PL168470B1 - Sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu PL - Google Patents

Abstract

1. SPOSÓB UWALNIANIA NIEORGANICZNEGO FOSFORANU Z FITYNIANU, ZNAMIENNY TYM, ZE POCHODZACA ZE ZRÓDLA GRZYBOWEGO FITAZE OCZYSZCZA SIE DO AKTYWNOSCI WLASCIWEJ POWYZEJ 50 JEDNOSTEK/MG BIALKA, OCZYSZCZONA FITAZE PODDAJE SIE FRAGMENTACJI ZA POMOCA CNBR, OZNACZA SIE SEKWENCJE N-KONCOWYCH AMINOKWASÓW OTRZYMANYCH FRAGMENTÓW BIALKOWYCH, PRZYGO- TOWUJE SIE NA DRODZE SYNTEZY KOMPLEKS SPECYFICZNYCH SOND OLIGONUKLEOTYDOWYCH W OPARCIU O OZNACZONA SEKWENCJE AMINOKWASOWA, IDENTYFIKUJE SIE PRZEZ HYBRYDYZACJE KLONY DNA Z BANKU GENOMOWEGO, PROWADZI SIE HODOWLE ZIDENTYFIKOWANYCH KLONÓW I WYODREBNIA SIE SKLONOWANA SEKWENCJE DNA, SEKWENCJE TE PRZYLACZA SIE DO PROMOTORA I EWENTUALNIE SEKRE- CYJNEJ SEKWENCJI LIDEROWEJ I TAK OTRZYMANA KONSTRUKCJE EKSPRESYJNA WPROWADZA SIE DO WEKTORA I TAK OTRZYMANYM WEKTOREM, ZDOLNYM DO TRANSFORMOWANIA KOMÓRKI GOSPODARZA, TRANSFORMUJE SIE KOMÓRKI GOSPODARZA, PO CZYM PROWADZI SIE HODOWLE TAK OTRZYMANEJ TRANS- FORMOWANEJ KOMÓRKI GOSPODARZA, USUWA SIE KOMÓRKI I WYODREBNIA SIE Z POZYWKI OTRZYMANY PEPTYD LUB BIALKO O AKTYWNOSCI FITAZY, PO CZYM FITYNIAN PODDAJE SIE DZIALANIU TAK OTRZYMANEGO PEPTYDU LUB BIALKA O AKTYWNOSCI FITAZY. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu.

Fosfor jest ważnym składnikiem potrzebnym do wzrostu wszystkich organizmów. W celu osiągnięcia szybkiego wzrostu zwierząt jednożołądkowych (świnie, drób i ryby), pasza przeznaczona dla tych zwierząt musi być wzbogacona w nieograniczony fosfor. W przeciwieństwie do tego, nie zachodzi konieczność dodawania fosforu do paszy przeznaczonej dla zwierząt przeżuwających. Mikroorganizmy, obecne w pierwszym żołądku przeżuwaczy, wytwarzają enzymy katalizujące konwersję fitynianów (myo- i nozytoheksakis-fosforan) do inozytu i nieorganicznych fosforanów. Fityniany występują we wszystkich substancjach paszowych pochodzenia roślinnego i stanowią źródło zmagazynowanego fosforu. [Phytic acid, chemistry and applications, E-Graf(ed), Bilitus Press; Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone Ameryki, (1986)]. 1 3 % orzechów, roślin zbożowych, strączkowych, nasion oleistych, zarodników i pyłków zawiera fityniany. Sole kompleksowe kwasu fitynianowego nazywane są fitynami. Kwas fitynowy uznany jest jako czynnik antyodżywczy, ponieważ chelatuje wapń, cynk, magnez, żelazo, a ponadto może reagować z białkami zmniejszając przyswajalność białek oraz ważnych odżywczo soli mineralnych. Fosfor zawarty w fitynianach przechodzi przez układ żołądkowo-jelitowy zwierząt jednożołądkowych i wydalany jest w odchodach. Chociaż zachodzi częściowa hydroliza fitynianów w okrężnicy, zwolniony nieorganiczny fosfor nie ma wartości odżywczych, ponieważ wchłania się tylko w jelicie cienkim. W konsekwencji, znaczna ilość ważnego pod względem odżywczym fosforanu nie jest używana przez zwierzęta jednożołądowe, pomimo tego, że jest on obecny w paszy.

Wydalanie w odchodach fosforu zawartego w fitynianach niesie dalsze konsekwencje. W ostatnich dziesięcioleciach nastąpił olbrzymi wzrost intensywnej hodowli. Odpowiednio wzrosła ilość odchodów, co spowodowało pojawienie się problemów z ochroną środowiska w różnych częściach świata. Częściowo powodem tego jest gromadzenie się fosforu pochodzącego z odchodów w wodach powierzchniowych, co spowodowało eutrofizację. Wytwarzane przez mikroorganizmy enzymy katalizujące przemianę fitynianu w inozyt i fosfor nieograniczony są szeroko znane jako fitazy. Mikroorganizmy produkujące fitazę obejmują bakterie, takie jak Bacillus subtilis (V.K. Paver i V. J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151, str. 1102 - 1108), i Pseudomonas (D.J. Cosgrove (1970) Austral J. Biol. Sci. 23, str. 1207 - 1220); drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae (N.R. Nayini i P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaftund Technologie 17, str. (24 - 26); oraz grzyby, takie jak Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda i S. Yamamoto (1986), Agric. Biol. Chem. 32, 1275 - 1282). Różne inne grzyby Aspergillus znane są jako grzyby wytwarzające fitazę. Fitazę wytwarzaną przez Aspergillus ficuum cechuje jeden z najwyższych poziomów aktywności właściwej oraz lepsza termostabilność w porównaniu z fitazami wytwarzanymi przez inne mikroorganizmy (nieopublikowane obserwacje).

Koncepcja dodawania fitazy pochodzenia mikrobiologicznego do pasz przeznaczonych dla zwierząt jednożołądkowych została wcześniej opisana (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 297 548; Nelson, I.S. Shieh, T.R. Wodziński, R.J. i Ware, J.H. (1971) J. Nutrition 101, str. (1289 - 1294). Jednakże, do chwili obecnej koncepcji tej nie zastosowano na skalę przemysłową, z uwagi na wysokie koszty wytwarzania enzymów pochodzenia mikrobiologicznego (Y. Han (1989) Animal Feed Sci. i Technol., 24, str. 345 - 350). Z powodów ekonomicznych w dalszym ciągu dodaje się do pasz przeznaczonych dla zwierząt jednożołądkowych fosfor nieorganiczny.

Fitazy pochodzenia mikrobiologicznego znalazły również inne przemysłowe zastosowania. Przykładem jest przemysłowy proces produkcji skrobi ze zbóż takich jak kukurydza i pszenica. Odpady produkcyjne procesów mokrego mielenia, zawierające przykładowo białko kukurydzy, sprzedaje się jako paszę dla zwierząt. Podczas procesu rozmiękczania można dodawać do nich fitazę. Są tu idealne warunki do dodawania fitaz grzybowych (temperatura około 50°C, pH równe 5,5), europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 321 004. Pasze dla zwierząt wyprodukowane z tych odpadów będą wówczas zawierały fosforany zamiast fitynianów.

Fitazy można również stosować w przetwórstwie soi (Finase TM Enzymes By Alko, broszura informacyjna wydana przez Alko Ltd., Rajamaki, Finlandia). Potrawy sojowe zawierają duże ilości antyodżywczego czynnika fitynianów, który powoduje, że to źródło białka nie nadaje się do stosowania w odżywkach dla dzieci i w paszach dla ryb, cieląt i innych zwierząt

168 470 nieprzeżuwających. Enzymatyczne wzbogacanie tych wartościowych źródeł białka podnosi ich odżywczą i handlową wartość.

Inni badacze zainteresowali się dokładniejszym określeniem różnych fitaz i ulepszeniem sposobów ich wytwarzania i zastosowania. Ullah opublikował sposób oczyszczania fitazy z Aspergillus ficuum dzikiego typu, jak również określił szereg własności biochemicznych tak wytworzonego produktu. (Ullah, A. · (1988) a) Preparative Biochem., 18,443 - 458). Odpowiednie dane uzyskane przez Ullah’a przedstawiono w Tabeli 1.

Sekwencja aminokwasów N-końca białka fitazy z A. ficcus została opublikowana dwukrotnie przez Ullah’a. Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering Conference IX, 4 - 8 Październik, 1987 r, Santa Barbara, Kalifornia oraz Ullah, A. (1988 a) Prep. Biochem., 18, str. 459 - 471. Sekwencję aminokwasów określoną przez Ullah’a przedstawiono na rysunku, Fig. 1A, E. Na podstawie publikacji Ullah’a można poczynić szereg interesujących obserwacji. Przede wszystkim, oczyszczony preparat opisany przez Ullah’a (1988a i 1988b) wykazuje na żelu SDS-PAGE dwa pasma białkowe. Twórcy wynalazku twierdzą, że oczyszczona fitaza z A. ficuum zawiera zanieczyszczenia, oraz, że jedno z pasm obecnych na SDS-PAGE, zidentyfikowane przez Ullah’a jako fitaza, pochodzi od tego zanieczyszczenia.

Ta różnica jest również dostrzegalna w danych odnośnie sekwencji aminokwasów opublikowanych przez Ullah’a (1987,1988b porównaj rysunek, fig. 1A, sekwencje A i B z sekwencją C). Faktycznie, jedna z sekwencji aminokwasów peptydów wewnętrznych fitazy opisana przez Ullah’a (patrz rysunek, Fig. Ib, sekwencja E) w rzeczywistości stanowi sekwencję białka zanieczyszczającego o masie cząsteczkowej wynoszącej 100 kDa (rysunek, fig. 1C), które to białko obecne jest w preparacie otrzymanym sposobem opisanym przez Ullah’a i widoczne jest na SDS-PAGE jako jedno z dwóch pasm (Ullah, 1988ai 1988b). Ullah nie potwierdza obecności takiego zanieczyszczającego białka i identyfikuje je jako inną postać fitazy. Obecność takiego zanieczyszczenia utrudnia z kolei selekcjonowanie i izolowanie rzeczywistej sekwencji nukleotydowej kodującej aktywność fitazy. Ponadto, obecność zanieczyszczenia obniża wartość aktywności właściwej badanego białka. Poza tym, odnośnie sekwencji opublikowanej przez Ullah’a należy zauważyć, że reszta aminokwasu w pozycji 12 została określona przez Ullah’a jako glicyna. Stosując techniki sekwencjonowania DNA i białek twórcy niniejszego wynalazku dowiedli, że ta reszta nie jest glicyną lecz cysteiną (rysunek, fig. 6 i 8). Ullah twierdzi, że fitaza jest białkiem o masie cząsteczkowej 85 kDa, a po deglikozylacji ma masę 61,7 KDa (Ullah, 1988b). Ta wielkość, która jest o wiele niższa niż dla wcześniej publikowanego białka o masie 76 kDa (Ullah, A. i Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(1), str. .63 - 91), opiera się na względnej ilości węglowodorów uwalnianych w czasie hydrolizy i uwidocznionej na SDS-PAGE masie cząsteczkowej natywnego białka. Twórcy wynalazku dowiedli, że glikozylowana fitaza mamasę cząsteczkową równą 85 kDa (widoczna jest pojedyncza), podczas gdy białko deglikozylowane ma pozorną masę cząsteczkową wynoszącą 48 - 56,5 kDa, w zależności od stopnia deglikozylacji. Mullaney i inni (Filamentons Fungi Conferece, Kwiecień 1987, Pacific Grove, Kalifornia) opublikowali charakterystykę fitazy pochodzącej z A. ficuum. Jednakże, ta publikacja również zawiera wzmiankę o dwóch pasmach białka widocznych na SDS-PAGE, jedno odpowiadające masie 85 kDa i jedno odpowiadające masie 100 kDa, które to białka były obecne w oczyszczonym preparacie białkowym. Te pasma zostały zidentyfikowane przez autorów jako dwie postacie fitazy. Proponują oni również sposób transformowania mikrobiologicznych organizmów, czego jednak nie przeprowadzili. Klonowania i izolowania sekwencji DNA kodującej fitazę nie opisano.

Oczekuje się, że ekonomiczny sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu będzie miał wielkie znaczenie, między innymi w przemyśle pasz zwierzęcych. Jeden z takich ekonomicznych sposobów mógłby polegać na stosowaniu technik rekombinacji DNA w .celu podniesienia poziomów ekspresji enzymu w różnych znanych mikroorganizmach i wytwarzania fitazy tworzącej fityniany, z których możnaby uwalniać nieorganiczny fosforan, z wytworzeniem inozytu, co z kolei prowadziłoby do wytwarzania dużych ilości peptydów lub białek. Jednakże, do tej pory nie ujawniono sposobu izolowania i klonowania sekwencji DNA kodującej aktywność fitazy.

168 470

Sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu według wynalazku polega na tym, że pochodzącą ze źródła grzybowego fitazę oczyszcza się do aktywności właściwej powyżej 50 jednostek/mg białka, oczyszczoną fitazę poddaje się fragmentach za pomocą CNBr, oznacza się sekwencję N-końcowych aminokwasów otrzymanych fragmentów białkowych, przygotowuje się na drodze syntezy kompleks specyficznych sond oligonukleotydowych w oparciu o oznaczoną sekwencję aminokwasową, identyfikuje się przez hybrydyzację klony DNA z banku genomowego, prowadzi się hodowlę zidentyfikowanych klonów i wyodrębnia się sklonowaną sekwencję DNA, sekwencję tę przyłącza się do promotora i ewentualnie sekwencyjnej sekwencji liderowej, tak otrzymaną konstrukcję ekspresyjną wprowadza się do wektora i tak otrzymanym wektorem, zdolnym do transformowania komórki gospodarza transformuje się komórkę gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tak otrzymanej transformowanej komórki gospodarza, usuwa się komórki i wyodrębnia się z pożywki otrzymany peptyd lub białko o aktywności fitazy, po czym fitynian poddaje się działaniu tak otrzymanego peptydu lub białka o aktywności fitazy.

Tak więc, w sposobie według wynalazku, najpierw wytwarza się oczyszczoną i wyizolowaną sekwencję DNA kodującą fitazę. Wyizolowanie i sklonowanie sekwencji DNA kodującej fitazę osiąga się przez zastosowanie specyficznych sond oligonukleotydowych, które opracowano specjalnie dla potrzeb wynalazku.

Korzystne sekwencje DNA kodujące fitazy otrzymuje się ze źródeł grzybowych, zwłaszcza z grzybków nitkowych rodzaju Aspergillus.

Następnie wytwarza się wektor zawierający konstrukcję ekspresyjną, która to konstrukcja zawiera co najmniej jedną kopię co najmniej jednej kodującej fitazy sekwencji homologicznego DNA.

Korzystnie, sekwencja ta ogranicza się do regionu regulacyjnego zdolnego do wywołania ekspresji o wysokim poziomie peptydów lub białek o działaniu fitazy w odpowiednim do uzyskania tej ekspresji organizmie, nazywanym dalej organizmem ekspresyjnym.

Otrzymaną konstrukcję ekspersyjną włącza się do wektora, korzystnie do plazmidu,który jest zdolny do transformowania komórki gospodarza pochodzenia mikrobiologicznego i do integrowania się w genomie.

Z kolei wytwarza się transformowaną komórkę, korzystnie organizmu pochodzenia mikrobiologicznego, który otrzymuje się w wyniku transformacji wyżej opisanym wektorem. Organizmami transformowanymi, stosowanymi korzystnie w sposobie według wynalazku są grzyby nitkowe rodzaju Aspergillus, Trichoderma, Mucor i Penicillium, drożdże rodzaju Kluyveromyces i Saccharomyces, lub bakterie rodzaju Bacillus. Szczególnie korzystnymi organizmami ekspresyjnymi' są grzyby nitkowe rodzaju Aspergillus. Transformowane organizmy są zdolne do wytwarzania dużych ilości rekombinantowej fitazy na skalę przemysłową.

Przez powodowanie ekspresji transformowanych komórek wytwarza się rekombinantowe peptydy i białka o aktywności fitazy, zarówno w formie zglikozylowanej jak i niezglikozylowanej , wolne od zanieczyszczeń, przy czym stosuje się monoklonalne przeciwciała reaktywne w stosunku do tych rekombinantowych lub oczyszczonych białek.

Niżej, w tabeli 1 przedstawiono dane porównawcze odnośnie biochemicznych właściwości oczyszczonej fitazy z A. ficuum typu dzikiego, otrzymanej według Ullah,a i dalej oczyszczonej fitazy z A. ficuum typu dzikiego otrzymanej jak przedstawiono w sposobie według wynalazku. Szczególną uwagę zwracają dane dotyczące aktywności właściwej, które wykazują, że oczyszczone białko otrzymane jak opisano w sposobie według wynalazku cechuje aktywność właściwa dwa razy większa od aktywności właściwej białka według U!lah,a.

W sposobie według wynalazku wytwarza się i stosuje sekwencje nukleotydów, które kodują białka wykazujące aktywność fitazy, jak też sekwencje aminokwasów w tych białkach. Te sekwencje stosuje się do konstruowania sond oligonukleotydowych, które z kolei stosuje się w badaniach wykorzystujących hybrydyzację do odróżniania genów fitazy od innych genów, zwłaszcza pochodzenia mikrobiologicznego, które można kolejno izolować i klonować.

Sekwencje wytwarzane i stosowane w sposobie według wynalazku można także stosować jako substancje wyjściowe do budowania fitaz drugiej generacji. Fitazy drugiej generacji są to fitazy, zmienione przez zastosowanie technik mutagenetycznych (np. ukierunkowana mutageneza). Własności tych fitaz różnią się od własności fitaz dzikiego typu lub fitaz rekom6

168 470 binantowych, takiej jak peptydy lub białka o aktywności fitazy, wytwarzane i stosowane w sposobie według wynalazku. Przykładowo, optymalną temperaturę lub pH, aktywność właściwą lub powinowactwo w stosunku do substratu można zmienić tak, aby wymienione własności dostosować lepiej do wykorzystania w określonym procesie.

, W kontekście niniejszego opisu, termin fitaza odnosi się do rodziny enzymów, które katalizują reakcje obejmujące usuwanie nieorganicznego fosforu z różnych fosforanów myoinozytu.

Aktywność fitazy mierzy się stosując szereg prób, których wybór nie jest istotny w kontekście niniejszego wynalazku. Dla ilustracji, aktywność fitazy można określić przez mierzenie ilości enzymu, która uwalnia nieorganiczny fosfor z 1,5 mM fitynianu sodowego z szybkością wynoszącą 1 pmol/minutę, w temperaturze 37°C, przy pH równym 5,50.

Należy zauważyć, że termin fitaza stosowany w niniejszym opisie obejmuje wszystkie peptydy i białka o aktywności fitazy. Zilustrowano to na rysunku, fig. 1A, gdzie uwidoczniono porównanie sekwencji A i B (sekwencje otrzymane sposobem według wynalazku) z sekwencją C (opublikowaną przez Ullah,a, 1988 b). Ten rysunek dowodzi, że stosując sposób według wynalazku, z dojrzałego białka fitazy z A. ficuum można otrzymać białka, w których brak jest pierwszych czterech aminokwasów (w białku o sekwencji A brakuje pierwszych siedmiu aminokwasów).

Mimo tego, białka te zachowują aktywność fitazy.

Kompletna sekwencja aminokwasów białka fitazy, wydedukowana z odpowiadającej jej sekwencji nukleotydów, przedstawiono na rysunku na fig. 8.

Peptydy lub białka o aktywności fitazy, wytworzone i stosowane w sposobie według wynalazku, znajdują zastosowanie w różnych procesach, w których wymagana jest konwersja fitynianu do inozytu i nieorganicznego fosforanu.

Wiadomo, że chelatowanie jonów metali przez fitynian może spowodować, że te substancje mineralne będą niedostępne dla drobnoustrojów produkcyjnych.

Enzymatyczna hydroliza fitynianu zapobiega tym problemom. Korzyści wynikające z zastosowania wynalazku, wyjaśniono szczegółowo dalej.

Wynalazek jest bliżej wyjaśniony na rysunku.

Figura 1 przedstawia sekwencje N-końcowych aminokwasów określone dla oczyszczonej fitazy. Sekwencje aminokwasów oznaczone literami A i B określono w niniejszym wynalazku i pochodzą one z subpostaci fitazy, odpowiednio, o punktach izoelektrycznych 5,2 i 5,4.

Sekwencję C zacytowano z Ullah,a (1987,1988b, Supra). Resztę aminokwasów ulokowaną w pozycji 12, o sekwencjach A i B określono w niniejszym opisie wynalazku jako nie będącą resztą glicyny (x oznacza jednoznaczną identyfikację, xx oznaczają nie wykryte reszty).

Figura 1 B przedstawia sekwencje N-końcowych aminokwasów wewnętrznych fragmentów fitazy po obróbce CNBr. Sekwencje aminokwasów oznaczone literami A i B (pozorna masa cząsteczkowa peptydów w przybliżeniu 2,5 kDa i 36 kDa, odpowiednio) otrzymano jak opisano wyżej. Sekwencje C do E zacytowano z Ullah,a (1988b, Supra).

Figura 1 C przedstawia sekwencję N-końcowych aminokwasów białka o masie cząsteczkowej wynoszącej 100 kDa. Obecna jest ona w próbach zanieczyszczonej fitazy.

Figura 2 A przedstawia oligonukleotydowe sondy zbudowane na podstawie danych z fig. 1A, peptydy A.do E.

Figura 2 B przedstawia oligonukleotydowe sondy zbudowane na podstawie danych z fig. 1B peptydy A i B.

Figura 3 przedstawia oligonukleotydowe sondy zastosowane do wyizolowania genu kodującego kwaśną fosfatazę.

Figura 4 przedstawia mapę restrykcyjną bakteriofaga lambda AF 201 posiadającego locus fitazy z A. ficuum. Strzałka wskazuje locus genu fitazy i kierunek transkrypcji. Klon # uwidacznia subklony otrzymane za pomocą wskazanych enzymów restrykcyjnych z faga AF 201 w pAN 8-1 (dla pAF 28-1) i w pUC 19 (dla wszystkich innych subklonów).

Figura 5 przedstawia mapę restrykcyjną pAF-1. Fragment o długości 10 kb wycięty przez BamHI włączony do pUC 19 zawiera cały gen z A. ficuum kodujący kwaśną fosfatazę.

168 470

Figura 6 przedstawia kompilację sekwencji nukleotydowych plazmidów pAF 2-3, pAFF 2-6 i pAF 2-7 obejmujących locus chromosomowego genu fitazy. Region kodujący fitazę umiejscowiony iest na obszarze od nukleotvdu o pozvcii 210 do nukleotvdu o pozycji 1713.

------J-- ~~J J ' L J ' intron obecny w chromosomowym genie umiejscowiony jest na obszarze od nukleotydu o pozycji 254 do nukleotydu o pozycji 355. Oznaczono także relewantne cechy, takie jak miejsca restrykcyjne, kodony startu i terminacji fitazy oraz usytuowanie intronu.

Figura 7 przedstawia szczegółową mapę fizyczną chromosomowego locus fitazy, strzałki wskazują usytuowanie dwóch egzonów regionu kodującego fitazę.

Figura 8 przedstawia nukleotydową sekwencję regionu fragmentu cDNA fitazy i otrzymaną sekwencję aminokwasów białka fitazy; początek dojrzałego białka fitazy oznaczono jako pozycję +1. Amino-koniec wewnętrznego fragmentu białka umiejscowiony jest w pozycji 241, a fragment białka o masie 2,5 kDa zaczyna się w pozycji 390.

Figura 9 przedstawia mapę fizyczną kasety ekspresji fitazy pAF 2-2 S. Strzałki wskazują kierunek transkrypcji genów.

Figura 10 przedstawia dane eksperymentalne na JEF-PAGE odnośnie zwiększonej ekspresji fitazy w transformancie A. ficuum NRRL 3135. Jednakowej objętości supernatanty hodowli A. ficuum (pas 1) i transformantów pAF 2-2S SP7 (pas 2), wzrastających w identycznych warunkach analizowano na żelu JEF-PAGE, stosując technikę Phast-System w zakresie pH 4,5 - 6. Dla porównania, próbkę fitazy z A. ficuum oczyszczoną do jednorodności włączono oddzielnie (pas 4), lub zmieszaną z supernatantami hodowli (pas 3). Żele zabarwiono albo barwnikiem wykazującym fosfatazę, opisanym w tekście (A), albo barwnikiem wykazującym ogólne białka. (Coomassie Brilliant Blue, B). Pasma fitazy oznaczono gwiazdką.

Figura 11 przedstawia dane eksperymentalne na JEF-PAGE odnośnie zwiększonej ekspresji fitazy w transformantach A. niger CBSS 513,88. Jednakowej objętości supernatanty hodowli macierzystego szczepu A. niger (pas 1), lub transformantów pAF 2-2S # 8 (pas 2), pFYT3 # 205 (pas 3) i # 282 (pas 4) analizowano stosując technikę JEF-PAGE, jak opisano w objaśnieniu do fig. 10. Żele były zabarwione albo barwnikiem wykazującym aktywność fosfatazy (A), albo barwnikiem wykazującym ogólne białka. Pasma fitazy oznaczono gwiazdką.

Figura 12 przedstawia mapę fizyczną pAB 6-1. Insert DNA ciętego HindHI o długości 14,5 kb w pUC 19 zawiera całe locus glukoamylazy (AG) z A. niger.

Figura 13 przedstawia schemat powstawania fuzji genów promotor AG (fitaza) na drodze reakcji budowy łańcucha pod wpływem polimerazy (PCR). Sekwencje wszystkich stosowanych primerów oligonukleotydowych podano w tekście.

Figura 14 przedstawia mapę fizyczną ekspresji fitazy pAF 2-2SH.

Figura 15 przedstawia mapy fizyczne konstrukcji przejściowych pXXFYT1, pXXFYT2 i kaset ekspresji fitazy pXXFYT3, gdzie XX oznacza sekwencję liderową (L).

Do p18 FYT # i p24 FYT # włączone są sekwencje liderowe 18-tego i 24-tego aminokwasu AG, odpowiednio, a w pFYT # zastosowano sekwencję liderową fitazy.

Figura 16 przedstawia mapę fizyczną plazmidu pFYT3 amdS.

Figura 17 przedstawia mapę fizyczną plazmidu pFYT3INT.

Figura 18 przedstawia mapę fizyczną wektora pREpFYT3 powodującego wymianę genów fitaza/AG.

Autoradiografy chromosomowego DNA trawionego PvuII (A) i BamHI (B) zhybrydyzowanego z cDNA fitazy z A. ficuum znakowanym za pomocą p³ , służącego jako sonda:

S. cerevisiae, (pas 2), B. subtilis (pas 3), K. lactis (pas 4), P. crysogenum (pas 5), P. aeruginosa (pas 6), S. lividans (pas 7), A. niger 1 gg (pas 8), A. niger 5 gg (pas 9), pusty (pas 10), C. thermocellum (pas 11).

Pas 1: marker dNa

Klonowanie genów kodujących wybrane białka w celu wytwarzania białek przez mikroorganizm przeprowadza się stosując różne metody.

Jedna z nich polega na oczyszczeniu białka, następnie na określeniu sekwencji jego N-końcowych aminokwasów i przeszukaniu banku genomów danego mikroorganizmu przy zastosowaniu sondy oligonukleotydowej DNA wytworzonej na podstawie wspomnianej sekwencji N-końcowych aminokwasów. Przykładem skutecznego stosowania tej procedury jest klonowanie genu N-syntezy izopenicyliny, pochodzącego z Cophalosporium acremonium (S.M. Samson i inni (1985), Naturę 318, str. 191 - 194 i izolowanie genu kodującego TAKA amylazę dla Aspergillus oryzae (Boel i inni (1986), zgłoszenie europejskie nr EP-A-0238023).

Stosując tę procedurę próbowano wyizolować gen Aspergillus ficuum, kodujący fitazy. Białko oczyszczono ekstensywnie i określono kilka jego biochemicznych własności. Uzyskane dane porównano z danymi opublikowanymi przez Ullah’a (1988a). Oba komplety danych umieszczono w tabeli 1 poniżej.

Tabela 1

Biochemiczne własności oczyszczonej fitazy z A. ficuum dzikiego typu

Własność	Wynalazek	Ullah
Aktywność właściwa *	100 jednostek/mg białka	50 jednostek/mg białka
Czystość SDS-PAGE	85 kDa	85/100 kDa
JEF-PAGE	3 lub 4 pasma	nie wykonano
Ku (stała powinowactwa)	250 |ik z~>\j p-Pc	40 pk
Specyficzność stosunku do:
Inozyt-1-p	nieaktywny	nieaktywny
Inozyt-2-p	km=3,3 mk	5% aktywności
Optymalne pH	2,5 i 5,5	2,5 i 5,5
Optymalna temperatura	50°C	58°C
Masa cząsteczkowa **	85 kDa	85 i 100 kDa
Masa cząsteczkowa ***	56,5 kDa	61,7 kDa
(niezglikozylowany)
Punkt izoelektryczny	5,0 - 5.4	4,5

* Ullah mierzył aktywność fitazy raczej w temperaturze 58°C a nie 37°C. Jednostką aktywności fitazy jest ilość enzymu, która uwalnia nieograniczony fosfor z 1,5 mk fitynianu sodowego z szybkością równą 1 pmol/min., w temperaturze 37°C i przy pH równym 5,50. Aby porównać wydajności fermanetacji i aktywności właściwe, wielkości aktywności opublikowane przez Ullah’a skorygowano, biorąc pod uwagę różnicę temperatur. Poprawka oparta jest na różnicy pomiędzy aktywnością fitazy mierzoną w temperaturze 37°C, a aktywnością mierzoną w temperaturze 58°C, jak uwidoczniono w tabeli III w publikacji Ullah’a (1988b).

** Pozorna masa cząsteczkowa określona za pomocą SDS-PAGE.

*** Określona za pomocą JEF-PAGE.

W celu wyizolowania genu kodującego fitazę skonstruowano za pomocą wyżej opi_sa_nej metody (fig. 2A) pierwszy komplet sond oligonukleotydowych.

Konstrukcja tych sond oparta była na danych dotyczących sekwencji aminokwasów. W celu kontroli poczyniono podobne kroki w kierunku wyizolowania genu kodującego kwaś_ną fosfatazę, wykorzystując dane dotyczące białka, opublikowane przez Ullah’a i Cummins’a (1987), Prep. Biochem. 17, str. 397 - 422). Gen odpowiadający kwaśnej fosfatazie wyizolowa_no bez trudności. Jednakże w przypadku fitazy, sytuacja okazała się być inna. Pomimo wielu prób, w których stosowano sondy skonstruowane w oparciu o sekwencję N-końcowych aminokwasów, nie można było wyizolować z banku genomów ani genomowych fragmentów DNA, ani też klonów, które można było pozytywnie zidentyfikować, jako obejmujące gen kodujący fitazę.

Aby rozwiązać ten problem, oczyszczoną fitazę poddano rozrywającemu działaniu CNBr, a otrzymane fragmenty białka wyizolowano. Określono sekwencje N-końcowych aminokwasów tych fragmentów (fig. 1B) i skonstruowano nowe sondy oligonukleotydowe w oparciu o nowe dane (fig. 2B).

Nieoczekiwanie okazało się, że •nowe sondy oligonukleotydowe rozpoznawały specyficzne fragmenty DNA i nadawały się do rozpoznawania w sposób niedwuznaczny klonów z banku genomów. Nie obserwowano hybrydyzacji krzyżowej pomiędzy nowymi klonami lub wyizolowanymi z nich fragmentami DNA a pierwszym zbiorem sond olignonukleotydowych lub klonami wyizolowanymi przy zastosowaniu pierwszego zbioru sond.

168 470

Uważa się, że ten drugi zbiór sond można również zastosować do rozpoznawania sekwencji kodujących pokrewne fitazy.

Wyizolowane klony stosowano jako sondy wykorzystujące metodę Northern’a.

Nieciągły mRNA można było wykryć jedynie wtedy, gdy był on wyizolowany z grzybni wytwarzającej fitazy· Kiedy badano rNa z grzybni nie wytwarzającej fitazy, nie zaobserwowano sygnału hybrydyzacji. mRNA ma długość około 180θ par zasad i teoretycznie wytwarza białko o maksymalnej masie cząsteczkowej wynoszącej około 60 kDa. Ta wielkość odpowiada zarówno masie cząsteczkowej określonej dla białka niezglikozylowanego jak i masie cząsteczkowej białka, którego budowę przewidziano na podstawie sekwencji DNA.

Ponadto, gdy RNA wprowadzano na drodze transformacji do komórki grzybowej, obserwowano wzrost aktywności fitazy. To dowodzi ostatecznie, że faktycznie wyizolowano sekwencję nukleotydową kodującą fitazę. Sekwencje aminokwasów określone dla oczyszczonego enzymu fitazy i dla fragmentów otrzymanych z tego enzymu za pomocą CNBr zgadzają się z sekwencją aminokwasów wyprowadzoną na podstawie sekwencji określonej dla klonowanego genu. Sekwencję nukleotydów i wyprowadzoną sekwencję aminokwasów uwidoczniono na rysunku, fig. 6 i 8. Przedstawiają one klonowaną sekwencję kodującą fitazę. Wyizolowanie sekwencji nukleotydów kodującej fitazę umożliwia ekonomiczną produkcję fitazy na skalę przemysłową przy zastosowaniu nowoczesnych technik rekombinacji DNa, takich jak, amplifikacja genów, wymiana elementów regulacyjnych, przykładowo promotorów, sygnałów sekwencyjnych lub ich kombinacji.

Kolejny etap sposobu według wynalazku obejmuje wytwarzanie transformowanego organizmu ekspresyjnego, zdolnego do efektywnej ekspresji dużych ilości peptydów lub białek o aktywności fitazy, jeśli jest to pożądane, zdolny również do efektywnej ekspresji kwaśnych fosfataz. Organizmy, w których zachodzi ekspresja obejmują nitkowe grzyby wybrane z rodzaju Asp ergillus, Trichoderma, Mucor i Penicillium, drożdże wybrane z rodzaju Kluyveromyces i Saccharomyces i bakterie rodzaju Bacillus. Korzystnie, organizm wybrany jest spośród tych organizmów, które są zdolne do wydajnego wydzielania ich endogennych białek.

Szczególnie interesujące są przemysłowe szczepy Aspergillus zwłaszcza niger, ficuum, avamori lub oryzae.

Alternatywnie stosuje się Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis lub Bacillus licheniformis.

Konstrukcja ekspresyjna zawiera sekwencje nukleotydowe kodujące pożądany produkt enzymatyczny, mający powstać w wyniku ekspresji, które to sekwencje zwykle posiadają sekwencję sygnałową funkcjonującą w organizmie i powodującą wydzielanie peptydowego lub białkowego produktu.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się różne sekwencje sygnałowe. Można zastosować sygnałową sekwencję, która jest homologiczna z klonowaną w celu ekspresji sekwencją nukleotydów. Alternatywnie, w celu ułatwienia rekombinacji homologicznej stosuje się sekwencję sygnałową homologiczną albo rzeczywiście homologiczną z sekwencją sygnałową genu, leżącego w miejscu docelowym gospodarza.

Ponadto, można również stosować sekwencje sygnałowe skonstruowane dla poprawienia sekrecji w wybranych organizmach ekspresyjnych. Przykładowo, jak opisano w publikacjach: Von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133, str. 17 - 21 i Perlman i Halverson (1983) J. Mol. Biol., 167, str. 391 - 409. Sekwencję DNA kodującą sekwencję sygnałową można połączyć bezpośrednio poprzez sekwencję, kodującą sygnał wytwarzania (miejsce rozpoznawcze rozerwania) z sekwencją kodującą żądane białko, lub poprzez krótki mostek, zwykle krótszy niż dziesięć kodonów.

Korzystnymi sekwencjami sygnałowymi sekrecji stosowanymi w sposobie według wynalazku są sekwencja sygnałowa homologiczna z klonowaną w celu ekspresji sekwencją nukleotydów, sygnałowa sekwencja 18-tego aminokwasu glukoamylazy (AG) i sygnałowa sekwencja 24-tego aminokwasu glukoamylazy (AG).

Dwie ostatnie sekwencje są albo homologiczne, albo heterologiczne w stosunku do sekwencji nukleotydów, która będzie ulegać ekspresji.

168 470

Produkt ekspresji lub sekwencja nukleotydów będąca przedmiotem zainteresowania, może stanowić DNA, który jest homologiczny lub heterologiczny w stosunku do organizmu eksprecyjneon

Homologiczny DNA oznacza tu DNA pochodzący z tego samego rodzaju. Przykładowo, Aspergillus transformuje się za pomocą DNA pochodzącego z Aspergillus. W ten sposób można poprawić własności już występujące w danym rodzaju grzybów, bez wprowadzania nowych cech, 'które w nim przedtem nie występowały.

Heterologiczny DNA określa się jako DNA pochodzący od więcej niż jednego rodzaju, to jest, jak to wynika z przykładów, DNA pochodzący od innego rodzaju niż Aspergillus, który to DNA będzie ulegał ekspresji w Aspergillus.

Nukleotydowe sekwencje kodujące aktywność fitazy korzystnie otrzymuje się ze źródeł grzybowych. Bardziej korzystne są sekwencje nukleotydowe kodujące fitazę otrzymane z rodzaju Aspergillus. Najkorzystniejsze sekwencje otrzymuje się z Aspergillus ficuum lub z Aspergillus niger.

Region 5’ w kierunku do otwartej fazy odczytu w sekwencji nukleotydów zawiera region regulacyjny inicjacji transkrypcji (lub promotor). Można zastosować każdy region funkcjonujący włącznie z promotorem homologicznym z sekwencją nukleotydów, która będzie ulegać ekspresji. Jednakże, przeważnie stosowany region jest homologiczny z regionem miejsca docelowego. Powoduje to zastąpienie ekspresji produktu miejsca docelowego przez ekspresję żądanego produktu.

Ten region regulacyjny inicjacji transkrypcji jest satysfakcjonujący wówczas, gdy poziom ekspresji i sekrecji białka kodowanego przez miejsce docelowe zapewnia wydajną produkcję. Jednakże, w wielu przypadkach żąda się wyższego poziomu transkrypcji niż poziom transkrypcji genu miejsca docelowego, albo żąda się ekspresji indukowanej przy zastosowaniu szczególnego środka indukcyjnego. W takich przypadkach stosuje się region regulacyjny inicjacji transkrypcji inny, niż region znajdujący się w genie miejsca docelowego. Znanych jest szereg regionów regulacyjnych inicjajcji transkrypcji działających w grzybach nitkowych.

Obejmują one regiony występujące w genach kodujących glukoamylazę (AG), 'amylazę grzybową, kwaśną fosfatazę, GAPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, histon H2A, Pyr 4, Pyr G, N-syntetazę izopenicyliny, PGK, kwaśną proteazę, acylotransferazę i podobne.

Miejsce docelowe korzystnie koduje białko o wysokim poziomie ekspresji, tj. stanowi taki gen, którego produkt eksperymentalny jest na takim poziomie, że jego stężenie wynosi pod koniec procesu fermentacji co najmniej 0,1 g/litr.

Czas trwania procesu fermentacji zmienia się w zależności od żądanego produktu białkowego.

Jako przykład takiego genu służy gen kodujący glukoamylazę (AG). Inne takie geny obejmują geny kodujące grzybową α-amylaz.ę, kwaśną fosfatazę, proteazę, kwaśną proteazę, lipazę, fitazę i celobiohydrolazę. Szczególnie korzystnymi miejscami docelowymi są: gen glukoamylazy z A. niger, gen amylazy grzybowej z A. oryzae, geny celobiohydrolazy z T. reesei, gen kwaśnej proteazy z Mucor miehei, gen laktazy z Kluyveromyces lactis lub gen β-fruktofuranozydazy z Saccharomyces cerevisiae.

Region regulacyjny inicjacji transkrypcji może pochodzić z genu będącego przedmiotem zainteresowania, z miejsca docelowego bądź z jakiejkolwiek innej dogodnej sekwencji. Jeśli konstrukcja zawiera dalszą sekwencję w kierunku w dół (tzn. w kierunku transkrypcji) od genu będącego przedmiotem zainteresowania, region regulacyjny inicjacji transkrypcji, jeśli jest homologiczny z miejscem docelowym, powinien być znacznie mniejszy niż homologiczny region flankujący.

Zazwyczaj stosuje się marker selekcyjny, który może stanowić część konstrukcji ekspresyjnej bądź być elementem oddzielnym; taki który może integrować się w innym miejscu, niż gen będący przedmiotem zainteresowania. Ponieważ rekombinantowe cząsteczki według wynalazku korzystnie transformuje się do szczepu organizmu, który można stosować w produkcji przemysłowej, selekcyjne markery do kontrolowania transformacji stanowią korzystnie dominujące markery selekcyjne, nie zachodzi wówczas potrzeba stosowania mutacji w szczepie organizmu, aby można było użyć wymienionych markerów selekcyjnych. Przykładami takich markerów są te, które umożliwiają transformantom wzrost na określonych pożywkach (np. gen

168 470

A. nidulans amdS umożliwia transformantom A. niger wzrost na acetamidzie, stanowiącym jedyne źródło azotu), lub które nadają odporność na antybiotyki (np. gen ble nadający odporność na fleomycynę lub gen bph nadający odporność na bygromycynę B).

Gen selekcyjny posiada własne regiony inicjacji i zakończenia transkrypcji i translacji, co umożliwia niezależną ekspresję markera. Znanych jest szereg regionów regulacyjnych inicjajcji transkrypcji, które stosuje się w połączeniu z genem służącym jako marker.

W przypadku wykorzystywania odporności na antybiotyki, stężenie antybiotyku użytego do selekcji zależy od antybiotyku, na ogół waha się ono w granicach od około 30 do 300 μ g/ml.

Można łączyć różne sekwencje, stosując znane sposoby, takie jak restrykcja, łączenie komplementarnych miejsc restrykcyjnych i ligacja, dołączenie tępych końców przez dobudowanie miejsc wystających i tępa ligacja, przecięcie za pomocą Bal 31, reperacja za pomocą primera, mutageneza in vitro i inne. Stosuje się poliłączniki i adaptery, które wprowadza się bądź usuwa znanymi metodami w celu ułatwienia budowania konstrukcji ekspresyjnej. W każdym stadium syntezy, fragment konstrukcji można klonować i analizować za pomocą enzymów regulacyjnych bądź metodami sekwencjonowania lub hybrydyzacji, lub innymi.

Dostępnych jest szereg wektorów do klonowania, · ich wybór nie jest istotny dla niniejszego wynalazku.

Na ogół klonowanie zachodzi w E.coli.

Regiony flankujące mogą zawierać co najmniej części zewnętrznej fazy odczytu miejsca docelowego, a zwłaszcza sekwencję sygnałową, regiony regulacyjne 5’ i 3’ genu z miejsca docelowego, lub mogą rozciągać się poza regiony regulacyjne. Na ogół region regulacyjny ma wielkość co najmniej 100 par zasad, zwykle co najmniej 200 par zasad, a może też być wielkości 500 par zasad, lub większy.

Wybiera takie regiony flankujące, które rozrywają gen docelowy i zapobiegają jego ekspresji. Osiąga się to przez włączenie kasety ekspresji (zawierającej sekwencję nukleotydową do ekspresji i ewentualnie dodatkowe elementy takie jak sekwencja sygnałowa, sekwencja regionu regulacyjnego zakończenia transkrypcji) do zewnętrznej ramki odczytu w sąsiedztwie regionu 5’, przez zastąpienie całego genu docelowego, bądź jego części konstrukcją ekspresyjną, lub przez umieszczenie konstrukcji ekspresyjnej w miejscu pomiędzy regionem · regulacyjnym inicjacji transkrypcji miejsca docelowego a zewnętrzną fazą odczytu.'

Jak wykazano, kiedy region regulacyjny terminacji jest homologiczny z tym regionem miejsca docelowego, region flankujący 3’ powinien być znacznie większy od regionu regulacyjnego terminacji obecnego; w konstrukcji.

W sposobie według wynalazku można również stosować filtry drugiej generacji. Postępowanie w opisany wyżej sposób dostarcza również materiału wyjściowego do budowania fitaz drugiej generacji, tj. enzymów fitazy o własnościach różnych od własności izolowanych tu enzymów. Fitazy drugiej generacji mogą mieć zmienione takie własności jak: optymalną temperaturę lub optymalne pH, aktywność właściwa lub powinowactwo w stosunku do substratów, lub inne cechy która to zmiana czyni enzym bardziej odpowiednim do zastosowania w określonym procesie.

Do przeprowadzenia takiej mutagenezy (mutagenezy ukierunkowanej) najlepszym gospodarzem jest E.coli. Ponieważ E.coli nie posiada aparatu do usuwania intronów, które mogą być obecne w genie fitazy, klon cDNA fitazy jest sekwencją z wyboru, która to sekwencja ulega ekspresji w E.coli. Tę sekwencję cDNA można z łatwością zmutować, stosując znane metody, po czym zmutowany gen można wprowadzać do konstrukcji· ekspresyjnych.

Konstrukcję transformuje się do gospodarza w postaci wektora klonującego, liniowego bądź kolistego, lub też usuwać z pożądanego wektora klonującego.

Wektor klonujący jest korzystnie plazmidem. Plazmid będzie zwykle przekształcony w postać liniową w genie będącym przedmiotem zainteresowania o długości około 1 kilopar zasad. Korzystnie, konstrukcję ekspresyjną do wytwarzania fitaz, stosowanych w sposobie według wynalazku integruje się w genomie wybranego organizmu ekspresyjnego.

Istnieje szereg sposobów transformowania grzybów nitkowych. Obejmują one fuzję lub transformację protoplastów, elektroporację i wstrzeliwanie mikropocisków do komórek. Korzystnym sposobem jest transformacja protoplastów.

168 470

Grzybnię szczepu grzybowego przekształca się najpierw w protoplastry na drodze enzymatycznego trawienia ścianki komórkowej w obecności stabilizatora osmotycznego takiego jak KCL lub sorbit. Pobieranie DNA przez protoplasty wspomaga się przez dodanie CaCh i stężonego roztworu glikolu polietylenowego, który powoduje agregację protoplastów. W ten sposób następuje włączanie transformującego DNA do agregatów i pobieranie go przez protoplasty. Następnie protoplasty poddaje się regeneracji na stałym podłożu zawierającym stabilizator osmotyczny i kiedy trzeba, środek selekcjonujący, w takim przypadku transformujący DNA koduje odporność na ten środek.

Po wyselekcjonowaniu transformantów, obecność genów będących przedmiotem zainteresowania można wykryć różnymi sposobami. 'Jeśli produkt ekspresji jest heterologiczny w stosunku do gospodarza, ekspresję genu wykrywa się stosując przeciwciała. Alternatywnie, do wykrywania obecności zintegrowanego genu lub jego produktu stosuje się metody Southern’a lub Northern’a.

Amplifikację sekwencji nukleotydowej lub konstrukcji ekspresyjnej osiąga się przez stosowanie znanych technik, takich .jak wprowadzanie wielokrotnych kopii konstrukcji do wektora transformującego, lub stosowanie genu amdS jako markera selekcyjnego (np. Winas i inni (1985) Current Genetics, 9, str. 361 - 368).

Sekwencja DNA, która ma być amplifikowana, może zawierać DNA zarówno homologiczny, jak i heterologiczny w stosunku do organizmu ekspresyjnego, jak omówiono powyżej.Następnie komórki hoduje się na odpowiedniej pożywce. Można zastosować inhibitor proteazy w niskich stężeniach, taki jak fluorek fenylometylosulfonylowy, a2-makroglobuliny, pepstatyna lub podobne. Na ogół stosuje się stężenie w granicach od około 1 μg/ml do 1 mg/ml. Geny proteazy inaktywuje się w celu uniknięcia lub zredukowania degradacji żądanego białka. Transformanty hoduje się w reaktorach do fermentacji periodycznej lub ciągłej, gdzie oddziela się pożywkę i uzyskuje żądane białko.

Białko oczyszcza się różnymi metodami, np. chromatograficznie (chromatografia cieczowa wysokosprawna), albo stosując ekstrakcję rozpuszczalnik - rozpuszczalnik, bądź elektroforetycznie, lub stosując kombinacje tych metod.

Wynalazek obejmuje również sposób postępowania, polegający na tym, że bulion fermentacyjny (ewentualnie oczyszczony) przesącza się, po czym przesączony roztwór zagęszcza się. Tak otrzymany .koncentrat w stanie ciekłym można stosować następująco:

a) fitaza i inne białka wytrąca się z ciekłego koncentratu przez dodawanie acetonu do stężenia 60%, ciągle mieszając. Osad suszy się w próżni w temperaturze 35°C. Po roztarciu suchego proszku, produkt enzymatyczny stosuje sięjako taki do badań. Wydajność wynosi około 90%.

b) ciekły koncentrat poddaje się suszeniu rozpryskowemu, stosując konwencjonalne metody. Wydajność odzysku waha się w granicach 80 - 99%.

c) ciekły koncentrat miesza się z nośnikami, takimi jak otręby pszenne. Tak otrzymaną mieszaninę suszy się w wieży natryskowej lub w złożu fluidalnym.

d) ciekły koncentrat stabilizuje się osmotycznie przez dodanie sorbitu.

Można dodać środek konserwujący, taki jak kwas benzoesowy, co zapobiega zanieczyszczeniom pochodzenia mikrobiologicznego.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jednak zakresu ochrony.

Jest oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie, że gen fitazy skonstruowany jak opisano wyżej, można stosować do badań heterologicznej hybrydyzacji w celu izolowania genów kodujących fitazę z innych mikroorganizmów.

Przykład I. Fermentacja z zastosowaniem A. ficuum NRRL 3135

Szczep Aspergillus ficuum NRRL 3135 pochodzi z Northern Region Research Ltd., USA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois,. Stany Zjednoczone. Preparaty zarodników grzyba przygotowuje się następującą standardową techniką.

Prowadzi się serię periodycznych fermentacji tych zarodników a potem komórek, zaczynając od szarż w kolbach Erlenmeyera a kończąc na szarży w fermentatorze 10-litrowym. Po wzroście w hodowli szarżowej zawartość tego fermentora stosuje się jako inokulum do szarży o załadunku 500 litrów.

168 470

Stosuje się pożywkę o składzie: 91 g/litr skrobi kukurydzianej (BDH Chemicals Ltd.), 38 g/litr glukozy · H₂0, 0,6 g/litr MgSO4 · 7 H₂0, 0,6 g/litr KCL, 0,2 g/litr FeSO4· 7 H₂O i 12 g/litr KNO3. Wartość pH utrzymuje się na poziomie 4,6 ± 0,3 metodą automatycznego miareczkowania albo 4N NaOH albo'4N H2SO4. ' '

Wzrost komórek prowadzi się w temperaturze 28°C przy automatycznie kontrolowanym stężeniu rozpuszczonego tlenu wynoszącym 25 procent nasycenia powietrzem. Maksymalny poziom wytwarzania fitazy, 5 - 10 jednostek/ml obserwuje się po 10 dniach fermentacji.

Przykład II. Oczyszczanie i chrakterystyka fitazy z A. ficuum

A. Oznaczanie aktywności fitazy. Do mieszaniny inkubacyjnej o składzie:

- 0,25M bufor octanu sodowego (pH = 5,5) albo

- bufor chlorowodorku glicyny (pH = 2,5)

- 1 mM roztwór soli sodowej kwasu fitynowego

- woda demineralizowana do 900 {ll dodaje się 100 μΐ przesączu z brzeczki (w razie potrzeby rozcieńczonego) lub supematantu lub 100 μl wody demineralizowanej (próba porównawcza). Wytworzoną mieszaninę inkubuje się w czasie 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 1 ml 10 procentowego roztworu kwasu trój chlorooctowego (TCA), po czym dodaje się 1 ml odczynnika o składzie: 3,66 g FeS04 · 7 H2O w 50 ml roztworu molibdenianu amonowego (2,5g) NH4/Mo7024 · 4H20 i 8 ml H2S04, rozcieńczone do 250 ml wodą demineralizowaną). Pomiar intensywności barwy niebieskiej wykonuje się spektrofotometrycznie przy 750 nm. Pomiary wykazują ilość uwolnionego fosforanu w stosunku do krzywej kalibracji fosforanu w zakresie 0-1 milimol/litr.

Próba barwienia fosfatazy

Składniki wykazujące aktywność fosfatazy wykrywa się przez ogniskowanie w punkcie izolelektrycznym stosując ogólny test barwienia fosfatazy. Żel inkubuje się w roztworze α-naftylofosforanu i soli Fast Gamet GBC salt (Sigma, odpowiednio 0,1 i 0,2 procentowe, wagowo objętościowo) w buforze 0,6M roztworu octanu sodowego (pH = 5,5). W wyniku reakcji pojawia się strąt o barwie czarnej. Reakcję tę albo zatrzymuje się przez dodanie mieszaniny metanolu z kwasem octowym (30 : 10, objętościowo) albo, o ile potrzebne jest białko o aktywności fitazy, przemywa się wodą destylowaną.

B. Oczyszczanie fitazy z A. ficuum. Z brzeczki hodowli A. ficuum NRRL 3135 oczyszcza się fitazę do homogeniczności. Z brzeczki usuwa się zarodniki przez filtrację i uzyskany filtrat hodowli zatęźa się w agregacie do ultrafiltracji Filtron z filtrami odcinającymi cząstki o wielkości 30 kD. Przed procesem oczyszczania normalizuje się wartość pH i siły jonowej próbki przez przemywanie tej próbki 10 mM roztworem octanu sodowego (bufor o pH = 4,5). W powyższym procesie ultrafiltracji osiąga się około 20-krotne stężenie roztworu.

Próbkę poddaje się na wymieniacz jonowy kationowy (S-Sepharose Fast-Flow w kolumnie HR 16/10 o pojemności 20 ml, uzyskane z firmy Pharmacia) w aparaturze do oczyszczania białek firmy Waters (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System). Związane białka eluuje się w gradiencie chlorku sodowego od 0 do 1M w buforze octanu sodowego. Fitazę eluuje się z kolumny przy stężeniu około 250 mM NaCl. Frakcje wykazujące aktywność fitazy zbiera się, zatęża i odsala przez ultrafiltrację. Uzyskany roztwór podaje się na wymieniacz jonowy anionowy (Q-Sepharose Fast-Floww kolumnie HR 16/10 o pojemności 20 ml, firmy Pharmacia), i prowadzi się eluowanie białek w opisanym powyżej gradiencie 0 - 1M chlorku sodowego w buforze octanowym. Z tej kolumny fitaza eluuje się przy stężeniu około 200 mM NaCl.

W wyniku tych etapów oczyszczania uzyskuje się częściowo oczyszczony preparat fitazy o aktywności właściwej około 40 - 50 jednostek/mg białka, co wskazuje na 25-krotne oiczy&^zczanie.

Analiza czystości tej częściowo oczyszczonej fitazy wykazuje obecność głównego zanieczyszczenia substancją o masie cząsteczkowej około 100 kDa (sekwencja E na fig. 1B).

Ogniskowanie w punkcie izoelektrycznym wykazuje obecność wielu enzymów posiadających aktywność fosfatazy, w tym 3-4 sub-formy fitazy (punkty izoelektryczne od 5,0 do 5,4; fig. 1A, sekwencje A i B).

168 470

W celu uzyskania preparatu jednorodnej fitazy prowadzi się następne, dwukrotne oczyszczanie, z następnym rozdzielaniem składników częściowo oczyszczonej fitazy metodą ogniskowania w punkcie izoelektrycznym w aparacie LKB Multiphor, na płytkach Ampholine PAG, w zakresie wartości pH od 4 do 6,5. Białka wykazujące aktywność fosfatazy (w tym fitazę) wykrywa się opisaną powyżej ogólną metodą barwienia fosfatazy. Następnie wycina się na żelu odpowiednie pasma i eluuje się aktywne białko poprzez 16 godzinną inkubację wycinków żelu w 10 mM buforze octanu sodowego (pH = 5,5). Frakcje białka analizuje się opisaną w przykładzie II metodą oznaczania specyficznej aktywności fosfataz. Wskaźnik końcowego oczyszczania fitazy wynosi około 60 razy (aktywność właściwa końcowego preparatu wynosi 100 jednostek/mg białka). W tym końcowym etapie oczyszczania możliwe jest również wyizolowanie różnych sub-form fitazy (fig. 1A, sekwencje A i B).

Narzędziem dla skutecznego oczyszczania są przeciwciała monoklonalne przeciw fitazie z A. ficuum. Przeciwciała takie sprzęga się z Sepharose 4B aktywowaną bromocyjanem (5 mg/ml żelu) i matrycę tę stosuje się do wypełniania kolumny do chromatografii powinowactwa. Matryca ta wiąże około 1 mg fitazy/ml. Z kolumny powinowactwa eluuje się fitazę buforem o wartości pH = 2,5 (100 mM chlorowodorku glicyny, 500 mM NaCl) bez strat w aktywności. Procedurę tę stosuje się dla wyizolowania homogenicznej fitazy z surowego przesączu hodowli w jednym, pojedyńczym etapie, z 80 procentowym odzyskiem i 60-krotnym oczyszczaniem.

C. Deglikozylacja fitazy. Fitazę uzyskaną z fermentacji A. ficuum (70 gg białka) inkubuje się z 2,5 jednostkami N-glukanazy (Genzyme) w 0,2M buforze fosforanu sodowego (pH = 8,6) i 10 mM 1,10-fenantroliny w całkowitej objętości 30 gl.

Po 16 godzinach utrzymywania w temperaturze 37°C oznacza się rozmiar deglikozylacji elektroforetycznie (aparat Phast System, Pharmacia). Oznaczono, że pozorny ciężar cząsteczkowy fitazy zmniejszył się z 85 kDa do około 56,4 kDa. Poprzez okresowe analizy barwienia cukrów kwasem Schiff’a (PAS), wykrywające natywną fitazę jako glikoproteinę, nie udało się wykryć żadnych resztkowych węglowodanów przyłączonych do białka. Całkowite usunięcie węglowodanów potwierdzono następnie czułą metodą hybrydyzacji z lektyną na bibule (blotting). Natywną i deglikozylowaną fitazę (obydwie - próbki po 2,5 gg) poddaje się elektroforezie w standardowym żelu SDS-PAGE i elektroforetycznie przenosi się je na błonę PVDF (Immobilon, firma Millipore) w buforze 25 mM TRIS-glicynowym (pH = 8,3) z dodatkiem 20% (objętościowo) metanolu, w czasie 16 godzin, przy różnicy potencjałów 30 V.

Błonę tę inkubuje się następnie z 1% (wag.obj.) albuminą surowicy bydlęcej w solance buforowej fosforanem, po czym prowadzi się jej inkubację z peroksydazą konkwanawaliny A’ (Sigma, 10 gg/ml w solance buforowanej fosforanem). Peroksydazę barwi się 4-chloro-1-naftolem (Sigma).

Ta czuła metoda również nie wykazała żadnych pozostałości węglowodanu związanego z deglikozylowaną fitazą.

Po deglikozylacji fitaza całkowicie traci swą aktywność, prawdopodobnie w wyniku agregacji enzymu.

Przykład III. Oznaczenie sekwencji aminokwasowej fitazy i konstrukcja sond oligonukleotydowych.

A. Oznaczenie N-końcowej sekwencji aminokwasowej

Fitazę przenosi się elektroforetycznie z żelu SDS-PAGE albo z żelu JEF-PAGE na błonę PVDF (Immobilon, Millipore) stosowaną do prób hybrydyzacji. Ten elektroblotting prowadzi się w 10 mM buforze CAPS (kwas 3-cykloheksyloamino-propanosulfonowy), (pH = 11,0) z dodatkiem 10% metanolu (objętościowo), w czasie 16 godzin przy różnicy potencjałów 30 V, w temperaturze 4°C. Białko lokalizuje się przez barwienie błękitem Coomassie Brilliant wycina się odpowiednie pasmo, odbarwia się je metanolem i poddaje sekwencjonowaniu w fazie gazowej. Procedurę powtarza się kilkakrotnie, stosując wiele pojedynczych preparatów. Wyniki przedstawione są na fig. 1A (sekwencje A i B).

Oznaczono również sekwencję aminokwasową dla białka o wielkości 100 kDa obecnego w surowych preparatach. Dane uzyskane dla tego białka podane są na fig. 1C. Sekwencja ta wykazuje znaczną homologię z sekwencją kwaśnej fosfatazy wyizolowanej z Aspergillus niger (MacRae i wsp., Gene 71, 339 - 348).

168 470

B. Oznaczanie wewnętrznych sekwencji aminokwasowych

Fragmentacja białka metodą z bromocyjanem. Oczyszczoną do stopnia homogeniczności fitazę przenosi się do 100% roztworu NaHCC3 przez ultrafiltrację w urządzeniu Microconcentrator Centricon 30, firmy Amicon. Białko to następnie liofilizuje się, rozpuszcza w 70% kwasie trójfluorooctowym (objętościowo) i inkubuje się przez 6 godzin z około 300-krotnym nadmiarem molowym CNBr. Reakcję zatrzymuje się rozcieńczając mieszaninę wodą. Uzyskane fragmenty powtórnie się liofilizuje. Następnie próbkę rozpuszcza się w buforze do elektroforezy SDS-PAGE zawierającym DTT (ditiotreitol) i oznacza się stopień fragmentacji metodą PAGE. Analizę netodą PAGE prowadzi się w aparacie Phast-System firmy Pharmacia w 20 procentowych żelach SDS-PAGE. Zele te poddaje się wstępnej elektroforezie w celu utworzenia ciągłego układu buforowego dla polepszenia rozdziału małych peptydow (według poradnika). Peptydy wykrywa się techniką barwienia srebrem gdyż barwienie błękitem Coomassie Brilliant nie daje możliwości wykrycia najmniejszych peptydów. Wynikiem tej procedury jest całkowity rozkład fitazy na peptydy o masach cząsteczkowych < 2,5 kDa, 36 kDa, 57 kDa i 80 kDa.

Do dalszego sekwencjonowania w fazie gazowej peptydy izoluje się przez elektroforezę SDS-Trycyna-PAGE opisaną przez Schaggefai Jagowa (1987, Anal. Biochem., 166,368 - 379) po czym prowadzi się elektroforetyczne nanoszenie na filtr do hybrydyzacji typu blott, opisane powyżej.

Według oznaczenia wykonanego przez Ullah’a (1988, jak wyżej), N-końcowa część fragmentu o wielkości 57 kDa jest identyczna z N-końcową częścią fitazy, za wyjątkiem pierwszych czterech aminokwasów, które są nieobecne (fig. 1A, sekwencja B). Sekwencje N-końcowe peptydów o wielkości 2,5 kDa i 36 kDa są przedstawione na fig. 1B (sekwencje A i B).

C. Sondy oligonukleotydowe.

Sondy oligonukleotydowe przygotowuje się na podstawie sekwencji aminokwasowych podanych na fig. 1A i 1B w syntetyzerze DNA Applied Biosystems ABI 380B. Struktura tych oligonukleotydów jest podana na fig. 2A i 2B.

Przykład IV. Hybrydyzacja genomowych biotów i genomowych banków z pierwszą serią sond oligonukleotydowych

Genomowy DNA z A. ficuum izoluje się przez zmielenie grzybni w ciekłym azocie w znany sposób (Yelton i wsp., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1984,1470 - 1474). Bank genomowy konstruuje się w wektorze bakteriofaga lambda EMBL3, stosując materiał po częściowym trawieniu San 3A cbromosomalnego DNA z A. ficuum NRRL 3135 standardową techniką Maniatis’a i wsp. (Molecular cloning, a laboratory manual, 1982, Cold Spring Harbor Laborator, Nowy York). Uzyskany w ten sposób genomowy bank zawiera 60 do 70 kopii genomu A. ficuum. Bank ten testuje się na pojawienie się łysinek bez insertu metodą hybrydyzacji z fragmentem rdzeniowym lambda EMBL3. Zaobserwowano, że poniżej 1 procenta łysinek hybrydyzuje z sondą lambda EMBL3. Wielkość insertu wynosi 13 do 17 kb. (1 kb = 1000· par zasad).

W celu określania warunków i sond odpowiednich do skriningu banku genomowego, genomowy DNA poddaje się trawieniu kilkoma enzymami restrykcyjnymi, rozdziela się materiał po trawieniu na żelach agarozowych i hybrydyzuje metodą na filtrze Genescreen plus, postępując według instrukcji producenta. Prowadzi się hybrydyzację ze wszystkimi sondami oligonukleotydowymi, stosując warunki i roztwory o różnej mocy (6 x SSC, 40 do 60°C dla hybrydyzacji i do 0,2 x SSC, 65°C dla wypłukiwania). Do skriningu banku genomowego •wyselekcjonowano sondy 1068 i 1024 (fig. 2A), jakkolwiek nie można było zidentyfikować wspólnych fragmentów DNA, które hybrydyzowałyby specyficznie z obydwiema sondami. Sonda 1025 kwaśnej fosfatazy (fig. 3) dawała specyficzny, oddzielny sygnał hybrydyzacyjny a zatem sondę tę· wybrano do skriningu banku genomowego dla genu kwaśnej fosfatazy.

Stosując wszystkie trzy sondy można zidentyfikować w banku genomowym hybrydyzujące łysinki. Sygnał hybrydyzacji korespondujący z sondą 1025 (kwaśna fosfataza) jest silny i powtarzalny. Sygnały hybrydyzacji o zmiennej intensywności obserwuje się stosując sondy 1024 i 1068 (fitaza). Nie obserwuje się hybrydyzacji krzyżowej między tymi dwiema seriami. Wszystkie trzy serie łysinek poddaje się powtórnemu skriningowi i izoluje się DNA z ośmiu pojedyńczych, dodatnio hybrydyzujących łysinek (Maniatis i wsp., jak wyżej). W każdej serii można zidentyfikować klony zawierające identyczne hybrydyżujące fragmenty, co wska16

168 470 zuje, że inserty tych klonów są pokrewne i prawdopodobnie nakładają się na ten sam region genomowego DNA. Tu również nie można zaobserwować hybrydyzacji krzyżowej przy użyciu dwu serii specyficznych dla fitazy (sondy 1024 i 1068), co wskazuje na to, że aczkolwiek obydwie sondy zastosowane do izolacji tych dwu serii klonów otrzymano z N-końcowej sekwencji aminokwasowej białka, to zidentyfikowano i sklonowano odmienne fragmenty genomowego DNA.

Wszystkie trzy serie klonów poddaje się hybrydyzacji techniką Northem’a z materiałem zawierającym mRNA wyizolowany z indukowanej i nie-indukowanej grzybni (przykład VI). Klony specyficzne dla kwaśnej fosfatazy jak również wyizolowany z tych klonów wewnętrzny fragment o wielkości 3,1 kb po trawieniu Sall hybrydyzuje wyłącznie z indukowanymi próbkami mRNA. Ten mRNA. Ten mRNA zidentyfikowany za pomocą sond specyficznych dla kwaśnej fosfatazy ma około 1800 zasad długości, co jest zgodne ze znaną wielkością tego białka (68 kDa; Ullah i Cummins, Prep. Biochem., 1987,17,397 - 422). Nie zachodzi hybrydyzacja tych klonów specyficznych dla fitazy ze specyficznym mRNA. Uznano, że opisany powyżej sposób nie nadaje się do klonowania genu kodującego fitazę. Można dalej wnioskować, że niepowodzenie to wynika z wyboru złej metody, gdyż metodę tę z powodzeniem stosuje się do identyfikacji genu dekodującego kwaśną fosfatazę. Klon lambda zawierający gen kwaśnej fosfatazy zdeponowano w dniu 24 kwietnia 1989 roku w Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandia, pod numerem akcesyjnym CBS 214.89. Z faga Z1 izoluje się fragment BamHI o długości 10 kb i subklonuje się go do plazmidu pUC 19. Ten podklon zawiera cały gen koduj ący kwaśną fosfatazę. Ten podklon, o nazwie pAF 1-1 (fig. 5) zdeponowano w dniu 24 kwietnia 1989 roku pod numerem CBS 213.89.

Przykład V. Izolowanie genu kodującego fitazę przy użyciu drugiej serii sond oligonukleotydowych.

Sondy przygotowano w oparciu o wytworzone po traktowaniu CNBr fragmenty N-końcowej sekwencji aminokwasowej (fig. 2B, sondy 1295, 1296 i 1297). Sondy te poddaje się hybrydyzacji z genomowym DNA w sposób opisany powyżej. Możliwość użycia tych sond do izolacji genu kodującego fitazę bada się przez hybrydyzację Southern’a materiału genomowego na filtrach z sondami. Tym razem można zidentyfikować hybrydyzujące fragmenty o odpowiednich długościach stosując wszystkie trzy sondy, pomimo tego, że sondy te pochodzą z regionów nie pokrywających się. Pomiędzy nowym zestawem sond a klonami wyizolowanymi przy użyciu pierwszego zestawu sond nie zachodzi hybrydyzacja (przykład IV). Dokonano zatem powtórnego skriningu banku genomowego stosując wszystkie trzy sondy w oddzielnych doświadczeniach. Podzbiór klonów (lambda AF201, 219, 241 i 243) wyizolowany z każdą osobną sondą hybrydyzuje również z dwiema innymi sondami, co wskazuje na to, że w tym przypadku przy użyciu trzech różnych sond wyizolowano klony z jednego regionu genomu. Usiłowano zhybrydyzować nowo wyizolowane klony z sondami 1024 i 1068. W obydwu przypadkach nie zaobserwowano hybrydyzacji z nowo wyizolowanymi klonami w warunkach, w których obydwie sondy hybrydyzują z klonami wyizolowanymi z zastosowaniem tych sond (przykład IV). Jest to dowodem na to, że nowo wyizolowane klony nie wykazują homologii z sondami pochodzącymi z N-końcowej sekwencji oczyszczonej fitazy.

Klon lambda EMBL3 hybrydyzujący ze wszystkimi trzema sondami (1295 - 1297) o nazwie AF201 (fig. 4) zdeponowano 9 marca 1989 roku pod numerem CBS 155.89.

Fragment BamHI klonu lambda AF201 o długości 5,1 kb (subklonowany w plazmidzie pUC19( i oznaczony jako pAF 2-3, fig. 4), hybrydyzujący ze wszystkimi trzema sondami oligonukleotydowymi stosuje się do sondowania materiału w próbie Northern’a. W tym przypadku, identyfikuje się oddzielny mRNA o wielkości 1800 zasad. Ten mRNA znajduje się tylko w indukowanej grzybni. Podobne wyniki uzyskano stosując te oligonukleotydy jako sondy. Stosując nowy zestaw sond zidentyfikowano zatem wspólny fragment DNA, który specyficznie hybrydyzuje z indukowanym mRNA. Długość tego mRNA (1800 par zasad) jest wystarczająca do kodowania białka o wielkości około 60 kDa, a jest to wielkość niezglikozylowanej fitazy. Jasne jest więc, że wyizolowane fragmenty zawierają co najmniej część genu kodującego fitazę.

Przykład VI. Izolowanie indukowanego i nie indukowanego mRNA.

Z piśmiennictwa wiadomo, że synteza fitazy w A. ficuum, podlega ścisłej regulacji zależnej od fosforanów (Han i Callagher, J. Indust. Microbiol., 1987, 1, 295 - 301). Wykazanie, że wyizolowany gen jest przedmiotem podobnej regulacji, stanowiłoby zatem następny dowód na to, że został sklonowany właściwy gen.

Dla wyizolowania mRNA, którego synteza przebiegała w warunkach zarówno produkcji jak i nieprodukcji, prowadzi się wzrost A. ficuum NRRL 3135 w sposób następujący: Na początku hoduje się zarodniki w pożywce nieindukującej przez dobę. Następnego dnia grzybnię zbiera się, przemywa się ją sterylną wodą i zaszczepia na podłoże indukujące i na podłoże nieindukujące. Stosuje się podłoże o składzie: 20g skrobi kukurydzianej, 7,5g glukozy, 0,5g MgSOą · 7H20,0,2g FeSO4 · 7 H2O i 7,2g KNO3 w litrze. W celu indukowania produkcji fitazy do podłoża dodaje się do 2 g/litr namoku kukurydzianego, natomiast podłoże nieindukujące zawiera 2 g/litr K2HPO4. Wzrost grzybni prowadzi się przez następne co najmniej 100 godzin. W określonych przedziałach czasu pobiera się próbki. Wytwarzanie fitazy śledzi się wykonując próby na fitazę, opisane w przykładzie HA. Denaturowany mRNA wyodrębnia się przez elektroforezę i nanosi na filtry Genescreen plus. Filtry te hybrydyzuje się ze znakowanym rAF 2-3 albo z wyizolowanym fragmentem Sali o wielkości 3,1 kb z pAF 1-1 (kwaśna fosfataza) z przykładu IV. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Dodatnie wyniki hybrydyzacji specyficznego dla fitazy fragmentu BamHI o wielkości 5,1 kb i specyficznego dla kwaśnej fosfatazy fragmentu Sall o wielkości 3,1 kb z wyizolowanym mRNA notuje się jedynie wówczas, gdy prowadzi się hodowlę komórek w warunkach o których wiadomo, że indukują syntezę fitazy i kwaśnej fosfatazy. Wynika stąd, że wyizolowane geny podlegają regulacji jakiej oczekuje się od genu dla fitazy i dla kwaśnej fosfatazy.

Tabela 2

Hybrydyzacja Northern’a z zastosowaniem właściwego dla fitazy fragmentu BamHI o wielkości 5,1 kb (A) albo właściwego dla kwaśnej fosfatazy fragmentu Sali o wielkości 3,1 kb (B) jako sondy. Znak + wskazuje na obecność mRNA fitazy o długości 1800 par zasad albo mRNA kwaśnej fosfatazy o długości 1800 par zasad. Względną aktywność fitazy oznaczano w próbach 24-godzinnych. Hodowle indukowane wykazywały 10-krotnie większą aktywność fitazy niż hodowle nieindukowanych

Czas po zaszczepieniu	Hodowla indukowana	Hodowla nieindukowana
A 24 godziny	+	-
B 24 godziny	+	-

Przykład VII. Dowód na sklonowanie genu fitazy.

Dla uzyskania definitywnego dowodu nato, że wyizolowano właściwy gen kodujący fitazę i dla zbadania możliwości zwiększonej ekspresji sklonowanego genu dokonano subklonowania genu fitazy do odpowiedniego wektora i transformowano go do A. niger 402 (ATCC 9092).

W tym celu, gen fitazy izoluje się z klonem lambda AF201 jako fragment Nrul o długości 10 kb i klonuje się do miejsca Stul w wektorze pAN 8-1 (Mattern I.E. i Punt P.J., Findal Genetics Newsletter, 1988,35,25), który zawiera gen ble (nadający oporność na fleomycynę) jako marker selekcyjny. Uzyskany konstrukt o nazwie pAF 29-1 (fig. 4) transformuje się do A. niger 402 techniką opisaną w przykładzie IX, z tą różnicą, że protoplastry posiewa się na minimalnym podłożu Aspergillus z dodatkiem 30 μg fleomycyny/ml i zestala się 0,75 procentowym agarem. Pojedyncze transformanty oczyszcza się, izoluje i testuje na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach w sposób opisany w przykładach I i II. Jako kontrolę testuje się, również transformanty posiadające jedynie wektor oraz nietransformowane komórki gospodarza (tabela 3). Jedynie A. niger 402 zawierający pAF 28-1 wytwarza fitazę, która reaguje ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym przeciw fitazie A. ficuum. Fitaza reagująca z tym przeciwciałem monoklonalnym, eluuje się z kolumny immunopowinowactwa przy pH 2,5, posiada identyczną masę cząsteczkową, stopień glikozylacji, punkt izoelektryczny i aktywność właściwą jak fitaza z A. ficuum. Stanowi to klarowny dowód na to, że komórki A. niger 402 transformowane pAF 28-1

116 440 wytwarzają fitazę, która jest identyczna z fitazą z A. ficuum. Podobna ekspresja nie zachodzi w innych typach komórek kontrolnych.

Tabela 3

Szczep	Aktywność fitazy jednostki/ml	Aktywność fitazy zaadsorbowana na kolumnie immunopowinowactwa (w procentach)
A. niger 402	0,5	0
A. niger 402
pAF 28-1	0,7	10
A. niger 402
pAN 8-1	0,5	0

Szczepy hodowano w warunkach indukujących (przykład VI). Próbki pobierano po 96 godzinnym wzroście.

Przykład VIII. Charakteryzacja genu fitazy

Klony lambda zawierające gen fitazy analizuje się przez trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi. Mapę regionu genomowego zawierającego gen fitazy podano na fig. 4. Określone fragmenty restryskcyjne subklonuje się do wektora klonującego pUC19, jak pokazano na fig. 4.

W przykładzie V wykazano, że fragment BamHI o wielkości 5,1 kb obecny w pAF 2-3 zawiera co najmniej część genu fitazy. Ponadto, oligonukleotydowe sondy 1295 i 1297 (fig. 2B) hybrydyzują z insertem Sali z pAF 2-7 (pozycje klonów pAF 2 są podane na fig. 4) podczas gdy sonda 1296 zajmuje prawdopodobnie miejsce SAll między fragmentami w pAF 2-6 i pAF 2-7. Wyniki te wykazują, że sekwencja kodująca fitazę jest zlokalizowana w lewostronnej części insertu BamHI pAF 2-3.

Ponadto całkowicie oznaczono sekwencje nukleotydowe insertów w plazmidach pAF 2-3, pAF 2-6 i pAF 2-7 stosując metodą zakańczania łańcucha di-dezoksy (Sanger i wsp., Prod. Natl. Acad. Sci. USA,, 1977,74, 5463 - 5467) i metodą strzałów na ślepo opisaną przez Messing’a i wsp. (Nuci. Acids Res., 1981, 9, 309 - 321). Zsyntetyzowano poza tym specyficzne oligonukleotydy w oparciu o informacje o sekwencji nukleotydowej uzyskane podczas procedury sekwecjonowania.

Całkowita sekwencja nukleotydowa klonów pAF 2-3, pAF 2-6 i pAF 2-7 obejmująca locus genu fitazy w chromosomie skompilowana jest na fig. 6, a w formie graficznej przedstawiona jest na fig. 7.

Analiza zdolności kodowania białka tej całkowitej sekwencji ujawniła, że N-końcowa sekwencja aminokwasowa dojrzałego białka jest kodowana startując od pozycji 381 w nukleotydzie (koniec aminowy ujawniony przez Ullah'a jest zlokalizowany w pozycji 369). Wykazano ponadto, że N-końcowa sekwencja aminokwasowa o wielkości 36 kDa i wewnętrzne fragmenty peptydu o wielkości 2,5 kDa (fig. 1B, sekwencja C i A) są kodowane w pozycjach nukleotydu 1101 i 1548, odpowiednio. Otwarta faza odczytu kończy się w pozycji 1710.

Wyniki tych badań stanowią dowód na identyczność scharakteryzowanego locus chromosomalnego jako locus zawierającego sekwencję DNA kodującą fitazę. Bezpośrednio w górę od sekwencji chromosomalnej kodującej dojrzałe białko fitazy nie wykryto kodonu stratu ATG w fazie odczytu sąsiadującej z otwartą fazą odczytu dla dojrzałego białka. Jednakże, stosując charakterystykę granicy intron - egzon można przypuszczać, że intron znajduje się między nukleotydami 254 a 355, dając kodon ATG w pozycji 210 nukleotydu, co jest w fazie zgodnej z otwartą fazą odczytu kodującą dojrzałe białko. Pochodna sekwencja aminokwasowa tego N-końcowego obszaru ściśle odpowiada regułom dla sygnalnej sekwencji sekrecji opublikowanym przez von Heyne’ego (Eur. J. Biochem., 1983, 133, 17 - 21).

168 470

Dla potwierdzenia tych hipotez izoluje się cDNA fitazy metodą PCR-amplifikacji z zastosowaniem primerów specyficznych dla fitazy i całkowitej populacji mRNA/cDNA jako matrycy, w sposób opisany poniżej.

Izolowanie poli A+ RNA z A. ficuum

Z A. ficuum NRRL 3135 hodowanego w warunkach indukujących podanych w przykładzie VI izoluje się całkowity RNA. Suchą grzybnię zamraża się w ciekłym azocie i miele. Następnie proszek homogenizuje się w aparacie Ultra-Turrax (pełna szybkość w czasie 1 minuty) w roztworze zawierającym 3 M LiCl i 6 M mocznika w temperaturze 0°C i utrzymuje się przez dobę w temperaturze 4°C w sposób opisany przez Auffrey’a i Rougeon’a (Eur. J. Biochem., 1980,107, 303 - 314). Całkowity komórkowy RNA otrzymuje się po wirowaniu z szybkością 16 000g w czasie 30 minut i po dwu kolejnych ekstrakcjach mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (50:48:2). Ten RNA strąca się etanolem i rozpuszcza w 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH = 7,4) z dodatkiem 0,5 x SDS. W celu wyselekcjonowania poli A+ RNA, próbkę całkowitego RNA ogrzewa się przez 5 minut w temperaturze 60°C, doprowadza się roztwór do stężenia 0,5 M NaCl i następnie podaje się na kolumnę z oligo/dt/-celulozę. Po kilku przemywaniach roztworem zawierającym 10 mM Tris-HCl (pH = 7,4), 0,5% SDS i 0,1 M NaCl zbiera się poli A+ RNA przez eluowanie 10 mM roztworem Tris-HCl (pH = 7,4) z dodatkiem 0,5% SDS. Przygotowanie kompleksu mRNA-cDNA.

W celu zsyntetyzowania pierwszej nici cDNA rozpuszcza się 5 μg poli A+ RNA w 16,5 μΐ wody i ddoaje się następpjące składniki: 2,5 μΐ RNasin (30 j eedostek/μΐ)i 10 μΐ buforu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH = 7,6), 6 mM MgCl₂ i 40 mM KC1, 211 M KC1, 5 μl 0,1 M DTT, 0,5 μΐ pongo/dt/H-^ (2,5 mg/ml), 5 μ 8 mM d^P-mieszaniny, 5 μΐ bSa (1 mg/ml) i 2,5 μl odwrotnej transkryptazy Moloneza MLV (200 jednostek/ml). Mieszaninę inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 10 μΐ 0,2 M EDTA i 50 μΐ wody. Następnie prowadzi się ekstrakcję chloroformem i po wirowaniu dodaje się do supernatantu kolejno 110 μΐ 5 M octanu. amonowego i 440 μΐ etanolu. Strącanie kompleksu mRNA-cDNA prowadzi się w roztworze suchy lód - etanol w czasie 40 minut, po czym kompleks ten zbiera się przez wirowanie, przemywa się go 70 procentowym etanolem ziębionym lodem i rozpuszcza się w 20 μΐ wody. Klonowanie fragmentów cDNA fitazy.

Izolację sekwencji cDNA kodujących fitazę prowadzi się przez reakcję budowy łańcucha za pomocą polimerazy (PCR) w dwu fragmentach. W oparciu o sekwencję genomową fitazy przedstawioną na fig. 8 projektuje się cztery syntetyczne primery oligonukleotydowe:

Oligo: 1:5’ - GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA-3’ oligo 2:5’ - ATG.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TGG-3’ oligo 3:5’- GAG.CAG.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC - 3’ oligo 4:5’- AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.GTT.TAA.ACC.C - 3’

Oligo 1 zawiera sekwencję aukleotydowc w dół od kddonu startu ATG fitazy (pozycje 210yo231) flaakdwjoc na końcu 5’ miejscem EcoRI. Oligo 2 zawiera sekwencję oukledtyydwą idącą w górę bezpośrednio od miejsca Sali (pozycje 1129 do 1109) również flankowaną dodatkowym miejscem EcoRI. Oligo 3 zawiera sekwencję nukleotydową wokół miejsca BamHI (pozycje 845 do 865) a oligo 4 zawiera sekwencję oukleotydową usytuowaną w dół od kodonu stopu dla fitazy (pozycje 1890 do 1867) flankowaną dodatkowym miejscem Pstl.

Reakcje budowy łańcucha wobec polimerazy prowadzi się według instrukcji dostawcy Tag-polymerase (Cetus). Jako matrycę stosuje się roztwór (1,5 μΐ) zawierający opisane powyżej hybrydy mRNA-cDNA a jako primery stosuje się po 0,3 μg oligo 1 i oligo 2 w reakcji amplifikacji N-końcowej części cDNA fitazy oraz oligo 3 i oligo 4 w reakcji amplifikacji C-końcowej części cDNA fitazy (fig. 8). Po denaturacji (7 minut w temperaturze 100°C) i dodaniu 2 jednostek polimerazy (Taq-plymerase) mieszaniny reakcyjne poddaje się 25 cyklom amplifikacji (każdy cykl: 2 minuty w 55°C, 3 minuty w 72°C, 1 minuta w 94°C) w amplifikatorze DNA Perkin-Elmer/Cetus. W ostatnim cyklu pomija się etap denaturacji. Po trawieniu (EcoRI dla części N-końcowej cDNA i BamHI oraz Pstl dla części

168 470

C-końcowej cDNA), obydwa fragmenty cDNA klonuje się do odpowiednich miejsc w plazmidzie pTZ18R (Promeqa).

Sekwencję nukleotydową obydwu uzyskanych metodą PCR fragmentów oznacza się techniką zakańczania łańcucha didezoksy (Sanger, jak wyżej) stosując jako primery syntetyczne oligonukleotydy skonstruowane po sekwencjonowaniu chromosomalnego genu fitazy oraz całkowity amplifikowany DNA i klonowane fragmenty cDNA jako matrycę. Sekwencja regionu cDNA kodującego białko fitazy oraz sekwencję aminokwasów białka fitazy przedstawiono na fig. 8.

Ta sekwencja cDNA stanowi potwierdzenie postulowanej powyżej lokalizacji intronu i wskazuje, że w obrębie sekwencji genu chromosomalnego nie występują żadne inne introny.

Gen fitazy koduje pierwotny produkt translacji złożony z 4677 aminokwasów (masa cząsteczkowa 51091). Ten pierwotny produkt translacji ulega przetworzeniu z odszczepieniem peptydu sygnalnego i powstaniem dojrzałego białka złożonego z 444 (masa cząsteczkowa 48851) albo z 448 (zawierających, pierwsze 4 N-końcowe aminokwasy opisane przez Ullah’a, masa cząsteczkowa 49232) aminokwasów.

Przykład IX. Zwiększona ekspresja fitazy w Aspergillus wywołana wprowadzaniem dodatkowych kopii genomowego DNA fitazy.

Konstruowanie wektora ekspresyjnego pAF 2-2S. Wszystkie konstrukty przygotowuje się stosując standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak opisane przez Maniatis’a i wsp. (Molecular cloning, A laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.)

Wektor ekspresyjny pAF 2-2S przygotowuje się przez subklonowanie fragmentu DNA PvuII o wielkości 6 kb z genomowego klonu fitazy lambda AF201 do miejsca Smal w pUC19. Plazmid pochodny oznaczano symbolem pAF 2-2 (fig. 4). Jako marker selekcyjny do transformacji do szczepu Aspergillus wprowadzono fragment EcoRI/KpnI z plazmidu pGW325 (Wernes K, Thesis, Agriculture University, Wegeningen, 1986, Holandia) zawierający homologiczny gen amdS z Aspergillus nidulans do miejsc ECoRI/KpnI w plazmidzie pAF 2-2. Uzyskany wektor ekspresyjny oznaczano symbolem pAF 2-2S. Jest on przedstawiony na fig. 9.

A. Zwiększona ekspresja fitazy w A. ficuum NRRL 3135.

Plazmid pAF 2-2S wprowadza się do A. ficuum NRRL 3135 stosując procedury transformacji opisane przez Tilburn’a i wsp. (Gene, 1983, 26, 205 - 221 i Kelley’ego J. i Hynes’a M. EMBO J., 1985, 4, 475 - 479) z następującymi modyfikacjami:

- grzybnię hoduje się na minimalnej pożywce Aspergillus (Cove D., Biochem. Biophys. Acta, 1966, 113, 51 - 560) z dodatkiem 10 mM argininy i 10 mM proliny w czasie -16 godzin w temperaturze 30°C na wstrząsarce rotacyjnej o obrotach 300 obrotów/minutę,

- do wytworzenia protoplastrów stosuje się tylko Novozym 234 (Novo Industri), natomiast nie dodaje się helikazy,

- po 90 minutach tworzenia się protoplastrów do zawiesiny protoplastrów dodaje się 1 objętość buforu STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 50 mM CaCk i wiruje się z szybkością 2500g w temperaturze 4°C w czasie 10 minut w rotorze wahadłowo - tłokowym. Protoplasty przepłukuje się i zawiesza w buforze STC w stężeniu 10⁸ komórek/ml,

- do zawiesiny protoplastów (100 μΐ) dodaje się plazmidowy DNA w objętości 10 μΐ w buforze TE (10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 0,1 mM EDTA),

- po inkubacji zawiesiny DNA - protoplasty w temperaturze 0°C w czasie 25 minut dodaje się 200 μΐ roztworu pEg, kroplami (25% PEG 400 firmy Merck), 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 50 mM CaCk). Następnie dodaje się powoli 1 ml roztworu PEG (60% PEG 400 w 10 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 50 mM CaCk) z wielokrotnym mieszaniem probówek. Po inkubacji w temperaturze pokojowej zawiesiny rozcieńcza się buforem STC, miesza przez odwrócenie i wiruje z szybkością 2000g w temperaturze 4°C w czasie 10 minut. Protoplasty zawiesza się łagodnie w 200 μΐ buforu STC i posiewa na minimalne podłoże Aspergillus z 10 mM acetamidu jako jedynym źródłem - azotu, 15 mM CsCl i 1 mM sacharozy, zestalone 0,75 agaru bakteriologicznego 1 (Oxoid). Hodowlę prowadzi się w temperaturze 33°C w czasie 6-10 dni.

Pojedyńcze transformanty oznaczone jako SP4, SP7 i SP8 izoluje się, oczyszcza i testuje na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach w sposób opisany w przykładach I i II. Jako

168 470 kontrolę testuje się transformanty posiadające jedynie wektor (gen amdS w pUC19) oraz nietransformowanego gospodarza.

Wzrost szczepów prowadzi się w warunkach indukowania (patrz przykład VI) pobierając próbki po 96 godzinach hodowli. Analizę prowadzi się przez pomiar aktywności fitazy (tabela 4) i metodą ogniskowania w punkcie izoelektrycznym w procesie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (JEP-PAGE). Z brzeczek fermentacyjnych A. ficuum i A. ficuum pAF 2-2S SP7 hodowanych w identycznych warunkach pobiera się próbki o jednakowej objętości i podaje się je na żel JEF-PAGE (zakres pH = 4,5 - 6, Phast-System, Pharmacia). Elektroforezę prowadzi się według instrukcji producenta. Następnie żele barwi się albo błękitem Coomassie Brilliant barwiącym ogólne białko (fig. 10B) albo wykonuje się barwienie opisane w przykładzie II na ogólną aktywność fosfatazy (fig. 10A).

Stosuje się również próbkę fitazy z A. ficuum, oczyszczoną do homogeniczności (na drodze chromatografii immunopowinowactwa opisanej w przykładzie VII) albo samej albo zmieszanej z supernatantem hodowli.

W różnych próbkach fitaza występuje w różnych formach izomerycznych (wskazanych gwiazdką), o czym wspomniano w opisie wynalazku. Dwa główne izoenzymy są dokładnie widoczne w oczyszczonej fitazie w pasmach 3 i 4 przy obydwu metodach barwienia (A i B). Pasma fitazy są ledwie widoczne w macierzystym szczepie A. ficuum, natomiast znacznie się zwiększają w szczepie transformowanym pAF 2-2S SP7.

Tabela 4

Zwiększone wytwarzanie fitazy w wyniku transformacji A. ficuum NRRL 3135

Szczep	Aktywność fitazy (jednostek ml)
A. ficuum	0,6
A. ficuum + plazmid kontrolny	0,6
A. ficuum pAF 2-2S SP8	7,6
A. ficuum pAF 2-2S SP7	6,7
A. ficuum pAF 2-2S SP4	4,3

B. Zwiększone wytwarzanie fitazy w A. niger CBS 513.88.

Wektor ekspresyjny pAF 2-2S wprowadzono również do A. niger CBS 513.88, stosując taką samą procedurę transformacji jak dla A. ficuum. Wyizolowano czyste transformanty, oczyszczono je i wykonano test na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach, w indukujących warunkach wzrostu, opisanych w przykładzie VI.

Poziomy ekspresji fitazy w niektórych transformantach (oznaczonych jako A. niger pAF 2-2S # 8, # 20 i # 33) oraz w szczepach kontrolnych, oznaczone w sposób podany w przykładzie IA przedstawiono w tabeli 5.

Poziomy ekspresji fitazy w transformantach A. niger są porównywalne z odpowiednimi poziomami w transformantach A. ficuum. Spostrzeżenie to wskazuje na fakt, że promotor fitazy z A. ficuum jest aktywny w A. niger.

Dalszą analizę prowadzi się stosując pożywkę hodowli transformantu pAF 2-2S # 8. Pożywkę tę poddaje się elektroforezie w żelu JEF-PAGE w zakresie pH od 4,5 do 6 w opisanej powyżej aparaturze Phast-System Pharmacia). Na żel nanosi się jednakowe objętości supernantantów hodowli macierzystego szczepu A. niger i transformantu pAF 2-2S # 8 hodowanych w. identycznych warunkach. Żele rozwija się i następnie barwi w wyżej opisany sposób.

Macierzysty A. niger wytwarza bardzo niewielką ilość fitazy, której nie można wykryć metodą elektroforezy w żelu. Szczep pAF 2-2S wytwarza około 90 razy więcej fitazy. Różnica ta jest dobrze widoczna na fig. 11.

Wykryto również wiele izo-form enzymu fitazy (wskazanych gwiazdką). Barwienie ogólnego białka wykazuje, że gwałtownie wzrosła intensywność pasm białka fitazy, podczas gdy nie pojawiły się większe pasma innych białek.

168 470

Tabela 5

Wytwarzanie fitazy w wyniku transformacji A. niger CBS 513.88 przez pAF 2-2S

Szczep	Aktywność fitazy (jednostek/ml)
A. niger	0,2
A. niger + plazmid kontrolny	0,2
A. niger pAF 2-2S # 8	14
A. niger pAF 2-2S # 33	5
A. niger pAF 2-2S # 20	4

Przykład X. Ekspresja fitazy w A. niger transformowanym wektorami ekspresyjnymi zawierającymi gen fitazy z A. ficuum sprzężony z promotorem i/lub sekwencjami sygnałowymi genu amyloglukozydazy (AG) z A. niger.

Konstruowanie wektorów ekspresyjnych.

Dla uzyskania zwiększonej ekspresji fitazy w A. niger sporządza się dodatkowe kasety ekspresyjne, w których gen fitazy z A. ficuum znajduje się pod kontrolą promotora genu amyloglukozydazy (AG) z A. niger w kombinacji z różnymi sekwencjami sygnałowymi. W plazmidach pl8FYT3 i p24FYT3 przyłącza się odpowiednie sekwencje liderowe 18 i 24 aminokwasu z genu AG z A. niger do fragmentu genu fitazy kodującego dojrzale białko. W kasecie ekspresyjnej pFYT3 sekwencja promotora AG jest przyłączona do sekwencji kodującej fitazę łącznie z sekwencją liderową fitazy.

Konstruowanie pl8FYT3.

Fuzję promotora Ag i sekwencji liderowej 18-tego aminokwasu AG z sekwencją fitazy kodującą dojrzałe białko prowadzi się metodą reakcji budowy łańcucha wobec polimerazy (PCR). W reakcjach PCR stosuje się dwie różne matryce: pAF 2-2S zawierającą cały gen fitazy, opisaną powyżej oraz pAB 6-1, plazmid zawierający całe locus AG z A. niger, wyizolowany z banku plazmidowego A. niger, zawierający fragmenty Hindlll o wielkości 13-15 kb w pUC19. Do izolacji stosuje się specyficzne w stosunku do AG oligonukleotydy:

AG-a: 5’ - GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGCATTTGGCCC -3’

AG-2 : 5’ - AAGCAGCCATTGCCCGAAGCGAT - 3’ obydwa oparte na sekwencji nukleotydowej opublikowanej przez Boel’a i wsp. (EMBO J., 1984, 3, 1097 - 1102 oraz Mol. and Cell. Biol. 1984, 4, 2306 - 2315) dla A. niger. Sondy oligonukleotydowe pochodzą z sekwencji otaczających intron 2: oligo AG-1 jest zlokalizowana w położeniu 3’ od intronu i posiada polamość identyczną z AG mRNA a oligo AG-2 znajduje się w górę od intronu 2 i w pozycji antyrównoległej do mRNA. Plazmid pAB6-l zawiera gen AG we fragmencie HindIII o wielkości 14,5 kb (fig. 12).

Jako primery do reakcji amplifikacji PCR stosuje się cztery syntetyczne oligonukleotydy o następujących sekwencjach:

oligo -1:5’ - CTCTGCACGAATTCAAGCTAG - 3’ (sekwencja specyficzna dla AG wokół miejsca EcoRI położona około 250 bp w górę od kodonu inicjacji ATC) oligo -18-2:5’- CGAGGCGGGGACTGCCATGCCAACCCTGTGCAGAC - 3’ dojrzała fitaza θ lider 18-tego aminokwasu AG oligo 18 - 3 : 5’ - GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGAGTCCCCGCCTCG - 3’ lider 18-tego aminokwasu ag θ dojrzała fitaza oligo 4:5’ - GGCACGAGGATCCTTCAGCTT - 3’ (sekwencja specyficzna dla fitazy, zlokalizowana w miejscu BamHI w pozycji 861).

Reakcje PCR prowadzi się według opisu podanego przez Saiki i wsp. (Science, 1988,239,

487 - 491) z małymi modyfikacjami (patrz przykład VIII).

Dla związania sekwencji AG z sekwencjami kodującymi fitazę prowadzi się dwie oddzielne reakcje PCR: pierwszą reakcję prowadzi się z pAB6-1 jako matrycą i oligonukleotydami 1 i

18-2 jako primerami w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 300 par zasad zawierającego część 3’ promotora AG i sekwencję liderową 18 aminikwasu AG flankowaną na końcu 3’

168 470 nukleotydami genu fitazy. Drugą reakcję prowadzi się stosując pAF 2-2S jako matrycę i oligonukleotydy 18-3 i 4 jako primery w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 600 par zasad zawierającego część 5’ genu fitazy flankowaną na końcu 5’ przez 18 nukleotydów dla peptydu sygnałowego AG. Schemat tych amplifikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Tak wytworzone dwa fragmenty DNA oczyszcza się przez elektroforezę i strącanie etanolem i stosuje jako matrycę w trzeciej reakcji PCR stosując oligonukleotydy 1 i 4 jako primery. W reakcji tej dokonuje się fuzji AG - fitaza. Wytworzony fragment dNa trawi się enzymami EcoRI i BamHI i klonuje do pTZ18R. Wytworzony plazmid fuzyjny sekwencjonuje się i oznacza symbolem p18FYT1.

Pozostałe regiony o wielkości 3,5 kb, w górę od promotora AG uzyskuje się przez trawienie plazmidu pAB6-1 za pomocą Kpn1 i częściowo EcoRI i poddaje się ligacji z fragmentem EcoRI/BamHI o wielkości 1,1 kb plazmidu pl8FYTl i następnie klonuje się do miejsc Kpnl/BamHI w pTZ18R. Otrzymany plazmid pl8FYT2 jest przedstawiony na fig. 15.

Dodatkowe miejsce restrykcyjne HindIII wprowadza się przez insercję syntetycznego fragmentu:

5’ - AATTCAAGCTTG 3’

3’ CTTCGAACTTAA 5’ do miejsca EcoRI (flankującego gen amds) w pAF 2-2S. Powstały plazmid, oznaczony jako pAF 2-2SH (fig. 14) stosuje się jako plazmid wyjściowy do wymiany sekwencji promotora fitazy na fuzyjne fragmenty DNA AG-fitaza pochodząca z reakcji PCR.

W końcowym etapie konstrukcji, p18FYT2 i pAF 2-2SH trawi się enzymem KpnI i częściowo BamHI. Izoluje się fragment DNA o wielkości 4,6 kb z pl 8FYT2 oraz fragment DNA o wielkości 11 kb z plazmidu pAF 2-2SH, fragmenty te oczyszcza się przez elektroforezę w żelu, następnie poddaje się ligacji i przenosi do E.coli. Uzyskaną kasetę ekspresyjną oznacza się symbolem p18FYT3 (fig. 15).

Konstruowanie plazmidu p24FYT3.

Fuzję promotora AG i sekwencji liderowej 24 aminokwasu AG z sekwencją kodującą dojrzałe białko fitazy prowadzi się metodą amplifikacji PCR w sposób opisany powyżej dla konstrukcji pl8FYT3, z tym, że stosuje się inne primery. Syntetyzuje się dwa nowe primery o następującej sekwencji:

Oligo 24-2 : 5’ - CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTGGAAATCACATT - 3’ dojrzała fitaza θ lider 24 aminokwasu AG

Oligo 24-3 : 5’ - AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG - 3’ lider 24 aminokwasu Ag θ dojrzała fitaza

Prowadzi się dwie oddzielne reakcje PCR: pierwszą reakcję z zastosowaniem pAB6-1jako matrycy i oligonukleotydów 1 i 24-2 jako primerów w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 318 bp zawierającego część 3’ promotora AG i sekwencję liderową 24 aminokwasu AG flankowaną na końcu 3’ przez 18 nukleotydów genu fitazy oraz drugą reakcję z zastosowaniem pAF 2-2S jako matrycy i oligonukleotydów 24-3 i 4 jako primerów w celu amplifikacji fragmentu DNA zawierającego część 5’ genu fitazy flankowaną na końcu 5’ przez 18 nukleotydów lidera 24 aminokwasu AG. Schemat tych amplifikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Dla skonstruowania końcowej kasety ekspresyjnej p24FYT3 poprzez pośrednie plazmidy p24FYTl i p24FYT2 stosuje się taką samą drogę i procedurę klonowania jaką zastosowano dla pl 8FYTl i pl8FYT2 dla uzyskania kasety ekspresyjnej pl8FYT3 (fig. 15).

Konstruowanie plazmidu pFYT3

Fuzję promotora AG z sekwencją genu fitazy (zawierającą sekwencję liderową dla fitazy) prowadzi się również metodą reakcji PCR w sposób opisany dla konstruowania pl8FYT3, za wyjątkiem użytych primerów. Generuje się dwa dodatkowe primery o następujących sekwencjach:

Oligo fyt-2 : 5’ - AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGTG - 3’ lider fitazy θ promotor AG

Oligo fyt-3 : 5’ - CATCATTACACCTCAGCAATGGGCCTCTCTGCTGTT - 3’ promotor AG θ lider fitazy

168 470

Prowadzi się dwie oddzielne reakcje amplifikacji PCR: pierwszą reakcję z zastosowaniem pAG 6-1 jako matrycy i oligonukleotydów 1 i fyt-2 jako primerów w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 282 par zasad zawierającego część 3’ promotora AG flankowaną na końcu 3’ przez 18 nukleotydów lidera fitazy oraz drugą reakcję z zastosowaniem pAF 2-2Sjako matrycy i oligonukleotydów fyt-3 i 4 jako primerów, w celu amplifikacji fragmentu zawierającego część 5 ’ genu fitazy (łącznie z liderem fitazy) flankowaną na końcu 5 ’ przez 18 nukleotydów promotora AG. Schemat tych reakcji amplifikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Dla skonstruowania końcowej kasety ekspresyjnej pFYT3 poprzez pośrednie plazmidy pFYT l i pFYT2 stosuje się taką samą drogę i procedurę klonowania jaką zastosowano dla pl 8FYTl i p18FYT2 dla uzyskania kasety ekspresyjnej pl8FYT3 (fig. 15).

Ekspresja genu fitazy pod kontrolą promotora AG z A. niger.

Z opisanych powyżej kaset ekspresyjnych fitazy usuwa się sekwencje E.coli przez trawienie Hindlll. Następnie, A. niger szczep CBS 513.88 (zdeponowany w dniu 10 października 1988 roku) transformuje się ilością 10 gg fragmentu DNA stosując procedurę opisaną w przykładzie IX. Izoluje się pojedyńcze transformanty A. niger pochodzące z każdej kasety ekspresyjnej i zarodniki posiewa się na płytki selekcyjne z agarem z dodatkiem acetamidu. Z komórek rosnących przez 3 dni w temperaturze 37°C na płytkach agarowych na podłożu 0,4% ziemniaczano - glukozowym (Oxoid, W. Brytania) zbiera się zarodniki z każdego transformantu. Testy na wytwarzanie fitazy prowadzi się we wstrząsanych kolbach stosując następujące warunki wzrostu: Ilość około 1 x 10⁸ zarodników zaszczepia się na 100 ml pożywki hodowli wstępnej zawierającej w litrze: lg KH2PO4, 30g maltozy, 5g wyciągu drożdżowego, l0g hydrolizatu kazeiny, 0,5g MgSCO ·7 K2O i 3g Tween’u 80. Doprowadza się pH do wartości 5,5.

Po hodowli przez dobę w temperaturze 34°C na wstrząsarce rotacyjnej ilością 1 ml rosnącej hodowli zaszczepia się 100 ml podłoża do hodowli głównej zawierającego w litrze: 2g KH2PO4, 70g maltodekstryny (Maldex MDO3, Amylum), 12,5g wyciągu drożdżowego, 25g hydrolizatu kazeinowego, 2g K2SO4,0,5g MgSO4 -7 H20,0,03g ZnCl2, 0,02g CaCh, 0,05g MnSO4 -4H2O i FeS0U. Doprowadza się pH do wartości 5,6.

Wzrost mycelium prowadzi się przez co najmniej 140 godzin. Wytwarzanie fitazy oznacza się w sposób podany w przykładzie II. Wyniki uzyskane dla kilku wybranych losowo transformantów otrzymanych z każdej kasety ekspresyjnej są przedstawione w tabeli 6.

T a b e l a 6

Wytwarzanie fitazy przez kilka szczepów A. niger CBS 513.99 transformowanych plazmidami zawierającymi gen fitazy z A. ficuum pod kontrolą promotora AG z A. niger w kombinacji z różnymi sekwencjami liderowymi

Kaseta ekspresyjna	Transformant	Aktywność fitazy (jednostek/ml)
1	2	3
p18FYT3 (promotor AG/	pl8FYT3 # 240	82
lider 18 aminokwasu AG)	p18FYT3 # 242	84
	p18FYT3 # 243	62
	p18FYT3 # 244	43
	p18FYT3#245	80
	p18FYT3 # 246	82
	p18FYT3 #250	110
p24FYT3 (promotor AG/	p24FYT3 # 256	8
lider 24 aminokwasu AG)	p24FYT3 # 257	30
	p24FYT3 # 258	13
	p24FYT3 # 259	33
	p24FYT3 # 260	17
	p24FYT3 # 261	28
	p24FYT3 # 262	18
	p24FYT3 # 265	12

168 470

1	2	3
pFYT3 (promotor AG/	pFYT3 # 205	50
lider fitazy)	pFYT3 # 282	280
	pFYT3 # 299	96
	pFYT3 # 302	220
	pFYT3 # 303	175
	pFYT3 # 304	150
	pFYT3 # 305	150
_	pFYT3 #312	140

Przedstawione w tablicy 6 wyniki jasno wykazują wysokie poziomy ekspresji fitazy w transformantach. A. niger zawierających gen fitazy pod kontrolą promotora AG z A. niger. Najwyższe wytwarzanie fitazy obserwuje się przez szczepy z wektorem ekspresyjnym pFYT3 zawierającym sekwencję liderową fitazy. Podobne wektory ekspresyjne zawierające gen fitazy bez intronu dają po transformacji do A. niger poziomy ekspresji fitazy porównywalne z poziomami dla transformantów pFYT3 A. niger.

Ponadto, supematanty hodowli transformantów pFYT3 # 205 i # 282 poddaje się elektroforezie w żelu jEF-PAGE w zakresie pH od 4,5 do 6. Jednakowe objętości supernatantów hodowli macierzystego szczepu A. niger i obydwu transformantów rosnących w identycznych warunkach podaje się na żel, rozwija i następnie barwi w sposób opisany w przykładzie IX. Macierzysty A. niger wytwarza bardzo niewielką ilość fitazy, która nie jest wykrywalna tą metodą. Szczepy pFYT3 # 205 i # 282 wytwarzają około 250 i 1400 razy więcej fitazy (porównaj poziomy fitazy podane w tabeli 4 i 5). Różnica ta jest wyraźnie widoczna na fig. 11. Wykrywa się kilka izo-form enzymu fitazy (oznaczonych gwiazdką). Barwienie ogólnego białka wykazuje, że intensywność pasm białka fitazy gwałtownie wzrasta, podczas gdy nie pojawiają się żadne większe pasma innych białek.

Przykład XI. Zwiększona ekspresja fitazy w A. ficuum i A. niger hodowanych na skalę przemysłową

A. A. ficuum

Prowadzi się hodowlę szczepu A. ficuum pAF 2-2S # 4 i A. ficuum NRRL 3135 w sposób opisany w przykładzie I. Szczep transformowany wytwarza około 50 razy więcej fitazy niż szczep typu dzikiego.

Tabela 7

Zwiększone wytwarzanie fitazy przez transformanta A. ficuum zawierającego wielokrotne geny fitazy. Hodowlę komórek prowadzi się jak w przykładzie I

Godziny po inokulacji	Aktywność fitazy A. ficuum NRRL 3135	(Jednostek/ml brzeczki fermentacyjnej) A. Ficuum pAF 2-2S # 4)
0	0	0
24	0	0
92	2	142
141	5	270

B. A. niger

Postępując w sposób opisany w przykładzie I prowadzi się hodowlę szczepu A. niger pAF

2-2S # 8 będącego transformantem szczepu A. niger CBS 513.88 i macierzystego szczepu A.

niger. Transformant ten wytwarza około 1000 razy więcej fitazy niż orginalny macierzysty szczep A. niger (tabela 8).

168 470

T a b e l a 8

Zwiększona ekspresja fitazy przez transformant A. niger (CBS 513.99) zawierający wielokrotne geny fitazy. Hodowlę komórek prowadzi się w sposób opisamy w przykładzie I

Godziny po inokulacji	Aktywność fitazy A. niger CBS 513.88	(Jednostek/ml brzeczki fermentacyjnej) A. niger pAF 202 # 8)
0	0	0
24	0	0
92	0,1	65
141	0,1	95

Godziny po inokulacji 0 24 92 141

Aktywność fitazy A. niger CBS 513.88 0 0 0,1 0,1 (Jednostek/ml brzeczki fermentacyjnej) A. niger pAF 202 # 8) 0 0 65 95

Przykład XII. Dla skonstruowania wektora pREPFYT3 za pomocą którego osiąga się jednocześnie ekspresję fitazy i zastąpienie genu AG trawi się pFYT3 enzymem KpnI. Uzyskany liniowy fragment DNA KpnI poddaje się dwóm oddzielnym reakcjom ligacji. Prowadzi się ligację z adapterem KpnI - HindlU:

5’ - ’ CGGGA - 3’

3’ - CATGGCCCTTCGA - 5’ * oraz ligację z adapterem KpnI - HindlU , w którym po ligacji nie zachowuje się miejsce restrykcyjne dla HindIII:

5’ - CGGGGG - 3’

3’ - CTAGGCCCCCTCGA - 5’

KpnI HindIII

Następnie produkt reakcji ligacji 1 trawi się częściowo enzymem HindIII. Po usunięciu fragmentu zawierającego amdS w procesie elektroforezy żelowej pozostały fragment DNA zamyka się do postaci kolistej przez ligację i przenosi się do E.coli. Uzyskany plazmid oznacza się symbolem pFYT3AamdS (fig. 16).

Produkt ligacji 2 również trawi się enzymem fragment DNA izoluje się w procesie elektroforezy żelowej fragment DNA HindlII-HIndIII, zawierający gen amdS o wielkości 3 kb. Fragment ten poddaje się ligacji z produktem częściowego trawienia pFYT3 amdS enzymem HindIII i przenosi się do E.coli. Plazmid zawierający gen amdS na końcu 1 ’ genu fitazy oznacza się jako pFYT3INT (fig. 17).

Dla wprowadzenia fragmentu SaH/HindIII o wielkości około 6 kb z pAG6-l, zawierającego 3’-flankującą sekwencję AG, plazmid pFYT3INT trawi się częściowo enzymem HindIII, poddaje się ligacji początkowo z adapterem:

5’ - AGCTAGGGGG -3’

3’ -_TCCCCCAGCT - 5’

HindIII* Sali * (w którym miejsce restrykcyjne HindII* nie pozostanie po ligacji) a następnie z fragmentem SalI/Hiń(^]III z pAB6-1. Po transformacji do E.coli uzyskuje się żądany plazmid pREPFYT3, zawierający sekwencję flankującą 3’AG we właściwym położeniu (fig. 18).

Ekspresja fitazy w A. niger przez zastąpienie genu AG.

Przed transformowaniem A. niger plazmidem pREPFYT3 usuwa się sekwencje E.coli występującą w tym plazmidzie przez trawienie HindIII i elektroforezę w żelu. Szczep A. niger CBS 513.88 transformuje się ilością 10 μg fragmentu DNA postępując w sposób opisany w przykładzie IX. Selekcję i wzrost transformantów prowadzi się również w sposób opisany w przykładzie IX. Tylko niewiele z wyselekcjonowanych transformantów traci aktywność AG (około 20). Dla sprawdzenia, że gen AG został rzeczywiście zastąpiony genem fitazy prowadzi się analizę Southernachromosomalnego DNA pochodzącego z AG - ujemnych i fitazo-dodatnich transformantów.

168 400

Przykład XIII. Konserwatywność genu fitazy w różnych rodzajach.

Dla określenia, czy gen fitazy odznacza się wysoką niezmiennością w różnych rodzajach drobnoustrojów, wykonuje się analizy Southerna chromosomalnego DNA z 10 różnych rodzajów drobnoustrojów stosując jako cDNA fitazy z A. ficuum. Analizy tego chromosomalnego DNA wykonuje się na rodzajach należących do grzybków nitkowców, drożdży i bakterii. Z każdej grupy wybrano jako przykłady ograniczoną ilość przedstawicieli: dla nitkowców Penicillium chrysogenum i Aspergillus niger, dla drożdży - Saccharomyces cerevisiae i Kluyveromyces lactis a dla organizmów prokariotycznych - rodzaje gram-dodatnie: Bacillus subtilis, Clostridium thermocellum i Streptomyces lividans oraz gram-ujemne - bakterię Pseudomonas aeruginosa.

Chromosomalny DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym z tych rodzajów trawi się osobno PvuII i BamHI i następnie poddaje się elektroforezie w 0,7% żelu agarozowym.

Po przeniesieniu na filtry nitrocelulozowe wykonuje się próby hybrydyzacji, przez dobę, przy niskiej mocy (6 x SSC, 50°C), ze znakowanym ³²p fragmentem 5’cDNA fitazy (opisanym w przykładzie VIII). Filtry przemywa się w roztworze 6 x SSC w temperaturze pokojowej po czym wykonuje się radiogramy na kliszy czułej na promieniowanie X w czasie 18 godzin.

Jak to jest przedstawione na fig. 19a i b, w prawie każdym słupie po elektroforezie obserwuje się oddzielne pasmo, wskazujące na wysoki stopień homologii genu fitazy w poszczególnych rodzajach mikroorganizmów.

168 470

Sekwencje N-końcowych aminokwasów

ABC

POZYCJA
01			LEU
02			ALA
03			VAL
04			PRO
05		ALA	ALA
06		SER	SER
07		—	ARG
08	—**	—	ASN
09	GLN	GLN	GLN
10	SER	SER	SER
11	SER	SER	SER
12	—	—	GLY
13	ASP	ASP	ASP
14	THR	THR	THR
15	VAL	VAL	VAL
16	ASP	ASP	ASP
17	GLN	GLN
18		GLY
19		TYR
20		GLN
21		ARG
22		PHE
23		SER
24		GLU
25		THR
26		SER
27		HIS
28		LEU
29		ARG
30		(GLY>
31		GLN
32		TYR
33		ALA
34		PRO
35		PHE
36		PHE
37		(ASP)
38		LEU
39		ALA

Fig.1 A

168 470

Sekwencje aminokwasów peptydu

	A	B	CDE
POZYCJA
01	GLN	(TRP)*	MET	ALA	VAL
02	---**	SER	MET	SER	VAL
03	GLN	PHE	GLN	SER	ASP
04	ALA	ASP	CYS	ALA	—
05	GLU	THR	GLN	GLU	ARG
06	GLN	(LE	ALA	LYS	PHE
07	GLU	SER	GLU	GLY	PRO
08	PRO	THR	GLN	TYR	TYR
09	LEU	SER	GLU	ASP	THR
10	VAL	THR	PRO	LEU	GLY
11	(ARG)	VAL	LEU	VAL	—
12	VAL	ASP	VAL	VAL	ALA
13	LEU	THR	ARG
14	VAL	LYS	VAL
15	ASN	LEU	LEU
16	(ASP)	SER	VAL
17	(ARG)	PRO	ASN
18	(VAL)	PHE	ASP
19	VAL	(CYS)	ARG
20	PRO	(ASP)
21		LEU
22		PHE
23		THR

Fig. 1B

168 470

N-koniec białka o masie cząsteczkowej 100 kDa

POZYCJA
01	VAL
02	VAL
03	ASP
Ok	GLU
05	ARG
06	PHE
07	PRO
08	TYR
09	THR
10	GLY

Fig .1C

168 470

Peptyd C » Peptyd 8 ⁵ Peptyd A ‘

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 l*u-Ale-V«l-Pro-Alo-Ssr-Arg-A3n-Ctn-S»r-8er-Gly-A»p-Thr-Val-A»p

Ale-S»r-*^,e-***-Gtn-S«r-Ser-*^e*Aep-Thr*V«l-Aep-Gln-GlyTyr-Glr»*^e*-Oln-Ser-Ser-^cee*A»p-Thr’Vel-A»p-Cln

Możliwe kodony

5'

-CTQ-GCG-GTG-CC0-GCG-TCG-CGQ-AAT-CAA-TCG-TCG-CCG-GAT-ACe-GTC-6AT-CAA-GGG-TAT-CAAA

T c

TTA

G

AGT AGA C G

AGT AGT C C

AB1024 :

AC1065 i

AB1066 t AB1067 I A810ÓS : A81069 : AB1070 :

AB1226 1

AB1227 :

3'-CCG-CAG-GGG*CGG-TCG-GCG-TTG-GTC-TCG-TCG-CCe-CTG*TGG-CAG-CTG-GTC

3’-CCG-CTG-TGG-CAC-CTG-GTC

A

A

A A A G A

3‘-CAG*CTGGTC*CCGATG-GTC CA A

3·-CAG-CTG-GTC-CCG-ATG-CTC C A T A A T A T

AB1290 χ

3‘-CTG-T6G-CAG-CTG-GTG-CCG-ATG-GTC (Arg)

CCG

T

T

C

AGG

A

33 34 35 36 37 38 39

Ph«-S®r-Glu-Thr-Ser-Hl»-t«u-Arg-(Gly)-6ln-Tyr-Ale-Pro-Pbo-Phe-(Aep)-leu-Ala

TTT-TCO-GAG-ACG-TCG-CAT-CTG-CGGC

T c

AGT

C

A

T

C

AGT

C

GGG

A

T

-CAG-TAT-GCG-CCG-TTT'

ΤΙΤΟ

GAT

C

CTG-GCG

AB1388

TTG AGG

A A

A

T

C

TTG

A

3·- CCG -GTC-ATG-CGG-GGG-AAG-AAG- CTG -GA C CC A

Fig. 2A

168 470 χ

PM —* ΓΜ CO

CO < o co »

CO

X

CO

CO o

X

CJ o

o u ΓΜ a.

co < tj u

o. m 4 PM <

o 2 *· o.

3* tj

U

X

CM H·

CO < X CJ cj <

CJ co co co >

co

X co < x cj >

X L.

*- <

<O < w- CJ to co co

CJ

CJ CO < to <

α» u

<

<o <

co

Cj

CJ CO < co <

to

CJ <

O. CO 4 r- <

<

to

C <

a. m 4 *- <

<

co

PM 4 *- >

co < >~ CJ hco co < x cj co < x ►— u >CO < k- CJ ►— co

co	<	X	CJ	co	«c
co				co
CJ				<
X
co	<	X	CJ	X	CJ
CJ				co
X				<

O 4 «- >

i €> * •

O u

co a. •

X CO i

C

Ό o •

IA O «

-*r <

t c

K> co co

X co

I co

X u

< >- u o <

co <

CJ

CJ

I co < < co <

co <

<

u

CO < X CJ

8«

CO

3* c

co

CO <

CJ

		Ki CM	u X X	CO O <	<
			4	X	ŁJ
		PM	X	X
		PM	a.	X
			1	•
			3	co	<
			4
		PM	-J	CJ
			a	X	CJ
		o	4	<
		PM	<	co
			1	«
				X·*
			4	X	CJ
		o	X	co
			CJ	X
			w	\·χ
			4	X	CJ
		co	X	X
			a.	X
			o	co	<
		X	u	CJ
			a.	CJ
			u	co	<
		•o	4	CJ
			<Λ	X
			3	co	<
		IA	4	X
			_J	u
			»	*
			4	CO	<
		'•T	X _J	5
			u	CO	<
		KI	X	CJ
			X	<
			»	t
			a	X	CJ
		PM	4 <	3
			2*	CO	<
			4	X
			>	co
			U	co	<
		O	X	CJ
		w·	X	<
			u	co	<
			4	u
		o	<Λ	X
			U	co	<
			X	CJ
«<		03	X	<
CJ			1	t
			u	co	<
co	u		4	CJ
<		X	<Z>	X
co	<		»	1
			4	<	X
co	CJ			X
co		<5		<
co			•	1
			U	co	<
CJ	X		X	CJ
X		IA	X	<
CJ			1	•
•			a	X	u
CJ	X		4
X			<	CO
co			1	•
«			4	X	CJ
CJ	X		X	X
X		m	Ο»	X
CJ			1	1
				co	<
CJ	co		4	CJ
co		PM	</>	X
CJ			«	•
»				Λ
CJ	X		a	co
X			Ł.	co
co		w—	X	X
			w

co <

co <

CJ to co

X

CJ a co co co <

<

CO CJ < co co kCJ co

CJ <

a <

<

u co co co

X	CJ			CJ < CJ
X	CJ			co	o
				co
				X
X	CJ	X	CJ	to	CJ		□ co
		co		CO	CJ	Κ»	4 »—
		<		<	X	Ki	-J CJ
X	CJ			co	CJ		**>
				o			t- X
				X		PM	X <
						Ki	►— X
>-	CJ	X	CJ	co’	CJ		W
		co		co	CJ		* *
		<		<	X
							X co
CJ				co			co
				<			a co
				X			•*X
				•			0) co
X	CJ			u		T—	c. co
				co		Ki	< CJ
				X
				co
				X			U X
				CJ		o	x<
						Ki	X X
				co			w *-*

< H U U <

< X CJ co <

o <*M

C X CJ

X X U to < r: a ►— <

CJ co co <

Ό m—

CU ω

(X s

PM

-O >»

CL <υ

CL ό

o

CM r*“ co <

X o

PM

CO <

h— X X <J f\i <J »Fig. 2B co <c co

CJ <

168 470

	X	o	•i		CJ
KI		cj
CM	CJ	o
	CL	>-	U
fM	V»	<
<M	<	o
	o>	o	<	L-	ŁJ	CJ	CJ
ν·	u	cj				o		CJ	CJ
(M	<	u				<		o	CJ
	o		ŁJ					o	CJ
O	-C	>-						<	<
f\ł	OL	>~						<	<
	□	<j	<					CJ	a	ł—
O		<						►-
<“·	CJ	o						CJ	CJ
	c	a	<					CJ	CJ
CO		<						>-	k-
	o	u						a	a
	u	a	<	>—	ŁJ	>—	CJ	o	CJ	< U
N.	o	u				cj		CJ	CJ	CJ
*—	Vł	h-				<		ł-	>—	<
	OJ	>—	ŁJ					CJ	CJ
O	.c	K·»						<	<
	o. « c	h-						<	<
	O	<					CJ	CJ
IA		<						>—	>-
	cj	CJ						CJ	CJ
	tt	o	<					u	CJ
T	X	3							►-
								>-
	□	CJ	<					cj	CJ	►-
KI		<						>—
	O	o						CJ	CJ
	c	ó	<					CJ	CJ
CM		<						►-	h-
r—	o	o						CJ	CJ
	Ł.	a	<	h-	ŁJ			CJ	•
w—	JZ	CJ						a	ΓΌ
	h-	<						>—
	u	<j	<	k-	ŁJ		u	CJ
O	OJ	CJ				o		CJ
łT-	(Z>	h-				<		Τ-
	t	•						ι
	c	CJ	<					CJ			CJ
		<									h-
o>	o	CJ						CJ			CJ
	•	•						<			t
	o	o	<	>-	ŁJ			CJ			CJ
	u	CJ						CJ			CJ
co	a.	CJ						CJ			CJ
		<	>-	CJ				CJ			<
	«w	>—						<			<
X	M·	<						»—			►-
	•	1				*		•			•
	es	CJ	<	>-	U			CJ			CJ
	a·^	o						CJ			CJ
o	<	o						a			CJ
	«	•						»			1
	<0	o	<	►*	U			a			CJ
	w··*	CJ						CJ			CJ
IA	<	o						CJ			u
	•	«						t			1
	X	cj	<	►—	CJ			CJ			CJ
		CJ						CJ			CJ
<·	cj	o						CJ			u
	u	►-	U					CJ			CJ
	:x	<						►-			►-
m		>—						<			<
	•	1						1			1
	U	cj	<	>—	(J	b—	cj	«·			*
	O	CJ				u		K>			KI
fM	V)	>—				<
	<j	►-	ŁJ

Ł3

Ο >- < a >- < ω ν- α. >c o

Ό

O ·· ·· ··

IA
<M	fM	fM
O	O	O
ν-	r“·
α	ca	CO
<	<	<

co cn

Ll.

168 470

GTCGACTrCCCGTCCTATTCGGCCTCOTCCGCTGAAGATCCATCCCAcnATTQCACGTnn

Sali

GCCACCTTTGTGAGCTTCTAACCTGAACTGGTAGAGTATCACACACCATGCCAAGGTGGG

ATGAAGGGGTTATATGAGACCCTCCGGTCCGGCGCGATGGCCGTAGCTGCĆACTCGCTGC

TGTGCAAGAAATTACTTCTCATAGGCATCATCGGCGTCTCTGCTCITCTAC1TCCTT3?GT początek translacji

ATCTCCTGTCTGGGTATGCTAAGCACCACAATCAAAGTCTAATA/\GGA(XCTCCCTTCCG początek intronu

AC<€<XXCTGAAGCTCX?GACTGTGTGGGACTACTGATCGCTGACTATCTGIGCAGAGTCA koniec intronu

CCTCCGGACTGGCAGTCCCCGCd^GAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGlOGATCAGG

GGTATCAATCCTTCTCCGAGACTTCGCATCTTTCKjGGTCAATACGCACCGTrcTTCTCTC

TGGCAAACGAATCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTTCGCTC

AGGTCCTCTCCCGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATACTCCG

CTCTCATTGAGGAGATCCAGCAGAACGCGACCACX7rTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGA

AGACATACAACTACAGCTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGAGCTAG

TCAACTCCGGCATCAAGTTCTACCAGCGGTACGAATCGCTCACAAGGAACATCGTTCCAT

TCATCCGATCCTCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCT

TCCAGAGCACCAAGCTGAAGGĄTCCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCG

BamHI

ACGTGGTCATTTCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTG

TCTrCGAAGACAGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTTCGTCC

CCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAG

Fig. 6

168 470

1081 TGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCCTCGACACCA Sali

1141 AGCTCrrCCCCCTTCTCrGACCTCrrCACCCATGACGAATGG.ATCAACTACGACTACCrcC

1201 AGTCCTTGAAAAAGTATTACO2CCATGGTGCAGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCAGGGCG

1261 TCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCA

1321 CriTCCAACCACACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCnTCCGCTCAACTCTACTCTCTACG

1381 CGGACTTITGGCAItlACMCGGCATCATCTCCAITCTCTITGCTTTAGGTCTGTACAACG

1441 GCACTAAGCCGCTATCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGT

1501 CTGCTKKIACGGTTCCGTITGCTTCGCGTTTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCGG

1561 AGCAGGAGCCGCTGGTCCGTGTCITGGITMlX^TCGCGTTGIWCCX7rcCATCGGTCTC

1621 CGGITOAlTKnTTGGGGAGAICTACCCGGGATAGCTITGTGAGGGGGTrGAGCTTTGCTA

1681 GATCTOGGGG7XlATTGGGCGGAGTCTTrrcCTTAGCTGAATTACCTTGATG.AATGGTATG koniec translacji

1741 TATCACAlTGCATATCATTAGCACTTCAGGTATGTAlTATCGAAGATGTATATCGAAAGG

1801 ATCAATGGTGACTGTCACTGGTTATCTGAATATCCCTCTATACCTCGTCCCACAACCAAT

1861 CATCACCCTTTAAACAATCACACTCAACGCACAGCGTACAAACGAACAAACGCACAAAGA

1921 ATATTTTACACTCCTCCCCAACGCAATACCAACCGCAATTCATCATACCTCATATAAATA

1981 CAATACAATACAATACATCCATCCCTACCCTCAAGTCCACCCATCCTATAATCAATCCCT

2041 ACTTACTTACITCTCCCCCTCCCCCTCACCCTTCCCAGAACTCACCCCCGAAGTAGTAAT

2101 AGTAGTAGTAGAAGAAGCAGACGACCTCTCCACCAATCTCTTCGGCCTCTTATCCCCATA

Fig .6 (ciąg dalszy 1)

CGCTACACAAAACCCCCACCCCGITAGCATGCACTCAGAAAATAATCAAAAATAACTAAG

AAGGAAAAAAAAGAAGAAGAAAGGTTACATACTCCTCTCATACAAACTCCAAGACGrTATA

CATCAAGATGGGCAATCCCACPATTACTGATATCCATCTATGAACCCATTCCCATCCCAC

GrTAGTrGATrACTTTACTTAGAAGAAGAAAAAGGGAAGGGAAGGGAAAGAAGTGGATGG

GATTGAGTTAGTGCTCACCGTCTCGCAGCAAGTTTATATTCTTTTGTTTGGCGGATATCT

TTCACTGCTCCTGCTGGACGTTGTCACGGGGTGGTAGTGGTTGGCGGTGGTGAGGGTCCA

TCATCACTCTTCGITTGGGGGGTTOITGITGrcGTTGITGTTGTTGTTGGGTGGGCATTr

TCTTTTCTTCACTTGGGGATTATTATITGGAATTGGTTAGTTTGAGTGAGTGGGTAATAT

TCAATGGGTGAITAITGGGAATGAAGTAGATTTGGCTATGAATGGTTGATGGGATGGAAT

GAATCGATCGATCAATAGATGGAGGCGGAAAAGTCAGGTGGTTTGAGGTrCGGATTATTA

TCTTTGTGCCTGAGGCAIOACTCTCCATCTATGTrGTTCTTTCTATACCGATCTACCAGA

GCTAAGTTGACTGATTCTACCACAGTGCACAATAAGTATGTACTTATTTCATITAGAGTA

TTrAGAITAACCCGCTCTGCTAITrcCCGTAGCTrrCCACCCAATITCGAAGTTCGAAGA

ATTAAAACTCATCCTACAGTACAGAATAGAAGTAAAAGGAGAAGAGAAAAACAAGATAAT

ACAACCAGTCCAGGTCCATTCTAGATCTCGAATGACCACCAAATAAGAAAGCAACAAGCA

AGTAAGCAAAGCATAAGTCTAAATGAACGCCAATAACTTCATCGCCTGCCTTTGAAACTG

AACGCTATGCACGAATGGCTCGAAATGATTCCCTTAACTCCGTACTATTGAGAGTGAGAG

GAAAAGAAAAAAAGAGACAGAAAAGCTGACCATGGGAAAGAAGCATGATCAGTCGGGAAT

Fig . 6 (ciąg dalszy 2)

168 470 ggatctgcggcttgagatagatatgagttgcctcgcagatccggtgacaagataagaga.ą

TTGGGAGATGTCAPCAGCCACTGTAACTTCATCAAGCATCGACATTCAACGGTCGGGTCT

GCGGGTTGAGATGCAAGTTGAGATGCCACGCAGACCCGAACAGAGTGAGAGATGTGAGAC

TTITGAACCACTCTGACTrCATCAAGCATCAAAACACACTCCATGGIGAATCGGTTAGGG

TGTGAGGGTTGATATGCCAGGTTCGATGCCACGCAGACCCGAACCGACTGAGAAATATGA

AAAGTTGGACAGCCACTTCATCTTCATCAAGCGTAAAACCCCAATCAATGGTAAATCGAA

AACGAATCTGCGGGCTGATGTGGAAATGAGACGAATGCCTCGCAGATTCGAAGACACGTA

AATCGAGATGAACAATCACTTrAACTTCATCAAAGCCTTAAATCACCCAATGGCCAGTCT

AITCGGGTCTGCGGGTTGAGGTTCCTGTTGAGATGCCACGCAGACTGCGAACATGCGATG

CATTATAAGTTGGACGAGTGTAGACTGACCATTGATAACCGAGATAAACAATCACTTCAA

C1TCATCAAAGCCTTAAATCACTCAATGGCCAGTCTGTTTGCGGTCTGCGGGCTGATACC

CAAGITGCGATGCCACGCAGACTGCAAACATTGATCGAGAGACGAGAAAAACAACGCACT

ITAACTTCAACAAAAGCCTnOAATCAGTCAATGGCCAGTCTGTTCGCGGTCTGCGGGCT

GATATGCGAGTTGAGGTGCCTCGCAGACCGCGAACATGCGATGTAATTTCTTAGn^AGAC

GAGTGCCTGGCCATTGAGAAACGAGAGAAACAACCACTTTAACTTCATGAAAGCCTrGAA

CTACTCAATGACCCGTCTGrTGGCGGTCTGCGGGCTGATATTCGAGTTGAGATGCCACGC

AGACCGCCAACATGCGATGTATCATGTAAGTTAGATGAGTGACTGGCCATTGAGAAACGA

GAGAAACAACCACACTTCATGAGAGCCTTAAAlTATTCAATGACCAGTCTGTrCACGGTC

Fig .6 (ciqg dalszy 3)

168 470

TGCOGGrTGOTATOCOAGTCGAGarOCCTCOCAOACCCCOAACATOCOATSTrTrCOATa a5CGAGTaV,CCCTGACa^TCG?.GA.ACTATCTCACZITC<X7nWCCATTCGCCTQCXXaT

TGGGTTTAGTATTAGGATCGTCAGGTTrGTCCGATGGAACOTTCCOTTTGCOTOCGTTM

CGCGACGAGCCCTCTCCTCGGCGTGATTCTGAAATTCTGCAATCAGGGCAGCCGCAGCAC

GGCGACGGGACGTCCTCCAGGAGCTGTGTTGAAGTTTCGGGGrrGGCGGTCCAOAAOGGOG

AGTTACATTAAAAGCCTCATAGATGTCTTTGGGTGGTTCCGGGGGGCCCATCGCAAGATC

TTCTGGAGTTCTGCCrrCTGATCATCTGTTGAGTGTAATTGCGACGCAGACCGAGCTTCAG

GATITIWAAGGGCTGGATCGCTCGTGCTGACTCTTTCCęTCAGCGGGCTTCGTCTCOGC

ACn^irCATTTCGGCGGGCTGATCTTCCATCTCAGAATGGGATCGCTTrcTGGTCGCTGC

ACCCGCTGCTOCCTTCAAGGTGAGCITGATGCGCAGCGTCTTGGGCGGCTCAGCTGGTGG

AGITGGTTCCGGCTCTGGCTCCCTCCGGCGTCGCITCGGCACTTGAGTAGTCTCTGAGGC

TTCGccGCGGCGccoTTTGCGAGiwGCTxxTTGGivrciTTGGCCTCTTTCACTTCACC

TGGACCGTCTTTCGGGGCGGTTTCATCGTGCTGAGCGATCAAGGTTTGGATGTAGGCAGC

CGGCATCAITOGATCMCGGCAATTCCTCTCTTGCOGGCCTCCTCCCGAGCCTrGATTGT

CGCCTTOACCTCGTCCACGTITTCGAAGAAGAAAGGCATCTTGTTATCCTGAGGCAAGTT

GCGCTCTCCCATGCGTGGGGATATCCOAAGATGCGGTCCTTCTCGAACTGTTCATGAGAC

ITCAGACGAAITGGAGGCTGGGGGACCAATTTGTCTęCGTAGGTGTTGTrAGGGCGGAAC

CAAGAATAGCCTTCGCCTACAACGACAAGCTCTTCGCCAAATTTATTTTnTGGCCTGTA

Fig.6 (ciąg dalszy4)

168 470

AAAACGAACCCATCCTCGTCAGTCCACCGGTOCGTCTCGGACGTACAGATTCKICTTACTT

ATTCCCTCAACGCCGATCTCTGCCTGGGGCTGCGCTrCGGATGCOSOCTCGGTCACGGCT

TGCGTAACTCTTCGATCAGCCTCGGCTTCCGATGACTGCTCAAATTCTGGAGCAACAGCT

GCCGCGGCCAGGTCAAGCAGGCGGTTTGCTAAAACTGCCCATTTTCCATCGACACCTGCC

TCCGACGCCTGTGCAAAACCAGCTCTTITCGCAlTGGCCTGTTTGTTGGCACGCGTCTTC

ITGACTGCTGCC7ITGCCCTTTAC7rTCCTTGAGAGCAGACTCTGGCTTAGATGATGGTGCA

CGGITIVrGCGGAAGCGCCGCTCAGATTCCAAAGATTCCATAGCTTTAATGGTAGGCTTT

CTGGTTCTrcCAGAAGTGCGCGCAGCTGACGTAGTGGTTGAGTAGCTGGCAGTTGGGGAT

CCTGGGCCCTCAITGGAACCATCAAGACCAAAITTGTTTCCATACATATCAGCATGGTAT

TCAAAAGGAAAACTTTCGCCGTACGGAGTACTGCGTTCGATTCCGGGTGTATCCAAGTCG

TATCCAGACATGGTGTCGAATrCAGCCTTGCTGTCAAGAGCAGGGGTACTTTCAATGCTG

TCAGCAACCACGCGGCCAAAGGOCGTCTTCGGGAAAOAAGOTOTTTCAAGAGAAGCGTCA

TCCACGGCCTGGCTTGCGGCGTTGATTGCAGACTTTCGAGTAGATCGCTGAGGTCGCGAA

CTCGTTCGAGTAGCAACCTGTGAAITGGCAGCCTIUrGACTGCTTCGATTCACTGCAaAa

ACGGAGTAGACTCCAeTGAITTCGAATTCTGAGTCGCAGCCATTCTGGATTTGCGTTCGG

CGCGACGAGATCTCGCAGTCGTGGTACGAGGAOTAGAGCGAGGCTGCGTAGCAGTGTTGC

AAGCTTGGTGCTAGCCTCCTGGGCTTCAGCAGCTTCAGCAGTGGTGGCAGACGCAGCAGA

Fig -6 (ciąg dalszy 5)

168 470

6481 ATTAGCGGAGCTTTATCGGCTTTGCCGCTCTGAGCGTTGGGAGTAGAAGTGAGAGAAGAG

6541 GTAGAGTCCACGGAAGAAGTCTTCTCGCTGTTCTCAAAGCCGTrCAGCTITGCTGlXATA

6601 GACTTACGCGTCTTGCGGCTGTTGGAAGCGGAAGAGTTCATGGCGGGAGAGGAGACGTTA

6661 GAAGTAGACATCGTGGGGTTTCITOACGGGTTTTGAGTAACAAGAGACTTGCGTCGATCT

6721 TTGAGTGTTCTTGACAGAAAGTITATGCAACGTCGAC Sali

Fig.6 (ciąg dalszy 6)

168 470 ω

Σ3

Ο

Ο

Ο

8Źt z_

·—· <5^— oj i

χ

Fig.7

168 470

ATGGGCGTCTCTCCTGTTCTACTTCCTITCTAIVrCCTGTCTOaA£3TCACCTCCGGACTG -23MGVSAVLLPLYLLSGVTSGL

GCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGGGGTATCAATGC avpasrmqsscdtvdqgyqc

-1 ♦!

121 ITCTCCGAGACTrCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTTCTCTCTGGCAAACGAA fsetshlhgqyapffslane

181 TCGGTC ATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTTCGCTC AGGTCCTCTCC

38svispevpagcrvtfaqvls

241 CGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATACTCCGCTCTCATTGAG 58 RHGARYPTDSKGKKYSALIE

301 GAGATCCAGCAGAACGCGACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAAC 78 EIQQNATTFDGKYAFLKTYN

361 TACAGCTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGAGCTAGTGAACTCCGGC

98yslgaddltpfgeqelvnsg

421 ATCAAGTTCTACCAGCGGTACGAATCGCTGACAAGGAACATCGTrCCATTCATCCGATCC 118 IKFYQRYESLTRNIVPFIRS

481 TCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACC

138SGSSRVIASGKKFIEGFQST

541 AAGCTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATT 158KLKDPRAQPGQSSPKIDVVI

601 TCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAC 178 SEASSSNNTLDPGTCTVFED

66l AGCGAATrGGCCGATACCCTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGT

198 SELAD-TVEANFTATFVPSIR

721 CAACGTVrcGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGACAGAGAAGTGACCTACCTC

218 Q R L Ε N D L S G V T L T D T Ε V T Y L

781 ATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCC 238 MDMCSFDTISTSTVDTKLSP

168 470

841 ITCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAA 258 FCDLFTHDEWINYDYLQSLK

901 AAGTAITACGGCCATGGTGCAGCTAACCCGCTCGGCCCGACCCAGGGCGrrCGGCTACGCT 278 KYYGHGAGNPLGPTQGVGYA

961 AACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCAGTTCCAACCAC 298 NELIARLTHSPVHDDTSSNH

1021 ACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCTTTCCGCTCAACTCTACTCTCTACGCGGACTITTCG

318TLDSSPATFPLNSTLYADFS

Co 1 CATGACAACGGC ATCATCIWAirCTCTTTCCriTAGGTCTGTACAACGGCACTAAGCCG 338 HDNGIISILFALGLYNGTKP

1141 CTATCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGTCTGCTTGGACG 358 LSTTTVENITQTDGFSSAWT

1201 CTTGCGlTrGCTTCGCGTTTGTACC73?CGAGATGATGCAGTGTCAGGCGGAGCAGGAGCCG 373 V P F A S R L Y V E H H Q C Q A E Q Ε P

1261 CTGGTCCGTCTC7TGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCrGCATGGGTGTCCGGTTGATGCT

398 lvrvlvndrvvplhgcpvda

1321 TTGGGGAGATCTACCCGGGATAGCTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTAGATCTGGGGGT 4l8LGRCTRDSFVRGLSFARSGG

1381 GAITGGGCGGAGTGTTTTGCTTAG 438DWAECFA*

Fig . 8 (ciąg dalszy 1)

168 470

Fig. 9

168 470

. .3

Fig.10

168 470

A A

2 ... 3 4

Fig .11

168 470

Fig. 12

168 470

Fuzje genów AG i fitazy metodą PCR

Primery stosowane do >	ATG /*	BamH I
pl8FYT 1 — 1 18-2	18-3	4
p24FYT 1 — 1 24-2	24-3	4
pFYT 1 — 1 fyt-2	fyt-3	4
I PCR		|PCR
▼ E ATG	ATG	▼ BamH I

PCR

EcoRI ATG

BamH I

pTZ(EcoRI/BamHI) pl8FYT1 /p24FYT1/pFYT1

Fig.13

168 400

Hind III EcoR 1 EcoRI

Amp

Hind III,

Sal I

BamHI on

BamHI

	pAF 2-2SH
	13405 par zasad	V/

Ncol

BamHI Sali

Fig.14

168 470

HindlU Sal I

BamHI

pXXFYT1

3600 par zasad fuzja AG/fitaza

EcoRI

Fig.15a

168 470

Fig. 15b

168 470

Fig.15c

168 470

Hind ΙΠ

Fig. 16

168 470

Fig.17

ΚρηΙ

Fig. 18

168 470

AF201

Fig.4

c o	1 CD f4 LU <	r*i 1 rsi u_ <	m < Csl u. <	<#* LP fij	vO I ΓΊ U_ <X	r- 1 fvl U. <	CD f» U_ «X
u_ <£	LL. <
22	l CL	[	CL	CL	o.	, °·	CL	CL

3

ĆL ε

cS σ

tn

X

168 470

Fig.5

12345678 9 10 11 kiiozasady

1.6 Fig.19 A

168 470

2 3 4 5 6 7 Β 9 10 11

Fig .19 Β.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób uwalniania nieorganicznego fosforanu z fitynianu, znamienny tym, że pochodzącą ze źródła grzybowego fitazę oczyszcza się do aktywności właściwej powyżej 50 jednostek/mg białka, oczyszczoną fitazę poddaje się fragmentacji za pomocą CNBr, oznacza się sekwencję N-końcowych aminokwasów otrzymanych fragmentów białkowych, przygotowuje się na drodze syntezy kompleks specyficznych sond oligonukleotydowych w oparciu o oznaczoną sekwencję aminokwasową, identyfikuje się przez hybrydyzację klony DNA z banku genomowego, prowadzi się hodowlę zidentyfikowanych klonów i wyodrębnia się sklonowaną sekwencję DNA, sekwencję tę przyłącza się do promotora i ewentualnie sekrecyjnej sekwencji liderowej i tak otrzymaną konstrukcję ekspresyjną wprowadza się do wektora i tak otrzymanym wektorem, zdolnym do transformowania komórki gospodarza, transformuje się komórki gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tak otrzymanej transformowanej komórki gospodarza, usuwa się komórki i wyodrębnia się z pożywki otrzymany peptyd lub białko o aktywności fitazy, po czym fitynian poddaje się działaniu tak otrzymanego peptydu lub białka o aktywności fitazy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję dNa pochodzącą z Aspergillus.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się sekwencję DNA pochodzącą z Aspergillus ficuum lub Aspergillus niger.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się promotor AG.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się homogologiczną sekwencję liderową fitazy.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 18-go aminokwasu AG.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 24-go aminokwasu AG.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się homologiczny promotor fitazy.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się homologiczną sekwencję liderową fitazy.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 18-go aminokwasu AG.
11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 24-go aminokwasu AG.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor stosuje się plazmid.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako wektor stosuje się plazmid wybrany z grupy obejmującej pAF 28-1, pAF 2-25, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, p18FYT 3, p24FYT3 i pFYT3.
14. 14. · Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza wybraną z grupy obejmującej bakterie, drożdże i grzyby.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza wybraną z grupy obejmującej Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces i Saccharomyces.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, · znamienny tym, że stosuje się komórką gospodarza wybraną z grupy Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd lub białko o aktywności fitazy wyodrębnia się z pożywki metodą chromatografii.

    168 470