KR100754242B1

KR100754242B1 - 효모 유래 프로모터를 이용한 대장균 유래 파이타제의제조방법

Info

Publication number: KR100754242B1
Application number: KR1020050079504A
Authority: KR
Inventors: 이찬호; 조원탁; 정준기; 최의성; 장형욱; 안정오
Original assignee: (주)진바이오텍
Priority date: 2005-08-29
Filing date: 2005-08-29
Publication date: 2007-09-03
Also published as: KR20070027097A

Abstract

본 발명은 효모 유래 프로모터를 이용한 대장균 유래 파이타제의 제조방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열이 효모 유래 프로모터를 포함한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터, 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균 그리고, (1) 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 단계; (2) 상기 핵산 서열을 효모 유래의 프로모터를 포함한 조절서열에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (3) 상기 재조합 발현 벡터로 대장균 숙주 세포주를 형질전환하는 단계; (4) 상기 형질전환된 대장균 숙주 세포주를 배양하여 파이타제가 발현되도록 하는 단계; (5) 배양물로부터 대장균 유래 파이타제를 분리 · 정제하는 단계를 포함하는 대장균 유래 파이타제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

효모 유래 프로모터, 대장균 유래 파이타제

Description

효모 유래 프로모터를 이용한 대장균 유래 파이타제의 제조방법{ Method for Preparing Escherichia coli Phytase Using Promoter Derived from Yeast}

도 1은 본 발명의 비교 실시예에 해당하는 파이타제 코딩 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 pET-appA를 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 해당하는 파이타제 코딩 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 pEPGAL-appA를 나타낸 것이다.

도 3은 pET-appA와 pEPGAL-appA로 각각 형질전환된 대장균으로부터 생산된 파이타제의 활성을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명의 재조합 발현 벡터 pEPGAL-appA로 형질전환된 대장균을 5L 발효조에서 유가식 배양하고 시간별로 균체량, 파이타제 활성 및 포도당의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(○: 균체량, ■: 총 파이타제 활성, □: 분비된 파이타제 활성, ●: 포도당의 농도).

도 5는 본 발명의 재조합 발현 벡터 pEPGAL-appA로 형질전환된 대장균을 300L 발효조에서 유가식 배양하고 시간별로 균체량, 파이타제 활성 및 포도당의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다(○: 균체량, ■: 총 파이타제 활성, □: 분비된 파이타제 활성, ●: 포도당의 농도).

본 발명은 파이타제의 제조방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 효모 유래의 프로모터에 작동가능하게 연결시켜 만든 재조합 발현 벡터를 대장균으로 형질전환시키고 상기 대장균을 배양하여 파이타제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

파이타제(phytase)는 1907년 미강에서 발견된(Suzuki et al. Bull. Coll. Agr. 1907, vol.7, p.495) 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 미생물이다(Dox & Golden, J. Biological Chemistry, 1911, vol.10, p.183). 파이타제는 파이테이트(phytate) 형태로 존재하는 파이테이트 인(phytate phosphorous)을 무기 인으로 가수분해시키는 효소를 말한다. 즉, 미오-이노시톨 헥사키스포스페이트(myo-inositol hexakisphosphate)를 가수분해하여 오르소포스페이트(orthophosphate), 미오이노시톨(myo-inositol)과 무기 에스테르(inorganic esters)를 생산할 수 있는 에스테라제(esterase)이다. 자연 상태에서 파이타제는 대부분 식물의 종자내에 존재하며, 식물에서 얻은 파이타제를 처리할 경우 파이테이트 인은 옥수수, 콩가루와 밀기물의 혼합체에서 81%가 감소된다는 보고가 있었지만, 사료를 가공하는 동안 pH와 온도에 의해 파이타제가 불활성화된다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점은 미생물로부터 생산된 파이타제를 이용할 경우 개선될 수 있다고 알려져 있다.

파이타제는 최적 작용 pH에 따라 산성 파이타제(acid phytase)와 알칼리성 파이타제(alkaline phytase)로 구분된다. 지금까지 히스티딘 산 포스파타제 (hisitidine acid phosphatase)로 알려진 대부분의 효소들이 산성 파이타제와 동일한 효소기작을 갖는 것으로 밝혀지면서 파이타제 효소그룹에 포함되었다. 산성 파이타제는 다시 그 작용기작에 따라 3-phytase (EC. 3.1.3.8)와 6-phytase (EC 3.1.3.26) 두 종류로 나누어지는데 이는 파이타제가 파이테이트의 인산 그룹 중 처음으로 분해하는 인의 위치에 의한 분류로 각각 미생물과 식물에서 주로 존재하는 것으로 보고되었다. 이들 산성 파이타제 유전자가 암호화하고 있는 아미노산 서열에 따르면 대부분의 파이타제 단백질의 N-말단 부위에는 RHGXRXP 활성 부위 모티브를 함유하고 있다.

파이타제는 환경적인 측면과 동물의 영양적인 측면에서 그 응용범위가 확대되어 국내외 여러 기업에서 대량 생산할 수 있는 기술을 개발해 왔다. 이미 곰팡이 유래의 파이타제가 연구 개발되어 세계적으로 시판되고 있다. 네덜란드 Gist-Brocades사와 그 제휴회사인 독일의 BASF사는 아스퍼질러스로부터 유래한 파이타제 유전자를 A. niger 균주의 플루거그 시스템(PluGug system)에 도입하여 파이타제 고발현 균주를 개발하였으며, 이를 1985년부터 시판하였다. 1994년에는 유럽에서 허가를 획득하였으며, "Natuphos"라는 상품명으로 독일, 네덜란드, 오스트리아, 스위스, 노르웨이, 불가리아, 브라질, 캐나다, 대만, 우리나라에서 현재 시판하고 있다. 또한, 세계적인 효소생산업체인 Novo Nordisk는 페니노포라 리키(Peninophora lycii) 유래 파이타제 유전자를 고발현하는 재조합 A. niger 균주를 개발하였으며, "Phytase Novo"라는 상품명으로 시판되고 있다. 또한, 핀란드의 Alko사는 A. niger의 파이타제와 산성 파이타제를 섞어서 "Finnase"와 "Econase"로 시판하고 있 다. 근래에는 곰팡이 발효 시의 여러 문제점 때문에 재조합 단백질의 고발현 균주로 각광받고 있는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 한세눌라 폴리모르파(Hasenula polymorpha) 균주를 이용한 파이타제 생산 기술 개발도 진행되고 있다.

또한, 알칼리성 파이타제로 알려진 그램 음성 박테리아(예: Bacillus subtilis, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens 등) 유래의 파이타제에 대해서도 연구개발이 이루어져 왔다. 특히, 국내 기업인 대성미생물에서는 B. amyloliquefaciens DS11 유래의 파이타제 유전자를 T7 프로모터를 이용하여 대장균에서 고농도로 생산하는 공정을 개발하였다(과학기술부 연구보고서, BSHS1580-98029-3(1998)).

최근에는 대장균 유래의 파이타제의 연구가 많이 이루어지고 있는데, 그 이유는 지금까지 알려진 파이타제 중에서 가장 높은 파이타제의 활성(Specific Activity: 600-800U/mg)을 나타내기 때문이다. 또한, 시판되고 있는 아스퍼질러스 유래의 파이타제보다 최적 활성을 나타내는 pH가 더욱 산성이어서 가축동물의 위에서 더 효과적으로 작용할 수 있다고 알려져 있다(Rodriguez et al. Biochemical and Biophysical Research Communication, 1999, vol.257, pp.117-123, Choi et al. Korean J. Microbiology Biotechnology, 2002, vol.30(1), pp.1-7 ).

대장균 유래의 파이타제 유전자는 1,298개의 염기서열을 갖는 페리플라즈믹 포스포안하이드리드 포스포하이드롤라제 (periplasmic phosphoanhydrid phosphohydrolase) 유전자이다(Genebank accession number:M88708). 상기 유전자(appA)는 원래 대장균의 산성 포스파타제 단백질(EcAP, 적정 pH 2.5)을 코딩하는 것으로 발견되었으며, 분자량은 44,644kDa으로 알려져 있다(Dassa et al. J. Bacteriology, 1990, vol.172, pp.5497-5500). appA의 구조는 Lim의 연구팀에서 밝혔으며, 전체적인 구조는 히스티딘 산 포스파타제의 구조를 갖고 있으며, 3개의 디설파이드 결합을 형성하고 있다(Lim et al. Nature structural biology, 2000, vol.7(2), pp.108-113). 그리고, appA는 야생형 대장균에서는 혐기성 조건하의 정상기(stationary phase)에서 많이 발현된다고 알려져 왔지만, 극히 적은 양의 효소가 생산되기 때문에 최근에는 유전자 재조합 기술을 사용하여 다양한 숙주세포에서 생산하는 기술이 시도되고 있다.

구체적으로 Golovan et al.은 appA를 강력한 T7 프로모터를 이용하고 대장균 BL21(DE3)의 유가식 배양을 통하여 약 600U/ml까지 생산하였다(Golvovan et al, 1999, Canadian J. Microbiology, 2000, vol.46, pp.59-71). Golovan et al.에서는 자신들이 생산한 appA의 파이타제 활성이 3,165U/mg로 보고하였지만 많은 문헌에서는 appA의 파이타제 활성은 600-800U/mg에 불과하다고 보고하고 있으며, 실제 생산된 파이타제의 양도 600U/ml 이하일 것으로 추정된다. Miksch 연구팀은 B. amyloiquefaciens의 β-glucanase를 조절하는 bglA의 프로모터와 균주 밖으로의 appA의 분비를 위한 kil 단백질을 사용하는 유가식 배양으로 appA를 약 60U/ml정도까지 생산하였다(Miksch et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, vol.59, pp.685-694). 대한민국특허출원 제 2000-7014601호에는 피키아 파스토리스에서 AOX 프로모터를 이용하는 유가식 배양을 통하여 약 200U/ml의 appA를 생산한 기술이 개시되어 있다. 대한민국특허출원 제 2002-7025970호는 appA 야생형 유 전자와 활성 및 내열성이 향상된 appA의 유전자를 개시하고 있다.

상술한 바와 같이 파이타제 활성이 높은 대장균 유래의 파이타제를 재조합 대장균으로부터 생산할 경우에는 대장균에서 불용체를 형성하기 때문에 활성을 갖는 파이타제를 생산하기가 어렵다. 또한, 효모를 이용하여 파이타제를 생산할 경우에도 발현율과 분비율이 낮아서 상당히 적은 양의 파이타제가 수득 가능함을 확인할 수 있다.

본 발명자들은 상술한 문제점을 해결하고자 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 효모 유래 프로모터에 작동가능하게 연결시켜 만든 재조합 발현 벡터를 대장균으로 형질전환시키고 상기 대장균을 배양시킨 결과, 파이타제의 발현양이 증가함은 물론 상기 파이타제의 활성이 높은 것을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 한 관점으로 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열이 효모 유래의 프로모터를 포함한 조절서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터를 제공한다.

다른 관점으로 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또 다른 관점으로 (1) 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 단계; (2) 상기 핵산 서열을 효모 유래의 프로모터를 포함한 조절서열에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (3) 상기 재조합 발현 벡터로 대장균 숙주 세포주를 형질전환하는 단계; (4) 상기 형질전환된 대장균 숙주 세포 주를 배양하여 파이타제가 발현되도록 하는 단계; (5) 배양물로부터 대장균 유래 파이타제를 분리 · 정제하는 단계를 포함하는 대장균 유래 파이타제의 제조방법을 제공한다.

"대장균 유래 파이타제"는 천연적으로 대장균내에 존재하는 파이타제의 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 동일한 아미노산 서열을 가지되, 당업계에 공지된 파이타제 활성을 보유하고 있는 대장균 유래 파이타제를 의미하는 것이다. 일반적으로 대장균 유래 파이타제는 다른 유기체에서 유래된 파이타제보다 파이타제의 활성이 높은 것으로 알려져 있다.

"효모 유래 프로모터"는 천연적으로 효모내에 존재하는 임의의 프로모터를 의미하는 것으로 효모 알파-메이팅 시스템(α-mating system)의 프로모터, 효모 트리오스 포스파타아제 이소머라제(triose phosphatase isomerase; TPI)의 프로모터, 효모의 해당과정에 관여하는 유전자들(glycolytic genes) 또는 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase) 유전자의 프로모터, 효모의 갈락토오스 대사에 관여하는 효소들(예를 들면, galactose kinase, GAL1 및 uridine diphosphoglucose 4-epimerase, GAL10)을 코딩하는 유전자의 프로모터, GADPH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), MOX(methanol oxidase), AOX(alcohol oxidase)의 프로모터 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “발현 조절 서열 (expression control sequence)”은 대장균 유래의 파이타제를 코딩하는 핵산 서열의 발현에 필수적인 또는 이로운 핵산 서열들을 말한다. 각각의 조절 서열은 파이타제를 코딩하는 핵산 서열에 천연적(native) 또는 외래적(foreign)일 수 있다. 그러한 조절 서열에는 이에 제한되는 것은 아니지만, 분비 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드(propeptide) 서열, 프로모터, 인핸서(enhancer) 또는 업스트림(upstream) 활성화 서열, 시그날 펩타이드 서열 및 전사 종결인자 등을 포함한다. 최소한 상기 조절 서열은 효모 유래의 프로모터를 포함한다.

본 발명에서 용어 "분비 서열(모티브 서열 또는 리더 서열)은 세포내에서 발현된 단백질이 세포막 밖으로 수송되도록 유도하는 아미노산 서열을 말한다. 일반적으로 세포막 밖으로 수송되는 표면 단백질 또는 분비 단백질은 세포막에서 분비 서열 펩티다제(signal peptidase)에 의해 절단되는 N-말단 서열을 구비하고 있다. 본 발명에서는 대장균에서 작용하는 임의의 분비 서열을 이용할 수 있으며, 예를 들면 알파-인자 분비 서열(α-factor signal sequence), 킬러 톡신 리더 분비 서열(killer toxin leader signal sequence), 인버타제 분비 서열(invertase signal sequence), 알파-아밀라아제 분비 서열(α-amylase signal sequence) 등이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 사용된 용어 “작동가능하게 연결된(operably linked)”이란 한 핵산 서열이 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치된 상태를 의미한다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 서열이 성숙한 단백질의 분비에 참여함 으로써 기능을 발휘했다면 그 단백질에 작동가능하게 연결된 것이다. 프로모터가 코딩 서열의 전사를 조절했다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 리보좀 결합 자리가 코딩 서열의 해독이 가능한 위치에 놓여져 있다면 그 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 서열의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 이들 서열의 연결은 적합한 제한 효소 부위에서 리게이션(ligation)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고 뉴클레오타이드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 외래 유전자를 숙주세포내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주세포 내로 유입될 수 있어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여야 한다.

본 발명에서 용어 "재조합 발현 벡터"는 일반적으로 외래 유전자가 숙주세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동가능하게 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 재조합 발현 벡터는 수 개의 카피(copy) 및 그의 삽입된 이종의 DNA가 생성될 수 있다. 당업계에 주지된 바와 같이 숙주세포에서 형질감염된 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주세포 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자를 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.

본 발명에 따른 대장균 유래의 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 발현시키기 위해서는 대장균에서 작용할 수 있는 임의의 발현 벡터가 이용될 수 있으며, 이들은 상업적으로 입수하거나 당업계에 공지된 방법에 따라 제조할 수도 있다. 구체적으로는 대장균에서 유래된 플라스미드 벡터 및 대장균 파지에서 유래된 게놈 벡터 뿐만 아니라 원핵생물(prokaryotic cell)에서 유래된 다양한 플라스미드 및 게놈이 이용될 수 있다. 보다 바람직하게는 대장균에서 유래된 플라스미드 벡터를 이용하는 것이며, 그러한 플라스미드 벡터에는 pBAD, pET, pGEX, pMal, pProEx, pQE, pRSET 및 pTrcHis 및 이들의 유도체 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 대장균 유래의 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 발현시키기 위해서는 공지된 대장균 숙주 세포주들이 이용될 수 있다. 그러한 대장균 숙주 세포주에는 Top10, LMG194, BL21, BL21(DE3), TB1, DH10B, M15, M15[pREP4], BL21(DE3)pLysS 등이 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 대장균 숙주 세포주들은 상업적으로 입수할 수 있다.

본 발명에 따른 대장균 유래의 파이타제를 코딩하는 핵산 서열의 발현 수준을 높이기 위해서는 적합한 발현 벡터 및 대장균 숙주 세포주의 조합을 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 조합은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 다음과 같다(표 1 참조).

발현 벡터와 대장균 숙주 세포주의 조합

발현 벡터	대장균 숙주 세포주
pBAD 벡터	Top10, LMG194
pET 벡터	BL21(DE3)
pGEX 벡터	BL21
pMal 벡터	BL21, TB1
pPRo 벡터	BL21, DH10B
pQE 벡터	M15 또는 M15[pREP4]
pPSET 벡터	BL21(DE3)pLysS
pTrcHis 벡터	BL21

본 발명에서 대장균 유래의 파이타제는 (1) 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 단계; (2) 상기 핵산 서열을 효모 유래의 프로모터를 포함한 조절서열에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; (3) 상기 재조합 발현 벡터로 대장균 숙주 세포주를 형질전환하는 단계; (4) 상기 형질전환된 대장균 숙주 세포주를 배양하여 파이타제가 발현되도록 하는 단계; (5) 배양물로부터 대장균 유래 파이타제를 분리 · 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열은 한 양태로서 올리고뉴클레오티드 합성기 등을 사용하는 화학적 방법에 의해서 합성할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 목적하는 단백질의 아미노산 서열을 기초로 하여, 단백질이 생산되는 숙주세포에서 이용되는 코돈을 선택함으로써 제조할 수 있다. 다른 양태로서 대장균의 게놈 DNA를 주형으로 하고 파이타제를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 제조할 수 있다.

이렇게 제조된 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열이 효모 유래의 프로모터를 포함한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 재조합 발현 벡터는 기본적인 재조합 DNA 기술을 사용해서 제조될 수 있다. 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열과 프로모터를 포함한 조절 서열은 특정한 순서(order)와 방향(orientation)을 고려하여 작동가능하도록 연결하여야 한다. 구체적으로 재조합 발현 벡터를 제조하는 방법을 예를 들면 다음과 같다.

DNA는 적절한 완충용액 내에서 특정한 제한 효소를 사용하여 절단될 수 있다. 일반적으로 약 0.2-1㎍의 플라스미드 혹은 DNA 단편은 약 20㎕의 완충용액에 해당 제한 효소 약 1-2 단위(unit)와 함께 사용된다. 적절한 완충용액, DNA 농도, 정치 시간과 온도는 제한 효소의 제조업체에 의해서 특정될 수 있다. 일반적으로, 약 37℃에서 약 1-2 시간 정도 정치시키는 것이 적당하지만 일부 효소들은 더 높은 온도를 필요로 한다. 정치 후에, 효소와 다른 불순물들은 페놀과 클로로포름 등의 유기용매의 혼합물로 상기 소화용액을 추출함에 의해서 제거되어지고, DNA는 알코올로 침전시켜 수용액 층으로부터 회수할 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 정제 키트를 사용하는 것이 보다 바람직할 것이다. 이때 DNA 단편들이 기능성 벡터를 형성할 수 있도록 연결되기 위해서는 DNA 단편의 말단이 서로 상용성이 있어야 한다.

절단된 DNA 단편들은 전기영동(electrophoresis)을 이용해서 크기별로 분류되고 선택된다. DNA는 아가로스나 폴리아크릴아미드 매트릭스(matrix)를 통해서 전기영동될 수 있다. 매트릭스의 선택은 분리될 DNA 단편의 크기에 따라 결정된다. 전기영동 후에, DNA는 전기용출(electroelution)에 의해 매트릭스로부터 추출되거나 저용융 아가로스가 사용되어졌다면 아가로스를 용융시키고 그로부터 DNA를 추출한다.

연결되어야 할 DNA 단편들은 동일한 몰 양으로 용액에 첨가시키는 것이 바람직하다. 상기 용액은 통상적으로 ATP, 리가제(ligase) 완충용액, DNA 0.5㎍당 약 10 단위의 T4 리가제(ligase) 같은 리가제를 포함하고 있다. DNA 단편이 벡터에 연결되려면, 벡터는 적합한 제한효소에 의해서 절단되어 선형화된 다음 알칼리성 인산 가수분해 효소 또는 소 내장의 가수분해 효소로 처리하면 된다. 이러한 인산 가수분해 효소 처리는 리게이션 단계 동안에 벡터의 자가 리게이션(self-ligation)을 방지한다. 이상과 같은 방법을 통해서 수득한 재조합 발현 벡터는 대장균 숙주 세포주를 형질전환시키는데 사용된다.

형질전환은 Davis et al. Basic Methods in Molecular Biology 및 Sambrook et al. Basic Methods in Molecular Biology와 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해서 실시될 수 있다. 본 발명에 따른 대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 대장균 숙주 세포주로 도입하기 위해서는 먼저 대장균 세포막을 수용성(competent)으로 만들어야 한다. 이러한 방법은 대장균 세포를 염화 칼슘(CaCl₂) 용액 또는 폴리에틴렌 글리콜(polyethylene glycol)과 염화 마그네슘(MgCl₂)의 혼합 용액에 노출시키는 과정을 포함한다. 이러한 화합물들은 DNA와 복합체를 형성하여 세포내로 DNA의 유입을 용이하게 해준다. 또한 대장균 세포막은 전기천공에 의해서도 수용성이 될 수 있는데, 상기 전기 전류는 DNA가 세포내로 유입되도록 세포막을 파열시키는 역할을 한다.

본 발명에서 상기 형질전환된 숙주 세포들은 공지된 기술을 이용해서 대장균 유래 파이타제의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양될 수 있다. 예를 들어, 세포들은 적합한 배지와 파이타제의 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 혹은 대규모 발효, 셰이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 수행한다. 적당한 배지는 상업적으로 입수하거나 문헌(예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그)에 공지된 바에 따라 제조할 수도 있다. 본 발명에 따른 대장균 유래 파이타제는 배지로부터 또는 세포의 여액(lysate)으로부터 분리될 수 있다.

본 발명에 따른 대장균 숙주 세포주에서 생산된 파이타제는 당업계에 공지된 단백질 분리 방법에 의해서 분리될 수 있다. 예를 들어서, 파이타제는 이에 제한되는 것은 아니지만, 원심분리, 여과, 추출, 분무 건조, 증발, 또는 침전을 포함하는 전통적인 방법에 의해서 영양 배지로부터 분리될 수 있다. 더 나아가 폴리펩타이드는 크로마토그래피(예, 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기별 배제), 전기영동, 분별용해도(예, 암모늄 설페이트 침전), SDS-PAGE 또는 추출을 포함하여 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해서 정제될 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1>

대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열의 제조

대장균 유래의 파이타제 유전자는 Novagen사로부터 구입한 대장균(Escherichia coli, BL21)의 게놈 DNA를 분리한 다음, 이렇게 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 공지된 파이타제 유전자의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 1 및 서열번호 2; 각각 제한효소 NdeI과 HindIII의 인식부위가 포함되어 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 파이타제를 코딩하는 핵산 서열을 증폭하였다. 이렇게 증폭된 핵산 서열은 대장균 유래 파이타제의 분비 서열과 파이타제를 코딩하는 서열을 포함한다.

이 때, PCR은 최종부피가 50㎕가 되도록 20pmol 프라이머, 2.5mM의 dNTP 혼합물, 100ng의 파이타제를 코딩하는 핵산 서열, 5㎕의 10 x PCR 완충용액(Solgent Co.), 2.5 단위의 Taq DNA 폴리머라제를 혼합한 후 상기 혼합액을 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 재결합, 72℃에서 45초간 신장 과정을 34회 반복하고 추가로 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에서 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다.

<실시예 2>

pET-appA의 제조

상기 실시예 1에서 증폭된 파이타제 유전자를 대장균의 재조합 발현 벡터인 pET-22(b)+(Novagen, USA)에 결합시키기 위하여, 파이타제 유전자와 pET-22(b)+를 각각 제한효소 NdeI과 HindIII로 처리한 다음 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다. 이어서, 상기 제한효소로 처리된 파이타제 유전자의 PCR 산물과 발현 벡터 pET-22(b)+를 리가제(ligase)로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터를 pET-appA라고 명명하였다(도 1 참조).

<실시예3>

pEPGAL-appA의 제조

사카로마이세스 세레비제(S. cerevisiae) 유래의 GAL10 프로모터에 의해 파이타제 유전자의 발현을 조절시키기 위하여, 파이타제 유전자를 GAL10 프로모터가 포함된 재조합 발현 벡터인 pYEGA-AM(Ahn et al. J. Microbiol.Biotech. 2003, vol.13(3), pp.451-456)에 연결하였다.

우선, 실시예 2에 따른 pET-appA를 주형으로 공지된 파이타제 유전자를 코딩하는 DNA 서열의 말단에 상보적인 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3 및 서열번호 4; 각각 제한효소 EcoRI과 HindIII의 인식부위가 포함되어 있음)를 프라이머로 이용하는 PCR을 수행하여 파이타제를 코딩하는 유전자를 증폭하였다.

이 때, PCR은 최종부피가 50㎕가 되도록 20pmol 프라이머, 2.5mM의 dNTP 혼합물, 100ng의 플라스미드 DNA, 5㎕의 10 x PCR 완충용액(Solgent Co.), 2.5 unit의 Taq DNA 폴리머라제를 혼합한 다음 상기 혼합액을 94℃에서 10분간 변성, 94℃에서 1분간 변성, 55℃에서 45초간 재결합, 72℃에서 45초간 신장 과정을 34회 반복하고 추가로 72℃에서 10분간 확장한 다음 반응을 종료하였다. 이렇게 증폭된 PCR 산물은 0.8% 아가로스 젤[agarose gel (BMA, USA)]에서 전기 영동한 후, 큐어엑스 투 젤 추출 키트[Qiaex Ⅱ gel extraction kit (Qiagen, USA)]를 이용하여 분리하였다.

이어서, 상기 PCR 산물과 재조합 발현 벡터인 pYEGA-AM을 각각 제한효소

EcoRI과 HindIII로 처리한 다음 큐어엑스 투 젤 추출 키트를 이용하여 분리하였다. 이어서, 상기 제한효소로 처리된 파이타제 유전자의 PCR 산물과 발현 벡터 pYEGA-AM을 리가제(ligase)로 결합시켰다. 이때 생성된 재조합 발현 벡터를 pEPGAL-appA라고 명명하였다(도 2 참조).

<실시예 4>

형질전환된 대장균의 제조

숙주 세포로는 당업계에서 파이타제 유전자를 가장 안정적으로 발현하는 균주로 알려져 있는 대장균 BL21(DE3)을 이용하였다(Miksch et al. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, vol.59, pp.685-694). 상기 균주에 T7 프로모터를 이용하는 실시예 2에서 제조한 재조합 발현 벡터 pET-appA와 효모 유래 GAL10 프로모터를 이용하는 실시예 3에서 제조한 재조합 발현 벡터 pEPGAL-appA를 각각 전기천공 방법을 사용하여 형질전환하였다.

<실시예5>

pET-appA 및 pEPGAL-appA로 각각 형질전환된 대장균으로부터의 파이타제 발현양 비교

실시예 4에서와 같이 pET-appA와 pEPGAL-appA로 각각 형질전환된 균주를 파이타제 할로 플라이트(phytase halo plate; 글루코오스 10g/l, NH₃NO₃ 5g/l, Na-파이타제 5g/l, MgSO₄ 1g/l, FeSO₄ 0.02g/l, CaCl₂ 10mM)에 도말하여 37℃에서 배양한 후 형성된 콜로니 부위에 투명환이 생기는 균주를 각각 파이타제 활성이 우수한 균주로서 선별하였다. 선별된 균주를 LB/Amp(트립톤 펩톤 10g/l, 효모 추출물 5g/l, NaCl 10g/l, 암피실린 100㎍/l)를 함유하는 배지를 이용하여 250ml 플라스크 배양을 통하여 배양해서 파이타제의 발현 양상을 비교 분석하였다.

구체적으로 pET-appA로 형질전환된 균주인 경우는 유도(induction)를 위하여 균체농도가 1 O.D.일 때에 IPTG 0.1mM을 배양액 내에 첨가하여 파이타제 유전자의 발현을 유도하였다. 이어서, 균체를 초음파(sonication) 처리하여 용균(lysis)시키고 원심분리한 후 상등액을 Fiske등의 방법을 이용하여 무기인의 양을 측정함으로써 파이타제 활성을 확인하였다. 즉, 일정비율로 희석한 100㎕의 발효액에 400㎕의 기질 용액(2 mM sodium phytate in 0.1 M Sodium acetate buffer, pH 5.0 containing 2 mM CaCl₂)을 넣고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 500㎕의 5% TCA 용액을 가하고 0℃에서 10분간 방치하여 반응을 정지시켰다. 이어서, 4ml의 시약 A 용액을 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 820nm에서 효소반응용액과 블랭크(blank)의 흡광도 차이를 통하여 파이테이트인에서 유리된 무기인의 양을 측정하였다. 이 때, 효소의 1 단위는 1 분 동안에 1μmol의 무기인을 방출시키는 효소의 양으로 정의하였다.

pET-appA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)는 고농도로 파이타제를 발현하였지만, 이들 중 90% 이상이 활성이 없는 불용체(inclusion body)를 형성하였고, pEPGAL-appA을 도입한 대장균 BL21(DE3)의 경우는 상대적으로 적은 양의 파이타제를 발현하였지만, 파이타제의 활성은 pET-appA로 형질전환된 대장균 BL21(DE3)에 비하여 약 20배 이상 증가하였다(도 3 참조). 이러한 결과는 appA에는 디설파이드 결합이 3개 이상 존재하기 때문에 대장균 내의 페리플라즘(periplasm)으로 전좌(translocation)되어야 비로소 정확한 단백질 접힘이 이루어져 활성을 갖는 효소가 형성되기 때문이라고 해석될 수 있다. 상기 결과를 통하여 활성을 가진 appA의 효과적인 발현을 위해서는 강력한 프로모터인 T7 프로모터보다는 비교적 약한 효모 유래의 GAL10 프로모터가 적합한 것을 알 수가 있었다.

<실시예 6>

pEPGAL-appA로 형질전환된 대장균의 유가식 배양

파이타제를 대량으로 생산하기 위하여 실시예 4에서 제조된 pEPGAL-appA으로 형질 전환된 대장균(수탁번호 KCTC 10820BP; 수탁일자: 2005년 06월 20일)를 5L 발효조에 유가식 배양하였다. 배양 중에 온도는 37℃로 설정하였으며 24% 암모니아수를 이용하여 pH를 7.0으로 유지시켰다. 상기 유가식 배양시에 사용된 배지 조성은 하기 표 1에 나타내었다.

배지의 조성

전배양 배지		본배양 배지		공급 배지
성분	농도(g/l)	성분	농도(g/l)	성분	농도(g/l)
효모추출액	5	포도당	10	포도당	800
펩톤	10	MgSO₄·7H₂O	2
NaCl	10	효모추출액	20
암피실린	100 μg	펩톤	10
		(NH₄)₂SO₄	10
		Na₂HPO₄·12H₂O	10
		KH₂PO₄	3
		NaCl	0.5
		암피실린	100 μg
		Trace element^*	1ml

이 때, 유가식 배양 시간별로 균체량, 파이타제 활성 및 포도당의 농도를 측정하였다. 각각의 측정방법은 다음과 같이 수행되었다.

(1) 균체량 측정 : 배양액을 적당히 희석한 후 분광계(spectrometer)를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.

(2) 파이타제의 정량법 : 파이타제의 역가는 앞서 기술한 Fiske등의 방법을 이용하였다.

(3) 글루코오스의 정량법 : 글루코오스의 정량은 글루코오스 분석기를 이용하였다.

측정 결과는 도 4에 도시한 바와 같이, 초기의 포도당은 발효조에 접종한 후 약 6.5시간 만에 다 소비되었으며, 그 시점에서 공급배지(포도당 600 g/l)를 7.2 g/l/시간의 일정한 속도로 공급하였다. 공급배지가 공급된 후 배양액 내에 포도당의 농도는 1 g/l 미만으로 유지되었다. 균체의 성장은 점차적으로 증가하여 120 O.D.에 도달하였으며, 파이타제의 생산은 초기의 포도당이 소비된 후부터 생산하기 시작하여 35시간에 최대의 활성 2,400U/ml로 도달하였다. 그리고, 상당한 양의 파이타제의 활성(647 U/ml)이 배양액에서 관찰되었다. 이렇게 생산된 appA의 양은 지금까지 문헌에서 보고된 것 중에서 가장 높은 것으로 사료된다.

<실시예 7>

pEPGAL-appA로 형질전환된 대장균의 파일롯 스케일(pilot scale) 유가식 배양

상기 실시예 6에 따른 파이타제의 5L 발효조에서의 배양 중에 측정한 산소전달 속도, 혼합시간의 분석 결과를 토대로 하여 300L 발효조를 이용한 파이타제의 유가식 발효를 수행하였다. 이 때에 사용된 배지 조성은 표 1과 동일하며, 30L에서 본배양과 똑같은 배지를 사용하여 균체를 30 O.D.까지 증식시킨 후 그 배양을 300L의 본배양에 접종하였다. 배양조건은 온도 30℃, 통기량 0.5-2.5vvm, 교반속도는 용존산소량의 농도가 10%이상 유지되도록 200rpm에서 395rpm까지 단계적으로 증가시켰다. 또한 발효 중 pH가 6.7이 유지되도록 24% 암모니아수(NH₄OH)를 공급하였다.

배양결과, 균체는 초기 포도당을 3 시간내에 모두 소비하는 빠른 증식을 보였으며, 공급 배지의 연속적인 공급으로 균체는 계속 성장하여 배양 말기에는 약 82 O.D.에 도달하였다. 파이타제는 공급 배지의 공급 후에 계속 생산되어 배양시간 약 18시간에 약 2,100U/ml까지 도달하였다.

5L 발효와 300L 발효에서의 배양 결과를 비교한 결과, 300L 발효에서의 생산성이 5L 발효보다 약 2.5배 이상 높았다. 이는 전배양에서 본배양과 똑같은 배지를 사용하여 균체의 증식을 높이고, 이러한 균체를 본배양에 접종하였기 때문인 것으로 추정된다.

5L 발효와 300L 발효에서의 배양 결과 비교

발효기	배양시간 (hr)	균체량 (O.D.)	파이타제의 활성 (U/ml)	생산성 (U/O.D./hr)
5L 발효	35	100	2,400	0.68
300L 발효	18	70	2,100	1.67

본 발명에 따른 제조방법을 통하여 활성형의 파이타제를 다량으로 생산될 수 있다.

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대장균 유래 파이타제를 코딩하는 핵산 서열이 사카로마이세스 세레비제 유래의 GAL10 프로모터를 포함한 조절 서열에 작동가능하게 연결되도록 포함된 재조합 발현 벡터 pEPGAL-appA로 형질전환된 대장균.
제 4항에 있어서, 상기 대장균이 수탁번호 KCTC 10820BP인 것을 특징으로 하는 대장균.
(1) 제4항 또는 제5항에 따른 대장균을 배양하여 파이타제가 발현되도록 하는 단계 및 (2) 배양물로부터 대장균 유래 파이타제를 분리·정제하는 단계를 포함하는 대장균 유래 파이타제의 제조방법.