PL167790B1 - Sposób wytwarzania peptydu lub bialka o aktywnosci fitazy PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób w ytw arzania peptydu lub bialka o aktyw nosci fitazy, z n a m ie n n y ty m , ze pochodzaca ze zródla grzybow ego fitaze oczyszcza sie do aktyw nosci w lasciw ej pow yzej 50 jednostek/m g bialka, oczyszczona fitaze poddaje sie fragm entacji, za pom oca CN Br, oznacza sie sekw encje N -koncow ych am inokw asów otrzym anych fragm entów bialkow ych, przygotow uje sie na drodze syntezy kom pleks specyficznych sond oligonukleotydow ych w oparciu o oznaczona sekw encje am inokw asow a, identyfikuje sie przez hybrydyzacje klony D N A z banku genom ow ego, prow adzi sie hodow le zidentyfikow anych klonów i w yodrebnia sie sklonow ana sekw encje D N A , sekw encje te przylacza sie do prom otora i ew entualnie sekrecyjnej sekw encji liderow ej i tak otrzym ana konstrukcje ekspresyjna w prow adza sie do w ektora i tak otrzym anym w ektorem , zdolnym do transform ow ania kom órki gospodarza, transform uje sie kom órke gospodarza, po czym prow adzi sie hodow le tak otrzym anej transform ow anej kom órki gospodarza, usuw a sie kom órki i w yodrebnia sie z pozyw ki otrzym any peptyd lub bialko o aktyw nosci fitazy. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania peptydu lub białka o aktywności fitazy.

Fosfor jest ważnym składnikiem potrzebnym do wzrostu wszystkich organizmów. W celu osiągnięcia szybkiego wzrostu zwierząt jednożołądkowych (świnie, drób i ryby), pasza przeznaczona dla tych zwierząt musi być wzbogacona w nieorganiczny fosfor. W przeciwieństwie do tego, nie zachodzi konieczność dodawania fosforu do paszy przeznaczonej dla zwierząt przeżuwających. Mikroorganizmy, obecne w pierwszym żołądku przeżuwaczy, wytwarzają enzymy katalizujące konwersję fitynianów (myoinozytoheksakis-fosforan) do inozytu i nieorganicznych fosforanów. Fityniany występują we wszystkich substancjach paszowych pochodzenia roślinnego i stanowią źródło zmagazynowanego fosforu (Phytic acid, chemistry and applocations, E-Graf/ed/, Pilitus Press; Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone Ameryki, (1986)). 1-3% orzechów, roślin zbożowych, strączkowych, nasion oleistych, zarodników i pyłków zawiera fityniany. Sole kompleksowe kwasu fitynowego nazywane są fitynami. Kwas fitynowy uznany jest jako czynnik antyodżywczy, ponieważ chelatuje wapń, cynk, magnez, żelazo, a ponadto może reagować z białkami zmniejszając przyswajalność białek oraz ważnych odżywczo soli mineralnych. Fosfor zawarty w fitynianach przechodzi przez układ żołądkowo-jelitowy zwierząt jednożołądkowych i wydalany jest w odchodach. Chociaż zachodzi częściowa hydroliza fitynianów w okrężnicy, zwolniony nieorganiczny fosfor nie ma wartości odżywczych, ponieważ wchłania się tylko w jelicie cienkim. W konsekwencji, znaczna ilość ważnego pod względem odżywczym, fosforu nie jest zużywana przez zwierzęta jednożołądkowe, pomimo tego, że jest on obecny w paszy.

Wydalanie w odchodach fosforu zawartego w fitynianach niesie dalsze konsekwencje.

W ostatnich dziesięcioleciach nastąpił olbrzymi wzrost intensywnej hodowli. Odpowiednio wzrosła ilość odchodów, co spowodowało pojawienie się problemów związanych z ochroną środowiska w różnych częściach świata. Częściowo powodem tego jest gromadzenie się fosforu pochodzącego z odchodów w wodach powierzchniowych, co spowodowało eutrofizację. Wytwarzane przez mikroorganizmy enzymy katalizujące przemianę fitynianu w inozyt i fosfor nieorganiczny są szeroko znane jako fitazy. Mikroorganizmy produkujące fitazę obejmują bakterie, takie jak Bacillus subtilis (V. K. Paver i V. J. Jagannathan (1982) J. Bacteriol. 151, str. 1102-1108) i Pseudonomas (D. J. Cosgrove (1970) Austral J. Biol. Sci. 23, str. 1207-1220); drożdże, takie jak Saccharomyces cerevisiae (N. R. Nayini i P. Markakis (1984) Lebensmittel Wissenschaft und Technologie 17, str. 24-26); oraz grzyby, takie jak Aspergillus terreus (K. Yamada, Y. Minoda i S. Yamamoto (1986). Agric. Biol. Chem. 32, 1275-1282). Różne inne grzyby Aspergillus znane są jako grzyby wytwarzające fitazę. Fitazę wytwarzaną przez Aspergillus ficuum cechuje jeden z najwyższych poziomów aktywności właściwej oraz lepsza termostabilność w porównaniu z fitazami wytwarzanymi przez inne mikroorganizmy (niepublikowane obserwacje).

Koncepcja dodawania fitazy pochodzenia mikrobiologicznego do pasz przeznaczona dla zwierząt jednożołądkowych została wcześniej opisana (opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 297 548; Nelson. T. S., Shieh, T. R., Wodziński, R. J. i Ware, J. H. (1971) J. Nutrition 101, str. 1289/1294). Jednakże, do chwili obecnej koncepcji tej nie zastosowano na skalę przemysłową, z uwagi na wysokie koszty wytwarzania enzymów pochodzenia mikrobiologicznego (Y. W. Han (1989) Animal Feed Sci. i Technol. 24, str. 345-350). Z powodów ekonomicznych, w dalszym ciągu dodaje się do pasz przeznaczonych dla zwierząt jednożołądkowych fosfor nieorganiczny.

Fitazy pochodzenia mikrobiologicznego znalazły również inne przemysłowe zastosowania. Przykładem jest przemysłowy proces produkcji skrobi ze zbóż takich jak kukurydza i pszenica. Odpady produkcyjne procesów mokrego mielenia, zawierające przykładowo białko kukurydzy, sprzedaje się jako paszę dla zwierząt. Podczas procesu rozmiękczania można dodawać do nich fitazę. Są tu idealne warunki do dodawania fitaz grzybowych (temperatura około 50°C, pH równe 5,5) - europejskie zgłoszenie patentowe nr 0 321 004. Pasze dla zwierząt wyprodukowane z tych odpadów będą wówczas zawierały fosforany zamiast fitynianów.

Fitazy można również stosować w przetwórstwie soji (Finase TM Enzymes By Alko, broszura informacyjna wydana przez Alko Ltd., Rajamaki, Finlandia). Potrawy sojowe zawierają duże ilości antyodży wczego czynnika fitynianów, który powoduje, że to źródło białka nie nadaje

167 790 się do stosowania w odżywkach dla dzieci i w paszach dla ryb, cieląt i innych zwierząt nieprzeżuwających. Enzymatyczne wzbogacanie tych wartościowych źródeł białka podnosi ich odżywczą i handlową wartość.

Inni badacze zainteresowali się dokładniejszym określeniem różnych fitaz i ulepszeniem sposobów ich wytwarzania i zastosowania. Ullah opublikował sposób oczyszczania fitazy z Aspergillus ficuum dzikiego typu, jak również określił szereg własności biochemicznych tak wytworzonego produktu. (Ullah, A. (1988a) Preparative Biochem. 18, 443-458). Odpowiednie dane uzyskane przez Ullah’a przedstawiono w tabeli 1.

Sekwencja aminokwasów N-końca białka fitazy z A. ficuum została opublikowana dwukrotnie przez Ullah’a. Ullah, A. (1987) Enzyme and Engineering Conference IX, 4-8 październik, 1987 r, Santa Barbara, Kalifornia oraz Ullah, A. (1988 b) Prep. Biochem. 18, str. 459-471. Sekwencję aminokwasów określoną przez Ullah’a przedstawiono na rysunku fig. 1A, E. Na podstawie publikacji Ullah’a można poczynić szereg interesujących obserwacji. Przede wszystkim, oczyszczony preparat opisany przez Ullah’a (1988a i 1988b) wykazuje na żelu SDSPAGE dwa pasma białkowe. Twórcy wynalazku twierdzą, że oczyszczona fitaza z A. ficuum zawiera zanieczyszczenia oraz, że jedno z pasm obecnych na SDS-PAGE, zidentyfikowane przez Ullah’a jako fitaza, pochodzi od tego tego zanieczyszczenia.

Ta różnica jest również dostrzegalna w danych odnośnie sekwencji aminokwasów opublikowanych przez Ullah’a (1987, 1988b, porównaj rysunek fig. 1 A, sekwencje A i B z sekwencją C). Faktycznie, jedna z sekwencji aminokwasów peptydów wewnętrznych fitazy opisana przez Ullah’a (patrz rysunek fig. 1b, sekwencja E) w rzeczywistości stanowi sekwencję białka zanieczyszczającego, o masie cząsteczkowej wynoszącej 100 kDa (rysunek fig. 1C), które to białko obecne jest w preparacie otrzymanym sposobem opisanym przez Ullah’a i widoczne jest na SDS-PAGE jako jedno z dwóch pasm (Ullah, 1988a i 1988b). Ullah nie potwierdza obecności takiego zanieczyszczającego białka i identyfikuje je jako inną postać fitazy. Obecność takiego zanieczyszczenia utrudnia z kolei selekcjonowanie i izolowanie rzeczywistej sekwencji nukleotydowej kodującej aktywność fitazy. Ponadto, obecność zanieczyszczenia obniża wartość aktywności właściwej białka. Poza tym, odnośnie sekwencji opublikowanej przez Ullah’a należy zauważyć, że reszta aminokwasu w pozycji 12 została określona przez Ullah’a jako glicyna.

Stosując techniki sekwencjonowaniaDNA i białek twórcy niniejszego wynalazku dowiedli, że ta reszta nie jest glicyną lecz cysteiną (rysunek fig. 6 i 8). Ullah twierdzi, że fitaza jest białkiem o masie cząsteczkowej 85 kDa, a po deglikozylacji ma masę 61,7 kDa (Ullah, 1988b). Ta wielkość, która jest o wiele niższa niż dla wcześniej publikowanego białka o masie 76 kDa (Ullah, A. i Gibson, D. (1988) Prep. Biochem. 17(1), str. 63-91), opiera się na względnej ilości węglowodanów uwalnianych w czasie hydrolizy i uwidocznionej na SDS-PAGE masie cząsteczkowej natywnego białka. Twórcy wynalazku dowiedli, że glikozylowana fitaza ma masę cząsteczkową równą 85 kDa (widoczna jako pojedyncza), podczas gdy białko deglikozylowane ma pozorną masę cząsteczkową wynoszącą48-56,5 kDa, w zależności od stopnia deglikozylacji. Mullaney i inni (Filamentons Fungi Conference, Kwiecień 1987, Pacific Grove, Kalifornia) opublikowali charakterystykę fitazy pochodzącej z A. ficuum. Jednakże, ta publikacja również zawiera wzmiankę o dwóch pasmach białka widocznych na SDS-PAGE, jedno odpowiadające masie 85 kDa i jedno odpowiadające masie 100 kDa, które to białka były obecne w oczyszczonym preparacie białkowym. Te pasma zostały zidentyfikowane przez autorów jako dwie postacie fitazy. Proponują oni również sposób transformowania mikrobiologicznych organizmów, czego jednak nie przeprowadzili. Klonowania i izolowania sekwencji DNA kodującej fitazę nie opisano.

Oczekuje się, że ekonomiczny sposób wytwarzania fitazy będzie miał wielkie znaczenie, między innymi w przemyśle pasz zwierzęcych. Jeden z ekonomicznych sposobów wytwarzania fitazy mógłby polegać na stosowaniu technik rekombinacji DNA w celu podniesienia poziomów ekspresji enzymu w różnych znanych mikroorganizmach, co z kolei prowadziłoby do wytwarzania dużych ilości peptydów lub białek. Jednakże, do tej pory nie ujawniono sposobu izolowania i klonowania sekwencji DNA kodującej aktywność fitazy.

Sposób wytwarzania peptydu lub białka o aktywności fitazy według wynalazku polega na tym, że pochodzącą ze źródła grzybowego fitazę oczyszcza się do aktywności właściwej powyżej

167 790 jednostek/mg białka, oczyszczoną fitazę poddaje się fragmentacji, za pomocą CNBr, oznacza się sekwencję N-końcowych aminokwasów otrzymanych fragmentów białkowych, przygotowuje się na drodze syntezy kompleks specyficznych sond oligonukleotydowych w oparciu o oznaczoną sekwencję aminokwasową, identyfikuje się przez hybrydyzację klony DNA z banku genomowego, prowadzi się hodowlę zidentyfikowanych klonów i wyodrębnia się sklonowaną sekwencję DNA, sekwencję tę przyłącza się do promotora i ewentualnie sekrecyjnej sekwencji liderowej i tak otrzymaną konstrukcję ekspresyjną wprowadza się do wektora i tak otrzymanym wektorem, zdolnym do transformowania komórki gospodarza, transformuje się komórkę gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tak otrzymanej transformowanej komórki gospodarza, usuwa się komórki i wyodrębnia się z pożywki otrzymany peptyd lub białko o aktywności fitazy.

Wyizolowanie oczyszczonej i sklonowanie sekwencji DNA kodującej fitazę, stosowanej według wynalazku, osiągnięto przez zastosowanie specyficznych sond oligonukleotydowych, które opracowano specjalnie dla potrzeb tego wynalazku.

Korzystnie, sekwencje DNA kodujące fitazy otrzymuje się ze źródeł grzybowych, zwłaszcza z grzybów nitkowych rodzaju Aspergillus.

W sposobie według wynalazku wytwarza się wektor, stosowany w dalszych etapach sposobu, zawierający konstrukcję ekspresyjną, która to konstrukcja zawiera co najmniej jedną kopię co najmniej jednej kodującej fitazę sekwencji homologicznego DNA.

Korzystnie, sekwencja ta ogranicza się do regionu regulacyjnego zdolnego do wywołania ekspresji o wysokim poziomie peptydów lub białek o działaniu fitazy w odpowiednim do uzyskania tej ekspresji organizmie, nazywanym dalej organizmem ekspresyjnym.

Konstrukcję ekspresyjną otrzymaną jak opisano wyżej włącza się do wektora, korzystnie do plazmidu, który jest zdolny do transformowania komórki gospodarza pochodzenia mikrobiologicznego i do integrowania się w genomie.

W kolejnym etapie sposobu według wynalazku wytwarza się transformowaną komórkę, korzystnie organizmu pochodzenia mikrobiologicznego, który otrzymuje się w wyniku transformacji wektorem opisanym wyżej. Organizmami transformowanymi są grzyby nitkowe rodzaju Aspergillus, Trichoderma, Mucor i Penicillium, drożdże rodzaju Kluyveromyces i Saccharomyces lub bakterie rodzaju Bacillus. Szczególnie korzystnymi organizmami ekspresyjnymi są grzyby nitkowe rodzaju Aspergillus. Transformowane organizmy są zdolne do wytwarzania dużych ilości rekombinantowej fitazy na skalę przemysłową.

Wynalazek obejmuje również sposób wytwarzania rekombinantowych peptydów i białek o aktywności fitazy, zarówno w formie zglikozylowanej jak i niezglikozylowanej, sposób wytwarzania tych niezglikozylowanych białek i peptydów, sposób wytwarzania peptydów i białek o aktywności fitazy, wolnych od zanieczyszczeń, przy czym stosuje się monoklonalne przeciwciała reaktywne w stosunku do tych rekombinantowych lub oczyszczonych białek.

Dane porównawcze odnośnie biochemicznych własności oczyszczonej fitazy z A. ficuum typu dzikiego otrzymanej według Ullah'a i dalej oczyszczonej fitazy z A. ficuum typu dzikiego otrzymanej sposobem według wynalazku przedstawiono poniżej w tabeli 1. Warte szczególnej uwagi są dane odnośnie aktywności właściwej, które wykazują, że oczyszczone białko otrzymane sposobem według wynalazku cechuje aktywność właściwa dwa razy większa od aktywności właściwej białka według Ullah’a.

Realizując sposób według wynalazku, wytwarza się sekwencje nukleotydów, które kodują białka wykazujące aktywność fitazy, jak też sekwencje aminokwasów w tych białkach. Te sekwencje stosuje się do konstruowania sond oligonukleotydowych, które z kolei stosuje się w badaniach wykorzystujących hybrydyzację do odróżniania genów fitazy od innych genów, zwłaszcza pochodzenia mikrobiologicznego, które można kolejno izolować i klonować.

Wytworzone sekwencje można także stosować jako substancje wyjściowe do budowania fitaz drugiej generacji. Fitazy drugiej generacji są to fitazy, zmienione przez zastosowanie technik mutagenetycznych (np. ukierunkowana mutagenoza). Własności tych fitaz różnią się od własności fitaz dzikiego typu lub fitaz rekombinantowych, takich jak peptydu lub białka o aktywności fitazy, wytwarzane sposobem według wynalazku. Przykładowo, optymalną temperaturę lub pH, aktywność właściwą lub powinowactwo w stosunku do substratu można zmienić tak, aby wymienione własności dostosować lepiej do wykorzystania w określonym procesie.

167 790

W kontekście niniejszego opisu, termin fitaza odnosi się do rodziny enzymów, które katalizują reakcje obejmujące usuwanie nieorganicznego fosforu z różnych fosforanów myc-inizytu.

Aktywność fitazy mierzy się stosując szereg prób, których wybór nie jest istotny w kontekście niniejszego wynalazku. Dla ilustracji, aktywność fitazy można określić poprzez mierzenie ilości enzymu, która zwalnia nieorganiczny fosfor z 1,5 mM fitynianu sodowego z szybkością wynoszącą 1 μ mol/min. w temperaturze 3°C przy pH równym 5,50.

Należy zauważyć, że termin fitaza stosowany w niniejszym opisie obejmuje wszystkie peptydy i białka o aktywności fitazy. Zilustrowano to na rysunku, fig. 1A, gdzie uwidoczniono porównanie sekwencji A i B (sekwencje otrzymane sposobem według wynalazku) z sekwencją C (opublikowaną przez Ullah’a, 1988 b) Ten rysunek dowodzi, że stosując sposób według wynalazku, z dojrzałego białka fitazy z A. ficuum można otrzymać białka, w których brak jest pierwszych czterech aminokwasów (w białku o sekwencji A brakuje pierwszych siedmiu aminokwasów).

Mimo tego, białka te zachowują aktywność fitazy.

Kompletna sekwencja aminokwasów białka fitazy, wydedukowana z odpowiadającej jej sekwencji nukleotydów, przedstawiona jest na rysunku, fig. 8.

Peptydy lub białka o aktywności fitazy, wytworzone sposobem według wynalazku, znajdują zastosowanie w różnych procesach, w których wymagana jest konwersja fitynianu do inozytu i nieorganicznego fosforanu.

Przykładowo, produkcja fitaz sposobem według wynalazku obniży koszty produkcji fitaz pochodzenia mikrobiologicznego, w celu ich ekonomicznego zastosowania w paszy dla zwierząt, co będzie prowadziło in vivo do konkurencyjnego stosunku koszty/efekt działania w porównaniu z działaniem nieorganicznego fosforanu. Dalszą korzyścią jest to, że znacznie zmniejszy się zawartość fosforu w odchodach zwierząt. Oczekuje się, że zastosowanie fitaz, których ceny będą konkurencyjne w stosunku do cen nieorganicznych fosforanów, zwiększy możliwości produkowania przez przemysł paszowy pasz wysokiej jakości. Przykładowo, w paszy wzbogaconej w fitazę możliwe będzie wyeliminowanie dodatku nieorganicznego fosforanu, a zwiększenie zawartości różnych substancji zawierających fityniany.

Obok stosowania fitazy w paszach zwierzęcych i w przetwórstwie soi, peptydy lub białka o aktywności fitazy wytworzone sposobem według wynalazku można będzie stosować do różnych celów, a mianowicie:

- do ciekłych pasz dla świń i drobiu. Powszechnie praktykuje się nagrzewanie paszy w ciągu kilku godzin przed karmieniem. Przez ten czas enzym będzie mógł przetworzyć fityniany w inozyt i nieorganiczne fosforany;

- do produkcji inozytu lub inozytofosforanów z fitynianu,

- do innych procesów przemysłowych, w których stosuje się substraty zawierające fitynian takich jak przemysł skrobiowy oraz przemysł fermentacyjny - produkcja piwa.

Chelatowanie jonów metali przez fitynian może spowodować, że te substancje mineralne będą niedostępne dla drobnoustrojów produkcyjnych.

Enzymatyczna hydroliza fitynianu zapobiega tym problemom. Te i inne cele oraz korzyści wynikające z zastosowania niniejszego wynalazku, wyjaśniono szczegółowo dalej.

Opis figur rysunku.

Figura 1. A. Sekwencje N-końcowych aminokwasów określone dla oczyszczonej fitazy. Sekwencje aminokwasów oznaczone literami A i B określono w niniejszym wynalazku i pochodzą one z subpostaci fitazy, o punktach izoelektrycznych 5,2 i 5,4 odpowiednio. Sekwencję C zacytowano z Ullah’a (1987, 1988b, Supra). Resztę aminokwasów ulokowaną w pozycji 12, a sekwencjach A i B określono w niniejszym wynalazku jako nie będącą resztą glicyny (x oznacza jednoznaczną identyfikację, xx oznaczają: nie wykryte reszty).

B. Sekwencje N-końcowych aminokwasów wewnętrznych fragmentów fitazy po obróbce CNBr. Sekwencje aminokwasów oznaczone literami A i B (pozorna masa cząsteczkowa peptydów w przybliżeniu 2,5 kDa i 36 kDa, odpowiednio) otrzymano według wynalazku. Sekwencje C do E zacytowano z Ullah’a (1988b, Sypra).

C. Sekwencja N-końcowych aminokwasów białka o masie cząsteczkowej wynoszącej 100 kDa. Według wynalazku obecne jest ono w próbkach zanieczyszczonej fitazy.

167 790

Figura 2. A. Oligonukleotydowe sondy zbudowane na podstawie danych z fig. 1 A, peptydy Ado C.

B. Oligonukleotydowe sondy zbudowane na podstawie danych z fig. 1B peptydy A i B.

Figura 3. Oligonukleotydowe sondy zastosowane do wyizolowania genu kodującego kwaśną fosfatazę.

Figura 4. Mapa restrykcyjna bakteriofaga lambda AF 201 posiadającego locus fitazy z A.ficuum. Strzałka wskazuje locus genu fitazy i kierunek transkrypcji. Klon # uwidacznia subklony otrzymane za pomocą wskazanych enzymów restrykcyjnych z faga AF 201 w pAN 8-1 (dla pAF 28-1) i w pUC 19 (dla wszystkich innych subklonów).

Figura 5. Mapa fizyczna pAF 1-1. Fragment o długości 10 kb wycięty przez BamHI włączony do pUC 19 zawiera cały gen z A.ficuum kodujący kwaśną fosfatazę.

Figura 6. Komplikacja sekwencji nukleotydowych plazmidów pAF 2-3, pAF 2-6, i pAF 2-7 obejmujących locus chromosomowego genu fitazy. Region kodujący fitazę umiejscowiony jest na obszarze od nukleotydu o pozycji 210 do nukleotydu o pozycji 1713, intron obecny w chromosomowym genie umiejscowiony jest na obszarze od nukleotydu o pozycji 254 do nukleotydu o pozycji 355. Relewantne cechy, takie jak miejsca restrykcyjne, kodony startu i terminacji fitazy oraz usytuowanie intronu są oznaczone.

Figura 7. Szczegółowa mapa fizyczna chromosomowego locus fitazy, strzałki wskazują usytuowanie dwóch egzonów regionu kodującego fitazę.

Figura 8. Nukleotydowa sekwencja regionu fragmentu cDNA fitazy i otrzymana sekwencja aminokwasów białka fitazy, początek dojrzałego białka fitazy oznaczono jako pozycję +1. Aminokoniec wewnętrznego fragmentu białka umiejscowiony jest w pozycji 241, a fragment białka o masie 2,5 kDa zaczyna się w pozycji 390.

Figura 9. Mapa fizyczna kasety ekspresji fitazy pAF 2-2 5. Strzałki wskazują kierunek transkrypcji genów.

Figura 10. Dane eksperymentalne na IEF-PAGE odnośnie zwiększonej ekspresji fitazy w transformancie A ficuum NRRL 3135. Jednakowej objętości supernatanty hodowli A.ficuum (pas 1) i transformantów pAF 2-2S SP7 (pas 2), wzrastających w identycznych warunkach analizowano na żelu JEF-PAGE, stosując technikę Phast-System w zakresie pH 4,5-6. Dla porównania, próbkę fitazy z A.ficuum oczyszczoną do jednorodności włączono oddzielnie (pas

4), lub zmieszaną z supernatantami hodowli (pas 3). Żele zabarwiono albo barwnikiem wykazującym fosfatazę, opisanym w tekście (A), albo barwnikiem wykazującym ogólne białka. (Coomassie Brilliant Blue, B). Pasma fitazy oznaczono gwiazdką.

Figura 11. Dane eksperymentalne na JEF-PAGE odnośnie zwiększonej ekspresji fitazy w transformantach A.niger CBS 513,88. Jednakowej objętości supernatanty hodowli macierzystego szczepu A.niger (pas 1), lub transformantów pAF 2-2 S # 8 (pas 2), pFYT3 # 205 (pas 3) i # 282 (pas 4) analizowano stosując technikę JEF-PAGE, jak opisano w objaśnieniu do fig. 10. Żele były zabarwione albo barwnikiem wykazującym aktywność fosfatazy (A), albo barwnikiem wykazującym ogólne białka. Pasma fitazy oznaczono gwiazdką.

Figura 12. Mapa fizyczna pAB 6-1. Insert DNA ciętego Hind III o długości 14,5 kb w pUC 19 zawiera całe locus glukoamylazy (AG) z A.niger.

Figura 13.Schemat powstawania fuzji genów promotor AG (fitaza na drodze reakcji budowy łańcucha pod wpływem polimerazy (PCR). Sekwencje wszystkich stosowanych primerów oligonukleotydowych podano w tekście.

Figura 14. Mapa fizyczna kasety ekspresji fitazy pAF 2-2SH.

Figura 15. Mapy fizyczne konstrukcji przejściowych pXXFYTl, pXXFYT2 i kaset ekspresji fitazy pXXFYT3, gdzie XX oznacza sekwencję liderową (L). Do p 18 FYT # i p 24 FYT # włączone są sekwencje liderowe 18 i 24 aminokwasu AG, odpowiednio, a w pFYT # zastosowano sekwencję liderową fitazy.

Figura 16. Mapa fizyczna plazmidu pFYT3 amdS.

Figura 17. Mapa fizyczna plazmidu pFYT3INT.

Figura 18. Mapa fizyczna wektora pREpFYT3 powodującego wymianę genów fitaza/AG.

Autoradiografy chromosomowego DNA trawionego Pvu II (A) i BamHI (B) zhybrydyzowanego z cDNA fitazy z A.ficuum znakowanym za pomocą P³, służącego jako sonda:

167 790

S.cerevisiae (pas 2), B.subtilis (pas 3), K.lactis (pas 4), P.crysogenum (pas 5), P.aeruginosa (pas

6), S.lividans (pas 7), A.nigier 1 pg (pas 8), A.niger 5 pg (pas 9), pusty (pas 10), C.thermocellum (pas 11).

Pas 1: marker DNA.

Klonowanie genów kodujących wybrane białka w celu wytwarzania białek przez mikroorganizm przeprowadza się stosując różne sposoby.

Jeden ze sposobów polega na oczyszczeniu białka, następnie na określeniu sekwencji jego N-końcowych aminokwasów i przeszukaniu banku genomów danego mikroorganizmu przy zastosowaniu sondy oligonukleotydowej DNA wytworzonej na podstawie wspomnianej sekwencji N-końcowych aminokwasów. Przykładem skutecznego stosowania tej procedury jest klonowanie genu N-syntetazy izopenicyliny, pochodzącego z Cephalosporium acremonium (S.M.Samson i inni, (1985). Naturę 318, str. 191-194) i izolowanie genu kodującego TAKA amylazę dla Aspergillus oryzae (Boel i inni, (1986), zgłoszenie europejskie nr EP-A-0238023).

Stosując tę procedurę próbowano wyizolować gen Aspergillus ficuum, kodujący fitazę. Białko oczyszczono ekstensywnie i określono kilka jego biochemicznych własności. Uzyskane dane porównano z danymi opublikowanymi przez Ullah’a (1988a). Oba komplety danych umieszczono w tabeli 1 poniżej.

Tabela 1

Biochemiczne własności oczyszczonej fitazy z A.ficuum dzikiego typu

Własność	Wynalazek	Ullah
Aktywność właściwa x	100 jednostek/mg białka	50 jednostek/mg białka
Czystość SDS-PAGE	85 kDa	85/100 kDa
JEF-PAGE	3 lub 4 pasma	nie wykonano
Km (stała powinowactwa)	250 pM	40 pM
Specyficzność w stosunku do:
Inozyt-1-P	nieaktywny	nieaktywny
Inozyt-2-P	Km=3,3 mM	5% aktywności
Optymalne pH	2,5 i 5,5	2,5 i 5,5
Optymalna temperatura	50°C	58°C
Masa cząsteczkowa xx	85 kDa	85 i 100kDa
Masa cząsteczkowa xx
(niezglikozylowany)	56,5 kDa	61,7 kDa
Punkt izoelektryczny	5,0 - 5,4	4,5

^xUllah mierzył aktywność fitazy raczej w temperaturze 58°C, a nie 37°C. Jednostką aktywności fitazy jest ilość enzymu, która uwalnia nieorganiczny fosfor z 1,5 mM fitynianu sodowego z szybkością równą 1 pmol/min. w tempertaurze 37°C i przy pH równym 5,50. Aby porównać wydajności fermentacji i aktywności właściwe, wielkości opublikowane przez Ullah’a skorygowano, biorąc pod uwagę różnicę temperatur. Poprawka oparta jest na różnicy pomiędzy aktywnością fitazy mierzoną w temperaturze 37 °C, a aktywnością mierzoną w temperaturze 58°C,jak uwidoczniono w tabeli 3 w publikacji Ullaha (1988b).

^xx Pozorna masa cząsteczkowa określona za pomocą SDS-PAGE. xxx określona za pomocą JEF-PAGE.

W celu wyizolowania genu kodującego fitazę skonstruowano za pomocą wyżej opisanej metody (fig. 2A) pierwszy komplet sond oligonukleotydowych. Konstrukcja tych sond oparta była na danych dotyczących sekwencji aminokwasów. W celu kontroli poczyniono podobne kroki w kierunku wyizolowania genu kodującego kwaśną fosfatazę, wykorzystując dane dotyczące białka, (opublikowane przez Ullah’a i Cummins’a (1987), Prep.Biochem. 17, str. 397-422). Gen odpowiadający kwaśnej fosfatazie wyizolowano bez trudności. Jednakże w przypadku fitazy, sytuacja okazała się być inna. Pomimo wielu prób, w których stosowano sondy skonstruowane w oparciu o sekwencję N-końcowych aminokwasów, nie można było wyizolować z banku genomów ani genomowych fragmentów DNA, ani też klonów, które można by było pozytywnie zidentyfikować, jako obejmujące gen kodujący fitazę.

167 790

Aby rozwiązać ten problem, oczyszczoną fitazę poddano rozrywającemu działaniu CNBr, a otrzymane fragmenty białka wyizolowano. Określono sekwencje N-końcowych aminokwasów tych fragmentów (fig. 1B) i skonstruowano nowe sondy oligonukleotydowe w oparciu o nowe dane (fig. 2B).

Nieoczekiwanie okazało się, że nowe sondy oligonukleotydowe rozpoznawały specyficzne fragmenty DNA i nadawały się do rozpoznawania w sposób niedwuznaczny klonów z banku genomów. Nie obserwowano hybrydyzacji krzyżowej pomiędzy nowymi klonami, lub wyizolowanymi z nich fragmentami DNA a pierwszym zbiorem sond oligonukleotydowych, lub klonami wyizolowanymi przy zastosowaniu pierwszego zbioru sond.

Uważa się, że ten drugi zbiór sond można również zastosować do rozpoznawania sekwencji kodujących pokrewne fitazy. Wyizolowane klony stosowano jako sondy wykorzystując metodę Northern’a.

Nieciągły mRNA można było wykryć jedynie wtedy, gdy był on wyizolowany z grzybni wytwarzającej fitazę. Kiedy badano RNA z grzybni nie wytwarzającej fitazy, nie zaobserwowano sygnału hybrydyzacji, mRNA ma długość około 1800 par zasad i teoretycznie wytwarza białko o maksymalnej masie cząsteczkowej wynoszącej około 60 kDA. Ta wielkość odpowiada zarówno masie cząsteczkowej określonej dla białka niezglikozylowanego jak i masie cząsteczkowej białka, którego budowę przewidziano na podstawie sekwencji DNA.

Ponadto, gdy RNA wprowadzono na drodze transformacji do komórki grzybowej, obserwowano wzrost aktywności fitazy. To dowodzi ostatecznie, że faktycznie wyizolowano sekwencję nukleotydową kodującą fitazę. Sekwencje aminokwasów określone dla oczyszczonego enzymu fitazy i dla fragmentów otrzymanych z tego enzymu za pomocą CNBr zgadzają się z sekwencją aminokwasów wyprowadzoną na podstawie sekwencji określonej dla klonowanego genu. Sekwencję nukleotydów i wyprowadzoną sekwencję aminokwasów uwidoczniono na rysunku, fig. 6 i 8. Przedstawiają one klonowaną sekwencję kodującą fitazę.

Wyizolowanie sekwencji nukleotydów kodującej fitazę umożliwia ekonomiczną produkcję fitazy na skalę przemysłową przy zastosowaniu nowoczesnych technik rekombinacji DNA, takich jak amplifikacja genów, wymiana elementów regulacyjnych, przykładowo promotorów, sygnałów sekwencyjnych lub ich kombinacji.

Realizując sposób według wynalazku, wytwarza się transformowany organizm ekspresyjny, zdolny do efektywnej ekspresji dużych ilości peptydów lub białek o aktywności fitazy, jeśli jest to pożądane, zdolny również do efektywnej ekspresji kwaśnych fosfataz. Organizmy, w których zachodzi ekspresja obejmują nitkowe grzyby wybrane z rodzaju Aspergillus, Trichoderma, Mucor i Penicillium, drożdże wybrane z rodzaju Kluyveromyces i Saccharomyces i bakterie rodzaju Bacillus. Korzystnie, organizm wybrany jest spośród tych organizmów, które są zdolne do wydajnego wydzielania ich endogennych białek.

Szczególnie interesujące są przemysłowe szczepy Aspergillus, zwłaszcza niger, ficuum, avamori lub oryzae. Alternatywnie stosuje się Trichoderma reesei, Mucor miehei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subbilis lub Bacillus licheniformis.

Konstrukcja ekspresyjna zawiera sekwencje nukleotydowe kodujące pożądany produkt enzymatyczny, mający powstać w wyniku ekspresji, które to sekwencje zwykle posiadają sekwencję sygnałową funkcjonującą w organiźmie i powodującą wydzielanie peptydowego lub białkowego produktu.

Zgodnie z wynalazkiem stosuje się różne sekwencje sygnałowe. Można zastosować sygnałową sekwencję, która jest homologiczna z klonowaną w celu ekspresji sekwencją nukleotydów. Alternatywnie, w celu ułatwienia rekombinacji homologicznej stosuje się sekwencję sygnałową homologiczną albo rzeczywiście homologiczną z sekwencją sygnałową genu, leżącego w miejscu docelowym gospodarza. Ponadto, można również stosować sekwencje sygnałowe skonstruowane dla poprawienia sekrecji w wybranych organizmach ekspresyjnych. Przykładowo, jak opisano w publikacjach: Von Heyne (1983) Eur. J. Biochem. 133, str. 17-21 i Perlman i Halverson (1983) J. Mol. Biol. 167, str. 391-409. Sekwencję DNA kodującą sekwencję sygnałową można połączyć bezpośrednio poprzez sekwencję, kodującą sygnał wytwarzania (miejsce rozpoznawcze rozerwania) z sekwencją kodującą żądane białko, lub poprzez krótki mostek, zwykle krótszy niż dziesięć kodonów.

167 790

Korzystnymi sekwencjami sygnałowymi sekrecji stosowanymi w niniejszym wynalazku są sekwencja sygnałowa homologiczna z klonowaną w celu ekspresji sekwencją nukleotydów, sygnałowa sekwencja 18 aminokwasu glukoamylazy (AG) i sygnałowa sekwencja 24 aminokwasu glukoamylazy (AG). Dwie ostatnie sekwencje są albo homologiczne, albo heterologiczne w stosunku do sekwencji nukleotydów, która będzie ulegać ekspresji.

Produkt ekspresji lub sekwencja nukleotydów będącą przedmiotem zainteresowania, może stanowić DNA, który jest homologiczny lub heterologiczny w stosunku do organizmu ekspresyjnego.

Homologiczny DNA oznacza tu DNA pochodzący z tego samego rodzaju. Przykładowo, Aspergillus transformuje się za pomocą DNA pochodzącego z Aspergillus. W ten sposób można poprawić własności już występujące w danym rodzaju grzybów, bez wprowadzania nowych cech, które w nim przedtem nie występowały.

Heterologiczny DNA określa się jako DNA pochodzący od więcej niż jednego rodzaju, to jest, jak to wynika z przykładów, DNA pochodzący od innego rodzaju niż Aspergillus, który to DNA będzie ulegał ekspresji w Aspergillus.

Nukleotydowe sekwencje kodujące aktywność fitazy korzystnie otrzymuje się ze źródeł grzybowych. Bardziej korzystne są sekwencje nukleotydowe kodujące fitazę otrzymane z rodzaju Aspergillus. Najkorzystniejsze sekwencje otrzymuje się z Aspergillus ficuum lub z Aspergillus niger.

Region 5’ w kierunku do otwartej fazy odczytu w sekwencji nukleotydów zawiera region regulacyjny inicjacji transkrypcji (lub promotor). Można zastosować każdy region funkcjonujący włącznie z promotorem homologicznym z sekwencją nukleotydów, która będzie ulegać ekspresji. Jednakże, przeważnie stosowany region jest homologiczny z regionem miejsca docelowego. Powoduje to zastąpienie ekspresji produktu miejsca docelowego przez ekspresję żądanego produktu.

Ten region regulacyjny inicjacji transkrypcji jest satysfakcjonujący wówczas, gdy poziom ekspresji i sekrecji białka kodowanego przez miejsce docelowe zapewnia wydajną produkcję. Jednakże, w wielu przypadkach żąda się wyższego poziomu transkrypcji niż poziom transkrypcji genu miejsca docelowego, albo żąda się ekspresji indukowanej przy zastosowaniu szczególnego środka indukcyjnego. W takich przypadkach stosuje się region regulacyjny inicjacji transkrypcji inny, niż region znajdujący się w genie miejsca docelowego. Znanych jest szereg regionów regulacyjnych inicjacji transkrypcji działających w grzybach nitkowych.

Obejmują one regiony występujące w genach kodujących glukoamylazę (AG), amylazę grzybową, kwaśną fosfatazę, GaPDH, TrpC, AmdS, AlcA, AldA, histon H2A, Pyr4, Pyr G, N-syntetazę izopenicyliny, PGK, kwaśną proteazę, acylotransferazę i podobne.

Miejsce docelowe korzystnie koduje białko o wysokim poziomie ekspresji, tj. stanowi taki gen, którego produkt eksprymowany jest na takim poziomie, że jego stężenie wynosi pod koniec procesu fermentacji co najmniej 0,1 g/litr. Czas trwania procesu fermentacji zmienia się w zależności od żądanego produktu białkowego.

Jako przykład takiego genu służy gen kodujący glukoamylazę (AG). Inne takie geny obejmują geny kodujące grzybową tt-amylazę, kwaśną fosfatazę, proteazę, kwaśną proteazę, lipazę, fitazę i celobiohydrolazę. Szczególnie korzystnymi miejscami docelowymi są: gen glukoamylazy z A.niger, gen amylazy grzybowej z A.oryzae, geny celobiohydrolazy z T. reesei, gen kwaśnej proteazy z Mucor miehei, gen laktazy z Kluyveromyces lactis lub gen β-fruktofuranozydazy z Saccharomyces cerevisiae.

Region regulacyjny inicjacji transkrypcji może pochodzić z genu będącego przedmiotem zainteresowania, z miejsca docelowego bądź z jakiejkolwiek innej dogodnej sekwencji. Jeśli konstrukcja zawiera dalszą sekwencję w kierunku w dół (tzn. w kierunku transkrypcji) od genu będącego przedmiotem zainteresowania, region regulacyjny inicjacji transkrypcji, jeśli jest homologiczny z miejscem docelowym, powinien być znacznie mniejszy niż homologiczny region flankujący.

Zazwyczaj stosuje się marker selekcyjny, który może stanowić część konstrukcji ekspresyjnej bądź być elementem oddzielnym; taki który może integrować się w innym miejscu, niż gen będący przedmiotem zainteresowania. Ponieważ rekombinatowe cząsteczki według wyna167 790 lazku korzystnie transformuje się do szczepu organizmu, który można stosować w produkcji przemysłowej, selekcyjne markery do kontrolowania transformacji stanowią korzystnie dominujące markery selekcyjne, nie zachodzi wówczas potrzeba stosowania mutacji w szczepie organizmu, aby można było użyć wymienionych markerów selekcyjnych. Przykładami takich markerów są te, które umożliwiają transformantom wzrost na określonych pożywkach (np. gen

A. nidulans arndS umożliwia transfomiantom A.niger wzrost na acetamidzie, stanowiącym jedyne źródło azotu), lub które nadają odporność na antybiotyki (np. gen ble nadający odporność na fleomycynę lub gen hph nadający odporność na hygromycynę B).

Gen selekcyjny posiada własne regiony inicjacji i zakończenia transkrypcji i translacji, co umożliwia niezależną ekspresję markera. Znanych jest szereg regionów regulacyjnych inicjacji transkrypcji, które stosuje się w połączeniu z genem służącym jako marker.

W przypadku wykorzystywania odporności na antybiotyki, stężenie antybiotyku użytego do selekcji zależy od antybiotyku, na ogół waha się ono w granicach od około 30 do 300 μg/ml.

Można łączyć różne sekwencje, stosując znane sposoby, takie jak restrykcja, łącznie komplementarnych miejsc restrykcyjnych i ligacja, dołączenie tępych końców przez dobudowanie miejsc wystających i tępa ligacja, przecięcie za pomocą Bal 31 reperacja za pomocą primera, mutageneza in vitro i inne. Stosuje się poliłączniki i adaptory, które wprowadza się bądź usuwa znanymi metodami w celu ułatwienia budowania konstrukcji ekspresyjnej. W każdym stadium syntezy, fragment konstrukcji można klonować i analizować za pomocą enzymów restrykcyjnych bądź metodami sekwencjonowania lub hybrydyzacji, lub innymi.

Dostępnych jest szereg wektorów do klonowania, ich wybór nie jest istotny dla niniejszego wynalazku. Na ogół klonowanie zachodzi w E. coli.

Regiony flankujące mogą zawierać co najmniej części zewnętrznej fazy odczytu miejsca docelowego, a zwłaszcza sekwencję sygnałową, regiony regulacyjne 5’ i 3' genu z miejsca docelowego, lub mogą rozciągać się poza regiony regulacyjne. Na ogół region regulacyjny ma wielkość co najmniej 100 par zasad, zwykle co najmniej 200 par zasad, a może też być wielkości 500 par zasad, lub większy.

Wybiera się takie regiony flankujące, które rozrywają gen docelowy i zapobiegają jego ekspresji. Osiąga się to przez włączenie kasety ekspresji (zawierającej sekwencję nukleotydową do ekspresji i ewentualnie dodatkowe elementy, takie jak sekwencja sygnałowa, sekwencja regionu regulacyjnego inicjacji transkrypcji i/lub sekwencja regionu regulacyjnego zakończenia transkrypcji) do zewnętrznej ramki odczytu w sąsiedztwie regionu 5’, przez zastąpienie całego genu docelowego, bądź jego części konstrukcją ekspresyjną, lub przez umieszczenie konstrukcji ekspresyjnej w miejscu pomiędzy regionem regulacyjnym inicjacji transkrypcji miejsca docelowego a zewnętrzną fazą odczytu.

Jak wykazano, kiedy region regulacyjny terminacji jest homologiczny z tym regionem miejsca docelowego, region flankujący 3’ powinien być znacznie większy od regionu regulacyjnego terminacji obecnego w konstrukcji.

Niniejszy wynalazek dostarcza również materiału wyjściowego do budowania fitaz drugiej generacji, tj. enzymów fitazy o własnościach różnych od własności izolowanych tu enzymów. Fitazy drugiej generacji mogą mieć zmienione takie własności jak: optymalną temperaturę lub optymalne pH, aktywność właściwą lub powinowactwo w stosunku do substratów, lub inne cechy, która to zmiana czyni enzym bardziej odpowiednim do zastosowania w określonym procesie.

Do przeprowadzenia takiej mutagenezy (mutagenezy ukierunkowanej) najlepszym gospodarzem jest E.coli. Ponieważ E.coli nie posiada aparatu do usuwania intronów, które mogą być obecne w genie fitazy, klon cDNA fitazy jest sekwencją z wyboru, która to sekwencja ulega ekspresji w E.coli. Tę sekwencję cDNA można z łatwością zmutować, stosując znane metody, po czym zmutowany gen można wprowadzać do konstrukcji ekspresyjnych.

Konstrukcję transformuje się do gospodarza w postaci wektora klonującego, liniowego bądź kolistego, lub też usuwa się z pożądanego wektora klonującego. Wektor klonujący jest korzystnie plazmidem. Plazmid będzie zwykle przekształcany w postać liniową w genie będącym przedmiotem zainteresowania o długości około 1 kilopar zasad. Korzystnie, konstrukcję

167 790 ekspresyjną do wytwarzania fitaz sposobem według wynalazku integruje się w genomie wybranego organizmu ekspresyjnego.

Istnieje szereg sposobów transformowania grzybów nitkowych. Obejmują one fuzję lub transformację protoplastów, elektroporację i wstrzeliwanie mikropocisków do komórek. Korzystnym sposobem jest transformacja protoplastów.

Grzybnię szczepu grzybowego przekształca się najpierw w protoplasty na drodze enzymatycznego trawienia ścianki komórkowej w obecności stabilizatora osmotycznego, takiego jak KCl lub sorbit. Pobieranie DNA przez protoplasty wspomaga się przez dodanie CaClo i stężonego roztworu glikolu polietylenowego, który powoduje agregację protoplastów. W ten sposób następuje włączanie transformującego DNA do agregatów i pobieranie go przez protoplasty. Następnie protoplasty poddaje się regeneracji na stałym podłożu zawierającym stabilizator osmotyczny i kiedy trzeba, środek selekcjonujący; w takim przypadku transformujący DNA koduje odporność na ten środek.

Po wyselekcjonowaniu transformantów, obecność genów będących przedmiotem zainteresowania można wykryć różnymi sposobami. Jeśli produkt ekspresji jest heterologiczny w stosunku do gospodarza, ekspresję genu wykrywa się stosując przeciwciała. Alternatywnie, do wykrywania obecności zintegrowanego genu lub jego produktu stosuje się metody Southern’a lub Northern’a.

Amplifikację sekwencji nukleotydowej lub konstrukcji ekspresyjnej osiąga się przez stosowanie znanych technik, takich jak wprowadzanie wielokrotnych kopii konstrukcji do wektora transfromującego, lub stosowanie genu amdS jako markera selekcyjnego (np. Weinas i inni (1985) Current Genetics, 9, str 361 -368).

Sekwencja DNA, która ma być amplifikowana może zawierać DNA zarówno homologiczny, jak i heterologiczny w stosunku do organizmu ekspresyjnego, jak omówiono powyżej.

Następnie komórki hoduje się na odpowiedniej pożywce. Można zastosować inhibitor proteazy w niskich stężeniach, taki jak fluorek fenylometylosulfonowy, a2-makroglobuliny, pepstatyna lub podobne. Na ogół stosuje się stężenie w granicach od około 1 μ g/ml do 1 mg/ml. Geny proteazy inaktywuje się w celu uniknięcia lub zredukowania degradacji żądanego białka. Transformanty hoduje się w reaktorach do fermentacji periodycznej lub ciągłej, gdzie oddziela się pożywkę i uzyskuje żądane białko.

Białko oczyszcza się różnymi metodami, np. chromatograficznie (chromatografia cieczowa wysokosprawna), albo stosując ekstrakcję rozpuszczalnik-rozpuszczalnik, bądź elektroforetycznie, lub stosując kombinacje tych metod.

Wynalazek obejmuje również sposób postępowania, polegający na tym, że bulion fermentacyjny (ewentualnie oczyszczony) przesącza się, a następnie przesącza się drugi raz bez dostępu zarazków, po czym przesączony roztwór zagęszcza się. Tak otrzymany koncentrat w stanie ciekłym można stosować następująco:

a) Fitaza i inne białka wytrąca się z ciekłego koncentratu przez dodawanie acetonu do stężenia 60% ciągle mieszając. Osad suszy się w próżni w temperaturze 35°C. Po roztarciu suchego proszku, produkt enzymatyczny stosuje się jako taki do badań. Wydajność odzysku wynosi około 90%.

b) Ciekły koncentrat poddaje się suszeniu rozpryskowemu, stosując konwencjonalne metody. Wydajność odzysku waha się w granicach 80-99%.

c) Ciekły koncentrat miesza się z nośnikami, takimi jak otręby pszenne. Tak otrzymaną mieszaninę suszy się w wieży natryskowej lub w złożu fluidalnym.

d) Ciekły koncentrat stabilizuje się osmotycznie przez dodanie sorbitu.

Można dodać środek konserwujący, taki jak kwas benzoesowy, co zapobiega zanieczyszczeniom pochodzenia mikrobiologicznego.

Wszystkie omówione wyżej cztery postacie nadają się do sprzedaży wytwórniom przedmieszek, wytwórniom mieszanek paszowych lub innym dystrubutorom, a także rolnikom.

Poniższe przykłady ilustrują wynalazek nie ograniczając jednak zakresu ochrony. Jest oczywiste dla fachowców w tej dziedzinie, że gen fitazy skonstruowany sposobem według

167 790 wynalazku, można stosować do badań heterologicznej hybrydyzacji w celu izolowania genów kodujących fitazę z innych mikroorganizmów.

Przykład I. Fermentacja z zastosowaniem A.ficuum NRRL 3135.

Szczep Aspergillus ficuum NRRL 3135 pochodzi z Northern Region Research Lab., USDA, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, Stany Zjednoczone. Preparaty zarodników grzyba przygotowuje się następującą standardową techniką.

Prowadzi się serię periodycznych fermentacji tych zarodników a potem komórek, zaczynając od szarż w kolbach Erlenmeyera a kończąc na szarży w fermentorze 10-litrowym. Po wzroście w hodowli szarżowej zawartość tego fermentora stosuje się jako inokulum do szarży o załadunku 500 lltrów.

Stosuje się pożywkę o składzie: 91 g/litr skrobii kukurydzianej (BDH Chemicals Ltd.), 38 g/litr glukozy.HiO, 0,6 g/litr MgSOą.7 H20,0,6 g/litr KCl, g/litr FeSOą 7H2O i 12 g/litr KNO3. Wartość pH utrzymuje się na poziomie 4,6 ± 0,3 metodą automatycznego miareczkowania albo 4 N NaOH albo 4N H2SO4.

Wzrost komórek prowadzi się w temperaturze 28°C przy automatycznie kontrolowanym stężeniu rozpuszczonego tlenu wynoszącym 25 procent nasycenia powietrzem. Maksymalny poziom wytwarzania fitazy, 5-10 jednostek/ml obserwuje się po 10 dniach fermentacji.

Przykład II. Oczyszczanie i charakterystyka fitazy z A. ficuum.

A. Oznaczanie aktywności fitazy. Do mieszaniny inkubacyjnej o składzie:

- 0,25 M bufor octanu sodowego (pH=5,5) albo

- bufor chlorowodorku glicyny (pH=2,5),

- mM roztwór soli sodowej kwasu fitynowego,

- woda demineralizowana do 900 gl, dodaje się 100 gl przesączu z brzeczki (w razie potrzeby rozcieńczonego) lub supernatantu lub 100 gl wody demineralizowanej ( próba porównawcza). Wytworzoną mieszaninę inkubuje się w czasie 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 1 ml 10 procentowego roztworu kwasu trójchlorooctowego (TCA), po czym dodaje się 1 ml odczynnika o składziei 3,66 g FeSO4 . 7 HiO w 50 ml roztwoiui molibdenianu amonowego (21,5 g) NH4/eMo7O24 · 4 H2O i 8 ml H2SO4, rozcieńczone do 250 ml wodą demineralizowaną). Pomiar intensywności barwy niebieskiej wykonuje się spektrofotometrycznie przy 750 nm. Pomiary wykazują ilość uwolnionego fosforanu w stosunku do krzywej kalibracji fosforanu w zakresie 0-1 milimol/litr. Próba barwienia fosfatazy.

Składniki wykazujące aktywność fosfatazy wykrywa się przez ogniskowanie w punkcie izoelektrycznym stosując ogólny test barwienia fosfatazy. Żel inkubuje się w roztworze α-naftylofosforanu i soli Fast Garnet GBC salt (Sigma, odpowiednio 0,1 i 0,2 procentowe, wagowo objętościowo) w buforze 0,6 M roztworu octanu sodowego (pH=5,5). W wyniku reakcji pojawia się strąt o barwie czarnej. Reakcję tę albo się zatrzymuje przez dodanie mieszaniny metanolu z kwasem octowym (30:10, objętościowo) albo, o ile potrzebne jest białko o aktywności fitazy, przemywa się wodą destylowaną.

B. Oczyszczanie fitazy z A.ficuum. Z brzeczki hodowli A. ficuum NRRL 3135 oczyszcza się fitazę do homogeniczności. Z brzeczki usuwa się zarodniki przez filtrację i uzyskany filtrat hodowli zatęża się w agregacie do ultrafiltracji Filtron z filtrami odcinającymi cząstki o wielkości 30 kD. Przed procesem oczyszczania normalizuje się wartość pH i siły jonowej próbki przez przemywanie tej próbki 10 mM roztworem octanu sodowego (bufor o pH = 4,5). W powyższym procesie ultrafiltracji osiąga się około 20-krotne stężenie roztworu.

Próbkę podaje się na wymieniacz jonowy kationowy (S-Sepharose Fast-Flow w kolumnie HR 16/10 o pojemności 20 ml, uzyskane z firmy Pharmacia) w aparaturze do oczyszczania białek firmy Waters (Waters Preparative 650 Advanced Protein Purification System). Związane białka eluuje się w gradiencie chlorku sodowego od 0 do 1M w buforze octanu sodowego. Fitazę eluuje się z kolumny przy stężeniu około 250 mM NaCl. Frakcje wykazujące aktywność fitazy zbiera się, zatęża i odsala przez ultrafiltrację. Uzyskany roztwór podaje się na wymieniacz jonowy anionowy (Q-Sepharose Fast-Flow) w kolumnie HR 16/10 o pojemności 20 ml, firmy Pharmacia), i prowadzi się eluowanie białek w opisanym powyżej gradiencie 0-1 M chlorku

167 790 sodowego w buforze octanowym. Z tej kolumny fitaza eluuje się przy stężeniu około 200 mM NaCl.

W wyniku tych etapów oczyszczania uzyskuje się częściowo oczyszczony preparat fitazy 0 aktywności właściwej około 40-50 jednostek/mg białka, wskazuje na 25-krotne oczyszczenie.

Analiza czystości tej częściowo oczyszczonej fitazy wykazuje obecność głównego zanieczyszczenia substancją o masie cząsteczkowej około 100 kDa (sekwencja E na fig. 1B). Ogniskowanie w punkcie izoelektrycznym wykazuje obecność wielu enzymów posiadających aktywność fosfatazy, w tym 3-4 sub-formy fitazy (punkty izoelektryczne od 5,0 do 5,4; fig. 1A, sekwencje A i B).

W celu uzyskania preparatu jednorodnej fitazy prowadzi się następne, dwukrotne oczyszczanie, z następnym rozdzielaniem składników częściowo oczyszczonej fitazy metodą ogniskowania w punkcie izoelektrycznym w aparacie LKB Multiphor, na płytkach Ampholine PAG, w zakresie wartości pH od 4 do 6,5. Białka wykazujące aktywność fosfatazy (w tym fitazę) wykrywa się opisaną powyżej ogólną metodą barwienia fosfatazy. Następnie wycina się z żelu odpowiednie pasma i eluuje się aktywne białko poprzez 16 godzinną inkubację wycinków żelu w 10 mM buforze octanu sodowego (pH=5,5). Frakcje białka analizuje się opisaną w przykładzie II metodą oznaczania specyficznej aktywność i fitazy, odróżniając frakcje fitazy od innych kwaśnych fosfataz. Wskaźnik końcowego oczyszczania fitazy wynosi około 60 razy (aktywność właściwa końcowego preparatu wynosi 100 jednostek/mg białka). W tym końcowym etapie oczyszczania możliwe jest również wyizolowanie różnych sub-form fitazy (fig. 1A, sekwencje A i B).

Narzędziem dla skutecznego oczyszczania są przeciwciała monoklonalne przeciw fitazie z A. ficuum. Przeciwciała takie sprzęga się z Sepharose 4B aktywowaną bromocyjanem (5 mg/ml żelu) i matrycę tę stosuje się do wypełnienia kolumny do chromatografii powinowactwa. Matryca ta wiąże około 1 mg fitazy /ml. Z kolumny powinowactwa eluuje się fitazę buforem o wartości pH=2,5 (100 mM chlorowodorku glicyny, 500 mM NaCl) bez strat w aktywności. Procedurę tę stosuje się dla wyizolowania homogenicznej fitazy z surowego przesączu hodowli w jednym pojedynczym etapie, z 80 procentowym odzyskiem i 60-krotnym oczyszczeniem.

C. Deglikoeylacta fla^:jy , Fatazę uzyskaną z farmz feacji A.ficuum ę70 mg 7iałka) inkubuje się z 2,5 jednostkami N-glukynyay (Genzyme) w 0,2 M buforze fosforanu sodowego (pH=8,6) 1 10 mM 1,10-ferartrolinz w całkowitej objętości 30 łl.

Po 16 godzinach utrzymywania w temperaturze 37°C oznacza się rozmiar deglikozzlyśji elektroyoretyśarie (aparat Phast System, Pharmacia). Oznaczono, że pozorny ciężar cząsteczkowy f'itazy zmniejszył się z 85 kDa do około 56,4 kDa. Poprzez okresowe analizy barwienia cukrów kwasem Schiffa (PAS), wykrywające natywną fRazę jako glikoproteinę, nie udało się wykryć żadnych resztkowych węglowodanów przyłączonych do białka. Całkowite usunięcie węglowodanów potwierdzono następnie czułą metodą hybrydyzacji z lektyną na bibule (biotting). Natywną i deglikoaylowyną fRazę (obydwie próbki po 2,5 łg) poddaje się elektroforezie w standardowym żelu SDS-PAGE i elektroyoretyśznie przenosi się je na błonę PVDF (Immobilon, firma Millipore) w buforze 25 mM TRlS-glicynowym (pH=8,3) z dodatkiem 20% (objętościowo) metanolu, w czasie 16 godzin, przy różnicy potencjałów 30 V.

Błonę tę inkubuje się następnie z 1% (wag./obj.) albuminą surowicy bydlęcej w solance buforowej fosforanem, po czym prowadzi się jej inkubację z peroksydazą konkarywyliny A’ (Sigma, 10 łg/ml w solance buforowej fosforanem). Peroksydyaę barwi się 4-chloro^1-naftolem (Sigma).

Ta czuła metoda również nie wykazała żadnych pozostałości węglowodanu związanego z deglikozylowarą fitazą.

Po deglikoazlyśji fRaza całkowicie traci swą aktywność, prawdopodobnie w wyniku agregacji enzymu.

Przykład III. Oznaczenie sekwencji yminokwyzowee fRazy i konstrukcja sond oligonukleotzdowzśh.

A. Oznaczzme N-ko ńcowej oel^¹^ encji emin okwasowea. Fitaz ę przenori enę ei ευπ+οιτtycznie z żelu SDS-PAGE albo z żelu IEF-PAGE na błonę PVDF (Immobilon, Millipore) stosowaną do prób hybrydyzacji. Ten elektroblęttirg prowadzi się w 10 mM buforze CAPS

167 790 (kwas 3-cykloheksyloamino-propanosulfonowy), (pH=1 1,0) z dodatkiem 10%c metanolu (objętościowo), w czasie 16 godzin przy różnicy potencjałów 30 V, w temperaturze 4°C. Białko lokalizuje się przez barwienie błękitem Coomassie Brilliant, wycina się odpowiednie pasmo, odbarwia się je metanolem i poddaje sekwencjonowaniu w fazie gazowej. Procedurę powtarza się kilkakrotnie, stosując wiele pojedynczych preparatów. Wyniki przedstawione są na fig. 1A (sekwencje A i B).

Oznaczono również sekwencję aminokwasową dla białka o wielkości 100 kDa obecnego w surowych preparatach. Dane uzyskane dla tego białka podane są na fig. 1C. Sekwencje ta wykazuje znaczną homologię z sekwencją kwaśnej fosfatazy wyizolowanej z Aspergillus niger (MacRae i wsp., 1988, Gene 71, 339-348).

B. Oznaczanie wewnętrznych sekwencji amionokwasowych. Fragmentacja białka metodą z bromocyjanem. Oczyszczoną do stopnia homogeniczności fitazę przenosi się do 100 mM roztworu NaHCOj przez ultrafiltrację w urządzeniu Microconcentrator Centricon 30, firmy Amicon. Białko to następnie liofilizuje się, rozpuszcza w 70% kwasie trójfluorooctowym (objętościowo) i inkubuje się przez 6 godzin z około 300-krotnym nadmiarem molowym CNBr. Reakcję zatrzymuje się rozcieńczając mieszaninę wodą. Uzyskane fragmenty powtórnie się liofilizuje. Następnie próbkę rozpuszcza się w buforze do elektroforezy SDS-PAGe zawierającym DTT (ditiotreitol) i oznacza się stopień fragmentacji metodą PAGE. Analizę metodą PaGe prowadzi się w aparacie Phast-System firmy Pharmacia w 20 procentowych żelach SDS-PAGE. Żele te poddaje się wstępnej elektroforezie w celu utworzenia ciągłego układu buforowego dla polepszenia rozdziału małych peptydów (według poradnika). Peptydy wykrywa się techniką barwienia srebrem gdyż barwienie Coomassie Brilliant nie daje możliwości wykrycia najmniejszych peptydów. Wynikiem tej procedury jest całkowity rozkład fitazy na peptydy o masach cząsteczkowych < 2,5 kDa, 36 kDa, 57 kDa i 80 kDa.

Do dalszego sekwencjonowania w fazie gazowej peptydy izoluje się przez elektroforezę SDS-Trycyna-PAGE opisaną przez Schagger’a i Jagowa, (1987, Anal. Biochem., 166, 368-379) po czym prowadzi się elektroforetycznie nanoszenie na filtr do hybrydyzacji typu blott, opisane powyżej.

Według oznaczenia wykonanego przez Ullah’a (1988, jak wyżej), N-końcowa część fragmentu o wielkości 57 kDa jest identyczna z N-końcową częścią fitazy, za wyjątkiem pierwszych czterech aminokwasów, które są nieobecne (fig. 1A, sekwencja B). Sekwencje N-końcowe peptydów o wielkości 2,5 kDa i 36 kDa są przedstawione na fig. 1B (sekwencje A i B).

C. Sondy oligonukleotydowe. Sondy oligonukleotydowe przygotowuje się na podstawie sekwencji aminokwasowych podanych na fig. 1A i 1B w syntetyzerze DNA Applied Biosystems ABI380B. Struktura tych oligonukleotydów jest podana na fig. 2A i 2B.

Przykład IV. Hybrydyzacja genomowych biotów i genomowych banków z pierwszą serią sond oligonukleotydowych.

Genomowy DNA z A. ficuum izoluje się przez zmielenie grzybni w ciekłym azocie w znany sposób (Yelton i wsp., Proc.Natl. Acad. Sci USA, 1984, 1470-1474). Bank genomowy konstruuje się w wektorze bakteriofaga lambda EMBL3, stosując materiał po częściowym trawieniu San 3A chromosomalnego DNA z A. ficuum NRRL 3135 standardową techniką Maniatis’a i wsp. (Molecularcloning, alaboratory manuał, 1982, Cold Spring HarborLaboratory Nowy Jork). Uzyskany w ten sposób genomowy bank zawiera 60 do 70 kopii genomu A.ficuum. Bank ten testuje się na pojawianie się łysinek bez insertu metodą hybrydyzacji z fragmentem rdzeniowym lambda EMBL3. Zaobserwowano, że poniżej 1 procenta łysinek hybrydyzuje z sondą lambda EMBL3. Wielkość insertu wynosi 13 do 17 kb. (1kb= 100 par zasad).

W celu określenia warunków i sonad odpowiednich do skriningu banku genomowego, genomowy DNA poddaje się trawieniu kilkoma enzymami restrykcyjnymi, rozdziela się materiał po trawieniu na żelach agarozowych i hybrydyzuje metodą biot na filtrze Genescreen plus, postępując według instrukcji producenta. Prowadzi się hybrydyzację ze wszystkimi sondami oligonukleotydowymi, stosując warunki i roztwory o różnej mocy (6 x SSC, 40 do 60°C dla hybrydyzacji i do 0,2 x SSC, 65°C dla wypłukiwania. Do skriningu banku genomowego wyselekcjonowano sondy 1068 i 1024 (fig. 2A), jakkolwiek nie można było zidentyfikować

167 790 wspólnych fragmentów DNA, które hybrydyzowałyby specyficznie z obydwiema sondami. Sonda 1025 kwaśnej fosfatazy (fig. 3) dawała specyficzny, oddzielny sygnał hybrydyzacyjny a zatem sondę tę wybrano do skriningu banku genomowego dla genu kwaśnej fosfatazy.

Stosując wszystkie trzy sondy można zidentyfikować w banku genomowym hybrydyzujące łysinki. Sygnał hybrydyzacji korespondujący z sondą 1025 (kwaśna fosfataza) jest silny i powtarzalny. Sygnały hybrydyzacji o zmiennej intensywności obserwuje się stosując sondy 1024 i 1068 (fitaza). Nie obserwuje się hybrydyzacji krzyżowej między tymi dwiema seriami. Wszystkie trzy serie łysinek poddaje się powtórnemu skriningowi i izoluje się DNA z ośmiu pojedynczych, dodatnio hybrydyzujących łysinek (Maniatis i wsp., jak wyżej). W każdej serii można zidentyfikować klony zawierające identycznie hybrydyzujące fragmenty, co wskazuje, że inserty tych klonów są pokrewne i prawdopodobnie nakładają się na ten sam region genomowego DNA. Tu również nie można zaobserwować hybrydyzacji krzyżowej przy użyciu dwu serii specyficznych dla fitazy (sondy 1024 i 1068), co wskazuje na to, że aczkolwiek obydwie sondy zastosowane do izolacji tych dwu serii klonów otrzymano z N-końcowej sekwencji aminokwasowej białka, to zidentyfikowano i sklonowano odmienne fragmenty genomowego DNA.

Wszystkie trzy serie klonów poddaje się hybrydyzacji techniką Northern’a z materiałem zawierającym mRNA wyizolowany z indukowanej i nie-indukowanej grzybni (przykład VI). Klony specyficzne dla kwaśnej fosfatazy jak również wyizolowany z tych klonów wewnętrzny fragment o wielkości 3,1 kb po trawieniu Sali hybrydyzuje wyłącznie z indukowanymi próbkami mRNA. Ten mRNA i zidentyfikowany za pomocą sond specyficznych dla kwaśnej fosfatazy ma około 1800 zasad długości, co jest zgodne ze znaną wielkością tego białka (68 kDa; Ullah i Cummins, Prep. Biochem., 1987, 17, 397-422). Nie zachodzi hybrydyzacja tych klonów specyficznych dla fitazy ze specyficznym mRNA. Uznano, że opisany powyżej sposób nie nadaje się do klonowania genu kodującego fitazę. Można dalej wnioskować, że niepowodzenie to wynika z wyboru złej metody, gdyż metodę tę z powodzeniem stosuje się do identyfikacji genu kodującego kwaśną fosfatazę. Klon lambda zawierający gen kwaśnej fosfatazy zdeponowano w dniu 24 kwietnia 1989 roku w Central Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holandia, pod numerem akcesyjnym CBS 214.89. Z faga Z1 izoluje się fragment BamHI o długości 10 kb i subklonuje się go do plazmidu pUC 19. Ten podklon zawiera cały gen kodujący kwaśną fosfatazę. Ten podklon, o nazwie pAF 1-1 (fig. 5) zdeponowano w dniu 24 kwietnia 1989 roku pod numerem CBS 213.89.

Przykład V. Izolowanie genu kodującego fitazę przy użyciu drugiej serii sond oligonukleotydowych.

Sondy przygotowano w oparciu o wytworzone po traktowaniu CNBr fragmenty N-końcowej sekwencji aminokwasowej (fig. 2B, sondy 1295, 1296 i 1297). Sondy te poddaje się hybrydyzacji z genomowym DNA w sposób opisany powyżej. Możliwość użycia tych sond do izolacji genu kodującego fitazę bada się przez hybrydyzację Southern’a materiału genomowego na filtrach z sondami. Tym razem można zidentyfikować hybrydyzujące fragmenty o odpowiednich długościach stosując wszystkie trzy sondy, pomimo tego, że sondy te pochodzą z regionów nie pokrywających się. Pomiędzy nowym zestawem sond a klonami wyizolowanymi przy użyciu pierwszego zestawu sond nie zachodzi hybrydyzacja (przykład IV). Dokonano zatem powtórnego skriningu banku genomowego stosując wszystkie trzy sondy w oddzielnych doświadczeniach. Podzbiór klonów (lambda AF201, 219, 241 i 243) wyizolowany z każdą osobną sondą hybrydyzuje również z dwiema innymi sondami, co wskazuje na to, że w tym przypadku przy użyciu trzech różnych sond wyizolowano klony z jednego regionu genomu. Usiłowano zhybrydyzować nowo wyizolowane klony z sondami 1024 i 1068. W obydwu przypadkach nie zaobserwowano hybrydyzacji z nowo wyizolowanymi klonami w warunkach, w których obydwie sondy hybrydyzują z klonami wyizolowanymi z zastosowaniem tych sond (przykład IV). Jest to dowodem na to, że nowo wyizolowane klony nie wykazują homologii z sondami pochodzącymi z N-końcowej sekwencji oczyszczonej fitazy.

Klon lambda EMBL3 hybrydyzujący ze wszystkimi trzema sondami (1295-1297) o nazwie AF201 (fig. 4) zdeponowano 9 marca 1989 pod numerem CBS 155.89.

167 790

Fragment BamHI klonu lambda AF201 o długości 5,1 kb (subklonowany w plazmidzie pUC19 i oznaczony jako pAF 2-3, fig. 4), hybrydyzujący ze wszystkimi trzema sondami oligonukleotydowymi stosuje się do sondowania materiału w próbie Northern. W tym przypadku, identyfikuje się oddzielny mRNA o wielkości 1800 zasad. Ten mRNA znajduje się tylko w indukowanej grzybni. Podobne wyniki uzyskano stosując te oligonukleotydy jako sondy. Stosując nowy zestaw sond zidentyfikowano zatem wspólny fragment DNA, który specyficznie hybrydyzuje z indukowanym mRNA. Długość tego mRNA (1800 par zasad) jest wystarczająca do kodowania białka o wielkości około 6 kDa, a jest to wielkość niezglikozylowanej fitazy. Jasne jest więc, że wyizolowane fragmenty zawierają co najmniej część genu kodującego fitazę.

Przykład VI.

Izolowanie indukowanego i nie-indukowanego mRNA.

Z piśmiennictwa wiadomo, że synteza fitazy w A.ficuum podlega ścisłej regulacji zależnej od fosforanów (Han i Callagher, J. Indust. Microbiol., 1987, 1, 295-301). Wykazanie, że wyizolowany gen jest przedmiotem podobnej regulacji, stanowiłoby zatem następny dowód na to, że został sklonowany właściwy gen.

Dla wyizolowania mRNA, którego synteza przebiegała w warunkach zarówno produkcji jak i nie-produkcji, prowadzi się wzrost A.ficuum NRRL 3135 w sposób następujący: Na początku hoduje się zarodniki w pożywce nie-indukującej przez dobę. Następnego dnia grzybnię zbiera się, przemywa się ją sterylną wodą i zaszczepia na podłoże indukujące i na podłoże nie-indukujące. Stosuje się podłoże o składzie: 20 g skrobii kukurydzianej, 7,5 g glukozy, 0,5 g MgSOą.7 HjO), 0,2 g FeSOą-7 H2O i 7,2 g KNC3 w litrze. W celu indukowania produkcji fitazy do podłoża dodaje się do 2 g/litr namoku kukurydzianego natomiast podłoże nie-indukujące zawiera 2 g/litr K2HPO4. Wzrost grzybni prowadzi się przez następne co najmniej 100 godzin. W określonych przedziałach czasu pobiera się próbki. Wytwarzanie fitazy śledzi się wykonując próby na fitazę opisane w przykładzie IIA. Denaturowany mRNA wyodrębnia się przez elektroforezę i nanosi na filtry Genescreen plus. Filtry te hybrydyzuje się ze znakowanym ³²P pAF 2-3 albo z wyizolowanym fragmentem SalI o wielkości 3,1 kb z pAF 1-1 (kwaśna fosfataza) z przykładu IV. Wyniki przedstawiono w tabeli 2.

Dodatnie wyniki hybrydyzacji specyficznego dla fitazy fragmentu BamHI o wielkości 5,1 kb i specyficznego dla kwaśnej fosfatazy fragmentu Sali o wielkości 3,1 kb z wyizolowanym mRNA notuje się jedynie wówczas, gdy prowadzi się hodowlę komórek w warunkach o których wiadomo, że indukują syntezę fitazy i kwaśnej fosfatazy. Wynika stąd, że wyizolowane geny podlegają regulacji jakiej oczekuje się od genu dla fitazy i dla kwaśnej fosfatazy.

Tabela 2

Hybrydyzacja Northern’a z zastosowaniem właściwego dla fitazy fragmentu BamHI o wielkości 5,1 kb (A) albo właściwego dla kwaśnej fosfatazy fragmentu SalI o wielkości 3,1 kb (B) jako sondy, znak + wskazuje na obecność mRNA fitazy o długości 1800 par zasad albo mRNA kwaśnej fosfatazy o długości 1800 par zasad. Względną aktywnos'ć fitazy oznaczano w próbkach 24-godzinnych. Hodowle indukowane wykazywały 10-krotnie większą aktywność fitazy niż hodowle nie-indukowane.

Czas po zaszczepieniu	Hodowla indukowana	Hodowla nieindukowana
A 24 godziny	+	-
B 24 godziny	+	-

Przykład VII. Dowód na sklonowanie genu fitazy.

Dla uzyskania definitywnego dowodu na to, że wyizolowano właściwy gen kodujący fitazę i dla zbadania możliwości zwiększonej ekspresji sklonowanego genu dokonano subklonowania genu fitazy do odpowiedniego wektora i transformowano go do A.niger 402 (ATCC 9092).

W tym celu, gen fitazy izoluje się z klonem lambda AF201 jako fragment Nrul o długości 10 kb i klonuje się do miejsca Stul w wektorze pAN 8-1 (Mattern I.E. i Punt P. J., Fingal Genetics Newsletter, 1988, 35, 25), który zawiera gen ble (nadający oporność na fleomycynę) jako marker selekcyjny. Uzyskany konstrukt o nazwie pAF 28-1 (fig. 4) transformuje się do A. niger 402

167 790 techniką opisaną w przykładzie IX, z tą różnicą, że protoplasty posiewa się na minimalnym podłożu Aspergillus z dodatkiem 30 μg fleomycyny/ml i zestala się 0,75 procentowym agarem. Pojedyncze transformanty oczyszcza się, izoluje i testuje na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach w sposób opisany w przykładach I i II. Jako kontrolę testuje się również transformanty posiadające jedynie wektor oraz nietransformowane komórki gospodarza (Tablica 3). Jedynie A. niger 402 zawierający pAF 28-1 wytwarza fitazę, która reaguje ze specyficznym przeciwciałem monoklonalnym przeciw fitazie A.ficuum. Fitaza reagująca z tym przeciwciałem monoklonalnym eluuje się z kolumny immunopowinowactwa przy pH 2,5, posiada identyczną masę cząsteczkową, stopień glikozylacji, punkt izoelektryczny i aktywność właściwą jak fitaza z A. ficuum. Stanowi to klarowny dowód na to, że komórki A.niger 402 transformowane pAF 28-1 wytwarzają fitazę, która jest identyczna z fitazą z A. ficuum. Podobna ekspresja nie zachodzi w innych typach komórek kontrolnych.

Tabela 3

Szczep	Aktywność fitazy jednostki/ml	Aktywność fitazy zaadsorbowana na kolumnie immunopowinowactwa (w procentach)
A.niger 402	0,5	0
A.niger 402 pAF 28-1	0,7	10
A.niger 402 pAN 8-1	0,5	0

Szczepy hodowano w warunkach indukujących (przykład VI). Próbki pobierano po 96 godzinnym wzroście.

Przykład VIII. Charakteryzacja genu fitazy.

Klony lambda zawierające gen fitazy analizuje się przez trawienie różnymi enzymami restrykcyjnymi. Mapę regionu genomowego zawierającego gen fitazy podano na fig. 4. Określone fragmenty restrykcyjne subklonuje się do wektora klonującego pUC19, jak pokazano na fig. 4.

W przykładzie V wykazano, że fragment BamHI o wielkości 5,1 kb obecny w pAF 2-3 zawiera co najmniej część genu fitazy. Ponadto, oligonukleotydowe sondy 1295 i 1297 (fig. 2B) hybrydyzują z insertem Sali z pAF 2-7 (pozycje klonów pAF 2 są podane na fig 4) podczas gdy sonda 1296 zajmuje prawdopodobnie miejsce Sali między fragmentami w pAF 2-6 i pAF 2-7. Wyniki te wykazują, że sekwencja kodująca fitazę jest zlokalizowana w lewostronnej części insertu BamHI pAF 2-3.

Ponadto całkowicie oznaczono sekwencje nukleotydowe insertów w plazmidach pAF 2-3, pAF 2-6 i pAF 2-7 stosując metodę zakańczania łańcucha di-dezoksy (Sanger i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1977, 74, 5463-5467) i metodę strzałów na ślepo opisaną przez Messing’a i wsp. (Nucl.Acids Res., 1981, 9, 309-321). Zsyntetyzowano poza tym specyficzne oligonukleotydy w oparciu o informacje o sekwencji nukleotydowej uzyskane podczas procedury sekwencjonowania.

Całkowita sekwencja nukleotydowa klonów pAF 2-3, pAF 2-6 i pAF 2-7 obejmująca locus genu fitazy w chromosomie skompilowana jest na fig. 6, a w formie graficznej przedstawiona jest na fig. 7.

Analiza zdolności kodowania białka tej całkowitej sekwencji ujawniła, że N-końcowa sekwencja aminokwasowa dojrzałego białka jest kodowana startując od pozycji 381 w nukleotydzie (koniec aminowy ujawniony przez Ullah’a jest zlokalizowany w pozycji 369). Wykazano ponadto, że N-końcowa sekwencja aminokwasowa o wielkości 36 kDa i wewnętrzne fragmenty peptydu o wielkości 2,5 kDa (fig. 1B, sekwencje C i A) są kodowane w pozycjach nukleotydu 1101 i 1548, odpowiednio. Otwarta faza odczytu kończy się w pozycji 1710.

Wyniki tych badań stanowią dowód na identyczność zcharakteryzowanego locus chromosomalnego jako locus zawierającego sekwencję DNA kodującą fitazę. Bezpośrednio w górę od sekwencji chromosomalnej kodującej dojrzałe białko fitazy nie wykryto kodonu startu ATG

167 790 w fazie odczytu sąsiadującej z otwartą fazą odczytu dla dojrzałego białka. Jednakże, stosując charakterystykę granicy intron-egzon można przypuszczać, że intron znajduje się między nukleotydami 254 a 355, dając kodon ATG w pozycji 210 nukleotydu, co jest w fazie zgodnej z otwartą fazą odczytu kodującą dojrzałe białko. Pochodna sekwencja aminokwasowa tego N-końcowego obszaru ściśle odpowiada regułom dla sygnalnej sekwencji sekrecji opublikowanym przez von Heyne’ego (Eur.J.Biochem., 1983, 133, 17-21).

Dla potwierdzenia tych hipotez izoluje się cDNA fitazy metodą PGR-amplifikacji z zastosowaniem primerów specyficznych dla fitazy i całkowitej populacji mRNA/cDNA jako matrycy, w sposób opisany poniżej.

Izolowanie poli A+ RNA z A.ficuum.

Z A. ficuum NRRL 3135 hodowanego w warunkach indukujących podanych w przykładzie VI izoluje się całkowity RNA. Suchą grzybnię zamraża się w ciekłym azocie i miele. Następnie proszek homogenizuje się w aparacie Ultra-Turrax (pełna szybkość w czasie 1 minuty) w roztworze zawierającym 3 M LiCl i 6 M mocznika w temperaturze 0°C i utrzymuje się przez dobę w temperaturze 4°C w sposób opisany przez Auffrey’a i Rougeon’a (Eur. J.Biochem, 1980, 107, 303-314). Całkowity komórkowy RNA otrzymuje się po wirowaniu z szybkością 16 000 g w czasie 30 minut i po dwu kolejnych ekstrakcjach mieszaniną fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego (50:48:2). Ten RNA strąca się etanolem i rozpuszcza w 1 ml 10 mM Tris-HCl (pH=7,4) z dodatkiem 0,5% SDS. W celu wyselekcjonowania poli A+ RNA, próbkę całkowitego RNA ogrzewa się przez 5 minut w temperaturze 60°C, doprowadza się roztwór do stężenia 0,5 M NaCl i następnie podaje się na kolumnę z oligo(dT)-celulozą. Po kilku przemywaniach roztworem zawierającym 10 mM Tris HCl (pH =7,4), 0,5% SDS i 0,1 M NaCl zbiera się poli A⁺RNA przez eluowanie 10 mM roztworem Tris-HCl (pH=7,4) z dodatkiem 0,5% SDS.

Przygotowanie kompleksu mRNA-cDNA.

W celu zsyntetyzowania pierwszej nici cDNA rozpuszcza się 5 μl poli A*RNA w 16,5 μl wody i dodaje się następujące składniki: 2,5 μl RNasin (30 jednostek/al), 10 μl buforu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH=7,6), 6 mM MgCb i 40 mM KCl, 2 μl 1 M KC1, 5 al 0,1 M DTT, 0,5 μ l oligo (dT) 12-18 (2,5 mg/ml), 5 μ l 8 mM dNTP-mieszaniny, 5 al BSA ( 1 mg/ml) i 2,5 μ 1 odwrotnej transkryptazy Moloney MLV (200 jednostek/ml). Mieszaninę inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C. Reakcję zatrzymuje się przez dodanie 10 μ l 0,2 M EDTA i 50 μl wody. Następnie prowadzi się ekstrakcję chloroformem i po wirowaniu dodaje się do supernatantu kolejno 110 μl 5M octanu amonowego i 440 μl etanolu. Strącanie kompleksu mRNA-cDNA prowadzi się w roztworze suchy lód-etanol w czasie 40 minut, po czym kompleks ten zbiera się przez wirowanie, przemywa się go 70 procentowym etanolem ziębionym lodem i rozpuszcza się w 20 μ l wody. Klonowanie fragmentów cDNA fitazy.

Izolację sekwencji cDNA kodujących fitazę prowadzi się przez reakcję budowy łańcucha za pomocą polimerazy (PCR) w dwu fragmentach. W oparciu o sekwencję genomową fitazy przedstawioną na fig. 8 projektuje się cztery syntetyczne primery oligonukleotydowe:

Oligo 1:5’ - GGG.TAG.AAT.TCA.AAA.ATG.GGC.GTC.TCT.GCT.GTT.CTA.-3’ oligo 2:5’ - ATG.GAC.GAA.TTC.GTG.CTG.GTG.GAG.ATG.GTG.TCG.-3’ oligo 3:5’- GAG.CAC.CAA.GCT.GAA.GGA.TCC.-3’ oligo 4:5’ - AAA.CTG.CAG.GCG.TTG.AGT.GTG.ATT.GTT.TAA.ACC.C-3’

Oligo 1 zawiera sekwencję nukleotydową w dół od kodonu startu ATG fitazy (pozycje 210 do 231) flankowaną na końcu 5’ miejscem EcoRI. Oligo 2 zawiera sekwencję nukleotydową idącą w górę bezpośrednio od miejsca Sali (pozycje 1129 do 1109) również flankowaną dodatkowym miejscem EcoRI. Oligo 3 zawiera sekwencję nukleotydową wokół miejsca BamHI (pozycje 845 do 865) a oligo 4 zawiera sekwencję nukleotydową usytuowaną w dół od kodonu stop dla fitazy (pozycje 1890 do 1867) flankowaną dodatkowym miejscem Pstl.

Reakcję budowy łańcucha wobec polimerazy prowadzi się według instrukcji dostawcy Taq-polymerase (Cetus). Jako matrycę stosuje się roztwór (1,5 μθ zawierający opisane powyżej hybrydy mRNA-cDNA ajako primery stosuje się po 03 μg oligo 1 i oligo 2 w reakcji amplifikacji N-końcowej części cDNA fitazy oraz oligo 3 i oligo 4 w reakcji amplifikacji C-końcowej części cDNA fitazy (fig. 8). Po denaturacji (7 minut w temperaturze 100°C) i dodaniu 2 jednostek polimerazy (Taqpolymerase) mieszaniny reakcyjne poddaje się 25 cyklom amplifikacji (każdy

167 790 cykl: 2 minuty w 55°C, 3 minuty w 72°C, 1 minuta w 94°C) w amplifikatorze DNA Perkin-Elmer/Cetus. W ostatnim cyklu pomija się etap denaturacji. Po trawieniu (EcoRI dla części N-końcowej cDNA i BamHI oraz Pstl dla części C-końcowej cDNA), obydwa fragmenty cDNA klonuje się do odpowiednich miejsc w plazmidzie pTZ18R (Promeqa).

Sekwencję nukleotydową obydwu uzyskanych metodą PCR fragmentów oznacza się techniką zakańczania łańcucha didezoksy (Sanger, jak wyżej) stosując jako primery syntetyczne oligonuklotydy skonstruowane po sekwencjonowaniu chromosomalnego genu fitazy oraz całkowity amplifikowany DNA i klonowane fragmenty cDNA jako matrycę. Sekwencję regionu cDNA kodującego białko fitazy oraz sekwencję aminokwasową białka fitazy przedstawiono na fig. 8.

Ta sekwencja cDNA stanowi potwierdzenie postulowanej powyżej lokalizacji intronu i wskazuje, że w obrębie sekwencji genu chromosomalnego nie występują żadne inne introny.

Gen fitazy koduje pierwotny produkt translacji złożony z 467 aminokwasów (masa cząsteczkowa 51091) Ten pierwotny produkt translacji ulega przetworzeniu z odszczepieniem peptydu sygnalnego i powstaniem dojrzałego białka złożonego z 444 (masa cząsteczkowa 48851) albo z 448 (zawierających pierwsze 4 N-końcowe aminokwasy opisane przez Ullah’a, masa cząsteczkowa 49232) aminokwasów.

Przykład IX. Zwiększona ekspresja fitazy w Aspergillus wywołana wprowadzaniem dodatkowych kopii genomowego DNA fitazy.

Konstruowanie wektora ekspresyjnego pAF 2-2S. Wszystkie konstrukty przygotowuje się stosując standardowe techniki biologii molekularnej, takie jak opisane przez Maniatisa i wsp. (Molecular cloning, A laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.).

Wektor ekspresyjny pAF 2-2S przygotowuje się przez subklonowanie fragmentu DNA PvuII o wielkości 6 kb z genomowego klonu fitazy lambda AF201 do miejsca Smal w pUC19. Plazmid pochodny oznaczono symbolem pAF 2-2 (fig. 4). Jako marker selekcyjny do transformacji do szczepu Aspergillus wprowadzono fragment EcoRI/KpnI z plazmidu pGW325 (Wernars K, Thesis, Agriculture University, Wegeningen, 1986, Holandia/ zawierający homologiczny gen amdS z Aspergillus nidulans do miejsc EcoRI/KpnI w plazmidzie pAF 2-2. Uzyskany wektor ekspresyjny oznaczono symbolem pAF 2-2S. Jest on przedstawiony na fig. 9.

A. Zwiększona ekspresja fitazy w A . ficu urn NRRL 3135.

Plazmid pAF 2-2S wprowadza się do A.finuum NRRL 3135 stosując procedury transformacji opisane przez Tilburn’a i wsp. (Gene, 1983, 26, 205-221 i Kelley^go J. i Hynes’a M. (EMBO J., 1985, 4, 475-479) z następującymi modyfikacjami:

- grzybnię hoduje się na minimalnej pożywce Aspergillus (Cove D., Biochem. Biephys. Acta, 1966, 113, 51-56) z dodatkiem 10 mM argininy i 10 mM proliny w czasie 16 godzin w temperaturze 30°C na wstrząsarce rotacyjnej o obrotach 300 obrotów/minutę,

- do wytworzenia protoplastów stosuje się tylko Nevezym 234 (Novo Industri), natomiast nie dodaje się helikazy,

- po 90 minutach tworzenia się protoplastów do zawiesiny protoplastów dodaje się 1 objętość buforu STC (1,2 M sorbitol, 10 mM Tris-HCl (pH=7,5), 50 mM CaCh i wiruje się z szybkością 2500 g w temperaturze 4°C w czasie 10 minut w roztworze wahadłowo-tłokowym. Protoplasty przepłukuje się i zawiesza w buforze STC w stężeniu 10⁸ komórek/ml.

- do zawiesiny protoplastów (100 gl) dodaje się plazmidowy DNA w objętości 10 gl w buforze TE /10 mM Tris-HCl / pH= 7,5/, 0,1 mM EDTA/,

- po inkubacji zawiesiny DNA-protoplasty w temperaturze 0°C w czasie 25 minut dodaje się 200 gl roztworu PEG, kroplami (25% PEG 4000 firmy Merck), 10 mM Tris-HCl (pH =7,5), 50 mM CaCb). Następnie dodaje się powoli 1 ml roztworu PeG (60% PEG 4000 w 10 mM Tris-HCl (pH=7,5), 50 mM CaCF) z wielokrotnym mieszaniem probówek. Po inkubacji w temperaturze pokojowej zawiesiny rozcieńcza się buforem STC, miesza przez odwrócenie i wiruje z szybkością 2000 g w temperaturze 4°C w czasie 10 minut. Protoplasty zawiesza się łagodnie w 200 gl buforu STC i posiewa na minimalne podłoże Aspergillus z 10 mM acetamidu jako jedynym źródłem azotu, 15 mM CsCl i 1 mM sacharozy, zestalone 0,75% agaru bakteriologicznego 1 (Oxoid). Hodowlę prowadzi się w temperaturze 33°C w czasie 6-10 dni.

167 790

Pojedyncze transformanty oznaczone jako SP4, SP7 i SP8 izoluje się, oczyszcza i testuje na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach w sposób opisany w przykładach I i II. Jako kontrolę testuje się tranformanty posiadające jedynie wektor (gen amdS w pUC 19) oraz nietransformowanego gospodarza.

Wzrost szczepów prowadzi się w warunkach indukowania (patrz przykład VI) pobierając próbki po 96 godzinach hodowli. Analizę prowadzi się przez pomiar aktywności fitazy (tablica

4) i metodą ogniskowania w punkcie izoelektrycznym w procesie elektroforezy w żelu poliakryloamidowym (IEF-PAGE). Z brzeczek fermentacyjnych A.ficuum i A.ficuum pAF 2-2S SP7 hodowanych w identycznych warunkach pobiera się próbki o jednakowej objętości i podaje się je na żel IEF-PAGE (zakres pH - 4,5-6, Phast-System, Pharmacia). Elektroforezę prowadzi się według instrukcji producenta. Następnie żele barwi się albo błękitem Coomassie Briliant barwiącym ogólne białko (fig. 1 OB) albo wykonuje się barwienie opisane w przykładzie II na ogólną aktywność fosfatazy (fig. 10A).

Stosuje się również próbkę fitazy z A.ficuum, oczyszczoną do homogeniczności (na drodze chromatografii immunopowinowactwa opisanej w przykładzie VII) albo samej albo zmieszanej z supernatantem hodowli.

W różnych próbkach fitaza występuje w różnych formach izomerycznych (wskazanych gwiazdką), o czym wspomniano w opisie wynalazku. Dwa główne izoenzymy są dokładnie widoczne w oczyszczonej fitazie w pasmach 3 i 4 przy obydwu metodach barwienia (A i B). Pasma fitazy są ledwie widoczne w macierzystym szczepie A.ficuum, natomiast znacznie się zwiększają w szczepie transformowanym pAF 2-2S SP7.

Tabela 4

Zwiększone wytwarzanie fitazy w wyniku transformacji A. ficuum NRRL 3135.

Szczep	Aktywność fitazy (jednostek ml)
A.ficuum	0,6
A.ficuum + plazmid kontrolny	0,6
A.ficuum pAF 2-2S SP8	7,6
A.ficuum pAF 2-2S SP7	6,7
A.ficuum pAF 2-2S SP4	4,3

B. Zwiększone wytwarzanie fitazy w A.niger CBS 513.88.

Wektor ekspresyjny pAF 2-2S wprowadzono również do A.niger CBS 513.88, stosując taką samą procedurę transformacji jak dla A.ficuum. Wyizolowano czyste transformanty, oczyszczono je i wykonano test na wytwarzanie fitazy we wstrząsanych kolbach, w indukujących warunkach wzrostu, opisanych w przykładzie VI.

Poziomy ekspresji fitazy w niektórych transformantach (oznaczonych jako A.niger pAF 2-2S # 8, # 20 i # 33) oraz w szczepach kontrolnych, oznaczone · w sposób podany w przykładzie IXA przedstawiono w tablicy 5.

Poziomy ekspresji fitazy w transformantach A.niger są porównywalne z odpowiednimi poziomami w transformantach A. ficuum. Spostrzeżenie to wskazuje na fakt, że promotor fitazy z A. ficuum jest aktywny w A.niger.

Dalszą analizę prowadzi się stosując pożywkę hodowli transformantu pAF 2-2S # 8. Pożywkę tę poddaje się elektroforezie w żelu IEF-PAGE w zakresie pH od 4,5 do 6 w opisanej powyżej aparaturze Phast-System Pharmacia. Na żel nanosi się jednakowe objętości supernatantów hodowli macierzystego szczepu A.niger i transformantu pAF 2-2S # 8 hodowanych w identycznych warunkach. Żele rozwija się i następnie barwi w wyżej opisany sposób.

Macierzysty A.niger wytwarza bardzo niewielką ilość fitazy, której nie można wykryć metodą elektoforezy w żelu. Szczep pAF 2-2S # 8 wytwarza około 90 razy więcej fitazy. Różnica ta jest dobrze widoczna na fig. 11.

167 790

Wykryto również wiele izo-form enzymu fRazy (wskazanych gwiazdką). Barwienie ogólnego białka wykazuje, że gwałtownie wzrosła intensywność pasm białka fitazy, podczas gdy nie pojawiły się większe pasma innych białek.

Tabela 5

Wftwyfsnrio yliysf w wyniku tfyrsfęfmnśji A^ger CBS 513.88 przez pAF 2-2S.

Szczep	Aktywność yityaf (jjdręztjk/ml)
U.rigof	0,2
U.rigor + plazmid kęrtfęlrf	0,2
U.rigof pAF 2-2S # 8	14
A.rigor pAF 2-2S # 33	5
U.rigjr pAF 2-2S # 20	4

Przykład X. Ekspresja fitazy w A^ger transformowanym wektorami ekspresyjnymi zawierającymi gen fitazy z A. ficuum sprzężony z promotorem i/lub sekwencjami sygnałowymi genu ymylęglukozydyzy (AG) z A.niger.

Konstruowanie wektorów ekspresyjnych.

Dla uzyskania zwiększonej ekspresji fRazy w A.niger, sporządza się dodatkowe kasety ekspresyjne, w których gen fRazy z A.ficuum znajduje się pod kontrolą promotora genu ymyloglukęaydyay (AG) z A.niger w kombinacji z różnymi sekwencjami sygnałowymi. W plazmidach pl8FYT3 i p24FYT3 przyłącza się odpowiednie sekwencje liderowe 18 i 24 aminokwasu z genu AG z Amiger do fragmentu genu fRazy kodującego dojrzałe białko. W kasecie ekspresyjnej pFYT3 sekwencja promotora AG jest przyłączona do sekwencji kodującej t’itazę łącznie z sekwencję liderową fRazy.

Konstruowanie p18FYT3.

Fuzję promotora AG i sekwencji liderowej 18-tego aminokwasu AG z sekwencją fitazy dokującą dojrzałe białko prowadzi się metodą reakcji budowy łańcucha oolimeryay (PGR). W reakcjach PGR stosuje się dwie różne matryce: pAF 2-2S zawierającą cały gen fitazy, opisaną powyżej oraz pAB6-1, plazmid zawierający całe locus AG z A.niger, wyizolowany z banku plazmidowego A.niger, zawierający fragmenty HindIII o wielkości 13-15 kb w pUC19. Do izolacji stosuje się specyficzne w stosunku do AG oligonuklootzdz·.

AG-a: 5 ’ - GACAATGGCTACACCAGCACCGCAACGGACACATTGTTTGGCCC-3 ’

AG-2 : 5’- AAGCAGCCATTGCCCGAAGCGAT-3’, obydwa oparte na sekwencji nukleotydowej opublikowanej przez Boel’a i wsp. (EMBO J., 1984, 3, 1097-1102 oraz Mol-and CoII.BćoI. 1984, 4, 2306-2315) dla A.niger. Sondy ęligonukleotydowe pochodzą z sekwencji otaczających intron 2 : oligo AG-1 jest zlokalizowana w położeniu 3’ od intronu i posiada polarność identyczną z AG mRNA a oligo AG-2 znajduje się w górę od intronu 2 i w pozycji anty-równoległej do mRNA AG. Plazmid pAB6-1 zawiera gen AG we fragmencie HindIII o wielkości 14,5 kb (fig. 12).

Jako primery do reakcji ympliyikycei PCR stosuje się cztery syntetyczne oligęrukleotydy o następujących sekwencjach.

oligo 1:5’ -CTCTGCACGAATTCAAGCTAG-3’ (sekwencja specyficzna dla AG wokół miejsca EcoRI położona około 250 bp w górę od kodonu inicjacji ATC).

oligo 18-2 : 5’ -CGAGGCGGGGACTGCCATGCCAACCCTGTGCAGAC-3’ dojrzała fRaza j ¹ r idea 1 i aminokwAsu AG oligo 18-3 : 5’ - GTCTGCACAGGGTTGGCACTGGCAGTCCCCGCCTCG-3’,lider 18 aminokwasu AG dojrzała fitaza oligo 4:5’- GGCACGAGGATCCTTCAGCTT-3’ (sokwercey specyficzna dla fitazy, zlokalizowana w miejscu BamHI w pozycji 861).

Reakcję PCR prowadzi się według opisu oędyregę przez Saiki i wsp. (Sience, 1988, 239, 487-491) z małymi modyfikacjami (patrz przykład VIII).

167 790

Dla związania sekwencji AG z sekwencjami kodującymi fitazę prowadzi się dwie oddzielne reakcje PCR: pierwszą reakcję prowadzi się z pAB6-1 jako matrycą i oligonukleotydami 1 i 18-2 jako primerami w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 300 par zasad zawierającego cześć 3’ promotora AG i sekwencję liderową 18 aminokwasu AG flankowaną na końcu 3’ nukleotydami genu fitazy. Drugą reakcję prowadzi się stosując pAF 2-2S jako matrycę i oligonukleotydy 18-3 i 4 jako primery w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 600 par zasad zawierającego cześć 5’ genu fitazy flankowaną na końcu 5’przez 18 nukleotydów dla peptydu sygnałowego AG. Schemat tych amplifikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Tak wytworzone dwa fragmenty DNA oczyszcza się przez elektroforezę i strącanie etanolem i stosuje jako matryce w trzeciej reakcji PCR stosując oligonukleotydy 1 i 4 jako primery. W reakcji tej dokonuje się fuzji AG-fitaza. Wytworzony fragment DNA trawi się enzymami EcoRI i BaHI i klonuje do pTZ18R. Wytworzony plazmid fuzyjny sekwencjonuje się i oznacza symbolem p 18FYT1.

Pozostały region o wielkości 3,5 kb, w górę od promotora AG uzyskuje się przez trawienie plazmidu pAB6-1 za pomocą Kpn1 i częściowo EcoR1 i poddaje się ligacji z fragmentem EcoRI(BamHI o wielkości 1,1 Kb plazmidu p18FYTl i następnie klonuje się do miejsc KpnijBamHI w pTZ18R. Otrzymany plazmid pl8FYT2 jest przedstawiony na fig. 15.

Dodatkowe miejsce restrykcyjne HindIII wprowadza się przez insercję syntetycznego fragmentu:

5’ - AATTCAAGCTTG 3’

3’ CTTCGAACTTAA 5’ do miejsca EcoRI (flankującego gen amdS) w pAF 2-2S. Powstały plazmid, oznaczony jako pAF 2-2SH (fig. 14) stosuje się jako plazmid wyjściowy do wymiany sekwencji promotora fitazy na fuzyjne fragmenty DNA AG-fitaza pochodzące z reakcji PCR..

W końcowym etapie konstrukcji, p18FYT2 i pAF 2-2SH trawi się enzymem KpnI i częściowo BamHI. Izoluje się fragment DNA o wielkości 4,6 kb z p 18FYT2 oraz fragment DNA o wielkości 11 kb z plazmidu pAF-2-2SH, fragmenty te oczyszcza się przez elektroforezę w żelu, następnie poddaje się ligacji i przenosi do E.coli. Uzyskaną kasetę ekspresyjną oznacza się symbolem pl8FYT3 (fig. 15).

Konstruowanie plazmidu p24FYT3.

Fuzję promotora AG i sekwencji liderowej 24 aminokwasu AG z sekwencją kodującą dojrzałe białko fitazy prowadzi się metodą amplifikacji PCR w sposób opisany powyżej dla konstrukcji p18FYT3, z tym, że stosuje się inne primery. Syntetyzuje się dwa nowe primery o następującej sekwencji:

Oligo 24-2: 5’ - CGAGCCGGGGACTGCCAGGCGCTTGGAAATCACATT- 3’ dojrzała fitaza <—I—> lider 24 aminokwasAAG

Oligo 24-3 : 5’ - AATGTGATTTCCAAGCGCCTGGCAGTCCCCGCCTCG- 3’ lider 24 aminokwasu AG ( o r dojrzała fitaza

Prowadzi się dwie oddzielne reakcje PCR: pierwszą reakcję z zastosowaniem pAB- 6-1 jako matrycy i oligonukleotydów 1 i 24-2 jako primerów w celu amplifinacji fragmentu DNA o wielkości 318 bp zawierającego część 3’ promotora AG i sekwencję lidera 24 aminokwasu AG flankowaną na końcu 3’ przez 18 nukleotydów genu fitazy oraz drugą reakcję z zastosowaniem pAF2-eSjako matrycy i oligonukleotydów 24-3 i 4jako primerów w celu amplifikacji fragmentu DNA zawierającego część 5’ genu fitazy flankowaną na końcu 5’ przez 18 nukleotydów lidera 24 aminokwasu AG. Schemat tych amplikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Dla skonstruowania końcowej kasety ekspresyjnej p24FYT3 poprzez pośrednie plazmidy p24FYT1 i p24FYT2 stosuje się taką samą drogę i procedurę klonowania jaką zastosowano dla p 18FYT1 i p 18FYT2 dla uzyskania kasety ekspresyjnej p 18FYT3 (fig. 15).

Konstruowanie plazmidu pFYT3.

Fuzję promotora AG z sekwencja genu fitazy (zawierającą sekwencję liderową dla fitazy) prowadzi się również metodą reakcji PCR w sposób opisany dla konstruowania p18FYT3, za wyjątkiem użytych primerów. Generuje się dwa dodatkowe primery o następujących sekwencjach:

167 790

Oligo fyt-2 :5’ - AACAGCAGAGACGCCCATTGCTGAGGTGTAATGTG- 3’ lider fitazy promator AG

Oligo fyt-3 : 5’ - CATCATTACACCTCAGCAATGGGCGTCTCTGCTGTT-3’ promotor AG liitar fitazy

Prowadzi się dwie oddzielne reakcje amplifikacji PCR: pierwszą reakcję z zastosowaniem pAG 6-1 jako matrycy i olig-nukle-tfdów 1 i fyt-2 jako primerów w celu amplifikacji fragmentu DNA o wielkości 282 par zasad zawierającego część 3’ promotora AG flankowaną na końcu 3’ przez 18 nukleotydów lidera fitazy oraz drugą reakcję z zastosowaniem pAF 2-2S jako matrycy i oligonukleotydów fyt-3 i 4 jako primerów, w celu am-lifikacji fragmentu DNA zawierającego część 5’ genu fitazy (łącznie z liderem fitazy) flankowaną w końcu 5’ przez 18 nukleotydów promotora AG. Schemat tych reakcji amplifikacji jest przedstawiony na fig. 13.

Dla skonstruowania końcowej kasety ekspresyjnej pFYT3 poprzez pośrednie plazmidy pFYT1 i pFYT2 stosuje się taką samą drogę i procedurę klonowania jaką zastosowano dla p18FYT1 i p18FYT2 w celu uzyskania kasety ekspresyjnej p18FYT3 (fig. 15).

Ekspresja genu fitazy pod kontrolą promotora AG z A.niger.

Z opisanych powyżej kaset ekspresyjnych fitazy usuwa się sekwencje E.coli przez trawienie HindIII. Następnie, A.niger szczep CBS 513.88 (zdeponowany w dniu 10 października 1988 roku) transformuje się ilością 10 pg fragmentu DNA stosując procedurę opisaną w przykładzie IX. Izoluje się pojedyncze transformanty A.niger pochodzące z każdej kasety ekspresyjnej i zarodniki posiewa się na płytki selekcyjne z agarem z dodatkiem acetamidu. Z komórek rosnących przez 3 dni w temperaturze 37°C na płytkach agarowych na podłożu 0,4% ziemniaczano-glukozowym (Oxoid, W.Brytania) zbiera się zarodniki z każdego transformantu. Testy na wytwarzanie fitazy prowadzi się we wstrząsanych kolbach stosując następujące warunki wzrostu: Ilość około 1x10⁸ zarodników zaszczepia się na 100 ml pożywki hodowli wstępnej zawierającej w litrze: 1 g KH2PO4, 30 g maltozy, 5 g wyciągu drożdżowego, 10g hydrolizatu kazeiny, 0,5 g MgSOą. 7 H2) i 3 g Tween’u 80. Doprowadza się pH do wartości 5.5.

Po hodowli przez dobę w temperaturze 34°C na wstrząsarce rotacyjnej ilością 1 ml rosnącej hodowli zaszczepia się 100 ml podłoża do hodowli głównej zawierającego w litrze: 2 g KH2PO4, 70 g maltodekstryny (Maldex MDO3, Amylum), 12,5 wyciągu drożdżowego, 25 g hydrolizatu kazeinowego, 2 g K2SO4, 0,5 g MgSO4.7 H2O, 0,03 g ZnCk, 0,02 g CaCk, 0,05 g MnSO4.4 H2O i FeSO4. Doprowadza się pH do wartości 5,6.

Wzrost mycelium prowadzi się przez co najmniej 140 godzin. Wytwarzanie fitazy oznacza się w sposób podany w przykładzie II. Wyniki uzyskane dla kilku wybranych losowo transformantów otrzymanych z każdej kasety ekspresyjnej są przedstawione w tabeli 6.

Tabela 6

Wytwarzanie fitazy przez kilka szczepów A.niger CBS 513.88 transformowanych plazmidami zawierającymi gen fitazy z A.ficuum pod kontrolą promatora AG z A.niger w kombinacji z różnymi sekwencjami liderowymi

Kaseta ekspresyjna	Transformant	Aktywność fitazy (jednostek/ml)
1	2	3
p18FYT3	p 18FYT3 # 240	82
(promotor AG/lider	p 18FYT3 # 242	84
18 aminokwasu AG)	p 18FYT3 # 243	62
	p 18FYT3 # 244	43
	p 18FYT3 # 245	80
	p 18FYT3 # 246	82
	p 18FYT3 # 250	110
p24FYT3	p 24FYT3 # 256	8
(promotor AG/lider	p 24FYT3 # 257	30
24 aminokwasu AG)	p 24FYT3 # 258	13
	p 24FYT3 # 259	33

167 790 tabela 6 (ciąg dalszy)

1	2	3
	p 24FYT3 # 260	17
	p 24FYT3 # 261	28
	p 24FYT3 # 262	18
	p 24FYT3 # 265	12
pFYT3	p FYT3 # 205	50
(promotor AG/lider fitazy)	p FYT3 # 282	280
	p FYT3 # 299	96
	p FYT3 # 302	220
	p FYT3 # 303	175
	p FYT3 # 304	150
	p FYT3 # 305	150
	p FYT3 #312	140

Przedstawione w tablicy 6 wyniki jasno wykazują wysokie poziomy ekspresji fitazy w transformantach A.niger zawierających gen fitazy pod kontrolą promotora AG z A.niger. Najwyższe wytwarzanie fitazy obserwuje się przez szczepy z wektorem ekspresyjnym pFYT3 zawierającym sekwencję liderową fitazy. Podobne wektory ekspresyjne zawierające gen fitazy bez intronu dają po transformacji do A.niger poziomy ekspresji fitazy porównywalne z poziomami dla transformantów pFYT3 A.niger.

Ponadto, supernatanty hodowli transformantów pFYT3 # 205 i # 282 poddaje się elektroforezie w żelu IEF-PAGE w zakresie pH od 4,5 do 6. Jednakowe objętości supernatantów hodowli macierzystego szczepu A.niger i obydwu transformantów rosnących w identycznych warunkach podaje się na żel, rozwija i następnie barwi w sposób opisany w przykładzie IX. Macierzysty A.niger wytwarza bardzo niewielką ilość fitazy, która nie jest wykrywalna tą metodą. Szczepy pFYT3 #205 i #282 wytwarzają około 250 i 1400 razy więcej fitazy (porównaj poziomy fitazy podane w tablicy 4 i 5). Różnica ta jest wyraźnie widoczna na fig. 11. Wykrywa się kilka izo-form enzymu fitazy (oznaczonych gwiazdką). Barwienie ogólnego białka wykazuje, że intensywność pasm białka fitazy gwałtownie wzrasta, podczas gdy nie pojawiają się żadne większe pasma innych białek.

Przykład XI. Zwiększona ekspresja fitazy w A.ficuum i A.niger hodowanych na skalę przemysłową.

A.A. ficuum.

Prowadzi się hodowlę szczepu A.ficuum pAF 2-2S # 4 i A.ficuum NRRL 3135 w sposób podany w przykładzie I. Szczep transformowany wytwarza około 50 razy więcej fitazy niż szczep typu dzikiego.

Tabela 7

Zwiększone wytwarzanie fitazy przez transformanta A.ficuum zawierającego wielokrotne geny fitazy. Hodowlę komórek prowadzi się jak w przykładzie I.

Godziny po inokulacji	Aktywność fitazy A.ficuum NRRL 3135	(Jednostek/ml brzeczki fermentacyjnej/ A.ficuum pAF 2-2S # 4)
0	0	0
24	0	0
92	2	142
141	5	270

B. A. niger

Postępując w sposób opisany w przykładzie I prowadzi się hodowlę szczepu A.niger pAF 2-2S # 8 będącego transformantem szczepu A.niger CBS 513.88 i macierzystego A.niger.

167 790

Transformant ten wytwarza około 1000 razy więcej fitazy niż oryginalny macierzysty szczep A.niger (tabela 8).

Tabel a 8

Zwiększona ekspresja fitazy przez transformant A.niger (CBS 513.88) zawierający wielokrotne geny fitazy. Hodowlę komórek prowadzi się w sposób opisany w przykładzie I.

Godziny po inokulacji	Aktywność fitazy A.niger CBS 513.88	(Jednostki/ml brzeczki fermentacyjnej) A.niger pAF 2-2 #8
0	0	0
24	0	5
92	0,1	65
141	0,1	95

Przykład XII. Dla skonstruowania wektora pREPFYT3, za pomocą którego osiąga się jednocześnie ekspresję fitazy i zastąpienie genu Ag trawi się pFYT3 enzymem KpnI. Uzyskany liniowy fragment DNA KpnI poddaje się dwóm oddzielnym reakcjom ligacji. Prowadzi się ligację 1 z adaptorem KpnI-HindIII:

5’ - CGGGGA - 3’

3’ - CATGGCCCCTTCGA - 5’

KpnI HindIII * oraz ligację z adaptorem KpnI-HindIII , w którym po ligacji nie zachowuje się miejsce restrykcyjne dla HindIII:

5’ - CGGGGG - 3’

3’ - CTAGGCCCCCTCGA - 5’

KpnI HindIII*

Następnie produkt reakcji ligacji 1 trawi się częściowo enzymem HindIII. Po usunięciu fragmentu zawierającego amdS w procesie elektroforezy żelowej pozostały fragment DNA zamyka się do postaci kolistej przez ligację i przenosi się do E.coli. Uzyskany plazmid oznacza się symbolem pFYT3 amdS (fig. 16).

Produkt ligacji 2 również trawi się enzymem HindIII i izoluje się w procesie elektroforezy żelowej fragment DNA HindIII-HindIII , zawierający gen amdS o wielkości 3 kb. Fragment ten poddaje się ligacji z produktem częściowego trawieniapFYT3 amdS enzymem HindIII i przenosi się do E.coli. Plazmid zawierający gen amdS na końcu genu fitazy oznacza się jako pFYT3INT (fig. 17).

Dla wprowadzenia fragmentu SalI/HindIII o wielkości około 6 kb z pAB6-1, zawierającego 3’-flankującą sekwencję AG, plazmid pFYT3INT trawi się częściowo enzymem HindIII, poddaje ligacji początkowo z adaptorem: 5’ - AGCTAGGGGG - 3’

3’ - _TCCCCCAGCT - 5’

HindIII* SalI (w którym miejsce restrykcyjne HindIII nie pozostanie po ligacji) a następnie z fragmentem SalI/Hind III z pAB6-1. Po transformacji do E.coli uzyskuje się żądany plazmid pREPFYT3, zawierający sekwencję flankującą 3’AG we właściwym położeniu (fig. 18).

Ekspresja fitazy w A.niger przez zastąpienie genu AG.

Przed transformowaniem A.niger plazmidem pREPFYT3 usuwa się sekwencje E.coli występujące w tym plazmidzie przez trawienie HindIII i elektroforezę w żelu. Szczep A.niger CBS 513.88 transformuje się ilością 10 μg fragmentu DNA postępując w sposób w przykładzie IX. Selekcję i wzrost transformantów prowadzi się również w sposób opisany w przykładzie IX. Tylko niewiele z wyselekcjonowanych transformantów traci aktywność AG (około 20%). Dla sprawdzenia, że gen AG został rzeczywiście zastąpiony genem fitazy prowadzi się analizę Southerna chromosomalnego DNA pochodzącego z AG-ujemnych i fitazo-dodatnich transformantów.

167 790

Przykład XIII.

Kenjfrwatywneść genu fitazy w różnych rodzajach.

Dla określenia, czy gen fitazy odznacza się wysoką niezmiennością w różnych rodzajach drobnoustrojów, wykonuje się analizy Southerna chromosoma^ego DNA z 10 różnych rodzajów drobnoustrojów stosując jako sondę cDNA fitazy z A.ficuum. Analizy tego chromosomalnego DNA wykonuje się na rodzajach należących do grzybów nitkowców, drożdży i bakterii. Z każdej grupy wybrano jako przykłady ograniczoną ilość przedstawicieli: dla nitkowców- Peninillium chrysogenum i Aspergillus niger, dla drożdży - Sannharemynes cerfviaiae i Kluyveromyces lactis a dla organizmów prekariotynznych - rodzaje gram-dodatnie: Bacillus subtilis, Clostridium thermocellum i Streptemynes lividans oraz gram-ujemne- bakterię Pseudemenas aeruginosa.

Chromosomalny DNA o wysokim ciężarze cząsteczkowym z tych rodzajów trawi się osobno PvuII i BamH i następnie poddaje elektroforezie w 0,7% żelu agarozowym.

Po przeniesieniu na filtry nitrocelulozowe wykonuje się próby hybrydyzacji, przez dobę, przy niskiej mocy (6 x SSC, 50°C), ze znakowanym 3²P fragmentem 5’ cDNA fitazy (opisanym w przykładzie VIII). Filtry przemywa się w roztworze 6 x SSC w temperaturze pokojowej po czym wykonuje się radiogramy na kliszy czułej na promieniowanie X w czasie 18 godzin.

Jak to jest przedstawione na fig. 19 a i b, w prawie każdym słupie po elektroforezie obserwuje się oddzielne pasma, wskazujące na wysoki stopień homo^n genu fitazy w poszczególnych rodzajach mikroorganizmów.

167 790

Sekwencje N-końcowych aminokwasów

	A	B	c
POZYCJA
01			LEU
02			ALA
03			VAL
Ok			PRO
05		ALA	ALA
06		SER	SER
07		—	ARG
08	—**	—	ASN
09	GLN	GLN	GLN
10	SER	SER	SER
11	SER	SER	SER
12	—	—	GLY
13	ASP	ASP	ASP
1k	THR	THR	THR
15	VAL	VAL	VAL
16	ASP	ASP	ASP
17	GLN	GLN
18		GLY
19		TYR
20		GLN
21		ARG
22		PHE
23		SER
2k		G LU
25		THR
26		SER
27		HIS
28		LEU
29		ARG
30		(GLY)*
31		GLN
32		TYR
33		ALA
3k		PRO
35		PHE
36		PHE
37		(ASP)
38		LEU
39		ALA

Fig.1 A

167 790

Sekwencje aminokwasów peptydu

	A	B	C D E
POZYCJA
01	GLN	(TRP)*	MET	ALA	VAL
02	---	SER	MET	SER	VAL
03	GLN	PHE	GLN	SER	ASP
04	ALA	ASP	CYS	ALA	—
05	GLU	THR	GLN	GLU	ARG
06	GLN	ILE	ALA	LYS	PHE
07	GLU	SER	GLU	GLY	PRO
08	PRO	THR	GLN	TYR	TYR
09	LEU	SER	GLU	ASP	THR
10	VAL	THR	PRO	LEU	GLY
11	(ARG)	VAL	LEU	VAL	—
12	VAL	ASP	VAL	VAL	ALA
13	LEU	THR	ARG
14	VAL	LYS	VAL
15	ASN	LEU	LEU
16	(ASP)	SER	VAL
17	(ARG)	PRO	ASN
18	(VAL)	PHE	ASP
19	VAL	(CYS)	ARG
20	PRO	(ASP)
21		LEU
22		PHE
23		THR

Fig ,1B

N-koniec białka o masie cząsteczkowej 100 kDa

POZYCJA
01	VAL
02	VAL
03	ASP
04	GLU
05	ARG
06	PHE
07	PRO
08	TYR
09	THR
10	GLY

Fig .1C

167 790

Peptyd C Peptyd B Peptyd A

Możliwe kodony ’

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 : Leu-Ala-Val-Pro-Ala-Ser-Arg-Asn-Gtn-Ser-Ser-Gly-Asp-Thr-Val-Asp : ' Ala-Ser-***-***-Gln-Ser-Ser-***-Asp-Thr-Val-Asp-Gln-Gly-Tyr-Gin: ***-Gln-Ser-Ser-***-Asp-Thr-Val-Asp-Gln i'-CTG-GCG-GTG-CCG-GCG-TCG-CGG-AAT-CAA-TCG-TCG-GGG-GAT-ACG-GTG-GAT-CAA-GGG-TAT-CAAA

T c

TTA

G

AGT AGA C G

AGT AGT C C

ΛΒ1024 :

AB1065 :

AB1066 : AB1067 : AB1068 : AB1069 : AB1070 :

AB1226 :

AB1227 :

3‘-CGG-CAG-GGG-CGG-TCG-GCG-TTG-GTC-TCG-TCG-CCG-CTG-TGG-CAG-CTG-GTC

3'-CCG-CTG-TGG-CAC-CTG-GTC

A

3‘-CAG-CTG-GTC-CCG-ATG-GTC CA A

3'-CAG-CTG-GTC-CCG-ATG-GTC C A T A A T A T

AB1298 :

Peptyd B

3'-CTG-TGG-CAG-CTG-GTG-CCG-ATG-GTC ACCATCAT dalszy)

22 23 24 25 26' 27 ' 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 (Arg)-Phe-Ser-Glu-Thr-Ser-His-Leu-Arg-(Gly)-Gtn-Tyr-Ala-Pro-Phe-Phe-(Asp)-Leu-Ala (N-koniec fitazy ciaa

23 24 25 26^y 27 '28

CGG -TTT-TCG-GAG-ACG-TCG-CAT-CTG-CGG- GGG -CAG-TAT-GCG-CCG-TTT

T

T

C

AGG

A

C

T c

AGT

C

A

T

C

AGT

C

TTT- GAT C C

-CTG-GCG

AB1388 :

TTG AGG A A

A

T

C

TTG

A

3·- CCG -GTC-ATG-CGG-GGG-AAG-AAG- CTG -GA C CC A

Fig .2A

167 790 χ CU —* cu cs *- 4) CU Z cs cs cs cs

X <

□

Ό — CU o o <

<

cs

CJ x

o

Λ

•o

Ol

X

CJ

CS

o

CS

<

X

CJ

LA

Ui

<

X

o

u

CJ

CU

CS

CJ

CU

Q_

u

^rf

«·/

1

t

•

1

1

χ·\

o

CS

<

X

CJ

u

CS

< k U

CJ

o

u

CJ

>4

CJ

CS

o.

CJ

AJ

X

<

1

1

*»*

V>rf

CS

<

X

CJ

l

t

«

oo

<0

X

u

CS

< X CJ

CJ

w-

>

CS

Ki

x;

CJ

CS

1

ł

cu

X

<

X

rf·^

1

—t

CS

<

X

CJ

4)

X

£J

CS

<0

X

CU

JO

X

<

>

CS

CU

CL

X

<

<

t

t

oi

CS

<

X

CJ

CS

<c

3

CS

< X CJ CS <

CS

N.

u

CS

CS

4>

X

X

<

<

CJ

<

CU

CJ

X

CS

X·*

1

1

•

1

1

Z>

rf*\

Z-*

Oi

CS

<

X

CJ

CS

<:

CL

X

CJ

CS

u

CS

CS

o

Ui

<

X

<

CJ

<

CU

<

CS

CJ

%Mrf

S-*

u

CS

<

ł

«

CJ

X

<

Ui

X

CJ

CS

o

>

CS

CJ

Q_

X

CJ

CJ

X

<

o

(Λ

<

*-rf

>-rf

<

CS

1

1

•

•

I

4J

X

CJ

CS

w <

5

1 O

1 O

<

X

CJ

X

X

X

U

CJ

CL

X

CJ

X

CJ

O.

CJ

LA

Ui

<

t

<

CS

c_

CS

<

X

CJ

X

s-»

<5

41

CJ

CS

1

1

CO

X

<

o

<

X

U

1

1

*4*

<0

X

□

CS

<

X

CJ

CS

>

o

LA

4)

X

X

1

I

_J

CJ

X

□

CS

<

X

u

cs <

1

|

Ki

X

X

Ui

CS

<

_J

u

X

>4

X

<

1

1

<—

_J

<

o

<

X

o

1

«

CU

<0

X

U

CS

<

X

CJ

W“

>

CS

Ki

-C

CJ

1

I

V“

X

<c

cj cs

O)

CS

<

X

CJ

CS

<

O.

CJ

CS

u

CS

CS

CU

CO

2

X

<

u

<

<

CJ

X

X

«

1

•

c.

CS

<

X

CJ

X

CJ

CS

<

X

CJ

CJ

4)

CJ

CS

co

X

<

CO

X

<

Τ-

>

CS

CJ

1

S-rf 1

1 L_

1 CS

<

X

CJ

CS

CJ

CS

<

X

CJ

Ο

£

CJ

CS

o

<0

X

X

<

X

T“

>

CS

1

1

•

1

1

U

CS

<

X

CJ

X

CJ

CS

CJ

□

CS

<

X

CJ

CS

<

4)

CJ

CS

CS

CJ

4ł

X

X

o

CO

X

<

<

X

O

_J

CJ

k

1

ł

•

1

1

U

CS

<

X

CJ

CS

CJ

O

CS

<

JC

CJ

CS

CJ

<

co

X

<

X

J

Q_

u

CJ

ł

t

•

1

1

•

L.

<3

<

X

CJ

X

CJ

CS

CJ

3

CS

<

CS

CJ

4>

U

CS

CS

CJ

<

<

X

CO

X

<

<

X

X

CS

CS

CS

<

«

1

•

1

1

•

4)

<

X

o

CS

c

CS

<

CS

CJ

X

<

«rf

<

CS

o

<

X

ό

CS

CJ

CS

«

1

•

1

1

•

U

CS

<

X

CJ

CJ

3

CS

<

X

CJ

o

X

J=

CJ

CS

<

X

LA

X

<

X

LA

CS

CS

CJ

i

1

•

ł

1

•

O.

X

CJ

CS

CS

<

CJ

X

V)

<

X

—rf

o

X

*4

<

CS

CJ

*4·

<

CS

cs

1

1

•

t

I

•

4)

X

CJ

CS

c

CS

<

CJ

X

jC.

X

<

<

>«

Ki

CL

X

<

KI

CS

CJ

CJ

1

i

1

t

I X

CJ

cs

4»

CS CJ

<

X

CJ

X CS

CJ

Ki

X

X

CS

CU

co

X

<

CU

X

CJ

1

1

1

1

•

rf*\

c

CS

<

CJ

X

CL

CS

«rf

<

X

u

CS

CS

CJ

CS

*-

X

X

Ό

-να.

OJ

CL

CA o

CU ca <

QQ

Ό

o.

ω

CL o

o

CU co <

<

<

cj o o

cs c* o

cu t-» ca <

KJ cs < x o ta <

X cs < —* o CS CS

X

OT (J < t- CS < cj

O X < KI X X o cs o <

C X cj

Ui <

< <

X X

c. cs < x o O JZ u CU X <

φ < χ cj CO «— x PU —· <

Z*> o ω x χ X cs CJ cj x

Fig. 2B cs <

167 790

Μ	>	Ο Ο	<	>—	Ο
04	ο	(J
	Ω_	>—	Ο
04	ω	<
04	<	Ο
	σ>	ο	<	μ-	Ο	ο
	(_	ο				ο
04	<	ο				<
	φ	►—	Ο
Ο	JO	κ-
04	0.	>—
	□	ο	<
Ο*	—*	<c
*“	ο	ο
	£	ο	<
co		<
	u	(—)
	u	ώ	<	Η-	ο	Η—
Ν.	0)	(J				ο
	ω	>—				<
	φ	►—	ŁJ
Ο	χ:	κ-
	ο.	Η-
	£	Ο	<
ΙΑ	—*	<
*“	ο	Ο
	Μ	C3	<
Μ-	>*	<
*—	-J	<
	□	Ο	<
ΚΊ	—	<
▼—	Ο	ο
	£	ο	<
04		<
ν·	Ο	ο
	U	ο	<	►—	ο
r~	-C	CJ
**	h-	<
	U	ώ	<	Η-	ο	μ-
Ο	Φ	ο				ο
·“	<Λ	Η-				<
	£	Ο	<
		<
Ο*	Ο	Ο
	Ο	ο	<	Η-	ο
	ί-	<_)
00	α.	ŁJ
	φ	<	Η-	U
		Η-
Ν-		<
	<0	Ο	<	Η-	u
		Ο
>ο	<	Ο
	flj	ώ	<	>—	Ο
	^-*	ω
ΙΑ	<	ο
	X	ο	<	μ-	ο
	μ/	ο
	ο	ο
	ι_	ί—	ω
	>.	<
m	Η—	Ι-
	U	Ο	<	Η-	ο	Η-
04	Φ	ω				Ο
<Λ	h-				<
	Φ	►—	ο
	-C	►—
	CL	Η-

I ω

ο ο

ο

ΙΑ

CJ	ο
ο	ο
ό	ο
<	<
<	<
ο	ο	k—
k—	Η-
ο	Ο
υ	CJ
>—	k—
Ο	ο
ο	ο	<
ω	CJ	ο
Η·	k—	<
Ο	ο
<	<
<	<
α	ο
»—	κ-
α	ο
CJ	ο

I I

ο	CJ Η-
►—	k—
(J	Ο
ο	CJ
Η·	ί-
Ο	Ο
α	2
ο	ΓΑ
>—
ώ
cj
Η·
α		CJ
Η-		Η-
Ο		Ο
ώ		CJ
ο		ο
ο		CJ
ο		<
<		<
ί-		ί-
ο		ο
ο		ο
ο		CJ
ώ		ο
ο		ο
ο		ο
ο		ό
(J		υ
ο		ω
ο		ώ
k—		>—
<		<
		«.
ΓΑ		FA

ο ο

Η- < Ο

Η- < Ο

C0

CT i_i_ >s

C ο

Ό

Ο

Js:

ΙΑ	ο	0-
04	OJ	04
Ο	ο	Ο
τ~		<—
C0	CO	C0
«κ	<	<

167 790

Nru I

Nco I NcoI

ΒατηΗ I ΒατηΗ I

AF201

ΒατηΗ I Nrul

BamH I

Sal I Ρνυ 11 Sal I Sal I

ΡνυΙΙ Sali Sali

-».

mRNA fitazy

Klon #

Nru I Pvu II

BamH I

Sal I pAF 78-1 pAF2-2 pAF2-3 pAF2-4 pAF 2-5 pAF2-6 pAF2-7 pAF2-8

Fig. 4

Fig. 5

167 790 gtcgacttcccgtcctattcggcctcgtccgctgaagatccatcccaccattgcacgtgg

Sali

GCCACCTTTGTGAGCTTCTAACCTGAACTGGTAGAGTATCACACACCATGCCAAGGTGGG

ATGAAGGGGTTATATGAGACCgTCCGGTCCGGCGCGATGGCCGTAGCTGCCACTCGCTGC

TGTGCAAGAAATTACTTCTCATAGGCATCATGGGCGTCTCTGCTGTrCTACTTCCTTTGT początek translacji

ATCTCCTGTCTGGGTATGCTAAGCACCACAATCAAAGTCTAATAAGGACCCTCCCTTCCG początek intronu

AGGGCCCCTGAAGCTCGGACTGTGTGGGACTACTGATCGCTGACTATCTGTGCAGAGTCA koniec intronu

CCTCCGGACTGGCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGG

GGTATCAATGCTTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTTCTCTC

TGGCAAACGAATCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTTCGCTC

AGGTCCTCTCCCGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATACTCCG

CTCTCATTGAGGAGATCCAGCAGAACGCGACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGA

AGACATACAACTACAGCTTGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGAGCTAG

TCAACTCCGGCATCAAGTTCTACCAGCGGTACGAATCGCTCACAAGGAACATCGTTCCAT

TCATCCGATCCTCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCT

TCCAGAGCACCAAGCTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCG

BamHI

ACGTGGTCATTTCCGA6GCCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTG

TCTTCGAAGACAGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAATTTCACCGCCACGTTCGTCC

CCTCCATTCGTCAACGTCTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGACACAGAAG

Fig-6

167 790

TGACCTACCTCATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCA

Sali

AGCTGTCCCCCTTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCC

AGTCCTTGAAAAAGTATTACGQCCATGGTGCAGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCAGGGCG

TCGGCTACGCTAACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCA

GTTCCAACCACACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCTTTCCGCTCAACTCTACTCTCTACG

CGGACTTTTCGCATGACAACGGCATCATCTCCATTCTCTTTGCTTTAGGTCTGTACAACG

GCACTAAGCCGCTATCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGT

CTGCTTGGACGGTTCCGTTTGCITCGCGTrTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCGG

AGCAGGAGCCGCTGGTCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGGGTGTC

CGGTTGATGCTTTGGGGAGATGTACCCGGGATAGCTTTGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTA

GATCTGGGGGTGATTGGGCGGAGTGTTTTGCTTAGCTGAATTACCTTGATGAATGGTATG koniec translacji

TATCACATTGCATATCATTAGCACTrCAGGTATGTATTATCGAAGATGTATATCGAAAGG

ATCAATGGTGACTGTCACTGGTTATCTGAATATCCCTCTATACCTCGTCCCACAACCAAT

CATCACCCTTTAAACAATCACACTCAACGCACAGCGTACAAACGAACAAACGCACAAAGA

ATATTTTACACTCCTCCCCAACGCAATACCAACCGCAATTCATCATACCTCATATAAATA

CAATACAATACAATACATCCATCCCTACCCTCAAGTCCACCCATCCTATAATCAATCCCT

ACTTACTTACTTCTCCCCCTCCCCCTCACCCTTCCCAGAACTCACCCCCGAAGTAGTAAT

AGTAGTAGTAGAAGAAGCAGACGACCTCTCCACCAATCTCTTCGGCCTCTTATCCCCATA

Fig .6 (ciąg dalszy 1)

167 790

CGCTACACAAAACCCCCACCCCGTTAGCATGCACTCAGAAAATAATCAAAAATAACTAAG

AAGGAAAAAAAAGAAGAAGAAAGGTTACATACTCCTCTCATACAAACTCCAAGACGTATA

CATCAAGATGGGCAATCCCACPATTACTGATATCCATCTATGAACCCATTCCCATCCCAC

GTTAGTTGATTACTTTACTTAGAAGAAGAAAAAGGGAAGGGAAGGGAAAGAAGTGGATGG

GATTGAGTTAGTGCTCACCGTCTCGCAGCAAGTTrATATTCTTTTGTTTGGCGGATATCT

TTCACTGCTCCTGCTGGACGTTGTCACGGGGTGGTAGTGGTTGGCGGTGGTGAGGGTCCA

TGATCACTCTTGGTTTGGGGGGTrGTTGTrGTCGTTGTTGTTGTTGTTGGGTGGGCATTT

TCTTTTCTTCACTTGGGGATTATTAITTGGAATTGGTTAGnTGAGTGAGTGGGTAATAT

TGAATGGGTGATTATTGGGAATGAAGTAGATTTGGCTATGAATGGTTGATGGGATGGAAT

GAATGGATGGATGAATAGATGGAGGCGGAAAAGTCAGGTGGTTTGAGGTTCGGATTATTA

TCTTTGTGCCTGAGGCATCACTCTCCATCTATGITGTTCTTTCTATACCGATCTACCAGA

GCTAAGTTGACTGATTCTACCACAGTGCACAATAAGTATGTACTTATTTCATTTAGAGTA

TTTAGATTAACCCGCTGTGCTATTTGCCGTAGCTITCCACCCAATTTCGAAGTTCGAAGA

ATTAAAACTCATCCTACAGTACAGAATAGAAGTAAAAGGAGAAGAGAAAAACAAGATAAT

ACAACCAGTCCAGGTCCATTCTAGATCTCGAATGACCACCAAATAAGAAAGCAACAAGCA

AGTAAGCAAAGCATAAGTCTAAATGAACGCCAATAACTTCATCGCCTGCCTTTGAAACTG

AACGCTATGCACGAATGGCTCGAAATGATTCCCTTAACTCCGTAGTATTGAGAGTGAGAG

GAAAAGAAAAAAAGAGACAGAAAAGCTGACCATGGGAAAGAAGCATGATCAGTCGGGAAT

Fig .6 (ciąg dalszy 2)

167 790

GGATCTGCGGGTTGAGATAGATATGAGTTGCCTCGCAGATCCGGTGACAAGATAAGAGA.ą

TTGGGAGATGTGATCAGCCACTGTAACTTCATCAAGCATCGACATTCAACGGTCGGGTCT

GCGGGTTGAGATGCAAGTTGAGATGCCACGCAGACCCGAACAGAGTGAGAGATGTGAGAC

TTTTGAACCACTGTGACTTCATCAAGCATCAAAACACACTCCATGGTCAATCGGTTAGGG

TGTGAGGGTTGATATGCCAGGTTCGATGCCACGCAGACCCGAACCGACTGAGAAATATGA

AAAGTTGGACAGCCACTTCATCTTCATCAAGCGTAAAACCCCAATCAATGGTAAATCGAA

AACGAATCTGCGGGCTGATGTGGAAATGAGACGAATGCCTCGCAGATTCGAAGACACGTA

AATCGAGATGAACAATCACTTTAACTTCATCAAAGCCTTAAATCACCCAATGGCCAGTCT

ATTCGGGTCTGCGGGTTGAGGTTCCTGTTGAGATGCCACGCAGACTGCGAACATGCGATG

CATTATAAGTTGGACGAGTGTAGACTGACCATTGATAACCGAGATAAACAATCACTTCAA

CTTCATCAAAGCCTTAAATCACTCAATGGCCAGTCTGTTTGCGGTCTGCGGGCTGATACC

CAAGTTGCGATGCCACGCAGACTGCAAACATTGATCGAGAGACGAGAAAAACAACGCACT

TTAACTTCAACAAAAGCCTTTCAATCAGTCAATGGCCAGTCTGTTCGCGGTCTGCGGGCT

GATATGCGAGTTGAGGTGCCTCGCAGACCGCGAACATGCGATGTAATTTCTTAGTTAGAC

GAGTGCCTGGCCATTGAGAAACGAGAGAAACAACCACTTTAACTTCATGAAAGCCTTGAA

CTACTCAATGACCCGTCTGTTGGCGGTCTGCGGGCTGATATTCGAGTTGAGATGCCACGC

AGACCGCCAACATGCGATGTATCATGTAAGITAGATGAGTGACTGGCCATTGAGAAACGA

GAGAAACAACCACACTTCATGAGAGCCTTAAATTATTCAATGACCAGTCTGTTCACGGTC

Fig .6 (ciąg dalszy 3)

167 790 tgcgggttggtatgcgagtcgaggtgcctcgcagaccgcgaacatgcgatgttttcgatg

GACGAGTGAAGCCTGACGATCGAGAACTATCTCAGTTGGGTTGGCCATTCGGCTGGCCGT

TGGGTTTAGTATTAGGATCGTęAGGTTTGTCCGATGGAACGTrCCGTTTGCGTGCGTTGG

CGCGACGAGCCCTCTCCTCGGCGTGATTCTGAAATTCTGCAATCAGGGCAGCCGCAGCAC

GGCGACGGGACGTCCTCCAGGAGCTGTGTTGAAGTTTCGGGGTGGCGGTCCAGAAGGGGG

AGTTACATTAAAAGCCTCATAGATGTCTTTGGGTGGTTCCGGGGGGCCCATCGCAAGATC irCTGGAGTTGTGCGTCTGATCATCTCTTGAGTGTAATTGCGACGCAGACCGAGCTTCAG

GATTTTGGAAGGGCTGGATCGCTCCTGCTGACTCTTTCCCTCAGCGGGCTTCGTCTCGGC

AGTCTTCATTTCGGCGGGCTGATCTTCCATCTCAGAATGGGATCGCTTTCTGGTCGCTGC

ACCCGCTCCTCCCTTCAAGGTCAGCTTGATGCGCAGCGTCTTGGGCGGCTCAGCTGGTGG

AGTTGGTTCCGGCTCTGGCTCCCTCCGGCGTCGCTTGGGCACTTGAGTAGTCTCTGAGGC

TTCGCCGCGGCGCCGTTTGCGAGTCGGCTCCTTGGTCTCTTTGGCCTCTTTCACTTCACC

TGGACCGTCTTTCGGGGCGGTTTCATCGTGCTGAGCGATCAAGGTTTGGATGTAGGCAGC

CGGCATCATTCGATCAACGGCAATTCCTCTCTTGCGGGCCTCCTCCCGAGCCTTGATTGT

CGCCTTGACCTCGTCCACGTTTTCGAAGAAGAAAGGCATCTTGTTATCCTGAGGCAAGTT

GCGCTCTCCCATGCGSCGGGATATCCGAAGATGCGGTCCTTCTCGAACTGTTCATGAGAC

TTCAGACGAATTGGAGGCTGGGGGAGCĄATTTGTCTCCGTAGGTGTTGTTAGGGCGGAAC

GAAGAATAGCCTTCGCCTACAACGACAAGCTCTTCGCCAAATTTATTTTTTTGGCCTGTA

Fig.6 (ciąg dalszy 4)

167 790

AAAACGAACCCATCCTCGTCAGTCCACCGGTGCGTCTCGGACGTAGAGATTGGCTTACTT

ATTCCCTCAACGCCGATCTCTGCCTGGGGCTGCGCTTCGGATGCGGCCTCGGTCACGGC'r

CCGCCTCGGACTGCACCGCTGęAGTTTCGGTCTTCTTCTCCTGCTTCTCCAGGTACTCCT

TGCGTAACTCTTCGATCAGCCTCGGCTTCCGATGACTGCTCAAATTCTGGAGCAACAGCT

GCCGCGGCCAGGTCAAGCAGGCGGTTTGCTAAAACTGCCCATTTTCCATCGACACCTGCC

TCCGACGCCTGTGCAAAACCAGCTGTTTTCGCATTGGCCTGTTTGTTGGCACGCGTCTTC

TTGACTGCTGCCTTGCCCTTTACTTCCTTGAGAGCAGACTCTGGCTTAGATGATGGTGCA

CGGTTTCTGCGGAAGCGCCGCTCAGATrCCAAAGATTCCATAGCTrTAATGGTAGGCTTT

CTGGTTCTTCCAGAAGTGCGCGCAGCTGACGTAGTGGTTGAGTAGCTGGCAGTTGGGGAT

CCTGGGCCCTCATTGGAACCATCAAGACCAAAITTGTTTCCATACATATCAGCATGGTAT

TCAAAAGGAAAACTTTCGCCGTACGGAGTACTGCGTTCGATTCCGGGTGTATCCAAGTCG

TATCCAGACATGGTGTCGAATTCAGCCTTGCTGTCAAGAGCAGGGGTACTTTCAATGCTG

TCAGCAACCACGCGGCCAAAGGGCGTCTTCGGGAAAGAAGGTGTTTCAAGAGAAGCGTCA

TCCACGGCCTGGCTTGCGGCGTTGATTGCAGACTTTCGAGTAGATCGCTGAGGTCGCGAA

CTGGTTCGAGTAGCAACCTGTGAATTGGCAGCCTTGTGACTGCTTCGATTCACTGCAGAG

ACGGAGTAGACTGCAGTGATTTGGAATTCTGAGTCGCAGCCATTCTGGATTTGCGTTCGG

CGCGACGAGATCTCGCAGTCGTGGTACGAGGAGTAGAGCGAGGCTGCGTAGCAGTGTTGC

AAGCTTGGTGCTAGCCTCCTGGGCTTCAGCAGCTTCAGCAGTGGTGGCAGACGCAGCAGA

Fig · 6 (ciąg dalszy 5)

167 790

6481 attagcggagctttatcggctttgccgctctgagcgttgggagtagaagtgagagaagag

6541 GTAGAGTCCACGGAAGAAGTCTTCTCGCTGTTCTCAAAGCCGTTCAGCTTTGCTGGCATA

6601 GACTTACGCGTCTTGCGGCTGTTGGAAGCGGAAGAGTTCATGGCGGGAGAGGAGACGTTA

6661 GAAGTAGAC ATGGTGGGGTTTGTTGACGGGTTTTGAGTAAC AAGAGACTTGCGTCGATCT

6721 TTGAGTGTTCTrGACAGAAAGTTATGCAACGTCGAC Sali

Fg .6 (ciąg dalszy 6) locus fitazy

BamHI

Sali

	Ndel
		3amH I	3amHI
			3vu	.1	Sali
				Ndel		Ncol
				Sali 1		Sma I J

Ncol ^νυΙΙ ΡνυΙΙ Ρνυ II ΡνυΙΙ

BamHI

Scal

BcoRI

Nrul

Pstl

EcoRI

Sali

Sma I

Pstl

Sali

BamHI

Sali =>

- fitaza Fig·7

167 790 atgggcgtctctgctgttctacttcctttgtatctcctgtctggagtcacctccgc-ac^g

-23MGVSAVLLPLYLLSGVTSG L

GCAGTCCCCGCCTCGAGAAATCAATCCAGTTGCGATACGGTCGATCAGGGGTATCAATGC avpasrnqsscdtvdqgyqc

-1 +1

121 TTCTCCGAGACTTCGCATCTTTGGGGTCAATACGCACCGTTCTTCTCTCTGGCAAACGAA

18FSETSHLWGQYAPFFSLANE

181 TCGGTCATCTCCCCTGAGGTGCCCGCCGGATGCAGAGTCACTTTCGCTCAGGTCCTCTCC

38svispevpagcrvtfaqvls

241 CGTCATGGAGCGCGGTATCCGACCGACTCCAAGGGCAAGAAATACTCCGCTCTCATTGAG 58RHGARYPTDSKGKKYSALIE

301 GAGATCCAGCAGAACGCGACCACCTTTGACGGAAAATATGCCTTCCTGAAGACATACAAC

78eiqqnattfdgkyaflktyn

361 TACAGCITGGGTGCAGATGACCTGACTCCCTTCGGAGAACAGGAGCTAGTCAACTCCGGC

98yslgaddltpfgeqelvnsg

421 ATCAAGTTCTACCAGCGGTACGAATCGCTCACAAGGAACATCGTTCCATTCATCCGATCC 118IKFYQRYESLTRNIVPFIRS

481 TCTGGCTCCAGCCGCGTGATCGCCTCCGGCAAGAAATTCATCGAGGGCTTCCAGAGCACC 138SGSSRVIASGKKFIEGFQST

54l AAGCTGAAGGATCCTCGTGCCCAGCCCGGCCAATCGTCGCCCAAGATCGACGTGGTCATT 158KLKDPRAQPGQSSPKIDVVI

601 TCCGAGGCCAGCTCATCCAACAACACTCTCGACCCAGGCACCTGCACTGTCTTCGAAGAC 178SEASSSNNTLDPGTCTVFED

661 AGCGAATTGGCCGATACCGTCGAAGCCAAITTCACCGCCACGTTCGTCCCCTCCATTCGT 198SELAD-TVEANFTATFVPSIR

721 CAACGTCTGGAGAACGACCTGTCCGGTGTGACTCTCACAGAC ACAGAAGTGACCTACCTC 218QRLENDLSGVTLTDTEVTYL

781 ATGGACATGTGCTCCTTCGACACCATCTCCACCAGCACCGTCGACACCAAGCTGTCCCCC 238 MDHCSFDTISTSTVDTKL SP ia .8

167 790

841 TTCTGTGACCTGTTCACCCATGACGAATGGATCAACTACGACTACCTCCAGTCCTTGAAA

258 FCDLFTHDEWINYDYLQSLK

901 AAGTATTACGGCCATGGTGCAGGTAACCCGCTCGGCCCGACCCAGGGCGTCGGCTACGCT

278 KYYGHGAGNPLGPTQGVGYA

96l AACGAGCTCATCGCCCGTCTGACCCACTCGCCTGTCCACGATGACACCAGTTCCAACCAC

298 NELIARLTHSPVHDDTSSNH

1021 ACTTTGGACTCGAGCCCGGCTACCTTTCCGCTCAACTCTACTCTCTACGCGGACTTTTCG

318 T L D S S P A T F P L N S T L Y A D F S

1081 CATGACAACGGCATCATCTCCATTCTCTTTGCTTTAGGTCTGTACAACGGCACTAAGCCG

338 H D N G I I S I L F A L G L Y N G T K P

1141 CTATCTACCACGACCGTGGAGAATATCACCCAGACAGATGGATTCTCGTCTGCTTGGACG

358 LSTTTVENITQTDGFSSAWT

1201 GTTCCGTTTGCTTCGCGTTTGTACGTCGAGATGATGCAGTGTCAGGCGGAGCAGGAGCCG 378 VPFASRLYVEMMQCQAEQEP

1261 CTGGrrCCGTGTCTTGGTTAATGATCGCGTTGTCCCGCTGCATGGGTGTCCGGrrTGATGCT 398 LVRVLVNDRVVPLHGCPVDA

1321 TTGGGGAGATGTACCCGGGATAGCTITGTGAGGGGGTTGAGCTTTGCTAGATCTGGGGGT 4i8lgrctrdsfvrglsfarsgg

1381 gattgggcggagtgttttgcttag 438DWAECFA*

Fig. 8 (ciąg dalszy 1)

167 790

Sali

A

167 790

Fig .10

167 790 '•2EŻ· *

Fig.11

167 790

Hindlll

Fig.12

167 790

	Fuzje genów AG i fitazy metodą PCR
-ΡΑΒ6-Ί- część 3' promotora AG		- PAF2-2S - część 5‘ fitazy
1 1 Primery i? stosowane do \			I ATG	I 3amH I
pl8FYT 1	— 1 18-2			18-3	4
p24FYT 1	— 1 24-2			24-3	4
pFYT 1	—* 1 fyt-2			fyf-3	4
	I PCR			I PCR
	▼ E ATG			▼ ATG	BamHI

...i ' PCR

EcoRI

ATG

B -i

EcoRI ATG

BamH I

pTZ (EcoRI /BamHI)

P18FYT1 /p24FYT1 /pFYT1

Fig.13

167 790

Fig.14

EcoRI

Fig.15a

167 790

Fig. 15b

Hind III EcoR IlEcoRI

Fig ,15c

167 790

Hind III

Fig.18

167 790

Fig .19 A

167 790

1234567 89 10 11 ki (ozasady 12 r

6 - ''

1.6 -

Fig .19 B.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 150 zł

Claims (17)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania peptydu lub białka o aktywności fitazy, znamienny tym, że pochodzącą ze źródła grzybowego fitazę oczyszcza się do aktywności właściwej powyżej 50 jednostek/mg białka, oczyszczoną fitazę poddaje się fragmentacji, za pomocą CNBr, oznacza się sekwencję N-końcowych aminokwasów otrzymanych fragmentów białkowych, przygotowuje się na drodze syntezy kompleks specyficznych sond oligonukleotydowych w oparciu o oznaczoną sekwencję aminokwasową, identyfikuje się przez hybrydyzację klony DNA z banku genomowego, prowadzi się hodowlę zidentyfikowanych klonów i wyodrębnia się sklonowaną sekwencję DNA, sekwencję tę przyłącza się do promotora i ewentualnie sekrecyjnej sekwencji liderowej i tak otrzymaną konstrukcję ekspresyjną wprowadza się do wektora i tak otrzymanym wektorem, zdolnym do transformowania komórki gospodarza, transformuje się komórkę gospodarza, po czym prowadzi się hodowlę tak otrzymanej transformowanej komórki gospodarza, usuwa się komórki i wyodrębnia się z pożywki otrzymany peptyd lub białko o aktywności fitazy.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, stosuje się sekwencję DNA pochodzącą z Aspergillus.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, tym, że stosuje się sekwencję DNA pochodzącą z Aspergillus ficuum lub Aspergillus niger.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się promotor AG.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się homologiczną sekwencję liderową fitazy.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 18 aminokwasu AG.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 24 aminokwasu AG.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się homologiczny promotor fitazy.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się homologiczną sekwencję liderową fitazy.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 18 aminokwasu AG.
11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że stosuje się sekwencję liderową 24 aminokwasu AG.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wektor stosuje się plazmid.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, żejako wektor stosuje się plazmid wybrany z grupy obejmującej pAF 28-1, pAP 2-25, pAF 2-2, pAF 2-3, pAF 2-4, pAF 2-6, pAF 2-7, p18FYT 3, p24FYT3 i pPXT3.
14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza wybraną z grupy obejmującej bakterie, drożdże i grzyby.
15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza wybraną z grupy obejmującej Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Mucor, Bacillus, Kluyveromyces i Saccharomyces.
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że stosuje się komórkę gospodarza wybraną z grupy Aspergillus niger, Aspergillus ficuum, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae, Trichoderma reasei, Mucer michei, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cervisae, Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis.
17. 17. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że peptyd lub białko o aktywności fitazy wyodrębnia się z pożywki metodą chromatograf.

    167 790