KR100377781B1 - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 분리한 신규 파이타아제및 그의 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에서 분리한 신규 파이타아제(phytase; myo-inositol hexakisphosphate phosphohydro lase) 및 그 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 단위가축(monogastric animal)에 급여하는 사료내 인(phosphorus)의 체내 이용성을 높여주는 파이타아제 및 그 유전자, 상기 파이타아제 유전자를 클로닝하여 얻어진 재조합 발현벡터 및 형질전환체와 이를 이용한 사료조성물에 관한 것이다. 본 발명의 파이타아제는 단위가축 사료내 존재하는 파이트산(phytic acid)을 가수분해시켜 인의 체내 이용성을 높이고, 배설되는 인의 양을 감소시킴으로써 환경오염을 경감시킬 뿐 아니라, 사료내 부가적으로 첨가하던 인산(phosphoric acid)의 양을 감소시키기 위한 목적으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 분리한 신규 파이타아제 및 그의 유전자{A novel phytase and a gene thereof derived from Bacillus amyloliquefaciens}

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)에서 분리한 신규 파이타아제 및 그의 유전자에 관한 것으로 상세하게는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 분리한 파이타아제 및 파이타아제 유전자; 상기 유전자를 포함하는 발현벡터; 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 단백질을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다.

곡류, 콩과 식물, 지방성 종자 식물(oilseed crop)과 같은 작물은 그 재배면적이 전세계 수확면적의 약 90 % 이상에 달하며, 인간과 동물들의 중요한 영양원으로 이용되고 있다. 상기 작물들에는 파이트산(phytic acid; myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakisdihydrogen phophate)이 다량 존재하고 있는데, 이들의 염 상태인 파이테이트(phytate)는 동식물의 체내에서 골격, 핵산의 구성요소이며, 필수적인 무기물로서 중요한 구실을 하는 인의 주요 저장 형태로서 곡류와 콩과 식물에 존재하는 총 인량(total amount of phosphorus)의 80% 이상을 차지하고 있다(Reddy 등,Environ. Health Perspect.82, 253 - 257, 1989).

돼지, 가금류, 어류 등의 단위동물(monogastric animal)들은 파이트산을 분해할 수 없기 때문에 상기 동물의 인 요구량을 충족시키기 위하여 사료에 무기 인(inorganic phosphorus)을 첨가하고 있다. 그러나 상기와 같이 가축사료에 첨가되는 무기 인은 가축으로부터 배출된 후 지하수, 빗물 등을 통해 환경에 대규모로 전파되며, 이들은 적조현상, 호소(湖沼)의 부영양화로 인한 녹조현상과 같은 환경오염의 문제를 야기한다(Nasi,Oncogene, 5, 117 - 122). 또한, 파이트산은 동물에게 필요한 미량 금속들인 칼슘, 구리, 아연, 철 또는 마그네슘 등을 착염화함으로써 단위 동물의 영양을 저해하므로(Graf,Anal. Biochem.131, 351 - 355, 1983;Lei 등,J. Anim. Sci.71, 3368 - 3375, 1993), 단위동물의 장내에서 파이트산을 인산화 정도가 낮은 미오-이노시톨(myo-inositol) 유도체로 가수분해 하는 과정이 필요하다.

파이타아제(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase)는 파이트산을 미오-이노시톨과 인산(phosphoric acid)으로 가수분해하는 효소이다. 다양한 미생물들로부터 부분 정제된 미생물 파이타아제들에 대한 연구(Ghareib,Acta. Microbiol. Hung.37, 159 - 164, 1990; Greaves 등,Biochem. Biophys. Acta.132, 412 - 418, 1967; Greiner 등,Cornea.12, 461 - 465, 1993; Irving Cosgrove,Aust. J. Biol. Sci.24, 547 - 557, 1971; Shah Parekh,Indian J. Biochem. Biophys. Res. Commun.195, 53 - 57, 1990; Sutardi Buckle,Int. J. Food Microbiol.6, 67 - 79, 1988)가 보고된 바 있으며, 아스파질러스 피쿰(Aspergillus ficuum;Ullahand Gibson,Prep. Biochem.17, 63 - 91, 1987)과 아스파질러스 니거(Aspergillus niger;Ehrlich 등,Biochem. Biophys. Res. Commun.195, 53 - 57, 1993)에서 유래한 파이타아제에 대한 효소학적 특성이 가장 잘 연구되어 있다.

파이타아제 유전자의 클로닝 및 서열분석에 대한 연구는 주로 아스파질러스 니거(Van Hartingseldt 등,Z. Ernahrungswiss, 32, 308 - 315, 1993; Piddington 등,Gene,133, 55 - 62, 1993), 아스파질러스 푸미가투스(A. fumigatus;Pasarnontes 등,Appl. Environ. Microbiol.63, 1696 - 1700, 1997), 아스파질러스 테루스(A. terrus) 및 미셀리오프토라(Myceliophthora;Mitschell 등,Microbiology,143, 245 - 252, 1997) 등의 진균류(fungi) 파이타아제에 집중되어 있는데, 생육기간이 긴 곰팡이 등에서 파이타아제를 생산할 경우 장시간이 소요되므로 경제성이 떨어지는 단점이 있다. 박테리아 파이타아제 유전자에 대하여는 바실러스 속(Bacillus sp.)에 대한 Kerovuo 등(WO 98/06856)과 Kim 등(대한민국 특허 1996-006817)의 연구가 있다.

이러한 파이타아제의 효소학적인 성질에 대한 연구를 바탕으로 미생물 파이타아제로 파이트산(phytic acid)을 가수분해시켜 유리된 인산염을 동물사료에 첨가하여 영양가 향상을 돕는 한편, 동물에 의하여 배출되는 인의 양을 감소시키려는 시도들이 있었다(Lambrechts 등,Rev. Belge Met. Bent.47, 54 - 75, 1992; Simons Versteegh,Br. J. Nutr.64, 525 - 540, 1990). 또한 분리한 파이타아제 유전자로 세균 등을 형질전환시켜 파이타아제를 대량으로 생산하려는 시도가 이루어지고 있다. 따라서, 보다 높은 활성을 가지며, 다양한 목적으로 사용가능한 새로운 파이타아제 유전자에 대한 요구가 증가되고 있다.

이에 본 연구자들은 세포외 분비 파이타아제를 생산하는 식품성(food-grade) 세균인 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR) 기법을 사용하여 파이타아제 유전자를 클로닝하여 서열분석하고, 상기 유전자에 의해 코딩되는 파이타아제가 기존의 것과는 다른 신규한 것으로 등전점(Isoelectric point)이 6.5이고 크기가 39 kDa인 단백질로서, 최적활성은 pH7.5 이고, 최적활성온도는 55℃의 특성을 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단위가축 사료내 인의 체내 이용성을 높여 배설되는 인의 양을 감소시킴으로써 환경오염을 경감시키고, 사료내 부가적으로 첨가하는 인산을 양을 감소시킬 수 있는 파이타아제 및 그 유전자, 상기 파이타아제 유전자를 클로닝하여 얻어진 재조합 발현벡터 및 그의 형질전환체와 이를 이용한 사료조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 pET-Bph 발현벡터의 개열지도를 나타낸 것이고,

도 2는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 클로닝된 파이타아제 유전자를 젤상에서 확인한 것이고,

도 3a, 도 3b 및 도 3c는 공지의 파이타아제와 본 발명 파이타아제와의 염기서열을 비교한 것이고,

도 4는 온도에 따른 본 발명 파이타아제의 활성 변화를 나타낸 것이고,

도 5는 pH에 따른 본 발명 파이타아제의 활성 변화를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스에서 유래하고서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 파이타아제를 제공한다.

상기 파이타아제는 39 kDa의 크기를 가지며, 등전점(pI)은 6.5로서 ㎎ 당 1.2 단위의 효소 역가를 가지며 파이트산을 미오 이노시톨과 인산으로 가수분해하는 활성을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기 파이타아제를 코딩하는 파이타아제 유전자를 제공한다.

본 발명의 파이타아제 유전자는서열번호 2의 염기서열로 기재되며 1.1 Kb의 크기를 갖는 1065 bp 크기의 ORF(Open Reading Frame)부분이다. 상기 ORF는 신호서열(Signal peptide) 중 29개 아미노산이 제거된 354개 아미노산들로 구성된 38,953 Da의 분자량을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩한다. 본 발명의서열번호 2의 염기서열과 다른 미생물 종의 파이타아제 유전자간 DNA 상동성에 있어서는 공지의 바실러스속 DS11의 파이타아제(Kim 등, 1998; 특허 1996-006817)와 92 %의 유사성을 나타내었으며, 바실러스 썹틸러스(Bacillus subtilis)와는 51번째 아미노산이 치환된 것으로 나타났다.

또한, 본 발명은 상기의 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서는 상기의 파이타아제를 대량으로 생산하기 위하여 바람직한 실시예의 하나로 pET-22b(+)(Novagen)의 외래 유전자 삽입 부위에서열번호 2의 염기서열을 갖는 상기 유전자를 삽입하였고, 이를 pET-Bph로 명명하였다(도 1 참조). 그러나 상기 발현벡터의 제조에 이용된 pET-22b(+) 벡터 이외에도 다양한 원핵 세포용 또는 진핵 세포용 벡터가 알려져 있으므로 발현의 목적에 따라 pET-22b(+) 벡터 이외에 다른 발현벡터를 용이하게 이용할 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 또한 발현벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

상기 대장균 균주는 대장균 균주E. ColiBL21(DE3)에 상기 발현벡터를 도입하여 제조할 수 있으며, 그 도입 방법은 공지의 기술, 즉 열충격법, 전기천공법 등을 통해 도입할 수 있고, 상기 대장균 균주E. ColiBL21(DE3) 이외에도 다양한 형질전환용 대장균이 사용될 수 있다.

상기 형질전환체 (E. Coli BL21(DE3)/pET22b(+)-Bph; KCTC 8985P)는 T7 프로모터에 의하여 파이타아제 유전자를 발현시키며,E. ColiBL21(DE3)는 lac UV5 프로모터의 조절을 받는 T7 RNA 중합효소(polymerase) 유전자가 염색체에 존재하기 때문에 IPTG(Isopropyl thio-β-D-galactoside)를 첨가하면 lac UV5 프로모터로부터 T7 RNA 중합효소가 합성되고, 이 중합효소에 의해 T7 프로모터로부터 파이타아제 효소가 합성되어, 결과적으로 IPTG에 의해 파이타아제 발현이 유도된다.

상기 재조합 파이타아제의 활성을 조사하기 위하여 상기 재조합 대장균 형질전환체를 배양하여 균체를 회수한 다음 파쇄하여 그 상등액으로부터 재조합 파이타아제를 분리하고 에탄올과 황산암모늄을 조합한 방법으로 정제하였다. 파이트산 나트륨을 기질로 하여 반응시킨 후 인산의 양을 측정하는 방법으로 수행하였는데 그 결과 신규 재조합 파이타아제 효소는 단백질 ㎎당 1.2 단위의 효소역가를 가지는 것으로 나타났다. 또한, 상기 파이타아제의 최적 활성 조건은 온도에 있어서는 45℃ 내지 60℃, pH에 있어서는 pH 6 내지 9로 나타났다.

본 발명에서 제공하는 신규 재조합 파이타아제는 가축의 사료내에 존재하는 파이트산을 가수분해시켜 인의 체내 이용성을 높이는데 이용되므로 사료에 첨가시켜 사료조성물을 제조하는데 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 파이타아제 유전자의 클로닝.

Genbank 데이터베이스에서 바실러스속 파이타아제 유전자 염기배열을 검색한 다음, 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 이용하여 파이타아제를 증폭하기 위하여, 아미노산 말단에 존재하는 신호서열(signal sequence)이 제외되도록 디자인한 두 개의 상보적 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다. 순방향 시발체로서서열번호 3의 염기서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오타이드를, 역방향 시발체로서서열번호 4의 염기서열을 갖는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하였고, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(KCTC1660)의 상염색체(chromosome) DNA를 준비하여 주형으로 사용하였다. Taq DNA 중합효소(TaKaRa) 1.25 단위(unit), 10× 완충용액 2.5 ㎕, 2.5 mM dNTP 2 ㎕, 100 pM 프라이머 0.25 ㎕ 및 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 게놈 DNA (Genomic DNA) 500 ng이 포함된 시료를 가지고 95℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분의 조건으로 30회 반복하여 PCR을 수행하고, 이후 92℃에서 1분, 72℃에서 10분조건에서 반응을 완결하였다. PCR 후 시료 분석을 위해 0.8% TAE(0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA)아가로즈 젤에 전기영동하였으며, 그 결과 약 1.1 kb의 유전자가 증폭되었음을 확인하였다(도 2 참조).

<실시예 2> 파이타아제 유전자의 발현벡터로의 삽입

실시예 1의 방법으로 얻은 PCR 산물인 파이타아제 유전자를 제한효소 Nde Ⅰ과 Hind Ⅲ로 절단한 다음, 동일한 효소로 절단하여 준비한 pET-22b(+)(Novagen)에 삽입시킨 후, 이 발현벡터를 이용하여 대장균 BL21(DE3)를 형질전환시켰다.

삽입된 유전자의 위치와 발현벡터의 제한효소 지도는 도 1에 나타내었으며, 상기 발현벡터는 pET-Bph로 명명하였다. 상기 대장균 균주 E. Coli BL21(DE3)/ pET22b(+)-Bph는 2000년 1월 15일에 수탁번호 KCTC 8985P로 기탁되었다.

<실시예 3> 파이타아제 유전자의 염기서열 분석 및 상동성 비교

실시예 2의 형질전환체를 배양하여 얻은 발현벡터를 염기서열 분석을 위해 사용하였다. 서열분석을 위한 시발체로는 파이타아제 유전자 내부에 존재하는 염기서열을 가진 시발체를 합성하여 사용하였으며, 기초과학연구소의 자동서열분석기(automatic sequencer)를 사용하여 DNA 염기서열을 분석하였다.

그 결과 1.1 Kb의 크기를 가지는 파이타아제 유전자에 시작 코돈 ATG로부터 종결 코돈 TAA로 종결되는 1065 bp 크기의 ORF(Open Reading Frame)가 존재함을 확인하였고, 상기 ORF는 아미노말단의 신호서열(Signal peptide) 중 29개 아미노산이 제거된 354개 아미노산들로 구성된 38,953 Da의 분자량을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하고 있음을 확인하였다.

분석된 염기서열을 Genbank 데이터베이스와 비교 분석한 결과, 도 3a, 3b및 3c에서 보듯이 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(KCTC1660) 유래의 파이타아제는 공지의 바실러스속 DS11에서 분리된 특허 1996-006817의 파이타아제(Kim 등,FEMS Microbiol. Lett.162, 185 - 191, 1998)와 염기서열에서 92%의 상동성을 나타내고, 바실러스 썹틸리스(B. subtilis)에서 분리한 WO 98/06856의 파이타아제 (Kerovuo 등,Appl. Environ. Microbiol.64, 2079 - 2085, 1998)와는 51번째 아미노산이 Ser → Leu으로 치환되었음을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 신규 파이타아제의 생산 및 정제

신규 파이타아제를 생산하기 위하여 pH 7의 LB 배지를 121 ℃에서 15분간 멸균한 후 엠피실린(Ampicillin)을 100 ㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. 같은 조성의 배지로 미리 37 ℃에서 15시간 동안 플라스크에서 배양한 종배양액을 3 % (v/v)가 되도록 접종한 다음 30 ℃에서 배양하였다.

배양액이 지수적 성장 단계 중 OD₆₀₀0.8 정도에 도달하였을 때 유전자 발현의 유도(induction)를 위하여 IPTG(Isopropyl β-D-Thiogalactopyranoside)를 1.5 mM로 첨가한 다음 4시간 동안 배양을 계속하였다. 배양이 끝난 배양액을 원심분리하여 세포들을 회수하고 이를 초음파로 분쇄하여 세포추출물(cell lysate)을 수득하였다. 상기 세포추출물을 다시 원심분리하여 침전된 세포잔여물을 제거하고 상등액(supernatant)만을 효소활성 분석을 위하여 사용하였다.

<실시예 5> 신규 재조합 파이타아제의 효소활성 분석.

파이타아제는 일반적으로 사용되는 이온교환수지(ion exchange resin) 또는 젤 여과방법과 같은 크로마토그래피를 이용한 정제에 매우 민감하므로 에탄올(ethanol)과 황산암모늄(Ammonium sulfate)을 조합한 정제방법을 사용하여 정제하였다. 정제과정 중에서의 효소 활성의 상실을 방지하기 위하여 모든 정제 단계에 사용되는 용액에 염화칼슘(CaCl₂)을 최종농도 1 mM로 첨가하였다. 형질전환된 대장균 BL21(DE3)로부터 정제된 파이타아제의 크기는 SDS-PAGE 분석을 통하여 39 kDa이고, 등전점(pI)은 6.5임을 확인하였다.

생산된 효소의 역가 측정은 1 mM의 염화칼슘(CaCl₂)이 첨가된 100 mM의 Tris 완충액(pH 7.0)상에서 2 mM의 파이트산나트륨염을 기질로 하여 37 ℃에서 30 분간 반응한 후 생성된 인산의 양을 측정하는 방법으로 수행하였고, 이때 효소의 역가는 1 분당 1μM의 무기인을 분해하는 효소량을 1 단위(unit)로 하였다. 측정 결과 신규 효소는 단백질 ㎎ 당 1.2 단위의 효소 역가를 가짐을 확인하였다.

<실시예 6> 신규 파이타아제의 열에 대한 안정성 및 최적활성 온도 결정

본 발명의 유전자가 형질전환된 재조합 대장균 BL21(DE3)로 부터 정제된 상기 파이타아제를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 온도에 따른 효소 활성의 변화를 분석한 결과 도 4에서 보듯이 45℃ 내지 60℃ 사이에서 활성을 나타내었으며 최적활성 온도는 55 ℃임을 확인하였다.

온도에 따른 효소활성

온도(℃)	상대적 효소활성(%)
35	70
45	95
55	100
65	40
75	20

<실시예 7> 신규 파이타아제의 최적 pH 결정

상기 실시예 5와 동일한 방법으로 pH 변화에 따른 효소 활성의 변화를 37 ℃에서 측정하였다. 도 5에서 보듯이 상기 파이타아제 효소가 활성을 나타내는 pH는 약 pH 6 내지 9였으며 최적 활성 pH는 7.5 임을 확인하였다.

pH에 따른 효소활성

pH	상대적 효소활성(%)
3	0
5.3	60
6.5	90
7.3	100
8.3	90

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 유래의 신규 파이타아제는 단위가축 사료내 인의 체내 이용성을 높여 배설되는 인의 양을 감소시킴으로써 환경오염을 경감시키고, 사료에 부가적으로 첨가되는 인산의 양을 감소시키는데 효과적으로 이용될 수 있다.

Claims (6)

1. 서열번호 2의 염기서열을 갖는 파이타아제 유전자를 pET-22b(+)의 외래 유전자 삽입부위에 삽입하여 얻어진 pET-Bph 발현벡터를 E. Coli BL 21 (DE3)에 형질전환시켜 얻어진 대장균 형질전환체 (기탁번호 KCTC 8985P).
2. 제1항에 따른 대장균 형질전환체를 배양하여 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 파이타아제를 얻고,

   얻어진 파이타아제를 사료조성물에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 형질 전환체를 이용하여 사료 조성물의 제조방법.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제