061 Pichia sp. Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000235088 Saccharomyces sp. Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N [(2r,3s,5r,6r)-2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexyl] dihydrogen phosphate Chemical compound OC1[C@H](O)[C@@H](O)C(OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H]1O INAPMGSXUVUWAF-GCVPSNMTSA-N 0.000 description 1
- FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].OP(=O)([O-])O[C@@H]1[C@@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H](OP(=O)([O-])[O-])[C@H](OP(=O)(O)[O-])[C@H]1OP(=O)([O-])[O-] FENRSEGZMITUEF-ATTCVCFYSA-E 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P ammonium molybdate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-][Mo]([O-])(=O)=O APUPEJJSWDHEBO-UHFFFAOYSA-P 0.000 description 1
- 239000011609 ammonium molybdate Substances 0.000 description 1
- 235000018660 ammonium molybdate Nutrition 0.000 description 1
- 229940010552 ammonium molybdate Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019730 animal feed additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000433 anti-nutritional effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 235000008452 baby food Nutrition 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021384 green leafy vegetables Nutrition 0.000 description 1
- WPEXVRDUEAJUGY-UHFFFAOYSA-B hexacalcium;(2,3,4,5,6-pentaphosphonatooxycyclohexyl) phosphate Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])(=O)OC1C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C(OP([O-])([O-])=O)C1OP([O-])([O-])=O WPEXVRDUEAJUGY-UHFFFAOYSA-B 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004941 influx Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003017 phosphorus Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229940083982 sodium phytate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/189—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/06—Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/065—Microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래의 신규한 피타제 유전자 염기서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열, 상기 유전자의 클로닝을 통한 재조합 피타제의 제조 및 상기 바실러스 코아구란스 균주의 배양을 통한 피타제의 제조에 관한 것으로, 본 발명 유전자는 기존의 공지된 피타제 유전자와 그 염기서열 및 아미노산 서열이 상이한 신규한 유전자일뿐만 아니라, 다른 바실러스 유래의 피타제보다 대두분 중의 피틴산 분해능력이 우수한 피타제 효소를 암호화하여 상기 균주 또는 재조합 미생물로부터 제조된 피타제는 식품 및 사료 속에 소화가 잘 안되는 피틴산 형태로 들어있는 인이 이용가능한 형태가 되도록 하여 식품 및 동물사료의 영양가를 높이고, 사료 비용을 낮추며, 소화되지 않고 분비된 인으로인한 환경적인 부담을 감소시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.
Description
본 발명은 바실러스 코아구란스(Bacillus coagulans) KCTC 1823 균주 유래의 신규한 피타제(phytase) 유전자 및 그 유전자 산물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 공시균인 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주로부터 피타제를 암호화하는 신규한 유전자를 분리하고 이를 외래 미생물에 클로닝하여 피타제를 제조한 후, 상기 제조된 피타제를 가축사료 첨가물과 피틴산(phytate) 함유 곡물 가공식품 제조에 사용하는 방법에 관한 것이다.
피틴산(phytate,myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisphosphate, IP6)은 콩, 보리 옥수수 등의 식물종자에서 인(phosphate)의 주요 저장형태로 존재하는데 곡물전체 함량의 약 1∼2%를 차지하고 있다(Crit. Rev. Food Sci. Nutr.,16: 49-114(1982)). 이러한 피틴산은 미오-이노시톨(myo-inositol)에 6개의 인산이 결합된 화합물로서 칼슘, 마그네슘, 철, 아연 등과 같은 무기질이 결합된 염의 형태로 주로 존재하는데, 피타제(phytase, EC 3.1.3.8)는 피틴산을 가수분해하여 인을 유리시킬 수 있는 효소이다. 그런데 돼지와 가금류 등을 위한 대부분의 배합사료는 주로 식물성인 곡류나 그 부산물 및 박류로 이루어지는데, 식물성 사료에 함유된 인은 70%정도가 피틴산 형태로 존재하나 닭, 돼지와 같은 단위동물(monogastric animals)들은 장내에 피타제가 없어서 피틴산을 그대로 분뇨로 방출하기 때문에 동물의 성장에 필요한 인을 무기물 형태로 외부에서 따로 충분히 공급해줘야만 한다. 그리고 단위 동물이 소화하지 못하고 분뇨로 배출된 피틴산은 토양이나 물속에 존재하는 미생물에 의해 효소적으로 분해되어 인이 제한된 수중 환경에서 인의 대량유입으로 인한 부영양화를 야기함으로 축산 폐기물로 인한 수질의 부영양화가 환경오염 문제로 대두되고 있다. 게다가 피틴산은 미량 영양원인 여러 금속이온 (Ca2+, Zn2+, Mg2+와 Fe2+등)들과 착화합물을 강하게 형성할뿐만 아니라 곡물 중의 각종 단백질들과 결합하여 단백질 분해효소의 작용을 억제하기 때문에 곡물 중의 피틴산은 항영양인자로 작용하여 가축과 사람을 비롯한 단위동물의 체내에서 단백질 및 중요 광물질에 대한 소화흡수에 저해를 일으킨다(J. Food Sci.,46: 546 (1981)).
이러한 문제점을 해결할 수 있는 유력한 대안으로 사료 첨가제로써 피틴산 분해효소인 피타제를 사용하는 방법이 적용되고 있다. 피타제를 사료에 첨가하였을 경우에 인산염 첨가량을 획기적으로 줄임과 동시에 가축들의 무기금속 이온들에 대한 효용성 및 단백질 소화율이 증가하여 생산성을 증진시킬 뿐만 아니라 유효 인의 배설을 50%까지 감소시킬 수가 있게 된다. 이러한 점에 착안하여 네덜란드를 비롯한 구미 지역에서는 축산 폐기물에서 배출되는 인의 함량을 감소시킬 목적으로 사료에 피타제 첨가를 유도하고 있고 국내 배합사료에도 피타제 사용이 증대되는 추세에 있다. 특히 21세기에 접어들면서 전세계에서 환경문제가 전산업·전분야에 걸쳐서 중요한 요소로 대두되고 있어 여러나라에서 축산 폐수의 인 함량을 규제하는 추세에 있다. 그러므로 앞으로는 더욱 피타제의 유용성이 증대될 것이고 따라서 피타제 효소제 시장도 급격하게 확대될 것으로 예상된다. 한편 피타제는 가축을 위한 사료첨가제 용도로써 뿐만 아니라 앞으로는 피틴산 함유 곡물 가공 식품 제조에 적용되어 소화율 증진을 위한 유아용 식품 등에 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
현재 BASF사, Roche사 등에서 곰팡이 유래 피타제를 사료첨가제 용도로 제조, 판매하고 있으나 곰팡이 유래 피타제는 내산성은 뛰어나지만 내열성이 떨어지고 곡물 중의 피틴산에 대한 분해력이 다소 떨어지는 등의 문제가 있어 지금까지 국내를 포함한 전세계에서 단위동물을 위한 사료첨가제 용도로 더욱 적합한 피타제유전자원을 지속적으로 발굴·개발하고자 하는 노력이 진행되고 있다.
이에, 본 발명자들은 단위동물을 위한 사료첨가제 및 피틴산 함유 곡물 가공식품 제조 등에 사용하기 위해 종래의 피타제보다 활성이 뛰어난 신규한 특성의 다른 피타제 유전자원을 획득하기 위하여 곰팡이, 방선균, 세균 등 수백종의 균주 중에서 이러한 피타제를 생산하는 신규 미생물을 동정하였는 바, 공시균인 바실러스코아구란스 KCTC 1823 균주에서 신규한 피타제가 생산되는 것을 밝혀내어 배양상등 액에서 피타제를 제조하고, 유전자 재조합 기술을 이용하여 상기 균주로부터 피타제 유전자를 분리한 후, 상기 유전자의 염기서열 및 그로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 결정하여 신규한 유전자임을 확인하였다. 또한 상기 균주 및 재조합 대장균에서 생산되는 피타제를 정제하여 효소 특성을 조사한 결과 기존의 피타제와는 반응특성이 다른 신규한 효소임을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 피타제 유전자의 염기서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 염기서열로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 것을 포함하는 피타제의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조된 피타제를 포함하는 사료첨가제 및 곡물가공 식품을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다. 본 발명의 다른 목적 및 잇점들은 하기 실시예를 통하여 보다 명백히 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 바실러스 코아구란스가 생산하는 피타제를 이용한 대두분 분해능을 나타낸 그래프이다.
도 2는 바실러스 코아구란스 배양액으로부터 정제된 피타제를 전기영동하여 코마시 염색을 한 것이다.
도 3은 반응온도의 변화에 따른 정제된 피타제의 상대활성도와 안정성(가) 그리고 CaCl2첨가에 따른 열안정성(나)을 나타낸 그래프이다.
도 4는 반응 pH의 변화에 따른 정제된 피타제의 상대활성도와 안정성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명 피타제를 이용하여 피틴산과 이노시톨 포스페이트들로부터 생성된 반응산물을 나타낸 TLC 그림이다.
도 6은 본 발명 피타제의 피틴산에 대한 Linewever-Burk plot을 나타낸 그림이다.
도 7은 바실러스 코아구란스 피타제를 암호화하는 유전자의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 8은 바실러스 코아구란스 피타제 유전자의 염기서열로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 바실러스 코아구란스 피타제 유전자를 포함한 재조합 플라스미드 pBSK/phyJ와 pJH27/phyJ를 나타낸 그림이다.
도 10은 재조합 바실러스 서브틸리스 균주의 LB 배지에서의 피타제 생산성패턴을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 가축사료 첨가물과 피틴산 함유 곡물 가공 식품 제조에 사용할 수있는 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래의 신규한 피타제를 암호화하는 DNA서열을 포함하는 DNA 및 이와 기능적 등가물; 상기 피타제 유전자 암호화 단백질의아미노산 서열 및 이와 기능적으로 동등한 유도체 서열; 상기 DNA 서열을 포함하는 재조합 발현벡터; 상기 DNA 서열 또는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포; 상기 유전자의 DNA 서열을 적합한 숙주 세포에서 발현시킬 수 있는 벡터에 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하고, 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 상기 유전자 DNA 서열 또는 상기 재조합 발현벡터를 적합한 숙주세포에 형질전환시키고, 상기 형질전환된 숙주세포를 적합한 성장 조건하에서 배양시키고, 생산된 피타제를 상기 숙주세포 또는 배양액으로부터 분리하는 단계를 포함하는 신규한 피타제 단백질을 제조하는 방법; 이에 의해 제조된 피타제 및/또는 숙주세포 배양물을 포함하는 식품 또는 사료 조성물에 관한 것이다.
피타제 효소의 분리정제는 기존에 밝혀진 피타제의 성질을 이용하여 다양한 크로마토그래피 방법에 의한 단백질 분리방법을 그대로 사용하거나 실험 목적에 맞게 약간 변형하여 사용 가능하다. 크로마토그래피 방법에 의해 순수 분리한 본 발명 피타제의 순도 검정은 전기영동법을 이용하여 증명하였으며. 표준분자량 물질과 함께 이동시켜 이동거리를 비교함으로써 피타제 분자량을 결정하였다. 본 발명자들은 헤파린 세파로스(Heparin Sepharose) 칼럼을 통과한 활성분획의 시료가 전기영동 수행시 약 44,000 달톤의 위치에서 단일 밴드를 보여 피타제가 순수하게 정제되었으며, 그 분자량이 약 44,000 달톤임을 알 수 있었다. 본 발명 피타제 효소 활성을 결정하는 온도, pH 등에 대한 효소 활성 변화를 조사한 결과, 최적 반응온도는약 40℃이고, 60℃까지는 10분간 열처리를 하여도 열처리를 하지 않은 효소액의 활성과 동일하였으나 60℃ 이상의 온도에서는 급격히 실활되었고 효소 반응액에 5mM CaCl2를 첨가하였을 때는 70℃에서도 50% 이상의 잔존활성을 나타냈으며, pH 7.0에서 최적 활성을 보이고, pH 5.0과 11.0 사이에서 90% 이상의 활성을 나타내어 이 범위의 pH에서는 비교적 안정한 것으로 나타났다.
본 발명 피타제의 기질 특이성을 조사하기 위하여 여러 가지 포스페이트 에스터(phosphate ester) 결합을 하고 있는 기질들을 사용하여 효소활성을 측정한 결과, 본 발명의 피타제는 피틴산을 가장 잘 가수분해하였고 ADP와 ATP에 대해서는 피틴산에 대한 활성과 비교하여 각각 약 12%, 3%의 효소활성을 나타내었으며, 소디움 파이로포스페이트(sodium pyrophosphate) , α-글리세로포스페이트( α-glycero-phosphate) , β-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) , α-나프틸포스페이트(α-naphthylphosphate) , p-니트로페닐포스페이트(p-nitrophenyl phosphate) 등에 대해서는 효소활성을 나타내지 않았다. 본 발명 피타제 절단 특이성을 조사하기 위하여 피틴산과 여러가지 이노시톨 포스페이트(inositol phosphate) 기질로 사용하여 피타제의 절단 특이성을 조사한 결과, 본 발명 피타제는 피틴산에 결합되어있는 6개의 인 중 3개를 절단할 수 있었다.
본 발명 피타제의 실제 곡물 중의 피틴산 분해능력을 조사하기 위하여 대두분(soybean meal)을 기질로 하여 효소활성을 측정한 결과, 본 발명 피타제가 다른 바실러스 유래의 피타제보다 대두분 중의 피틴산 분해능력이 우수한 것으로 나타났다. 그러므로 본 발명 피타제는 사료산업 또는 피틴산 함유 곡물 가공 식품산업 등에 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.
바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래의 피타제를 암호화하는 유전자의 염기서열을 결정하여 도 7에 도시하였다. 도 7에 도시된 바와 같이 상기 유전자는 1,149개의 염기로 구성되며(서열번호 1), 상기 유전자는 도 8에 도시한 바와 같이 382개의 아미노산을 암호화한다(서열번호 2). 한편, 본 발명 피타제는 유전자 산물의 아미노산 염기서열에서 세포외 분비를 담당하는 30개 아미노산으로 구성된 신호서열을 가지고 있었다.
본 발명은 상기 특성 중 하나 또는 그 이상의 특징을 갖는 피타제를 암호하는 분리된 핵산 또는 이의 기능적인 유도체에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 핵산은 서열번호1에 따른 DNA나 이의 기능적 유도체를 포함하거나, 서열번호1에 따른 DNA나 이의 기능적 유도체와 하이브리다이제이션 될 수 있다. 상기 핵산은 바람직하게는 DNA 분자이다. 본 발명 명세서에 있어서, 핵산 또는 유전자와 관련하여 "이의 기능적인 등가물"이란 피타제를 암호하는 핵산의 기능적인 특성을 갖는 핵산의 유도체를 의미한다. 즉, 본 발명에 의한 피타제를 암호하는 핵산의 기능적인 등가물 또는 유도체는 본 발명에 의한 특징을 갖는 피타제를 암호화한다. 본 발명에 의한 피타제를 암호하는 핵산 유도체는 예컨대, 부위특이적 돌연변이법((Botstein, D., Shortle, D., 1985, Science 229: 1193-1201, Myers, R.M., Lerman, L.S., Maniatis, T., 1985, Science 229: 242-247 등에서 개시됨), error-prone PCR(예컨대, Leung, D.W., Chen, E., Goeddel, D.V., 1989, Technique 1:11-15; Eckert,K,A., Kunkel, T.A.,1991, PCR Methods Applic. 1: 17-24;Cadwell, R.C., Joyce, G.F., 1992, PCR Methods Applic. 2: 28-33), 및/또는 당해 분야에서 공지된 화학적으로 유도하는 돌연변이 유발 기술(예컨대, Elander, R.P 'Microbial screening, Selection and Strain Improvement' in Basic Biotechnology, J. Bu'lock and B. Kristiansen Eds., Academic Press, New York, 1987, 217) 등의 방법에 의해 생성된 돌연변이체를 포함된다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 핵산의 생산 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기한 핵산을 포함하는 탐침을 표준 조건하에, 상기 핵산을 포함하는 것으로 추정되는 표본에 하이브리다이제이션시켜, 상기 핵산을 회수하는 것을 특징으로 한다. 상기 하이브리다이제이션을 위한 탐침을 이용하는 표준 테크닉에는 Southern blotting(일예로, Sambrook et al.,Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press , 1989) 및 PCR 및 RT-PCR(일예로, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. andWhite, T.J. Eds., Academic Press New York, 1990)이 포함된다.
본 발명에서 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주로부터 피틴산 분해 활성을 갖는 피타제 유전자를 분리하는 것은 통상의 유전자 분리방법에 준하여 행할 수 있는데, 예컨대 이미 알려진 피틴산 분해효소 유전자의 활성 부위 보존 지역 중 일부영역을 DNA 합성기를 이용하여 시발물질(primer) DNA를 합성한 후, 상기 합성 시발물질을 이용하여 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction) 방법에 의래 피타제 유전자 단편을 증폭하고 이 유전자 단편의 삽입이 가능한 벡터를 이용하여 유전자 라이브러리를 제조하고 피틴산 분해활성을 측정하여 피타제 유전자를 지닌 클론을 선발할 수 있다. 본 발명 유전자의 분리방법 및 확인방법은 실시예에 기재되어 있다. 당업자들은 예컨대, Sambrook 등(Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ed. Vol. 1. pp.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))이 정의한 바와 같이, 본 발명이 피타제 유전자 염기서열에 하이브리다이제이션할 수 있는 그러한 DNA 또는 RNA 서열도 포함된다는 것을 명백히 이해하고 있을 것이다.
따라서, 본 발명에 의해 해석되는 핵산분자는 본 발명 핵산서열에 하이브리다이제이션하는 서열 및 유전암호의 축퇴성(codon degeneracy)에 의한 서열을 갖는 핵산분자들뿐만 아니라, 상기 개시한 방법에 의해 제조된 피타제 유전자 염기서열 또는 아미노산 서열로부터 귀납적으로 유추가능한 서열을 갖는 분자들도 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명에 의한 피타제는 서열번호 2의 아미노산 서열또는 이와 기능적으로 동등한 유도체를 포함한다. 본 발명 명세서에 있어서, "이와 기능적으로 동등한 유도체"란 본 발명에 의한 피타제의 기능적인 특성을 갖는 피타제 유도체를 의미한다. 즉, 피타아제의 기능적인 유도체는 본 발명에 의한 피타제의 일반적인 특성을 갖는 것으로, 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가된 천연, 합성 또는 재조합에 의한 펩티드나 펩티드 단편, 돌연변이체나 변이형을 모두 포괄한다고 할 수 있다. 따라서, 본 발명은 피타제 효소 아미노산 서열(서열번호 2)뿐만 아니라, 잠재성 변이(silent change)에 따라 서열내에서 다른아미노산 잔기들로 치환된 이와 기능적으로 동등한 서열들도 포함한다. 예컨대, 서열내 하나 이상의 아미노산이 기능적으로 동등하게 작용하는 유사한 극성의 다른 아미노산(들)으로 치환될 수 있다(silent change). 서열내 아미노산 치환은 그 아미노산이 속하는 클래스의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 예컨대, 소수성(nonpolar, hydrophobic) 아미노산 클래스는 알라닌, 발린, 류이신, 이소류이신, 페닐알라닌, 발린, 트립토판, 프롤린, 및 메티오닌을 포함한다. 극성의 중성(polar, neutral) 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 타이로신, 아스파라긴, 및 글루타민을 포함한다. 양성 전하를 띤 염기성(positively charged, basic) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음성 전하를 띤 산성(negatively charged, acidic) 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함한다. 또한, 본 발명 피타제 효소 단백질 및 아미노산 서열간의 일정범위의 상동성, 예컨대 90-100% 범위내의 동일 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 절편(fragments) 또는 이들의 유도체들도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명 피타제 유전자 염기서열을 공지의 다른 유전자들과 염기서열 상동성을 비교해 보았을 때, 공지의 다른 피타제 유전자와는 상이한 상동성을 나타내어 본 발명 유전자가 신규한 유전자임을 확인할 수 있었다. 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) VTT E-68013 유래phyC유전자(GenBank AF029053)와 바실러스 아밀로리퀴파시언스(Bacillus amyloliquefaciens) DS11 유래phy유전자(GenBank U85968)의 염기서열과는 각각 72%의 상동성을 보였고 또한 곰팡이 유래 피타제 유전자를 비롯한 기타 피타제 유전자와는 염기서열 상동성이 거의 없었다. 그런데, 본 발명의 피타제 유전자 염기서열이 바실러스 서브틸리스 168 유래yzxA유전자(GenBank AF015775)의 염기서열과 98%의 매우 높은 상동성을 보였는데, 바실러스 서브틸리스 168 균주 유래의yzxA유전자(yodV유전자라고도 명함)는 바실러스 서브틸리스 168 균주의 유전체 염기서열이 밝혀짐에 따라서 염기서열 분석을 통하여 밝혀진 추정 유전자(putative gene)로서 그 유전자 산물의 존재와 기능이 밝혀지지 않은 상태이다. 더군다나 본 발명의 피타제 유전자 공여체인 바실러스 코아구란스 균주는 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 공시균으로서 바실러스 서브틸리스 168 균주와는 서로 상이하며 본 발명을 통하여 바실러스 코아구란스 피타제 유전자 산물의 기능을 밝혀냄으로써 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명은 상기한 핵산 염기서열 뿐만 아니라, 이러한 염기서열을 갖는 DNA가 삽입된 재조합 발현벡터도 포함한다. 당업자들은 DNA 절편을 벡터내로 삽입하는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 적절한 전사/해독 조절서열 및 피타제 효소암호화 핵산서열을 이용하여 피타제 효소를 암호화하는 발현벡터를 제조할 수 있다. 상기 재조합 발현벡터는 선택된 숙주내에서 작용하는 한 어떠한 벡터도 작용가능한데, 예컨대 당업계에 공지된 통상적인 발현벡터인 플라스미드(plasmid), 코스미드(cosmid) 등이 이용될 수 있다. 발현벡터를 구축하는 방법은 그 자체가 공지되어 있고, 예컨대 Sambrook 등의 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989))에 개시되어 있다.
그렇게 하여 제조된 재조합 발현벡터는 숙주세포를 형질전환시킬 수 있다.재조합 DNA의 적당한 발현세포로는 대장균과 바실러스 속 등의 세균, 방선균, 효모, 곰팡이, 동물세포, 곤충세포, 또는 식물세포 등이 이용될 수 있다. 예컨대, 상기한 DNA 핵산 또는 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 대장균(E.coli), 바 실러스(Bacillus sp.), 락토바실러스(Lactobacillus)나 락토코커스(Lactococcus)와 같은 프로바이오틱 유산균, 아스퍼질러스(Aspergillus sp.), 사카로마이세스(Saccharomyces sp.), 후미콜라(Humicola sp.), 피치아(Pichia sp.), 트리코데르마(Trichoderma sp.), 및 콩이나 옥수수 등일 수 있다.
본 발명 피타제 효소 암호화 유전자 또는 이와 동등한 기능의 서열을 갖는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지와 조건에서 배양하여 피타제를 제조할 수 있다. 당업자는 상기 제조방법에 의해 제조된 피타제를 포함하는 배양물 또는 조성물 형태로, 또는 분리된 효소를 유리상태 또는 고정화시킨 상태로 상기 설명한 바와 같은 피틴산 활성을 이용하거나 목적 산물을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 의한 피타제를 식품 또는 동물 사료에 사용하는 용도에 관한 것이다. 상기 식품이나 동물 사료에는 소화관에서 활성을 가지는 피타제가 첨가제로써 포함되며, 상기 동물은 바람직하게는 가금류를 포함하는 조류, 소, 양 등의 반추류, 돼지, 물고기, 새우를 포함하는 수중 동물로 이루어지는 군에서 선택되어지며, 이 때 상기 첨가제는 식품 또는 사료 처리 공정 중 활성을 유지하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한, 본 발명에 의한 피타제를 발현할 수 있는 바실러스 코아구란스 KCTC 1823, 본 발명 유전자로 형질전환된 숙주세포 또는 숙주세포의 포자를 포함하는 식품 또는 동물 사료에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 식품 또는 동물 사료의 제조방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 식품 또는 동물 사료와 본 발명에 의한 피타제가 혼합된 것을 특징으로 한다. 상기 피타제는 처리 전에 건조물 형태로 첨가되거나, 액상으로 첨가될 수도 있다. 또한, 상기 방법은 상기 식품 또는 동물 사료에 본 발명에 의한 피타아제를 발현할 수 있는 바실러스 코아구란스 KCTC 1823, 숙주세포 또는 숙주세포의 포자가 첨가된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 이노시톨 및 무기 인산염의 생성에서, 본 발명에 의한 피아제를 보조적인 포스파타제를 제공하거나 제공하지 않은 가운데 사용하는 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 동물 분뇨에서 인 수준을 감소시키는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 동물 사료에 함유된 피틴산을 효과적으로 전환할 수 있는 양으로 본 발명에 의한 동물 사료를 제공하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명 피타제는 농업 및 식품분야 등에 산업적 응용이 가능하다. 예컨대, 본 발명 피타제를 돼지와 닭 등의 단위동물을 위한 사료에 첨가하여 사료내 인산염 첨가량을 획기적으로 줄임과 동시에 가축들의 인과 무기금속 이온들에 대한 효용성 및 단백질 소화율을 증진시켜 생산성을 증대하고 유효 인의 배설을 감소시킬 수가 있게 된다. 특히 한국을 포함한 전세계에서 축산 폐수의 인 함량을 규제하는 추세에 있으므로 오염 배출원들에 대한 근본적인 인의 함량을 낮추는 문제는 경제적·환경적인 측면에서 중요한 사항이 되고 있다. 따라서 피타제의 사용은 필수적으로 예상된다. 또한 곡물 중의 피틴산은 미량 영양원인 여러 금속이온들과 착화합물을 강하게 형성할뿐만 아니라 곡물 중의 각종 단백질들과 결합하여 단백질 분해효소의 작용을 억제하기 때문에 피틴산은 항영양 인자로 작용하여 사람 체내에서 단백질 및 중요 광물질에 대한 소화흡수에 저해를 일으키므로 곡물가공 식품제조에 본 발명 피타제를 적용하여 소화율 증진을 위한 드링크류의 개발 등 식품산업에 다양한 응용이 가능하다.
본 발명은 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주에서 피타제의 정제 및 정제된 효소의 특성 조사 단계; 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래의 피타제 유전자의 분리 단계; 클로닝된 유전자의 염기서열 결정 및 분석 단계; 대장균과 바실러스 서브틸리스 균주에서의 재조합 피타제 제조 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위는 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 바실러스 코아구란스 균주가 생산하는 피타제의 정제
신규한 피타제를 생산하는 균주를 탐색하고자 경남 일대의 토양시료에서 분리한 균주들과 유전자은행(KCTC)에서 분양받은 바실러스 속 균주들이 생산하는 피타제의 활성과 내열성, 내산성 등의 효소 반응특성을 측정함으로써 상대적으로 사료첨가제 용도에 가장 적합한 피타제를 생산하는 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주를 선발하였다. 공시균인 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주에서 피타제가 생산된다는 보고가 없을 뿐만 아니라 상기 균주가 생산하는 피타제의 반응특성이 공지의 피타제들의 반응특성과 상이하여 신규 피타제 유전자원으로 선발하고 본 발명에 이르게 되었다. 특히, 대두분(soybean meal)을 사용하여 실제 곡물 중의 피틴산 분해능력을 조사한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 바실러스 코아구란스 피타제가 다른 바실러스 유래의 피타제보다 대두분 중의 피틴산 분해능력이 우수한 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 본 발명의 피타제가 가축사료산업 또는 피틴산 함유 곡물 가공 식품산업 등에 효과적으로 사용될 수 있음을 의미한다. 따라서 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주가 생산하는 피타제의 물리적 성질과 효소 반응특성 등을 정밀하게 조사하기 위해서 상기 균주의 배양상등액으로부터 하기의 과정을 통하여 피타제를 정제하였다.
바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주를 PSM 배지(10 g peptone, 5 g beef extract, 10 g D-glucose, 5 g calcium phytate, 1 g MgSO4·7H2O, 1 g CaCl2)에 접종하여 37℃에서 2일간 진탕배양한 후 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 배양 상등액을 취하였다. 그리고 나서 배양 상등액을 ultrafiltration을 수행하여 농축을 하고 1 mM CaCl2가 함유된 10 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충액을 첨가하여 diafiltration을 수행하였다. 이와 같은 방법으로 제조된 조효소액을 가지고 Q-Sepharose Fast Flow 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다. Q-Sepharose Fast Flow 칼럼에 조효소액을 통과시킨 후에 1 mM CaCl2가 함유된 10 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충용액으로 충분히 세척하여 흡착되지 않은 단백질들을 제거하고 0∼0.5 M NaCl gradient를 걸어 주어 0.3 M NaCl 농도 부근에서 피타제 활성분획을 용출시켰다. 용출된 효소액을 모아 1 mM CaCl2가 함유된 10 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충용액에 투석하였다. 그 후에 투석액을 Heparin Sepharose 칼럼에 통과시킨 후 1 mM CaCl2가 함유된 10 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충용액으로 충분히 세척하고 0∼0.5 M NaCl gradient를 걸어 주어 0.15∼0.2 M NaCl 농도 부근에서 피타제 활성분획을 용출시켰다. 그 후에 효소 활성분획을 모아서 1 mM CaCl2가 함유된 10 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충용액에 투석을 함으로써 바실러스 코아구란스가 생산하는 피타제를 정제하였다.
상기 과정에 의해 수득된 활성 분획을 전기영동하여 코마시 염색을 하였을때, 도 2에 도시한 바와 같이 Heparin Sepharose 칼럼을 통과한 활성분획의 시료가약 44,000 달톤의 위치에서 단일 밴드를 보여 피타제가 순수하게 정제되었으며 그 분자량이 약 44,000 달톤임을 알 수 있었다.
또한 상기의 정제 과정에 의해 조효소액 활성의 약 32%를 회수하였고 정제도는 47배 정도 증가하였으며 비활성도는 정제 단백질 1 mg당 약 16 unit이었다. 이때 피타제 활성 측정은 Choi등의 방법(J. Microbiol. Biotechnol,9: 223-226(1999))을 이용하여 기질로부터 효소반응에 의해 유리되는 무기 인(inorganic phosphate)의 양을 측정하였다. 본 방법에 의한 피타제 효소활성 측정은 100 mM Tris-Cl (pH 7.0) 완충용액에 용해되어있는 2 mM sodium phytate 900 ㎕와 적절히 희석된 효소용액 100 ㎕를 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 750 ㎕의 5% 트리클로로아세틱산 용액을 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 대조구로서는 효소용액대신 증류수 100 ㎕를 넣어 반응하였다. 그 후에 1.5 ㎖의 발색시약(5.5% 황산에용해된 2.5% ammonium molybdate 용액과 2.5% FeSO4용액의 4:1 혼합물)을 가하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성단위 1 unit는 1분 동안에 1 μmol의 무기 인을 방출시키는 효소 양으로 정의하였다.
실시예 2. 바실러스 코아구란스 배양액으로부터 순수정제된 피타제의 특성
실시예 2-1. 피타제의 최적 반응온도와 열안정성
정제된 피타제의 최적 반응온도와 열안정성를 조사하기 위해서 다양한 온도에서 효소활성을 측정하여 상대활성도를 도 3에 나타내었다. 도 3(가)에서 보는 바와 같이 정제된 효소의 최적 반응온도는 40℃였으며, 각 온도에서 10분간 방치한 후에 잔존활성을 측정한 결과 60℃까지는 열처리를 하지 않은 효소액의 활성과 동일하였으나 60℃ 이상의 온도에서는 급격히 실활되었다. 그러나 도 3(나)에서 보는 바와 같이 효소 반응액 중 CaCl2의 농도를 높여갈수록 효소의 열안정성이 증가하여 효소 반응액에 5 mM CaCl2를 첨가하였을 때는 70℃에서도 50% 이상의 잔존활성을 나타냈다.
실시예 2-2. 피타제의 최적 pH 와 pH 안정성
정제된 피타제의 최적 pH를 알아보기 위해서 여러 가지 pH 조건에서 효소활성을 측정하였다(도 4). 또한 효소의 pH 안정성을 조사하기 위해서 각 pH별로 제조한 100 mM 완충용액에 효소액을 섞은 후 37℃에서 1시간 방치한 다음 잔존활성을 측정하였다(도 4). 그 결과, 정제된 피타제는 pH 7.0에서 최적 활성을 보였으며, pH 5.0과 11.0 사이에서 90% 이상의 활성을 나타내어 이 범위의 pH에서는 비교적안정한 것으로 나타났다.
실시예 2-3. 피타제의 기질 특이성
정제된 피타제의 기질 특이성을 조사하기 위하여 여러 가지 phosphate ester 결합을 하고 있는 기질들을 사용하여 효소활성을 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 피타제는 피틴산를 가장 잘 가수분해하였으며 ADP와 ATP에 대해서는 피틴산에 대한 활성과 비교하여 각각 약 12%, 3%의 효소활성을 나타내었다. 그러나 본 발명의 피타제는 sodium pyrophosphate, α-glycerophosphate, β-glycerophosphate, α-naphthylphosphate,p-nitrophenyl phosphate 등에 대해서는 효소활성을 나타내지 않았다.
실시예 2-4. 피타제의 절단 특이성 조사
박막 크로마토그래피(Thin-layer chromatography) 방법을 이용하여 피틴산과 여러가지 이노시톨 포스페이트를 기질로 사용하여 피타제의 절단 특이성을 조사하였다. 그 결과 도 5(가)에서 보는 바와 같이 반응시간이 경과함에 따라 정제효소가 피틴산에 결합되어 있는 인(phosphate)를 분해하여 유리 인(free phosphate)의 양이 점점 증가하고 최종산물로서 myo-Inositol-tris-phosphate을 생산하였다. 즉, 본 발명의 피타제가 피틴산에 결합되어있는 6개의 인 중 3개를 절단할 수 있었다. 또한, Ins(1)P와 Ins(1,4)P2 중의 인은 절단할 수 없었고, Ins(1,4,5)P3는 1개, Ins(3,4,5,6)P4는 1개의 인을 절단하였다 (도 5(나)).
실시예 2-5. 정제된 피타제의 kinetic parameter
피틴산에 대한 정제 피타제의 kinetic parameter를 Lineweaver-Burk plot 방법으로 결정하였다. 도 6에서 보는 바와 같이 K m 과 V max 는 각각 0.77 mM, 0.244 mmole/min/mg으로 나타났다.
실시예 2-6. 정제된 피타제의 N-말단 아미노산 서열
정제 피타제의 N-말단 아미노산 서열을 분석한 결과 글루탐산-글루탐산-히스티딘-히스티딘-페닐알라닌-라이신-발린-트레오닌-알라닌-히스티딘-트레오닌-글루탐산-트레오닌-아스파틱산-프롤린-발린 순으로 나타났다. 이러한 N-말단 아미노산 서열을 공지의 다른 단백질들의 아미노산 서열과 상동성을 비교해 보았을 때, 본 발명의 피타제의 N-말단 아미노산 서열은 바실러스 서브틸리스 168 균주의yzxA유전자 산물의 아미노산 서열과 동일하였으나 아스퍼질러스 속을 포함한 곰팡이, 바실러스 속과 대장균을 포함한 세균 유래의 피타제를 포함한 공지의 기타 단백질들의 아미노산 서열과는 상동성을 보이지 않았다. 그런데 바실러스 서브틸리스 168 균주유래의yzxA유전자(yodV유전자라고도 명함)는 바실러스 서브틸리스 168 균주의 유전체 염기서열이 밝혀짐에 따라서 염기서열 분석을 통하여 밝혀진 그 기능이 밝혀지지 않은 추정 유전자(putative gene)이다 (Nature,390: 249-256 (1997)) .
실시예 3. 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래 피타제 유전자의 분리
바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주를 LB 액체배지에서 진탕배양한 다음 회수된 균체로부터 Saito와 Miura의 방법(Biochim. Biophys. Acta.,72: 619-629(1963))으로 염색체 DNA를 분리하였다. 그리고 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 염색체 상의 피타제 유전자를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)에 의해 증폭하고 대장균에서 클로닝하기 위하여 바실러스 서브틸리스 168yzxA유전자의 염기서열에 기초하여 N-말단 시발물질(5'-GCTCTAGAGTGATAAAAGAGGAGGG-3')과 C-말단 시발물질( 5'-CGGGATCCGCTGCACAAGCTGCTTTC-3')를 제조하였다. 이들 두 시발물질을 이용하여 중합효소연쇄반응에 의해 생성된 1.2 kb 크기의 DNA 단편을 분리한 후에 이들 DNA 조각을Xbal과BamHI으로 완전절단하고 동일한 제한효소와 CIP로 탈인산화시킨 pBluescriptII SK+ (Strategene) 플라스미드와 접합시켰다. 이 접합 DNA를 가지고 전기천공법으로 대장균(E. coliJM83)을 형질전환시킨 후에 50 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린 항생제가 함유된 MacConkey 한천배지에 도말하여 형질전환체들을 얻었다.
MacConkey 평판한천배지에 생성된 콜로니들 중에서 흰색을 띠는 형질전환체에서 재조합 플라스미드를 분리하여 서던 하이브리다이제이션(Southern hybrdization)과 제한효소 패턴 등을 분석한 결과, 재조합 대장균으로부터 분리한 플라스미드에 1.2 kb 크기의 바실러스 코아구란스 유래의 DNA가 존재하는 것을 확인하였고 이 재조합 플라스미드를 pBSK/phyJ로 명명하였다.
실시예 4. 바실러스 코아구란스 피타제 유전자의 염기서열 결정 및 분석
재조합 플라스미드 pBSK/phyJ 내에 들어있는 바실러스 코아구란스 유래 DNA의 염기서열을 ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing kit을 사용한 Sanger의 방법 (Proc. Natl. Acad. Sci.,74: 5463 (1977))과 자동 염기서열 분석기(Automatic Sequencer ABI310)를 사용하여 결정하였다. 염기서열 결정으로 밝혀진 바실러스 코아구란스 유래의 피타제를 암호화하는 유전자의 염기서열은 도7에 도시한 바와 같다. 또한 상기 유전자 염기서열로부터 번역되는 단백질의 아미노산 서열은 도 8에 도시한 바와 같다.
도 7에 도시한 바와 같이phyJ로 명명된 바실러스 코아구란스 피타제 유전자는 1,149개의 염기로 구성되어 있었으며, 이 유전자는 도 8에 도시한 바와 같이 382개의 아미노산을 암호화하고 있었다. 그리고 본 발명의 피타제는 도 8에 밑줄로 표시된 바와 같이 31번 아미노산에서 시작되는 아미노산 서열이 바실러스 코아구란스 균주의 배양액에서 순수정제한 피타제의 N-말단 아미노산 서열과 정확히 일치하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 공지의 다른 유전자들과 염기서열 상동성을 비교해 보았을 때, 본 발명의 피타제 유전자 염기서열은 기능이 밝혀지지 않은 추정 유전자인 바실러스 서브틸리스 168 유래yzxA유전자(GenBank AF015775)의 염기서열과 98%의 매우 높은 상동성을 보였고, 바실러스 서브틸리스 VTT E-68013 유래phyC유전자(GenBank AF029053)와 바실러스 아밀로리퀴파시언스 DS11 유래phy유전자(GenBank U85968)의 염기서열과는 각각 72%의 상동성을 보였다. 또한 기타 공지의 유전자의 염기서열과는 거의 상동성이 없는 것으로 보아 본 발명의 유전자는 신규한 피타제 유전자임을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 바실러스 코아구란스 피타제 유전자의 대장균과 고초균에서의 발현
재조합 플라스미드 pBSK/phyJ(도 9(가))를E. coliJM83과E. coliXL1-blue 에 도입하고 이들 재조합 대장균들을 100 ㎍/㎖ 농도의 앰피실린 항생제가 함유된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 하루밤 동안 진탕배양하였다. 그 후에 원심분리하여얻은 균체를 파쇄하고 수득한 조효소액을 사용하여 피타제 활성을 조사한 결과, 벡터 DNA인 pBluescriptII SK+를 함유하고 있는 재조합 대장균에서는 피타제 활성이 측정되지 않았으나 재조합 플라스미드 pBSK/phyJ를 함유한 재조합E. coliJM83과 재조합E. coliXL1-blue에서는 각각 0.27 U/mg, 0.05 U/mg의 활성을 보였다. 또한 pBSK/phyJ를 함유한 재조합E. coliJM83 균주에서 얻은 조효소액을 부분정제하여 대장균에서 생산되는 피타제의 반응특성들을 조사해 본 결과 바실러스 코아구란스배양상등액에서 정제한 피타제의 반응특성과 동일하였다.
바실러스 서브틸러스 균주에서phyJ유전자를 발현시키기 위해서 pBSK/phyJ플라스미드 내에 들어있는phyJ유전자 절편을E. coli-Bacillusshuttle vector인 pJH27 vector(Biotechnol. Lett.,15: 133-138 (1993))에 도입하여 재조합 플라스미드 pJH27/phyJ(도 9(나))를 제작하여 바실러스 서브틸리스 DB431 균주 내로 도입하였다. 이 재조합 균주를 5 ㎍/㎖ kanamycin을 함유한 LB 배지에 접종하여 30℃에서 진탕배양하여 생육시간에 따른 균체 성장과 피타제 활성 정도를 조사하였다. 도 10에서 보는 바와 같이 재조합 바실러스 균주는 8시간 배양에서 0.2 unit/㎖의 최고활성을 나타냈는데 이것은 바실러스 코아구란스 균주에 비하여 5배 정도 생산성이 증가된 것이다. 그런데 균체량은 18시간을 지나면서 서서히 감소한 반면 피타제활성은 8시간을 기점으로 급격하게 떨어졌다. 이것은 바실러스 서브틸리스 숙주균이 생산하는 단백질 분해효소에 의해 피타제가 분해되는 것으로 추정되는데, 이는 단백질분해효소 결손 변이주의 사용 또는 배지조성의 변화 등을 통하여 극복될 수 있을 것으로 여겨진다.
이상에서 상세히 설명하였듯이, 본 발명의 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주 유래의 피타제 유전자는 기존의 공지된 피타제 유전자와 그 염기서열 및 아미노산 서열이 상이한 신규한 유전자일뿐만 아니라, 다른 바실러스 유래의 피타제보다 대두분 중의 피틴산 분해능력이 우수한 피타제 효소를 암호화하여 상기 균주 또는 재조합 미생물로부터 제조된 피타제는 식품 및 사료 속에 소화가 잘 안되는 피틴산 형태로 들어있는 인이 이용가능한 형태가 되도록 하여 식품 및 동물 사료의 영양가를 높이고, 사료 비용을 낮추며, 소화되지 않고 분비된 인으로인한 환경적인 부담을 감소시키는 매우 뛰어난 효과가 있다.
Claims (8)
- 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주로부터 분리한 서열번호 1과 같은 염기서열을 갖는 피타제 유전자 또는 그 기능적 등가물.
- 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주로부터 분리한 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 갖는 또는 이와 기능적으로 동등한 아미노산 서열을 갖는 피타제.
- 상기 제1항의 피타제 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
- 상기 제3항의 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주세포.
- 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 상기 제4항의 숙주세포를 적합한 배양조건 하에서 배양시키고 피타제를 상기 숙주세포 또는 배양액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 피타제의 제조방법.
- 상기 제2항 또는 제5항에 의해 제조된 피타제나 상기 제5항에 의한 숙주세포 배양물을 포함하는 식품 또는 사료조성물.
- 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 바실러스 코아구란스 KCTC 1823 균주를적합한 배양조건 하에서 배양시키고 피타제를 상기 균주 또는 배양액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 피타제의 제조방법.
- 상기 제7항에 의한 피타제 또는 균주배양물을 식품 또는 사료조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020010080964A KR20030050524A (ko) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020010080964A KR20030050524A (ko) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20030050524A true KR20030050524A (ko) | 2003-06-25 |
Family
ID=29576244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020010080964A KR20030050524A (ko) | 2001-12-18 | 2001-12-18 | 바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20030050524A (ko) |
-
2001
- 2001-12-18 KR KR1020010080964A patent/KR20030050524A/ko not_active Application Discontinuation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20220025384A1 (en) | Phytase mutants | |
| Kumar et al. | β-Propeller phytases: diversity, catalytic attributes, current developments and potential biotechnological applications | |
| US7442398B2 (en) | Phytase produced from Citrobacter braakii | |
| Tye et al. | Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B. subtilis á168 and B. licheniformis | |
| CN101426907B (zh) | 一种植酸酶的克隆和表达 | |
| EP1084257B1 (en) | A STRAIN E.COLI JM83/pKP2 TRANSFORMED WITH A NOVEL PLASMID AND PHYTASE PRODUCED THEREFROM | |
| KR100489286B1 (ko) | 바실러스 서브틸리스에서 유래된 피타아제, 상기 피타아제를 암호하는 유전자, 이의 생성 방법 및 용도 | |
| KR20000016576A (ko) | 반추동물 미생물의 피타아제를 발현하는 디엔에이 서열 | |
| SK280670B6 (sk) | Vyčistená a izolovaná sekvencia dna, konštrukt, ve | |
| AU2021201026B2 (en) | Glucanase production and methods of using the same | |
| DK3072962T3 (en) | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF PHYTASE VARIANT WITH IMPROVED THERMOSTABILITY AND A PHYTASE VARIANT AND APPLICATION THEREOF | |
| CA2743711A1 (en) | A thermotolerant non-k12 escherichia coli phytase and its production | |
| Clarkson et al. | Enzymes: screening, expression, design and production. | |
| US7335501B1 (en) | Phytases and methods for producing these phytases | |
| JP2011155932A (ja) | アルカリケラチナーゼおよびこれをコードするｄｎａならびにその使用方法 | |
| CN115074347A (zh) | 一种含角蛋白酶突变体和胆汁酸的饲料添加剂及其应用 | |
| US20070184521A1 (en) | Novel phytase and gene | |
| KR20030050524A (ko) | 바실러스 코아구란스 kctc 1823 균주 유래의 신규한피타제 유전자 | |
| KR100578539B1 (ko) | 사이트로박터 브라키 유래의 파이타제 | |
| Gordeeva et al. | Expression and Characterization of Phytase from Obesumbacterium proteus in Pichia pastoris | |
| KR100377781B1 (ko) | 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 분리한 신규 파이타아제및 그의 유전자 | |
| CN113166740A (zh) | 具有植酸酶活性的多肽 | |
| KR19990086028A (ko) | 신규한 파이타제 유전자, 재조합 파이타제 및 그 용도 | |
| JP2017060424A (ja) | リパーゼ、ポリヌクレオチド、組換えベクター、形質転換体、リパーゼの製造法、グリセロ脂質を加水分解する方法及びグリセロ脂質の加水分解物を製造する方法 | |
| Nurhusna et al. | Amino acids substitution to improve PhyFAUIA1 phytase activity for animal feed production |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E601 | Decision to refuse application |