JP2005512570A - 新規なフィターゼおよびこれらのフィターゼを生産するための方法 - Google Patents

Abstract

本発明は新規なフィターゼ、特に真菌起源のフィターゼ、またそれぞれの製造方法に関する。より特定して言えば、本発明はペニシリウム属の真菌、特にペニシリウムspCBS109899株に由来する新規なフィターゼおよびこれらのフィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびその組織内で前記フィターゼを発現する形質転換された宿主生物に関する。

Description

本発明は、新規なフィターゼ、特に真菌由来のフィターゼ、および、それぞれの生産方法に関する。より特定して言えば、本発明は、ペニシリウム属の真菌、特に、ペニシリウムCBS 109899株に由来する新規なフィターゼに関し、また、これらのフィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドを含むベクター、およびその組織内で前記フィターゼを発現する形質転換された宿主生物に関する。

特に、本発明のフィターゼは、動物栄養用の飼料組成物中の使用に特に適している。この適合性は、それらの特性、特に、前記組成物の製造条件および動物の消化器系で見られる条件に対応する温度およびpH条件下でのそれらの活性特性に伴うものである。

リンは、すべての生物の生命において必須の元素である。特に、畜産農家にとっては、飼育する家畜に、その成育および成長のためにその十分な量を確実に摂取させることが最も重要である。ほとんどの家畜は、植物系の飼料組成物で飼育されている。これらの植物は、その組織中に貯蔵化合物であるフィチン酸の形で大量のリン酸塩を含んでいる。平均して、植物の中に存在するリンの50〜70%をフィチン酸は含む。フィチン酸は自然な状態で利用され、それが含むリン酸塩はほとんどの家畜、特に反芻動物中で放出される。しかし、ブタやトリなどの単胃動物ではフィチン酸は代謝されない。この結果、これらの動物において、摂取した食餌中に含まれていたフィチン酸は、排泄物と一緒に排出されてしまうこととなり、飼育者は、その家畜が十分な量のリンを摂取するように前記の摂取飼料に無機リン酸塩を補填しなければならない。この戦略は、飼育者に付加コストを課すとともに、吸収されなかったフィチン酸が環境中に放出されて汚染を発生させる。この汚染は、密集繁殖エリアではなおさら大きなものになる。

フィチン酸はまた、例えば、マグネシウム、カルシウム、亜鉛または鉄など食餌摂取物中に含まれる重要な栄養成分元素のキレート化剤であることが知られている。この性質により、フィチン酸は食餌摂取物の栄養上の質の低下をもたらすことになり、フィチン酸に抗栄養剤の特性を与えている。

単胃動物によるフィチン酸同化の不足に伴う様々な欠点に対応するためには、これらの家畜動物食餌摂取物中に酵素(フィターゼ)を導入することが考えられる。フィターゼはフィチン酸を加水分解してイノシトールと無機リン酸塩を放出する。フィターゼ、およびこれらのフィターゼをコードする遺伝子が、多くの生物から単離されている。フィターゼは主に真菌から単離されている(Howson and Davis、1983、Enzyme Microb.Technol.5、377-382;Wyss et al.、1999、Appl.Environ.Microbiol.、65(2)、359-366)。フィターゼを生産する真菌の中では、アスペルギルス属、特にA.ficcum(Ullah and Gibson、1987、Preparative Biochemistry 17(1)、63-91;Ullah and Dischinger、1993、Biochem.Biophys.Res.Commun.、192(2)、747-753)、A.terreus(Mitchell et al.、1997、Microbiology、143(Pt 1)、245-252)、A.niger(Dvorakova et al.、1997、Folia Microbiol(Praha)、42(4)、349-352)、A.fumigatus(Pasamontes et al.、1997、Appl.Environ.Microbiol.、63(5)、1696-1700)、ペニシリウム属、特にP.caseicolum、ミセリオフトラ(Myceliophthora)属、特にM.thermophila(Mitchell et al.、1997、Microbiology、143(Pt 1)、245-252)、タラロミセス(Talaromyces)属、特にT.thermophilus、ニューロスポラ(Neurospora)属、特にN.crassaおよびN.sitophila、テルモミセス(Thermomyces)属、特にT.lanuginosus(Berka et al.、1998、Appl.Environ.Microbiol.64(11)、4423-4427)、またはモナスクス(Monascus)属、特にM.ankaなどの真菌が挙げられる。フィターゼは細菌でも見つかっている。例として言えば、バチルス属、特にB.subtilis(Powar and Jagannathan、1982、J.Bacteriol.151(3)、102-1108;Shimizu、1992、Biosci.Biotech.Biochem.56(8)、1266-1269;Keruvo et al.、1998、Appl.Environ.Microbiol.64(6)、2079-2085)、シュードモナス属(Cosgrove、1970、Austral.J.Biol.Sci.23、1207-1220)、エシェリキア属、特にE.coli(Golovan et al.、2000、Can.J.Microbiol.46、59-71)、エンテロバクター属(Yoon et al.、1996、Enzyme and microbiol.Technol.;18、449-454)またはストレプトミセス属などの細菌が挙げられる。Schwaniiomyces occidentalisやSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母による酵母フィターゼも単離されている(Dvorakova、1998、Folia Microbiol.43(4)、323-338)。最後に、フィターゼは、植物、特に大豆(Ullah and Gibson、1988、Arch.Biochem.Biophys.、260(2)、514-20)、トウモロコシ(Maugenest et al.、1997、Biochem J.、322(Pt 2)、511-7);Maugenest et al.、1999、Plant Mol.Biol.、39(3)、503-14)またはアラビドプシス(Arabidopsis)(Mullaney and Ullah、1998、Biochem.Biophys.Res.Commun.、251(1)、252-5)中で見つかっている。

フィターゼを特徴づけることを可能にする特性には、フィチン酸に関してのミカエリス定数(Km)、活性についての至適pHおよび至適温度、さらに所与のpHおよび温度での活性の安定度が含まれる。分子量(MW)、等電点(pI)またはペプチド配列などのフィターゼの構造に関するデータも使用することができる。これらを動物栄養として使用可能とするためには、フィターゼは特性を、この栄養を目的とする飼料に施される処理と適合性を有するようにしておかなければならない。特に、使用するフィターゼの活性が維持されねばならず、また、可能であれば、これらの飼料を製造するプロセスの温度およびpH条件、さらにこれらの飼料を摂取する家畜動物の消化器官内に存在する条件下で至適でなければならない。これらの制約から、主として、飼料組成物を製造するプロセス中で使用されるような高温条件および家畜動物の消化器官内に存在するような酸性pH条件に耐える活性を備えたフィターゼを探索することになる。

これらの基準を満たすために、フィターゼは、生物、特に温度とpHの条件がこれらの基準に相当する環境中で成長する微生物中で探されてきた。この戦略によって、例えば特許出願WO 97/35016またはEP 0 684 313に記載されているような高温に耐えるフィターゼや、例えば特許出願EP 0 960 934に記載されているような低Kmを有するフィターゼの単離が可能となった。別の戦略は、部位特異的突然変異誘発法(site-directed mutagenesis)によって既知のフィターゼに有利な特性を与えるようにその配列を人為的に改変することである。この戦略は特に特許出願WO 99/48380、EP 0 897 985およびEP 0 897 010に記載されている。
WO 97/35016 EP 0 684 313 EP 0 960 934 WO 99/48380 EP 0 897 985 EP 0 897 010 WO 99/64607 FR91/09870 EP0629699A2 FR 91/05294 WO 94/04673 WO 00/68401 米国特許第5188642号 EP 189707 FR91/09870 EP 0 508 909 米国特許第6130063号 WO 96/38567 US 5463175 WO 91/02071 WO 95/06128 WO 96/38567 WO 97/04103 米国特許第4,945,050号 EP 0260762 WO 00/36120 Howson and Davis、1983、Enzyme Microb.Technol.5、377-382 Wyss et al.、1999、Appl.Environ.Microbiol.、65(2)、359-366 Ullah and Gibson、1987、Preparative Biochemistry 17(1)、63-91 Ullah and Dischinger、1993、Biochem.Biophys.Res.Commun.、192(2)、747-753 Mitchell et al.、1997、Microbiology、143(Pt 1)、245-252 Dvorakova et al.、1997、Folia Microbiol(Praha)、42(4)、349-352 Pasamontes et al.、1997、Appl.Environ.Microbiol.、63(5)、1696-1700 Berka et al.、1998、Appl.Environ.Microbiol.64(11)、4423-4427 Powar and Jagannathan、1982、J.Bacteriol.151(3)、102-1108 Shimizu、1992、Biosci.Biotech.Biochem.56(8)、1266-1269 Keruvo et al.、1998、Appl.Environ.Microbiol.64(6)、2079-2085 Cosgrove、1970、Austral.J.Biol.Sci.23、1207-1220 Golovan et al.、2000、Can.J.Microbiol.46、59-71 Yoon et al.、1996、Enzyme and microbiol.Technol.;18、449-454 Dvorakova、1998、Folia Microbiol.43(4)、323-338 Ullah and Gibson、1988、Arch.Biochem.Biophys.、260(2)、514-20 Maugenest et al.、1997、Biochem J.、322(Pt 2)、511-7 Maugenest et al.、1999、Plant Mol.Biol.、39(3)、503-14 Mullaney and Ullah、1998、Biochem.Biophys.Res.Commun.、251(1)、252-5 Shimizu、1992、Biosci.Biotech.Biochem.56(8)、1266-1269 Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press Altschul et al.、1993、J.Mol.Evol.36:290-300 Altschul et al.、1990、J.Mol.Biol.215:403-10 Smith and Waterman、Applied Mathematics、1981、No.2、482-489 Ausubel et al.、(1987)Current Protocols in Molecular Biology、edit.John Wiley & Sons、Section 6.3-6.4 Makrides、1996、Microbiol.Rev.60:512-538 Current Opinions in Biotechnology、1996、7 Weickert et al.、1996、Current Opinions in Biotechnology 7:494-499 Holmes et al.、1993、EMBO J.12:3183-3191 Van den Berg et al.、1990、Bio/Technology 8:135-139 Gwynne et al.、1987、Bio/Technology 5:713-719 Neuhaus and Rodgers、1998、Plant Molecular Biology 38:127-144 Schumacher et al.、1986、Nucl.Acids.Res.14:5713-5727 Bowden and Georgiou、1990、J.Biol.Chem.265:16761-16766 Chang et al.、1986、Gene 44:121-124 Gritz et al.、1983、Gene 25:179-188 Punt et al.、1987;Gene 56:117-24 Gold et al.、1994、Gene 142:225-30 Avalos et al.、1989、Curr Genet、16:369-72 Buxton and Radford、1983、Mol.Gen.Genet.190:403-405 Berse et al.、1983、Gene 25:109-117 Goosen et al.、1989、Mol.Gen.Genet.、219:282-88 Appleyard et al.、1998、J Biol Chem 273:14869-76 Unkles et al.、1999;J Biol Chem 274:19286-93 Beri and Turner、1987、Curr Genet、11:639-41 White et al.、NAR 18:1062、1990 Chang and Cohen、1979、Mol.Gen.Genet.168(1)、111-115 Mercenier and Chassy、1988、Biochimie 70(4)、503-517 Andreason and Evans、1988、Biotechniques、6(7)、650-660 Shigekawa and Dower、1989、Aust.J.Biotechnol.3(1)、56-62 Gordon and Ruddle、1985、Gene 33(2)、121-136 Bruce et al.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)、9692-9696 Klein et al.、1992、Biotechnology 10(3)、286-291 Ausubel et al.、1995、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、New York Inoue et al.、1990、Gene 96:23-28 Chung et al.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2172-2175 Cameron et al.、1989、J.Bacteriol.、171:547-557 Bonamy et al.、1990、FEMS Microbio.Lett 66:263-270 Hopwood et al.、1985、Genetic Manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual、John Innes Foundation、Norwich Talbot、2001、Molecular and cellular biology of filamentous fungi、Oxford University Press、New York Sanchez et al.、1998、Mol.Gen.Genet.258;89-94 de Groot et al.、1998、Nature Biotechnology 16:839-842 Van den Berg et al.1990、Bio/Technology 8:135-139 Knopf、1979、Subcell.Biochem.6、143-173 Shaw et al.、1983、Gene 23(3):315-330 Bevan and Chilton、1982、Annu.Rev.Genet.16:357-384 Tepfer and Casse-Delbart、1987、Microbiol.Sci.4(1)、24-28 Ishida et al.、1996、Nat.Biotechnol.14(6)、745-750 P.J.Punt and C.A.M.J.J.van den Hondel、(1992)Methods in Enzymology 216、447-457 Orbach(1994)、GENE 150、pp.159-162 Maniatis et al.、1982

本発明は、配列番号3によって記載されるフィターゼをコードする、単離されたポリヌクレオチドに関する。このフィターゼ、およびそれをコードするポリヌクレオチドはまた、ペニシリウム属の真菌株、特にペニシリウムsp CBS 109899に由来する。

本発明によれば、「ポリヌクレオチド」という用語は、DNAタイプでもRNAタイプでもよい(好ましくはDNAタイプ、特に二本鎖)の天然または人工の塩基配列から構成される核酸分子を意味するように意図される。前記ポリヌクレオチドが天然の場合、本発明は、その自然環境におけるこのポリヌクレオチドは含まないが、それが本来見出される生命体のゲノムから単離し精製した同じポリヌクレオチドを含むことが明らかに理解される。このポリヌクレオチドは、抽出と精製によって直接に、または複製によって間接的に得ることができる。しかし、前記ポリヌクレオチドが本来存在する生命体以外のゲノムに人為的に組み込まれた場合やそれが得られた生命体に、この生物のゲノム中の1つまたは複数のコピーとして人為的に再導入された場合は、本発明は前記ポリヌクレオチドを含む。このポリヌクレオチドがプローブである場合、それは一般に一本鎖である。

したがって、本発明は、配列番号3で記載されるフィターゼのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含む。この定義が、遺伝子コードの縮重の結果異なるヌクレオチド配列を含むとしても、配列番号3によって表わされるのと同一のアミノ酸配列、したがって、同一のフィターゼをコードするすべてのポリヌクレオチドを含むことが当業者にはよく知られている。

本発明はまた、上記ポリヌクレオチドと相同なポリヌクレオチド(前記相同なポリヌクレオチドは配列番号3によって表わされるフィターゼと相同なフィターゼをコードする)を含む。本発明によれば、「相同な」という用語は、その配列が配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに対して改変されているフィターゼをコードするポリヌクレオチドを意味するように意図される。相同なポリヌクレオチドは、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドとの同一性の程度によって特徴づけられる。2つの対応するポリヌクレオチド間の同一性の程度はそれらの配列の比較により得られ、一般にこれらの配列間の同一ヌクレオチドの割合によって表現される。同一性のこの程度は所与の配列長さにわたって測定される(比較する配列のうち短い方が、相同な配列の同一性の程度が測定される配列の長さを決める)。したがって、本発明は、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに関する1個または複数の配列の改変を有し、かつ、配列番号3によって記載されるフィターゼと同等の特性のフィターゼをコードするポリヌクレオチドを含む。

本発明によれば、「同等のフィターゼ」または「同等の特性を備えたフィターゼ」という表現は、Km、活性の至適pHまたは活性の至適温度などのそれらの本質的な特性とは関係なく、フィターゼ活性を有するタンパク質を意味するように基本的に意図される。フィターゼ活性のレベルはフィターゼ活性を特徴づける任意の方法によって測定することができる。「フィターゼ」という用語は、その触媒活性が、フィチン酸を加水分解してイノシトールと無機リン酸塩を放出することにある酵素を意味するように意図される。しかし、大半のフィターゼはフィチン酸(6個のリン酸塩を含む)の完全な加水分解を実行しないため、本発明によるフィターゼの触媒活性は無機リン酸塩とミオイノシトールリン酸エステル類の放出をもたらすものでもよく、前記エステル類は、フィターゼの加水分解能力に応じて、ミオイノシトール-モノ-、ジ-、トリ-、テトラ-またはペンタリン酸エステルであり得る。例として言えば、フィターゼ活性は、Shimizu(1992、Biosci.Biotech.Biochem.56(8)、1266-1269)の方法、特に実施例2に記載されるような方法によって測定できる。しかし、フィターゼ活性を特徴づける任意の方法(基質の量の減少の測定によるものでも酵素の反応に由来する生成物の蓄積の測定によるものでもよい)を使用して、フィターゼ活性を測定してもよい。特に、同様の方法、例えば、別の基質または他の試薬を使用することによっても前記フィターゼ活性を測定することもできる。

相同なポリヌクレオチドの中に存在する配列の改変は自然のまたは通常の突然変異生成技術によって得られるヌクレオチドの追加、欠失または置換でもよい。同等の機能を備えたタンパク質をコードするそのような相同なポリヌクレオチドは、異なる生存種のゲノム、あるいはさらに異なる品種(race)、変種または株のゲノムにさえ天然に存在することが知られている。したがって、分子ハイブリダイゼーションのよく知られた技術(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)を用い、本発明による配列番号3によって表わされるペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの教示を使用して、そのような相同なポリヌクレオチドを単離するのは当業者にとっては容易なことである。

分子ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列間にある程度の同一性を有するポリヌクレオチドの相補鎖間で起こる対形成反応である。したがって、ハイブリダイゼーションによれば、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドを使用して、それらが由来する生物以外の生命体、例えば、他の真菌、特にペニシリウム(例えばP.funicolosum IMI 134756)以外の株のゲノム中において、これらのポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドであって、配列番号3によって表わされるフィターゼと同等の特性を備えたフィターゼをコードするポリヌクレオチドを識別することができる。ポリヌクレオチド間の配列同一性がより大きければ、前記ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの可能性および容易さはより大きくなり、また、ポリヌクレオチドが同等の特性を備えたタンパク質をコードするという蓋然性もより大きくなる。ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる方法は、文献(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)に広く記載され、当業者にはよく知られている。それらは例えば、生命体またはこの生物の組織から作成したゲノムまたはcDNAライブラリーのスクリーニングに基づく。スクリーニングは、既知のポリヌクレオチドまたはその断片からなるプローブを用いて、これらのライブラリー中で前記プローブに相同なポリヌクレオチド(前記プローブにハイブリダイズする)を識別することにより行う。本発明によれば、プローブは、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドまたはその断片からなる。プローブがハイブリダイズするポリヌクレオチドを識別するためには、例えば、³²Pのような放射性元素によって標識を付ける。当業者によく知られた、市販の非放射性のラベルを使用してもよい。

したがって、本発明はまた、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドのうちの1つに選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドまたはその断片を含む。これらのポリヌクレオチドは、それらが配列番号3によって表わされるフィターゼに同等のフィターゼをコードする場合は、本発明の一部にすぎないことが理解される。したがって、本発明によれば、「選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド」という表現は、分子ハイブリダイゼーションの通常の方法(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)のうちの1つによって、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドの1つまたはその断片からなる標識されたプローブと、前記プローブが相対的に非相同の他のポリヌクレオチド(特に、プローブされるポリヌクレオチドがcDNAライブラリーに由来する場合は他のcDNA)との間で起こす非特異的ハイブリダイゼーションより大きなレベルでハイブリダイズするポリヌクレオチドを意味するように意図される。ハイブリダイゼーションのレベルは、プローブの標識によって生じる信号によって測定される。選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドとプローブの間の相互作用によって生成される信号のレベルは、一般に、プローブと他のポリヌクレオチドとの相互作用によって生成されるレベル(「バックグラウンドノイズ」)の10倍、好ましくは100倍強い。選択的なハイブリダイゼーションは、一般には標準的な、好ましくはストリンジェントであるか非常にストリンジェントであるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件(例えば、およそ50℃〜60℃で少なくとも5×SSCおよび1%SDSを含むバッファーでハイブリダイズし、続いて洗浄を0.1%SDS、2×SSCから0.4×SSCまでSSC濃度を漸減、さらに20℃から50℃まで温度を増加させて行う)を使用して得られる。当業者は、ハイブリダイゼーション条件、つまり、実質的にはハイブリダイゼーション工程および洗う工程で使用されたバッファーの温度、および塩濃度を調節することができる。これらの条件は、特に、使用するプローブの長さおよびこのプローブでスクリーニングされるライブラリー中に存在するポリヌクレオチドの同一性の程度の関数として調節されるべきである。ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイズする相同な配列によって生成される信号を最適化し、同時にバックグラウンドノイズを最小限にするように調節する必要がある。

本発明によれば、ポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、例えば、真菌株、特にペニシリウム属の株(例えば、P.funiculosum IMI 134756株)から生産されたゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーから単離することができる。そのようなポリヌクレオチドの単離は、プローブとして配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドの断片またはそれらに相補的なポリヌクレオチドを使用して、標準的ハイブリダイゼーション技術(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)によって行うことができる。ポリヌクレオチドがこれらの技術によって単離された場合、その配列を決定し、このポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の特性を識別すること、特に、このタンパク質が配列番号3によって記載されたフィターゼと同等のフィターゼであることを確認する必要がある。

したがって、上に言及したハイブリダイゼーション技術は、配列番号3によって記載されたフィターゼをコードするポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドを単離することを可能にする。そのようなポリヌクレオチド、およびそれらがコードするフィターゼは、標準の分子生物学技術に習熟したバイオテクノロジー分野での当業者には容易に識別可能である。したがって、本発明は配列番号3によって記載されたフィターゼをコードするポリヌクレオチドに相同なポリヌクレオチドを含む。相同なポリヌクレオチドの同一性の程度は、配列番号3によって表わされるフィターゼをコードするポリヌクレオチドに比べて少なくとも45%、好ましくは少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、そして好ましくは少なくとも95%が有利であろう。配列間の同一性の程度を測定および識別する方法は、当業者によく知られている。例えば、PILEUP、BLAST(特にAltschul et al.、1993、J.Mol.Evol.36:290-300;Altschul et al.、1990、J.Mol.Biol.215:403-10)やBestFit(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix（登録商標）、Genetics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711、Applied Mathematics、1981、No.2、482-489に記載されたSmithとWatermanのアルゴリズムを使用)といったプログラムが利用できる。

このような相同なポリヌクレオチドは、従来の突然変異生成技術によって人為的に得ることもできる。

配列番号3によって表わされるフィターゼをコードする好ましいポリヌクレオチドは、配列番号1および配列番号2によって表わされる配列から選択される。

相同なポリヌクレオチドの例としては、配列番号4によって表わされるポリヌクレオチドを挙げることができる。

本発明の特定の実施形態によれば、上記の、フィターゼをコードするポリヌクレオチドは、ペニシリウム属の真菌に起源を有する。特定の実施形態によれば、それらはPenicillium sp CBS 109899株またはPenicillium funiculosum IMI 134756株に起源を有する。

本発明の特定の実施形態によれば、本発明によるポリヌクレオチドは、次の特性を有するフィターゼをコードする:
(a)至適温度=50℃
(b)至適pH=4〜5
(c)Km=550μm。

本発明はまた、上記ポリヌクレオチドの断片に関する。「断片」という用語は、特に、少なくとも20個のヌクレオチド、特に、少なくとも50個のヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも100個のヌクレオチドの断片を指す。このような断片は一般にオリゴヌクレオチドと呼ばれる。それらは、相同なポリヌクレオチドを識別するためのハイブリダイゼーションプローブとして、または、Ausubel et al.、(1987)Current Protocols in Molecular Biology、edit.John Wiley & Sons、Section 6.3-6.4に記載されているようなPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)技術によってそのような相同なポリヌクレオチドを識別し増幅するプライマーとして使用してもよい。

「断片」という用語はまた、配列番号3によって表わされるフィターゼの断片をコードする本発明によるポリヌクレオチドの断片、または配列番号3によって表わされるフィターゼの相同体もしくは同等物であるフィターゼの断片も指す。

本発明はまた、上記ポリヌクレオチドの少なくとも1つを含むポリヌクレオチドに関する。

上記ポリヌクレオチドはすべて、配列番号3によって表わされるフィターゼか、相同なフィターゼ、またはこれらのフィターゼの活性な断片をコードする。したがって、本発明は、これらのポリヌクレオチドのいずれかによってコードされたフィターゼすべてに及ぶ。したがって、この定義は、配列番号3によって表わされたフィターゼ、このフィターゼに相同なフィターゼおよびこれらのフィターゼの活性な断片を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、フィターゼは配列番号3によって記載されたペプチド配列を少なくとも含むタンパク質である。

したがって、本発明はさらに配列番号3によって表わされるフィターゼに相同なフィターゼを含む。本発明によれば、「相同なフィターゼ」という用語は、その配列が配列番号3によって表わされるフィターゼに対して改変されているフィターゼを意味するように意図される。相同なポリヌクレオチドと同様に、相同なフィターゼはペプチド配列がある程度の同一性(この同一性の程度は一般には、同一のアミノ酸の割合によって表現される)を示すフィターゼである。したがって、本発明は、配列番号3によって表わされるフィターゼに対して1つまたは複数の配列改変を有し、かつ、その特性が配列番号3によって記載されたフィターゼの特性に同等のフィターゼを含む。これらの改変はアミノ酸の付加、欠失または置換であり、天然のものでもよいし通常の突然変異生成技術によって得られるものでもよい。相同なフィターゼの同一性の程度は、配列番号3によって表わされるフィターゼに比べて少なくとも35%、好ましくは少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも90%、そして好ましくは少なくとも95%であると有利であろう。配列間の同一性の程度を測定および識別する方法は、当業者によく知られている。例えば、PILEUP、BLAST(特にAltschul et al.、1993、J.Mol.Evol.36:290-300;Altschul et al.、1990、J.Mol.Biol.215:403-10)やBestFit(Wisconsin Sequence Analysis Package、Version 8 for Unix（登録商標）、Genetics Computer Group、University Research Park、575 Science Drive、Madison、WI 53711、Applied Mathematics、1981、No.2、482-489に記載されたSmithとWatermanのアルゴリズムを使用)といったプログラムが利用できる。

配列番号3によって表わされるフィターゼに相同なフィターゼの例としては、配列番号4によって表わされるポリヌクレオチドがコードするフィターゼを挙げることができる。

本発明の特定の実施形態によれば、本発明によるフィターゼは、ペニシリウム属の真菌に起源を有する。

本発明の特定の実施形態によれば、フィターゼは次の特性を有する:
(a)至適温度=50℃
(b)至適pH=4〜5
(c)Km=550μm。

本発明はまた、配列番号3によって表わされるフィターゼの断片および相同なフィターゼの断片にまで及ぶ。「断片」という用語は、実施例2に記載された分析または同様の分析によって測定される、生物学的に活性な断片(つまり完全なフィターゼの活性と同等のフィターゼ活性を有する断片)を意味するように本質的に意図される。

本発明はまた、互いに機能的に結合した、宿主生物において機能する少なくとも1個のプロモーター、本発明によるフィターゼをコードするポリヌクレオチド、および同じ宿主生物において機能するターミネーター要素を含むキメラ遺伝子に関する。総括的な遺伝子が含む様々な要素には、第1に、プロモーター、シグナルペプチドまたは輸送ペプチドをコードする配列、あるいはポリアデニル化シグナルを構成するターミネーター要素などの、タンパク質の転写、翻訳および成熟を調節する要素、第2に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。「互いに機能的に結合した」という表現は、キメラ遺伝子の前記要素が、これらの要素のうちの1つの機能が別の要素の機能によって影響されるように互いに結合されていることを意味する。例として言えば、プロモーターはコードする配列に、それが前記コードする配列の発現に影響することができる場合、機能的に結合されている。本発明によるキメラ遺伝子の構築およびその様々な要素の組立ては当業者によく知られた技術、特に、Sambrookら(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されているものを使用して行うことができる。キメラ遺伝子を構成する調節要素の選択は、それらが機能すべき宿主生物に本質的に依存し、当業者は、所与の宿主生物において機能する調節要素を選択することができる。「機能的な」という用語は、所与の宿主生物の中で機能することができることを意味するように意図される。

本発明によるキメラ遺伝子が含み得るプロモーターは、構成的なものでも誘導的なものでもよい。例として言えば、細菌中で発現のために使用されるプロモーターは、下記のプロモーターから選ぶことができる。大腸菌中での発現については、lac、trp、lpp、phoA、recA、araBAD、proU、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、lpp-lac、Psyn、cspA、PL、PL-9G-50、PR-PL、T7、γPL-PT7、T3-lac、T5-lac、T4遺伝子32、nprM-lac、VHbおよびタンパク質Aプロモーター(Makrides、1996、Microbiol.Rev.60:512-538;Current Opinions in Biotechnology、1996、7;Weickert et al.、1996、Current Opinions in Biotechnology 7:494-499)、またこの他にP_trpプロモーター(WO 99/64607)が挙げられる。コリネバクテリアまたはストレプトマイセスなどのグラム陽性細菌中での発現については、P_tipA(Holmes et al.、1993、EMBO J.12:3183-3191)またはPS1およびPS2(FR91/09870)プロモーターまたは出願EP0629699A2に記載されているものが挙げられる。酵母と真菌中の発現については、K.lactis P_LAC4プロモーター(Van den Berg et al.、1990、Bio/Technology 8:135-139)またはK.lactis P_pgkプロモーター(特許出願FR 91/05294)、トリコデルマteflまたはcbhlプロモーター(WO 94/04673)、ペニシリウム、his、csl、またはapfプロモーター(WO 00/68401)、およびアスペルギルスglaプロモーター(Gwynne et al.、1987、Bio/Technology 5:713-719)が挙げられる。

キメラ遺伝子は、さらにシグナルペプチドや輸送ペプチドをコードする細胞内アドレス指定配列を含むものでもよい。このような配列は、フィターゼをコードするポリヌクレオチドの上流にまたは下流に位置し、宿主生物のある細胞内区画に前記フィターゼを特異的に誘導するか細胞外空隙にその分泌を誘導することを可能にする。例えば、キメラ遺伝子は、ミトコンドリア、プラスト(plasts)、小胞体または液胞などの細胞質の特定の部分にフィターゼを移動させるためのシグナルペプチドまたは輸送ペプチドをコードする配列を含んでもよい。好ましくは、アドレス指定配列は、アポプラスト(apoplast)または細胞外マトリックス中にフィターゼをアドレス指定するシグナルペプチドをコードする。

一実施形態によれば、輸送ペプチドは、葉緑体、液胞またはミトコンドリアへのアドレス指定信号(その後、葉緑体、液胞またはミトコンドリア中で開裂される)でもよい。そのようなペプチドは、文献に広く記載されている(Neuhaus and Rodgers、1998、Plant Molecular Biology 38:127-144;米国特許第5188642号に記載されているEPSPS輸送ペプチド;リブロースビスカルボキシラーゼ/オキシゲナーゼスモールサブユニット輸送ペプチド(EP 189707))。

別の実施形態によれば、輸送ペプチドは、pac(Schumacher et al.、1986、Nucl.Acids.Res.14:5713-5727)、ompA(Bowden and Georgiou、1990、J.Biol.Chem.265:16761-16766)およびphoA(Chang et al.、1986、Gene 44:121-124)遺伝子など、細菌のペリプラズムに指し向けるためのシグナルペプチド、またはPS1とPS2(FR91/09870)遺伝子などの細菌表面投錨ペプチドからなるものでもよい。

輸送ペプチドは単一ペプチドでもよいし、または2重ペプチドでもよい。2重輸送ペプチドは、場合によっては中間配列によって単離される。葉緑体輸送ペプチドの例として言えば、転写方向において、色素体(plastid)内にある酵素をコードする植物遺伝子の輸送ペプチドをコードする配列、色素体内にある酵素をコードする植物遺伝子の成熟したN-末端部分由来の配列の一部、さらに色素体内にある酵素をコードする植物遺伝子の第2の輸送ペプチドをコードする配列を含む2重輸送ペプチドを挙げることができる。このような2重葉緑体輸送ペプチドは例えば、特許出願EP 0 508 909に記載されている。

一実施形態によれば、輸送ペプチドは、培地へ分泌される対象タンパク質の量を増加させるための様々な要素から構成することもできる。したがって、キャリアータンパク質および対象タンパク質と融合させたタンパク質分解性開裂サイトの組合せを挙げることができる(米国特許第6130063号)。

本発明によれば、キメラ遺伝子はさらに、転写活性剤(エンハンサー)など、他の調節配列(それらは、プロモーターとコードする配列の間に位置する)を含んでもよい。

本発明はまた、本発明によるキメラ遺伝子を含むクローニング、発現および/または形質転換ベクターに関する。本発明によるベクターは、宿主生物を形質転換しこの生物中でフィターゼを発現することに役立つ。ベクターはプラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウィルスのいずれでもよい。好ましくは、本発明による形質転換ベクターは、プラスミドである。一般に、このベクターの主要な特質は、それ自体を宿主生物細胞中に維持し、特に複製起点の存在により、それ自体を複製する能力およびフィターゼをそこに発現する能力であるべきである。宿主生物の安定した形質転換の目的で、ベクターはゲノムに統合してもよい。この場合、ベクターの構成は、宿主中でのフィターゼの合成のために必要な要素に制限されてもよい。そのようなベクターの選択、および、本発明によるキメラ遺伝子のこのベクター中への挿入の技術は、Sambrookら(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Nolan C.編、New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)に完全に記載されており、当業者にとっては一般的な知識の一部をなすものである。本発明において使用されるベクターは、本発明によるキメラ遺伝子に加え、選択可能なマーカーをコードするキメラ遺伝子も含むと有利である。この選択可能なマーカーにより、有効に形質転換された宿主生物、つまりベクターを組み込んだ宿主生物の選択が可能になる。使用することができる選択可能なマーカーの中では、(例えば、ハイグロマイシン(hygromycin)ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Gritz et al.、1983、Gene 25:179-188;Punt et al.、1987;Gene 56:117-24)、ストレプトトリシン(streptothricin)アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(これはフレオマイシン耐性を付与するポリペプチドをコードする)、ベノミル耐性を付与する変異ベータチューブリン遺伝子(Gold et al.、1994、Gene 142:225-30)またはビアラフォス(bialaphos)アセチルトランスフェラーゼ遺伝子(Avalos et al.、1989、Curr Genet、16:369-72)など)、抗生物質または殺真菌剤に対する耐性遺伝子を含むマーカーを挙げることができる。他のマーカーは、栄養要求性(auxotrophy)を補足する遺伝子、(例えば、pyrA、pyrB、pyrG、pyr4(Buxton and Radford、1983、Mol.Gen.Genet.190:403-405)、arg4、argB(Berse et al.、1983、Gene 25:109-117)およびtrpC(Goosen et al.、1989、Mol.Gen.Genet.、219:282-88)遺伝子、モリブドプテリン(molybdopterin)シンターゼ遺伝子(Appleyard et al.、1998、J Biol Chem 273:14869-76;Unkles et al.、1999;J Biol Chem 274:19286-93)またはアセトアミダーゼ遺伝子(Beri and Turner、1987、Curr Genet、11:639-41)など)である。他のカテゴリーの選択可能なマーカーは、ビアラフォス耐性のためのbar遺伝子(White et al.、NAR 18:1062、1990)、グリホサート(glyphosate)耐性のためのEPSPS遺伝子(米国特許第5,188,642号)、イソオキサゾール耐性のためのHPPD遺伝子(WO 96/38567)またはグリホサートオキシドレダクターゼ遺伝子(US 5463175)など、除草剤に対する耐性遺伝子からなる。GUS酵素のような容易に識別可能な酵素、または形質転換された細胞において、色素または色素の生産を調節する酵素をコードする遺伝子も挙げることができる。そのような選択可能なマーカー遺伝子は、特に特許出願WO 91/02071、WO 95/06128、WO 96/38567およびWO 97/04103に記載されている。

本発明はまた、本発明による少なくとも1つのキメラ遺伝子(そのゲノムに組み込まれていてもよいし、染色体外の遺伝要素、例えばプラスミドで担持されてもよい)を含む形質転換された宿主生物に関する。「宿主生物」という用語は、本発明によるフィターゼを生産するために本発明によるキメラ遺伝子を導入することができる任意の下等または高等の単細胞または多細胞の生物を意味するように意図される。好ましくは、宿主生物は微生物、特に、真菌、例えば、ペニシリウム、アスペルギルス、クリソスポリウム(Chrysosporium)またはトリコデルマ属の真菌、細菌、例えば、エシェリキア(Escherichia)属、特に大腸菌、コリネバクテリウム属、バチルス属またはストレプトマイセス属の細菌、酵母、特にサッカロミセス、クルイヴェロミセス(Kluyveromyces)またはピチア(Pichia)属の酵母、バキュロウイルスまたは植物細胞である。宿主生物はさらに植物または植物の一部でもよい。

「形質転換された宿主生物」という表現は、そのゲノム中に、または染色体外の遺伝要素(例えばプラスミド)に、本発明による少なくとも1つのキメラ遺伝子を組み込んでおり、したがってその組織内に、または培養培地中にフィターゼを生産する宿主生物を意味するように意図される。本発明による宿主生物を得るために、当業者は、多くの既知の形質転換方法のうちの1つを使用してもよい。

これらの方法のうちの1つは、形質転換すべき宿主生物の細胞または組織をポリエチレングリコール(PEG)および本発明によるベクターと接触させるものである(Chang and Cohen、1979、Mol.Gen.Genet.168(1)、111-115;Mercenier and Chassy、1988、Biochimie 70(4)、503-517)。別の方法としてエレクトロポレーションがあり、これは、形質転換すべき細胞または組織、および本発明のベクターを電場にさらすものである(Andreason and Evans、1988、Biotechniques、6(7)、650-660;Shigekawa and Dower、1989、Aust.J.Biotechnol.3(1)、56-62)。別の方法は、マイクロインジェクションによって、ベクターを細胞または組織に直接注入するものである(Gordon and Ruddle、1985、Gene 33(2)、121-136)。「バイオリスティック(biolistic)」法を使用すると有利である。これは、本発明のベクターが吸着された粒子を細胞または組織に激しく衝突させるものである(Bruce et al.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)、9692-9696;Klein et al.、1992、Biotechnology 10(3)、286-291;米国特許第4,945,050号)。

細菌を形質転換するいくつかの方法が、大腸菌および他のグラム陰性細菌について文献に記載されている(Ausubel et al.、1995、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、New York;Inoue et al.、1990、Gene 96:23-28;Chung et al.、1989、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2172-2175)。コンジュゲーションも使用できる(Cameron et al.、1989、J.Bacteriol.、171:547-557)。グラム陽性細菌については、エレクトロポレーションが使用でき、また、特にストレプトマイセス属細菌についてはプロトプラスト形質転換が使用できる(Bonamy et al.、1990、FEMS Microbio.Lett 66:263-270;Hopwood et al.、1985、Genetic Manipulation of Streptomyces:A Laboratory Manual、John Innes Foundation、Norwich)。

真菌を形質転換するいくつかの方法も、文献に記載されている(Talbot、2001、Molecular and cellular biology of filamentous fungi、Oxford University Press、New York)。PEGによるプロトプラスト形質転換はEP 0260762にアスペルギルスに対して記載されている。また、ペニシリウム属フニクロースム種へのこの方法の適応例がWO 00/36120に記載されている。制限酵素媒介組み込み、すなわちREMI(restriction enzyme mediated integration)による形質転換も知られており(Sanchez et al.、1998、Mol.Gen.Genet.258;89-94)、アグロバクテリウム属の細菌を使用したプロトプラスト形質転換などがある(de Groot et al.、1998、Nature Biotechnology 16:839-842)。酵母の形質転換技術も、文献、特にAusubel et al.(1995、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley and Sons、New York)およびVan den Berg et al.(1990、Bio/Technology 8:135-139)に記載されている。

特に形質転換される宿主生物が植物起源である場合、植物細胞または組織は、好ましくはアグロバクテリウム属の細菌を使用して、好ましくは前記植物の細胞または組織をA.tumefaciens(Knopf、1979、Subcell.Biochem.6、143-173;Shaw et al.、1983、Gene 23(3):315-330)またはA.rhizogenes(Bevan and Chilton、1982、Annu.Rev.Genet.16:357-384;Tepfer and Casse-Delbart、1987、Microbiol.Sci.4(1)、24-28)に感染させることによって形質転換することもできる。好ましくは、Agrobacterium tumefaciensによる植物細胞または組織の形質転換は、イシダら(1996、Nat.Biotechnol.14(6)、745-750)によって記載されたプロトコルによって行う。それらの当業者は、形質転換すべき宿主生物の性質により適切な方法を選択するであろう。

本発明はまた、フィターゼ活性を有する抽出物の生産方法に関する。本発明の一実施形態によれば、この方法は以下の工程を含む:
(a) 本発明によるポリヌクレオチドを天然状態でそのゲノム中に有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
(b) 工程(a)において培養した生物を濃縮する工程
(c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
(d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
(e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程。

工程(c)は、機械的な粉砕(圧力差によるもの、超音波作用によるもの、練り潰しによるもの)、酵素による分解または浸透圧衝撃などの当業者に知られている技術を使用して行うことができる(前記技術は個別に使用しても組み合わせて使用してもよい)。

この方法はまた、追加的な精製工程(f)を加えることにより本発明によるフィターゼを生産する方法とすることもできる。本発明によるそのようなフィターゼを生産する方法の工程(f)は、工程(e)で回収された上清からフィターゼを精製することからなる。フィターゼの精製はタンパク質の濃縮または単離のために任意の技術、特に、精密濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーといった当業者によく知られた技術によって行うことができる。精製されたフィターゼを得るために、それらの当業者は、前記フィターゼを含む精製画分を識別するためにフィターゼ活性を測定する上述の方法を使用することができる。この方法によれば、生産されたフィターゼは、好ましくは50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%の純度であればよく、または100%の純度であると有利である。

本発明による方法の別の実施形態によれば、特に本発明によるフィターゼが培養培地に分泌される場合、前記方法は、以下の工程を含む:
(a) 本発明によるポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
(b) 前記生物を除去することにより培養培地を回収する工程。

「本発明によるポリヌクレオチドを天然状態でそのゲノム中に有する生物」という表現は、天然状態で、配列番号3によって記載される、フィターゼをコードするポリヌクレオチドまたは相同なポリヌクレオチドをそのゲノム中に有するすべての生物を意味するように意図される。

上記方法の一実施形態によれば、前記生物は微生物である。特定の実施形態によれば、前記微生物は真菌、特にペニシリウム属の真菌、特に、ペニシリウムsp CBS 109899株である。

これらの方法によれば、当業者に知られている技術を使用して、フィターゼの生産に適した培地において生物を培養することができる。前記生物は、特にそれが微生物、特に真菌である場合は、振盪エルレンマイヤーフラスコ、実験室規模の発酵槽または工業的規模の発酵槽(バッチ発酵、供給バッチ発酵または固体培地での発酵)で培養できる。使用する培地は、炭素源と窒素源および無機塩類を含有しなければならない。ペニシリウム属sp CBS 109899株を生物として使用する方法の特定の実施形態では、フィターゼの発現はフィチン酸塩(例として言えば、フィチン酸塩類はNa⁺塩、Ca⁺⁺塩またはCa⁺⁺とMg⁺⁺の塩の組合せでもよい)の存在下または非存在下で得られる。pHは制御してもよいし(好ましくはpH3または4)、または制御しなくてもよい。

この方法によれば、前記生物の除去によって培養培地を回収する工程は、液体画分に含まれる固体画分を単離するための任意の手段によって行うことができる。濾過と遠心分離は、特にこの工程を行うための適切な手段である。

この方法はさらに追加的精製工程(c)を加えることにより本発明によるフィターゼを生産する方法とすることができる。本発明によるフィターゼを生産するそのような方法の工程(c)は、工程(b)で回収された上清からフィターゼを精製することからなる。フィターゼの精製はタンパク質の濃縮または分離のための任意の技術、特に、精密濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーといった当業者によく知られた技術によって行うことができる。精製されたフィターゼを得るために、当業者は、前記フィターゼを含む精製画分を識別するためにフィターゼ活性を測定する上述の方法を使用することができる。この方法によれば、生産されたフィターゼは、好ましくは50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%の純度であればよく、または100%の純度であると有利である。

本発明の別の実施形態によれば、フィターゼ活性を有する抽出物を生産する方法は、本発明による形質転換された宿主生物を使用し、以下の工程を含む:
(a) 本発明による形質転換された宿主生物を培養する工程
(b) 工程(a)において培養した形質転換された宿主生物を濃縮する工程
(c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
(d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
(e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程。

工程(c)は、機械的な粉砕(圧力差によるもの、超音波作用によるもの、練り潰しによるもの)、酵素による分解または浸透圧衝撃などの当業者に知られている技術を使用して行うことができる(これらの技術は個別に使用しても組み合わせて使用してもよい)。

この方法はまた、追加的な精製工程(f)を加えることにより本発明によるフィターゼを生産する方法とすることもできる。本発明によるそのようなフィターゼを生産する方法の工程(f)は、工程(e)で回収された上清からフィターゼを精製することからなる。フィターゼの精製はタンパク質の濃縮または分離のための任意の技術、特に、精密濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーといった当業者によく知られた技術によって行うことができる。精製されたフィターゼを得るために、当業者は、前記フィターゼを含む精製画分を識別するためにフィターゼ活性を測定する上述の方法を使用することができる。この方法によれば、生産されたフィターゼは、好ましくは50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、または有利には100%の純度を有してもよい。

この方法で使用される、形質転換された宿主生物は微生物であることが好ましい。特に前記微生物は、真菌、例えば、ペニシリウム、アスペルギルス、クリソスポリウム(Chrysosporium)またはトリコデルマ属の真菌、細菌、例えば、エシェリキア(Escherichia)属、特に大腸菌、コリネバクテリウム属、バチルス属またはストレプトマイセス属の細菌、酵母（特にサッカロミセス、クルイヴェロミセス(Kluyveromyces)またはピチア(Pichia)属の酵母）、バキュロウイルスまたは植物細胞である。

本発明の別の実施形態によれば、特に本発明によるフィターゼが培養培地に分泌される場合、この方法は、以下の工程を含む:
(a) 本発明による形質転換された宿主生物を培養する工程
(b) 前記形質転換された宿主生物を除去することにより培養培地を回収する工程。

これらの方法によれば、当業者に知られている技術を使用して、フィターゼの生産に適した培地において生物を培養することができる。前記生物は、特にそれが微生物、特に真菌である場合は、振盪エルレンマイヤーフラスコ、実験用発酵槽または工業用発酵槽(バッチ発酵、供給バッチ発酵または固体培地での発酵)で培養できる。使用する培地は、炭素源と窒素源および無機塩類を含有するべきである。

この方法によれば、形質転換された宿主生物を除去することによって培養培地を回収する工程は、液体画分に含まれる固体画分を分離するための任意の手段によって行うことができる。特に濾過と遠心分離は、この工程を行うための適切な手段である。

本方法はさらに追加的精製工程(c)を加えることにより本発明によるフィターゼを生産する方法とすることができる。本発明によるフィターゼを生産するそのような方法の工程(c)は、工程(b)で回収された上清からフィターゼを精製することからなる。フィターゼの精製はタンパク質の濃縮または分離のための任意の技術、特に、精密濾過、限外濾過、電気泳動またはクロマトグラフィーといった当業者によく知られた技術によって行うことができる。精製されたフィターゼを得るために、それらの当業者は、前記フィターゼを含む精製画分を識別するためにフィターゼ活性を測定する上述の方法を使用することができる。この方法によれば、生産されたフィターゼは、好ましくは50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%の純度であるとよく、または100%の純度であると有利である。

本発明はまた、本発明による少なくとも1種類のフィターゼを含む酵素組成物に関する。

「酵素組成物」という用語は、本発明による少なくとも1種類のフィターゼ(このフィターゼの割合はその安定性およびその保存性を高めるために様々なアジュバントと組み合わせるかどうかにより変わり得る)を含む組成物を意味すると意図される。本発明による酵素組成物で使用される得るアジュバントの例としては、ソルビトール、マンニトール、安息香酸塩、無機塩または植物油を挙げることができる。本発明による酵素組成物は液状でもよく、この場合、組成物とそれが含むフィターゼは水溶液であり、または固体形状でもよく、この場合、組成物とそれが含むフィターゼは粉末状にして凍結乾燥される。

本発明の特定の実施形態によれば、酵素組成物は、本発明によるフィターゼに加えて、少なくとも1つの追加的酵素を含む。この追加的酵素はフィターゼ活性を有していてもよいし、またはフィターゼ活性以外の活性を有してもよい。この追加的酵素がフィターゼ活性を有する場合、前記フィターゼ活性は本発明によるフィターゼのフィターゼ活性とは異なり、それに補填的であることが好ましい。この追加的酵素がフィターゼ活性以外の活性を有する場合、それは例えば、キシラナーゼ、セルラーゼ、β-グルカナーゼ、ラミナリナーゼ、フェルラ酸エステラーゼ、プルラナーゼ、プロテアーゼ、アミダーゼ、ホスファターゼまたはマンナナーゼ活性を有してもよい。

好ましくは、前記酵素組成物は、家畜動物、特に単胃動物、好ましくはブタまたはトリ用飼料に配合するように意図される。

本発明はまた、本発明による少なくとも1種類のフィターゼを含む飼料組成物に関する。

「飼料組成物」という用語は、本質的には、家畜動物、特に単胃動物、好ましくはブタまたはトリ用飼料を意味するように意図される。本発明による飼料組成物は、理想的には、本発明による酵素組成物を補填した家畜動物用飼料である。したがって、本発明による飼料組成物は、本発明による少なくとも1種類の酵素組成物が加えられ、前記飼料組成物を得るために前記飼料と前記酵素組成物が混合されている家畜動物用飼料である。

本発明の特定の実施形態によれば、前記飼料組成物は、本発明による少なくとも1つの形質転換された宿主生物を含む。本発明の別の特定の実施形態によれば、前記飼料組成物は本発明によるポリヌクレオチドを有する少なくとも1種類の生物、特にペニシリウム属の少なくとも1種類の真菌、特にペニシリウムsp CBS 109899株の真菌を含む。

本発明による飼料組成物は、単胃動物栄養で使用されるように意図されると有利である。本発明の特定の実施形態によれば、前記飼料組成物はブタ栄養用である。本発明の別の特定の実施形態によれば、前記飼料組成物はトリ栄養用である。

さらに、本発明の対象は上記飼料組成物を生産する方法である。

本発明の特定の実施形態によれば、前記方法は、本発明による宿主生物、または本発明によるポリヌクレオチドを有する生物、特に、真菌、より正確にはペニシリウム属の真菌、特にペニシリウム属sp CBS 109899株を培養する工程、当業者に知られている任意の濃縮方法、特に濾過または遠心分離によって前記生物を濃縮する工程および前記濃縮された生物を飼料組成物中に配合する工程からなる。

本発明の別の特定の実施形態によれば、前記方法は、上記の前記抽出物または前記フィターゼを生産する方法の1つにより、フィターゼ活性を有する抽出物または本発明によるフィターゼを生産し、次いで、生産された前記フィターゼまたは前記抽出物を飼料組成物中に配合することからなる。

本発明はまた、植物系飼料のフィチン酸塩に含まれる無機リン酸塩の単胃動物による吸収を増加させる方法であって、前記動物の栄養に本発明によるフィターゼまたは酵素組成物を配合する方法に関する。好ましくは、前記方法では、前記単胃動物は、本発明による飼料組成物によって飼育される。

本発明はまた、単胃動物の栄養中のリンの添加量を減少させる方法であって、前記動物には本発明による飼料組成物を与える方法に関する。

本発明はまた、単胃動物の栄養に由来するリンの放出を減少させる方法であって、前記動物には本発明による飼料組成物を与える方法に関する。

本発明はまた、寄託番号CBS 109899を有するペニシリウムsp.属の糸状菌に関する。

以下の例は、本発明を例として示すものであるが、本発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１）
ペニシリウムsp CBS 109899株の特性および培養
1.1.特性
PDA寒天培地(24g/lのポテトデキストロースブロス、16g/l寒天-寒天)上で、CBS 109899株の菌糸体を、30℃で生育させたところ、時間経過に際して黄色くなった。気菌糸がカラムの周囲で観察されるが、ペニシリウムの特有の構造はない。振盪させながら28℃で2日間、MN-Uri液体培地(P.J.Punt and C.A.M.J.J.van den Hondel、(1992)Methods in Enzymology 216、447-457)中で真菌を培養した後に、濾過によって菌糸体を回収し液体窒素中で粉砕した。ゲノムDNAの抽出は、粉砕物1gに対し5mlの分解バッファー(1%SDS、2%トリトンX-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mMトリス、pH8.0)を用いて当業者にはよく知られたフェノールクロロホルム法によって行う。精製後、2倍容のエタノールを加えることによりゲノムのDNAを沈殿された。ハイフィデリティポリメラーゼおよびプライマーPN3(配列番号5)およびPN4(配列番号6)で実行されたPCR増幅で1175bpの断片が得られ、これは以下のように配列決定された(配列番号:7)。
PN3:5'-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3'
PN4:5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'

この内部転写されたスペーサー配列とデータバンクにおいて利用可能なITS配列とのアラインメントは、ペニシリウムアクレアトゥム(Penicillium aculeatum)のITS配列であると確認されたITS配列と96%の同一性、およびペニシリウムフニクロースム(Penicillium funiculosum)IMI 134756のITS配列と96%の同一性を示す。そこで、CBS 109899株をペニシリウムspと呼ぶことにした。

1.2.培養条件
CBS 109899株を培養するための合成媒体を決定した。それは、脱塩水中、10g/lのグルコース、0.1MのNH₄NO₃、1.5g/lのKH₂PO₄、0.5g/lのKCl、0.5g/lのMgSO₄、10mg/lのMnCl₂、10mg/lのZnSO₄および10mg/lのFeSO₄から構成される。フィターゼの発現については、PDA培地上で成長したコロニーから採取した1cm²菌糸体試料を、MSP3培地(10g/lのグルコース、NaNO₃、20g/lのフィチン酸カルシウム、0.5g/lのKCl、0.5g/lのMgSO₄、2.2mg/lのZnSO₄、1.1mg/lのH₃BO₃、0.5mg/lのMnCl₂、0.5mg/lのFeSO₄、0.17mg/lのCaCl₂、0.16mg/lのCuSO₄、0.15mg/lのNa₂MoO₄および5mg/lのNa₂EDTA)30ml中で振盪させながら30℃で7日間インキュベートする。培養物を5000rpmで10分間遠心分離し、実施例2に記載するようにして、上清を分析する。

（実施例２）
フィターゼ活性の測定
フィターゼ活性の測定は、シミズ(1992、Biosci.Biotech.Biochem.56(8)、1266-1269)の方法に基づく。この方法の原理は、フィターゼとその基質(1mM CaCl₂、pH5.5を含む、250mM酢酸塩中10g/lで調製されたフィチン酸ナトリウム溶液)との酵素反応の間に放出される無機リン酸塩の量を測定するものである。放出された無機リン酸塩の量は、このリン酸塩と色原体試薬(10.8%硫酸鉄1容積とモリブデン酸アンモニウム4容積とを0.012M H₂SO₄で瞬時に混合)との反応によって測定する。この反応は、高酸性媒体中、有色のリンモリブデン酸錯体(Fe²⁺の存在下)を形成し、生成された有色溶液の700nmで吸光度を分光分析計で測定することにより形成された錯体の量が定量される。

酵素反応速度を得るために3つの反応を37℃で10、20および30分間、平行して行う。20%のトリクロロ酢酸を2.5ml加えることにより酵素反応を停止する。粗抽出物(これは希釈してもよいし希釈しなくてもよい)に20%のトリクロロ酢酸、次いでフィチン酸を加えることにより試料の干渉を測定する。酵素反応についてのブランクは1mM CaCl₂、pH5.5を含む酢酸塩バッファー250mMで調製する。反応停止後、有色の試薬[1容積のFeSO₄.7H₂O+4容積のヘプタモリブデン酸アンモニウム溶液]を等容積添加することにより放出されたリン酸塩の量を明らかにする。青い発色の強度を分光分析によって700nmで測定する。0〜1mMの範囲のKH₂PO₄を使用してリン酸塩濃度と関連させる。酵素反応速度の過程でリン酸塩が現れる速度を用いて酵素活性を測定する。

（実施例３）
フィターゼ活性を含む真菌抽出物の分離
CBS 109899株を30℃で6〜8日間、エルレンマイヤーフラスコのスケールおよび3〜200リットルの発酵槽において培養する。生産培地は、10g/lのグルコース、40g/lのデンプン、25g/lの米糠、20g/lのCa²⁺フィチン酸塩、15g/lの塩化アンモニウム、0.5g/lの硫安および0.9g/lの脱泡剤から構成される。pHは5.5に調節するが、発酵中は制御しない。4%接種材料を用いて発酵を開始する。この接種材料は、10g/lのグルコース、10g/lのペプトン、5g/lのNa-CMC、0.5g/lの硫酸マグネシウム、0.5g/lの塩化カルシウム、0.01g/lのFeSO₄.7H₂Oおよび0.01g/lのMnS O₄.4H₂Oから構成される、30℃で3〜4日の培養物に相当する。接種材料は、胞子、または真菌が培養された寒天片(PDA培地、30℃で10日)を直接播種する。同じ条件下で3〜4日間調製した培養物それ自体で直接播種してもよい。

発酵の終わりに、全培養物を濾過し、10kDaの遮断分子量を有する有機または無機の膜による限外濾過により濾液を濃縮する。活性は限外濾過保持液について決定され、当初の発酵体積と関連付けられる。

（実施例４）
本発明による分離されたフィターゼの特性
得られた真菌粗抽出物の至適pHおよび至適温度、pHと温度に対する安定性およびさらにミカエリス定数を実施例2に記載された方法を使用して決定した。

4.1.ミカエリス定数
基質濃度およびインキュベーション時間を変えることによりミカエリス-メンテン定数(Km_app)および最大反応速度(Vm_app)を得た。真菌抽出物に含まれるフィターゼは、550μMのKm_app、および、毎分および試料1mg放出リン酸塩1.425μmolのVm_appによって特徴づけられる。

4.2.pHの関数としてのフィターゼ活性
pHおよび/または反応バッファー(pH2:KCl-HClバッファー;pH3:グリシン-HClバッファー;pH4、5、5.5および6:酢酸ナトリウムバッファー;pH7:トリス-HClバッファー)の性質を変えることにより至適pHを測定した。図1に表わす結果は、得られた最大酵素活性に対して計算された相対活性を示す。37℃で測定した真菌抽出物に含まれているフィターゼの至適pHは、pH4とpH5の間である。

4.3.温度の関数としてのフィターゼ活性
酵素反応のためのインキュベーション温度を変えることにより至適温度を測定した。得られた結果を図2に表わすが、これは、測定された最大酵素活性に対して計算された相対活性を示す。真菌抽出物に含まれるフィターゼの至適温度は、pH5.5で50℃の領域にある。

4.4.pHの関数としてのフィターゼの安定性
酸性pHに対するフィターゼ活性の抵抗性を評価した。0〜180分間、41℃でpH2とpH6.5の間のpHに抽出物をさらした後、溶液のpHを希釈によってpH5.5に安定させる。次いで、実施例2に記載した方法によって活性を決定する。結果は、抽出物のフィターゼ活性がpH3.5まで低下させても比較的安定していることを示す。しかし、それはより酸性のpH、特にpH2ではより急速に変性される。

4.5.温度の関数としてのフィターゼの安定性
60℃以上の温度についてフィターゼ活性の耐熱性を評価した。抽出物を希釈した溶液(最終濃度1IU/ml)を、所与の長さの時間(30分は超過せず)、試験温度にする。常温まで戻した後、熱処理した溶液をそれぞれ実施例1Aに記載した方法によって分析する。60℃では5分からフィターゼ活性はおよそ80%減少し、同じ実験条件下80℃では1分後に事実上0になる。

（実施例５）
本発明によるフィターゼの精製
実施例3で得られるような真菌酵素抽出物を10kDaの遮断分子量を備えた膜を使用して、限外濾過によって濃縮した。20mMグリシンバッファー(pH3)で数回洗浄することにより抽出物のイオン強度およびpHを調節する。

得られた濃縮液をpH3に維持したSP10カラム(PerSeptive BiosSystems)に適用することによって陽イオン交換クロマトグラフィーを行う。付着したタンパク質を、3ml/分の流速で、グリシンバッファー中の0から1M NaClの工程勾配で溶出する。フィターゼ活性のピークは1M NaClのおよそ30%に対して得られる。フィターゼは、0.7ml/分の流速で、50mM酢酸ナトリウムバッファー(pH5.5)で、HR200カラム(Pharmacia)上のゲル浸透によって、活性ピークの他の成分から分けられる。銀染色による非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって回収した画分の純度を評価する。単一タンパク質バンドがゲル上に存在し、130kDaの分子量と評価される。しかし、精製したフィターゼのSDS-PAGE電気泳動後には、2本のポリペプチドバンドが観察され、一方は主バンドで相対的な移動距離は70kDaであり、他方は相対的な移動距離90kDaの副バンドである。

（実施例６）
精製したフィターゼの微量配列決定
6.1.N-末端配列の決定
SDS-PAGE電気泳動によって得られた70および90kDaのポリペプチドバンドに対応するポリペプチドを、4℃、15時間でPVDF膜(ProBlott、Applied Biosystems)上に移した。ポリペプチドはアミドブラック10B(Sigma)で染色することにより検知し、配列決定した(パストゥール研究所、Laboratoire de Microsequensage des Proteines[タンパク質の微量配列決定研究室]、パリ)。2本のポリペプチドバンドについて同じN-末端配列(配列番号8)が得られた。

この結果は、SDS-PAGE上で識別された2本のポリペプチドバンドは恐らく同じポリペプチドに相当するものであり、移動速度の違いは精製工程の間に、ポリペプチド画分の部分的分解が生じた結果だという結論に結びついた。

6.2.フィターゼの内部断片のアミノ酸配列の決定
70および90kDaの2つのポリペプチドをSDS-PAGE電気泳動で単離し、アミドブラックで染色することにより検出した。70kDaのポリペプチドバンドはゲルから切り出し、ポリペプチドを37℃で18時間、エンドリシン(Endolysine)-Cでin situ分解をした。ペプチド断片をC18 DEAFカラム上のHPLCによって単離した。微量配列決定することにより4個の内部断片の配列を得た(配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12)。
配列番号:8:IPTDPQVPQ/VYF
配列番号:9:TSGGDAVNEWTALYLQK
配列番号:10:AGGAPFLAQXNPIYXQPXYV
配列番号:11:LYDPASK
配列番号:12:APGLVR

（実施例７）
ペニシリウムsp CBS 109899のフィターゼに関係する分子プローブの生産
微量配列決定後、ペニシリウムsp CBS 109899のフィターゼをコードする遺伝子に関係のあるDNA断片をPCRによって増幅するために、ペプチドからオリゴヌクレオチドを推定した。

7.1.PCRプライマー設計
配列番号9の内部配列のN-末端アミノ酸配列からプライマーを推定した。N-末端配列から、センス縮重プライマーの4個のプールが推定され、配列番号9の内部配列から逆方向縮重プライマーの1個のプールが推定された。センスプライマーの各プールを、逆方向プライマーのプールと共に別々に使用した。

7.2.フィターゼに関係のあるゲノムDNA断片の増幅
はじめに、ペニシリウムsp CBS 109899を、液体MN-Uri培地で培養した(28℃、180rpm、2日)。菌糸体を濾過して回収し、液体窒素中で粉砕した。ゲノムDNAの抽出は、粉砕物1gに対し5mlの分解バッファー(1%SDS、2%トリトンX-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mMトリス、pH8.0)および5mlのフェノールを用いて行った。水相をフェノール/クロロホルムおよびクロロホルム抽出により精製した後に、ゲノムのDNAに2倍容のエタノールを加えることにより沈殿させた。

PCR反応は、Taqポリメラーゼ(Q-BIOgene)1単位およびMJ Researchの Thermal cyclar model PTC-200を使用してゲノムDNA100ngに対して行った。各PCRからの反応生成物を0.8%のアガロースゲル上で分析した。850bpの領域内にあってOT ACS 17 P4.4(配列番号13)およびOT ACS 25 P6.1(配列番号14)のプライマー対に対応するヌクレオチド断片を得て、ベクターpCR4-TOPO(Invitrogen)に直接サブクローニングし、配列決定した(配列番号15)。

この配列の分析は、増幅のために使用した2個のプライマーが増幅された断片のそれぞれの側に存在し、それらから続く推定されたアミノ酸配列は、フィターゼを微量配列決定することにより得られたものと矛盾しないことを示した。さらに内部ペプチド断片配列番号10および配列番号11のアミノ酸配列はDNA断片から推定されるアミノ酸配列内に現れた。これらの観察結果から、増幅されたDNA断片は微量配列決定されたフィターゼに対応することが結論され、これはOT ACS 29.1と命名された。次いでこのDNA断片を、精製フィターゼをコードする遺伝子のクローニングをするための相同な分子プローブとして用いた。
OT ACS 17 P4.4(配列番号13)5'-ACNGAYCCNCARGTCCC
OT ACS 25 P6.1(配列番号14)5'-GCNGTCCAYTCRTTNAC

（実施例８）
ペニシリウムsp CBS 109899のフィターゼをコードする遺伝子のクローニングおよび同定
8.1.フィターゼに関係のあるcDNAの配列の決定
cDNAの完全な配列は、増幅、サブクローニングならびに5'および3'RACE-PCR技術によるその5'末端および3'末端配列決定によって得た。

はじめに、ペニシリウムsp CBS 109899を、40g/lのデンプン小麦粉、25g/lの米糠、20g/lのフィチン酸カルシウム、10g/lのグルコース、15g/lのNH₄Clおよび0.5g/lのMgSO₄.7H₂O、pH5.5から構成され、0.06g/lのグルコアミラーゼAMG 300L(Novozymes)および0.18g/lのアルファアミラーゼTermamyl 120L(Novozymes)を補った培地中、フィターゼの誘導条件下で培養した。培養は、培養培地のフィターゼ活性が10U/mlに到するまで継続した。ろ紙(ワットマン)によって培養物を濾過することにより菌糸体を回収し、次いで液体窒素中で粉砕した。10mM EDTAを含む50mM酢酸ナトリウムバッファー、pH5.3中のフェノール抽出によって粉砕物から全RNAを抽出した。次いで、mRNAをGeneRacerキット(Invitrogen)を用いて逆転写した。合成したcDNAsは、その5'および3'末端に所与のヌクレオチド配列(後のPCR増幅用)を持っていた。興味のあるcDNAの末端部を特異的に増幅するために、2つのプライマー(一方は5'末端方向でOT ACS 37 P1(配列番号20)と命名、他方は3'末端方向でOT ACS 37 P3(配列番号21)と命名)を、配列番号10のペプチドに関係のある領域の分子プローブから推定した。

cDNA合成産物1μlに対し、Taqポリメラーゼ(Q-BIOgene)1単位およびMJ Research Thermal cyclar model PTC200を使用してPCR反応を行った。増幅産物を0.8%アガロースゲル上で分析した。5'末端に関係のある0.3kbの領域および3'末端に関係のある1.7kbの領域の断片を直接ベクターpCR4-TOPO(Invitrogen)にサブクローニングし、次いで、配列決定した。次いで、完全なcDNA配列を再構成した(配列番号2)。
OT ACS 37 P1(配列番号20) 5'-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3'
OT ACS 37 P3(配列番号21) 5'-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3'

8.2.遺伝子を含むEcoRVゲノムDNA断片のサブクローニング
ゲノムDNAの断片はゲノムウォーキング技術を使用してクローンを作成した。はじめに、アダプターをEcoRV制限断片の末端部にライゲートした。これを行うために、ペニシリウムsp CBS 109899のゲノムDNAのEcoRV分解産物を、10mM MgCl₂、10mMジチオスレイトール、1mM ATPおよびウシ血清アルブミン0.25μg/ml中のT4 DNAリガーゼを含む50mMトリス-HClバッファーを用いて、pH7.5、16℃で、15時間で、GenomeWalkerアダプター(CLONTECH Laboratory社)にライゲートした。反応は70℃の熱処理によって停止し、反応混合物を超純水200μl中に採取した。

EcoRV制限断片の5'および3'領域を、PCRによって増幅するために、2つのセンスプライマー(一方は5'末端方向でOT ACS 32 P5(配列番号16)と命名、他方は3'末端方向でOT ACS32 P3(配列番号17)と命名)を分子プローブから推定した。PCR反応のために使用した逆方向プライマー(アダプターと命名)(CLONTECH Laboratory社)は、アダプターの5'末端の配列に対応した。

ライゲーション産物1μlに対し、Advantageゲノムポリメラーゼミックス(CLONTECH Laboratory社)1単位およびMJ Research Thermal cyclar model PTC200を使用してPCR反応を行った。各PCRからの反応生成物を0.8%アガロースゲル上で分析した。

2個の断片、一方は5'末端に関係のある1.8kbの領域、他方は3'末端に関係のある1.3kbの領域をサブクローニングし配列決定により分析した。5'および3'EcoRV断片のヌクレオチド配列が得られたので、各末端に特異的なプライマーを設計し、OT ACS 38 P1(配列番号18)およびOT ACS 38 P2(配列番号19)と命名した。断片はハイフィデリティポリメラーゼを使用して、その全体を増幅した。ペニシリウムsp. CBS109899のゲノムDNA100ngに対してPLATINUM Pfx DNAポリメラーゼ(Life Technologies社)1単位、およびMJ Research Thermal cyclar model PTC-200を使用してPCR反応を行った。増幅産物を0.8%アガロースゲル上で分析した。3.8kbの断片をvectgor pCR4-TOPO(Invitrogen)にサブクローニングし、配列決定し(配列番号1)、OT ACS 38.1と命名した。

8.3.cDNAおよび遺伝子の配列の分析
cDNAからアミノ酸配列を推定し分析した(配列番号3)。微量配列決定によって得られたフィターゼの内部ペプチド配列はこのアミノ酸配列内に見つかり、配列決定されたcDNAが目的とするフィターゼに相当することを確認した。さらに、推定されたアミノ酸配列は、結合のための特異的サイト(RHGXRXP)およびリン酸塩の求核攻撃サイト(HD)を含み、これらがヒスチジン酸ホスファターゼ類のグループに属するフィターゼであると同定された。cDNA配列とゲノムDNA断片OT ACS 38.1のアラインメントから、目的遺伝子の正確な範囲を決定しそれに含まれるイントロンの位置が決定できた。

（実施例９）
相同な配列の探索
9.1.ペニシリウムフニクロースムIMI 134756株のコスミドライブラリーの構築
P.funiculosum IMI 134756を液体MN-Uri培地(28℃、180rpm、2日)において培養した。菌糸体は濾過によって回収し、液体窒素中で粉砕した。ゲノムDNAの抽出は、粉砕物1gに対し5mlの分解バッファー(1%SDS、2%トリトンX-100、100mM NaCl、1mM EDTA、10mMトリス、pH8.0)および5mlのフェノールを用いて行った。水相をフェノール/クロロホルムおよびクロロホルムにより精製した後に、ゲノムのDNAに2倍容のエタノールを加えることにより沈殿させた。

SalI制限酵素によるゲノムDNAの部分分解産物20μgを、アガロース(低融点)ゲル上に載せ、0.5×TBEバッファー中でパルスフィールド電気泳動(18時間、5V/cm)にかけた。臭化エチジウムで汚色した後に、30〜40kbの長さのDNA断片をゲルからβ-アガラーゼ(GIBCO-BRL)による消化によって解放し、エタノールで沈殿させた。このゲノムDNAアリコートを、予めXhoIで分解し子牛腸ホスファターゼで脱リン酸化したベクターpMOCosX[Orbach(1994)、GENE 150、pp.159-162]にライゲートした。ライゲーション産物をλファージ要素と接触させ(パッケージングプロトコル-STRATAGENE;Gigapack Gold-11)、大腸菌株Q358(Maniatis et al.、1982)を感染可能にした。アンピシリン50μg/mlを補ったルリア-ベルターニ(LB)寒天培地上に植菌した後、コロニーを50枚の96-穴マイクロタイタープレート中に採取し、アンピシリン50μg/mlを補ったLB150μl中で一夜培養した。培養物をHybond N+膜(AMERSHAM)上に移し、最終濃度50%のグリセリンを補い、-80℃で保存した。

9.2.プローブOT ACS 29.1によるコスミドライブラリーのスクリーニング
P.funiculosum IMI 134756株のゲノムDNAへのサザンブロッティングによる分析をプローブOT ACS 29.1を用いて行った。予めいくつかの制限エンドヌクレアーゼで分解し、電気泳動によって単離したゲノムDNAを移した膜を、ハイブリダイゼーションバッファー(7% SDS;0.5Mリン酸ナトリウム、pH7.0)、65℃で10分間プレハイブリダイズした。DNA標識キット(Amersham)を使用して、α-³²P dCTPをプローブに標識として付けた。標識プローブは、ハイブリダイゼーションバッファーに加え、混合物を使用前に100℃で5分間加熱した。ハイブリダイゼーションは65℃で6時間実行した。ハイブリダイゼーション後に、膜を、すすぎ用バッファー(1%SDS;0.1Mリン酸ナトリウム、pH7.0)中、65℃で15分間、3回すすぎ、次いで露出した。この分析では1つの信号だけが明らかになった。したがって、P.funiculosum IMI 134756のゲノムは、目的遺伝子を1コピーのみ含む。次いで、コスミドライブラリーを、プローブOT ACS 29.1を使用して、同じストリンジェントな条件下でスクリーニングしたところ、膜15、19および48番上でいくつかの信号が明らかになった。したがって、コスミド15F10(膜15番に関係する)は、プローブOT ACS 29.1とハイブリダイズしたDNA配列を含むものとして識別された。対応する遺伝子の位置を決定するためにこのコスミドのDNA上で制限分析を行った。遺伝子はphyFと命名された。コスミド15F10の1.3kbのNcoI断片のクローニングおよび配列決定は、配列OT ACS 29.1と強い相同性を示した。完全なphyF遺伝子は2.7kbのEcoRV-EcoRI断片に位置付けられ、クローン化され配列決定された(配列番号4)。

配列分析の結果は、ATG 791において、790bpのプロモーター領域およびphyFをコードする配列の開始部分を示す。phyF遺伝子は1536bpを有し(位置791-2527)、2つの推定上のイントロン(長さで35bpと61bp)を含む。

（実施例１０）
OT ACS 38.1(配列番号1)に含まれる遺伝子の組み換え発現
10.1.P.funiculosum IMI 134756中への遺伝子の複数コピーの導入
クローン化した遺伝子(OT ACS 38.1)を有効にするために、P.funiculosum IMI 134756株(これはフィターゼをほとんど生産しない)のゲノムに複数コピーを導入し、形質転換されたクローンが生産力の増加を示すかどうかを観察することを企図した。

このために、P.funiculosum IMI 134756を、断片OT ACS 38.1を含むプラスミド、およびハイグロマイシンによる選択を可能にするプラスミドpAN7-1(Punt et al.、1987;Gene、56:117-24)と共に、特許WO 00/68401に記載された技術によって同時形質転換した。形質転換の後に、分子プローブOT ACS 29.1を使用したサザン分析によって対象遺伝子の多重コピー組み込みが確認された。サザン分析は実施例9に記載した条件に従い、EcoRI制限エンドヌクレアーゼにより分解した候補のゲノムDNAに対して行った。

20g/[lacuna]フィチン酸カルシウム、10g/lグルコース、8g/lのNH₄NO₃、5g/lのKClおよび5g/lのMgSO₄.7H₂Oに微量元素(2.2%のZnSO₄.7H₂O、1.1%のH₃BO₃、0.5%のMnCl₂.4H₂O、0.5%のFe SO₄.7H₂O、0.17%のCOCl₂.6H₂O、0.16%のCuS0₄.5H₂O、0.15%のNa₂MoO₄.2H₂Oおよび5.0%のNa₂EDTA、pH6.5)溶液1ml/lを補った媒地50ml中、フィターゼ誘導条件下で陽性候補を培養した。培地中のフィターゼ活性を経時的に測定した。

2つの候補の分析について得られた結果(形質転換していないP.funiculosum IMI 134756を対照として使用した)を表2に示す。

培地中でのフィターゼ活性のモニタリング結果は、それらのゲノムへOT ACS 38.1の多重コピーを組み込んで試験した2つの候補については、フィターゼ生産力が2〜2.5倍に増加することを示した。この結果は、断片OT ACS 38.1に含まれていた対象遺伝子がフィターゼをコードしており、ペニシリウム株のフィターゼ生産能力はそのゲノム内の遺伝子のコピーの数を増加させることにより増加させることができることを確認するものと言えよう。

10.2:異種プロモーターの制御下での遺伝子の発現
特許WO 00/68401に記載されたcsl31遺伝子のプロモーターおよびターミネーターを含む発現カセットを対象フィターゼをコードするゲノムDNA断片OT ACS 38.1の領域を発現するために使用した。このために、SwaIサイトをプロモーターの末端に導入した後、発現カセットをSwaI/SpeI制限エンドヌクレアーゼで分解した。ゲノムDNA断片OT ACS 38.1に含まれるフィターゼをコードする領域を下記のプライマーを使用して増幅した。
phyGoamp4 5'TAGATATCACGATGCTCAAGCTATATGTAGCTGC 3'(配列番号22)および
phyGoamp5 5'ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG 3'(配列番号23)。

PCR反応は、このポリメラーゼ(Life Technologies社)に関係のあるバッファー50μl中、各プライマー10pmolおよびPLATINUM Pfx DNAポリメラーゼ(Life Technologies社)1単位を用いMJ Research Thermal cyclar model PTC-200を使用して行った。PCR産物をEcoRVおよびSpeI制限エンドヌクレアーゼで分解し、ベクターpBCMTに結合した。このようにして得たプラスミドはpCPと命名された。

P.funiculosum IMI 134756を、断片OT ACS 38.1を含むプラスミド、およびハイグロマイシンによる選択を可能にするプラスミドpAN7-1(Punt et al.、1987;Gene、56:117-24)と共に、特許WO 00/68401に記載された技術によって同時形質転換した。候補ゲノム中へのpCPカセットの組み込みは、EcoRI制限エンドヌクレアーゼで分解した8つの候補のゲノムDNAに対し、分子プローブOT ACS 29.1を使用して、サザン分析によって確認した。分析後に、4つの同時形質転換体を選択し、csl31プロモーターの誘導条件下で培養した。遺伝子の発現を分析し、フィターゼ活性を測定した。

選択した4つの候補を、125mlのエルレンマイヤーフラスコ中、1%コーンスティープリカーを補った最小培地50mlにおいて培養した。28℃で48時間および72時間、培養した後に180rpmで菌糸体を回収し、各試料について全RNA20μgに対しプローブOT ACS 29.1を用いてノーザン分析を行った(Sambrook et al.、1989、Molecular Cloning:A Laboratory Manual)。膜をすすいだ後、STORM phosphoimager(Molecular Dynamics)を使用して信号を視覚化した。

結果は、pCPで形質転換した候補中でのみ信号を示し、形質転換されていない対照では信号が見られず、csl31プロモーターの制御下で遺伝子が発現されることを実証している。

平行して、各培養物の上清においてフィターゼ活性を測定した。結果を表3に示す。

結果の分析は、フィターゼ活性がpCPで形質転換した候補に対応する上清中にのみあることを示す。この結果は、遺伝子の発現に一致しており、ゲノムのDNA断片がフィターゼをコードする遺伝子を含むことを実証する。

（実施例１１）
ペニシリウムsp CBS 109899株を培養するための条件の最適化
11.1.フィターゼ生産に対する撹拌の影響
実施例3の条件下、400〜450rpmの範囲の撹拌速度(表4)で発酵を行った。

これらの結果は、天然のペニシリウムsp CBS 109899株によるフィターゼ生産では撹拌の増加が負の効果を及ぼしたことを示す。

11.2.フィターゼ生産に対する窒素源の影響
実施例3の条件下、発酵を行った。変わるただ1つのパラメーターは窒素源(米糠)であり、これを異なる窒素源(大豆ふすま)に置き換える(表5)。

これらの結果は、天然のペニシリウムsp CBS 109899株によるフィターゼ生産に窒素源が影響を及ぼすことを示す。特に大豆ふすまは窒素源としてフィターゼ生産を促進する。

11.3.フィターゼ生産に対するフィチン酸塩源の影響
実施例3の条件下、発酵を行った。変わるただ1つのパラメーターはCa⁺⁺フィチン酸塩であり、これをCa⁺⁺とMg⁺⁺との複塩に置き換える(表6)。

これらの結果は、天然のペニシリウムsp CBS 109899株によるフィターゼ生産にフィチン酸塩源が影響を及ぼすことを示す。特にカルシウムとマグネシウムとの複塩をフィチン酸塩源として用いることでカルシウム塩と比較して、フィターゼ生産を改善できる。

11.4.フィターゼ生産に対するフィチン酸塩量の影響
実施例3の条件下、発酵を行った。変わるただ1つのパラメーターは発酵培地中のフィチン酸塩の量である(表7)。

これらの結果は、天然のペニシリウムsp CBS 109899株によるフィターゼ生産は、発酵培地中のフィチン酸塩の量に従って顕著に増加することを示す。

（実施例１２）
ペニシリウムsp CBS 109899株によって生産したフィターゼの畜産学的効果
12.1.おんどりによるリン消化率に対するフィターゼ補填食餌の影響
実験は20羽のおんどりに対して行った。試験動物を10羽ずつの2群に分け、一方を処理群、他方を対照群とした上で、ケージの中で個別に育てた。次いで、これらに、可消化リン(P)が不足しているトウモロコシおよび大豆に基づく飼料を与え、処理動物群用飼料では、1kg当たりフィターゼ702IU(国際単位=37℃、pH5.5で、毎分リン酸塩1μmolを放出することができるフィターゼの量、10g/lのフィチン酸ナトリウム溶液)を補った。

リン排泄を分析するため、実験開始後2および3日で動物の糞便を回収した。リン消化率は、摂取した量と比較して、動物が吸収したリンの割合(パーセンテージ)に相当する。このパーセンテージは、糞便中で見られる排泄量から推定される(表8)。

表6中の結果は、可消化リンが不足している基本飼料に本発明によるフィターゼを補填することでリン排泄が著しく低減する(P<0.05)ことを明らかに示す。この効果は、補填した飼料が所与の動物においてリン消化率を増大させていることを反映する。それは、材料摂取物中の非可消化リンの放出における本発明によるフィターゼの効果を示す。

12.2.ヒヨコの成長に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、Ross308品種の210羽のヒヨコに対して行った。動物は35羽ずつ6群に分け、4つの動物群は様々なフィターゼの投与で処理し、1群は処理していないネガティブコントロール、1群は無機リンで処理したポジティブコントロールとした。動物は1ケージ当たり5羽の割合で育て、13日(9日齢から22日齢まで)間飼育した。処理動物の4群については、トウモロコシと大豆からなり可消化リン(P)が不足している基本飼料に、フィターゼを4つの異なる濃度(飼料の1kg当たりフィターゼ243、433、738および1234IU)で補い、ポジティブコントロールについては、一カルシウム塩または二カルシウムリン酸塩の形態の無機リン0.1%を補った。

成長は実験の始めおよび終わりに動物の体重を測定することにより行った。これらの測定により体重増加量および消費指数(CI)を決定することができる。消費指数は、体重増加量に対する消費した飼料の量に相当する。所与の量の飼料については、指数の減少は、動物が獲得した重量増加(つまり動物による飼料のよりよい吸収)を示す。結果を表9に示す。

結果は、可消化リンが不足している基本飼料に本発明によるフィターゼ243、433、738および1234IU/kgを補填すると、それぞれ1.7、2.0、2.1および2.3倍の体重増加をもたらすことを示す。最も高い服用量でも、無機リンを飼料に補填するよりさらに大きな体重増加を得ることを可能にする。この補填は、さらに消費指数を平均で33%増加させることを可能にする。

12.3.ヒヨコにおける骨無機化に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、Ross308品種の210羽のヒヨコに対して行った。動物は35羽ずつ6群に分け、4つの動物群は様々なフィターゼの投与で処理し、1群は処理していないネガティブコントロール、1群は無機リンで処理したポジティブコントロールとした。動物は1ケージ当たり5羽の割合で育て、13日(9日齢から22日齢まで)間飼育した。処理動物の4群については、トウモロコシと大豆からなり可消化リン(P)が不足している基本飼料に、フィターゼを4つの異なる濃度(飼料の1kg当たりフィターゼ243、433、738および1234IU)で補い、ポジティブコントロールについては、一カルシウム塩または二カルシウムリン酸塩の形態の無機リン0.1%を補った。

14日目に、各動物から脛骨を除去する。各脛骨は秤量し灰化する。また、その灰、カルシウムおよびリン含有量を分析する。結果を表10に示す。

これらの結果は、試験したすべての濃度について、ヒヨコにおける骨無機化に対する本発明によるフィターゼ補填飼料のプラスの効果を明らかに示す。特に本発明によるフィターゼは、骨のカルシウムおよびリン無機化ならびにそれらの灰多量化を促進する。さらに、測定したパラメーターの各々について投与量の効果が観察される。

12.4.ブタにおけるリンおよびカルシウム消化率に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、およそ70kgの平均体重を有する7匹のブタに対して行った。その回腸の内容物を定量的に回収し得るように、これらの動物において回腸と直腸の吻合を外科手術によって行った。これらは、実験の必要のために個別に育てた。

動物に、トウモロコシと大豆に基づく3種類の飼料を与えた。栄養補助剤は、飼料1kg当たり300および600IUで与えた。各動物は6日連続して飼料に適応させた。7日目に回腸の内容物を回収し、次いで、動物飼料を変更した。回腸の内容物中のカルシウムおよびリンの量を分析し、次いで、これらの2元素の消化率を測定した。結果を表11に示す。

本発明によるフィターゼを飼料に補填することにより、カルシウムおよびリン消化率が著しく増加する。それぞれ、飼料1kg当たり300および600IUを補填した飼料については、カルシウム消化率は、それぞれ5.6%と9.3%増加し、リン消化率は、飼料1kg当たり300および600IUを補填した飼料についてそれぞれ8.4%と17%増加する。

12.5.子豚におけるリン消化率に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、およそ11kgの平均体重を備えた12匹の子豚に対して行った。動物は、6匹ずつ2群に分け、一方は処理動物群、他方は対照動物群とし、次いで、ケージにおいて個別に育てた。次いで、それらに26日間、可消化リン(P)の不足したトウモロコシと大豆に基づく飼料1kg当たりフィターゼ481IUを補填した飼料を与えた。

リンおよびカルシウム含有量を分析するために動物の糞便を実験21日目から5日間回収した。リン消化率は、摂取された量と比較した、動物によって吸収されたリンおよびカルシウムのパーセンテージに相当する。このパーセンテージは、糞便中に見られる排泄量から推定される(表12)。

これらの結果は、本発明によるフィターゼを飼料に補填することでリン消化率が250%、カルシウム消化率が42%増加することを示す。

12.6.子豚の成長に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、およそ11kgの平均体重を備えた12匹の子豚に対して行った。動物は、6匹ずつ2群に分け、一方は処理動物群、他方は対照動物群とし、次いで、ケージにおいて個別に育てた。次いで、それらに26日間、可消化リン(P)の不足したトウモロコシと大豆に基づく飼料1kg当たりフィターゼ481IUを補填した飼料を与えた。

実験の始めと終わりに動物の体重を測定することにより成長を評価した。これらの測定により、体重増加量および消費指数(CI)を決定できた。結果を表13に示す。

これらの結果は、可消化リンの不足した基本飼料に本発明によるフィターゼ481IU/kgを補填することによって24%の体重増加がもたらされることを示す。この補填は消費指数を著しく減少させる。

12.7.子豚中の骨無機化に対するフィターゼ補填食餌の効果
実験は、およそ11kgの平均体重を備えた12匹の子豚に対して行った。動物は、6匹ずつ2群に分け、一方は処理動物群、他方は対照動物群とし、次いで、ケージにおいて個別に育てた。次いで、それらに26日間、可消化リン(P)の不足したトウモロコシと大豆に基づく飼料1kg当たりフィターゼ481IUを補填した飼料を与えた。

実験の27日目に各動物から脛骨を除去する。各脛骨を秤量し灰化し、その無機成分、カルシウムおよびリン含有量を分析する。結果を表14に示す。

これらの結果は、可消化リンの不足した基本飼料に本発明によるフィターゼ481IU/kgを補填することによって、子豚において骨無機化が著しく増加することを示す。特に本発明によるフィターゼは、骨のカルシウムおよびリン無機化にプラスであり、さらにその無機成分量を増やす。

ペニシリウムsp CBS 109899のフィターゼ活性をpHの関数として示すグラフである(相対活性100%の値は、所与のpHでのフィターゼの至適活性に相当する)。 ペニシリウムsp CBS 109899のフィターゼ活性を温度の関数として示すグラフである(相対活性100%の値は、所与の温度でのフィターゼの至適活性に相当する)。

【配列表】

Claims (53)

1. (a) 配列番号3によって記載されるフィターゼをコードする単離されたポリヌクレオチド
   (b) (a)によるポリヌクレオチドとハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド
   (c) (a)によるポリヌクレオチドに相同な単離されたポリヌクレオチド
   (d) (a)、(b)または(c)によるポリヌクレオチドの断片
   からなる群から選択される、フィターゼをコードする単離されたポリヌクレオチド。
2. 配列番号1および配列番号2によって表わされる配列から選択される請求項1に記載のポリヌクレオチド。
3. 配列番号4によって表わされる請求項1に記載のポリヌクレオチド。
4. ペニシリウム属の真菌に由来する請求項1から3のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
5. 請求項1から4のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
6. 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドによってコードされるフィターゼ。
7. (a) 配列番号3によって表わされるフィターゼ
   (b) (a)によるフィターゼに相同なフィターゼ
   (c) (a)または(b)によるフィターゼの断片
   からなる群から選択される請求項6に記載のフィターゼ。
8. ペニシリウム属の真菌に由来する請求項6または7のいずれかに記載のフィターゼ。
9. ペニシリウムsp CBS 109899株に由来する請求項8に記載のフィターゼ。
10. (a) 宿主生物において機能する1個のプロモーター、
    (b) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、
    (c) 宿主生物において機能するターミネーター要素
    を少なくとも含み、互いに機能的に関連しているキメラ遺伝子。
11. さらに前記宿主生物において機能するシグナルペプチドまたは輸送ペプチドを含む請求項10に記載のキメラ遺伝子。
12. 請求項10および11のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む発現または形質転換ベクター。
13. プラスミド、ファージまたはウィルスである請求項12に記載のベクター。
14. 請求項10および11のいずれかに記載のキメラ遺伝子を含む形質転換した宿主生物。
15. 微生物である請求項14に記載の宿主生物。
16. 前記微生物が細菌、真菌、酵母またはウィルスから選択される請求項15に記載の宿主生物。
17. 前記微生物が、コリネバクテリウム属、バチルス属、ストレプトミセス属およびエシェリキア属、特に大腸菌から選択される細菌、である請求項16に記載の宿主生物。
18. 前記微生物がペニシリウム属、アスペルギルス属、クリソスポリウム属およびトリコデルマ属から選択される真菌である請求項16に記載の宿主生物。
19. 前記微生物がサッカロミセス属、クルイヴェロミセス属およびピチア属から選択される酵母である請求項16に記載の宿主生物。
20. 植物細胞、植物または植物の一部である請求項14に記載の宿主生物。
21. フィターゼ活性を有する抽出物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
    (d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
    (e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程
    を含む方法。
22. フィターゼ活性を有する抽出物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
    (b) 前記生物を除去することにより培養培地を回収する工程
    を含む方法。
23. 請求項21または22に記載の方法の工程をすべて含み、
    (f) 請求項21に記載の方法については工程(e)で回収した上清からフィターゼを精製する工程
    (c) 請求項22に記載の方法については工程(b)で回収した培養培地からフィターゼを精製する工程
    の追加工程を加えてなる、請求項6から9のいずれか一項に記載のフィターゼの生産方法。
24. 前記生物が微生物である請求項21、22または23のいずれか一項に記載の生産方法。
25. 前記微生物が真菌である請求項24に記載の生産方法。
26. 前記真菌がペニシリウム属の真菌である請求項25に記載の生産方法。
27. 前記ペニシリウム属の真菌がペニシリウムsp CBS 109899株である請求項26に記載の生産方法。
28. フィターゼ活性を有する抽出物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項14から20のいずれか一項に記載の形質転換した宿主生物を培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した形質転換した宿主生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
    (d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
    (e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程
    を含む方法。
29. フィターゼ活性を有する抽出物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項14から20のいずれか一項に記載の形質転換した宿主生物を培養する工程
    (b) 前記形質転換した宿主生物を除去することにより、培養培地を回収する工程
    を含む方法。
30. 請求項28および29に記載の方法の工程をすべて含み、
    (f) 請求項28に記載の方法については工程(e)で回収した上清からフィターゼを精製する工程
    (c) 請求項29に記載の方法については工程(b)で回収した培養培地からフィターゼを精製する工程
    の追加工程を加えてなる、請求項6から9のいずれか一項に記載のフィターゼの生産方法。
31. 請求項6から9のいずれか一項に記載の少なくとも1種類のフィターゼを含む酵素組成物。
32. 請求項14から20のいずれか一項に記載の少なくとも1種類の形質転換した宿主生物を含む飼料組成物。
33. 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する少なくとも1種類の生物を含む飼料組成物。
34. 前記生物が真菌である請求項33に記載の飼料組成物。
35. 前記真菌がペニシリウム属の真菌である請求項34に記載の飼料組成物。
36. 真菌がペニシリウムsp CBS 109899株である請求項35に記載の飼料組成物。
37. 請求項6から9のいずれか一項に記載の少なくとも1種類のフィターゼを含む飼料組成物。
38. 請求項32から37のいずれか一項に記載の飼料組成物の単胃動物栄養のための使用。
39. ブタの栄養を目的とする請求項38に記載の飼料組成物の使用。
40. トリの栄養を目的とする請求項38に記載の飼料組成物の使用。
41. 請求項32に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項14から20のいずれか一項に記載の宿主生物を培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した宿主生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した宿主生物を前記材料組成物に配合する工程
    を含む方法。
42. 請求項33から36のいずれか一項に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した生物を前記飼料組成物に配合する工程
    を含む方法。
43. 請求項37に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
    (d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
    (e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程
    (f) 工程(e)で回収した上清を前記飼料組成物に配合する工程
    を含む方法。
44. 請求項37に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項1から5のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを有する生物を、前記フィターゼの発現を可能にする条件下で培養する工程
    (b) 前記生物を除去することにより培養培地を回収する工程
    (c) 工程(b)において回収した培養培地を前記飼料組成物に配合する工程
    を含む方法。
45. 請求項37に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項14から20のいずれか一項に記載の形質転換した宿主生物を培養する工程
    (b) 工程(a)において培養した形質転換した宿主生物を濃縮する工程
    (c) 工程(b)において分離した生物の細胞を破裂させる工程
    (d) 工程(c)において得た破裂細胞の抽出物を遠心分離する工程
    (e) 工程(d)に由来するフィターゼ活性を有する上清を回収する工程
    (f) 工程(e)で回収した上清を前記飼料組成物に配合する工程
    を含む方法。
46. 請求項37に記載の飼料組成物の生産方法であって、以下の工程:
    (a) 請求項14から20のいずれか一項に記載の形質転換した宿主生物を培養する工程
    (b) 前記形質転換した宿主生物を除去することにより、培養培地を回収する工程
    (c) 工程(b)の中で回収した培養培地を前記飼料組成物に配合する工程
    を含む方法。
47. 工程(f)を以下の工程:
    (f) 工程(e)において回収した上清からフィターゼを精製する工程
    (g) 工程(f)において精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する工程
    に置換する請求項43または45に記載の方法。
48. 工程(c)を以下の工程:
    (c) 工程(b)において回収した培養培地からフィターゼを精製する工程
    (d) 工程(c)において精製したフィターゼを前記飼料組成物に配合する工程
    に置換する請求項44または46に記載の方法。
49. 植物系飼料のフィチン酸塩中に含まれる無機リン酸塩の単胃動物による同化を増加させる方法であって、請求項6から9のいずれか一項に記載のフィターゼまたは請求項31に記載の酵素組成物を前記動物の栄養中に配合する方法。
50. 前記単胃動物に、請求項32から37のいずれか一項に記載の飼料組成物を与える請求項48に記載の方法。
51. 単胃動物の栄養中のリン添加量を減少させる方法であって、請求項32から37のいずれか一項に記載の飼料組成物を前記動物に与える方法。
52. 単胃動物の栄養に由来するリンの放出量を減少させる方法であって、請求項32から37のいずれか一項に記載の飼料組成物を前記動物に与える方法。
53. 寄託番号CBS 109899を有するペニシリウム属sp.の糸状菌。
    
    

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