KR20040064715A - 신규한 피타제 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 피타제, 특히, 진균 유래의 피타제 및 그 각각의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 진균 페니실리움 속, 특히 페니실리움 sp. CBS109899 균주로부터 유래한 신규한 피타제 및 이 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 피타제를 조직내에서 발현시키는 형질전환 숙주 유기체에 관한 것이다.

Description

신규한 피타제 및 그 제조 방법{Novel phytases and method for producing these phytases}

인은 모든 유기체의 생명에 필수 성분이다. 특히, 농장 동물 사육자에게는 가축들이 최적의 성장과 발전을 하기에 충분한 양의 인을 가축들이 반드시 섭취하도록 하는 것이 가장 중요하다. 대부분의 농장 동물들은 식물에 기초한 사료 조성물을 공급받는다. 이 식물들은, 저장 화합물 형태인 피트산 형태로 식물 조직에 저장된 다량의 인산염을 함유한다. 평균적으로, 피트산은 식물에 존재하는 인을 50 내지 70% 포함한다. 피트산은 원래 유동적이라 대부분의 농장 동물에서는 피트산이 함유한 인산염이 분비된다. 그러나, 피트산은 돼지나 가금과 같이 위가 하나인 동물에서는 소화되지 않는다. 따라서, 이 동물들에서는 사료에서 섭취된 피트산이 그 배설물과 함께 배출되므로, 사육자는 사료에 유기 인산염을 보충하여 그 동물들이 충분량의 인을 섭취하도록 해야한다. 이러한 방책은 사육자에게는 부대 비용을 발생시키고 소화되지 않는 피트산이 환경으로 흘러들어가 환경 오염을 유발시킨다.

피트산은 또한 음식물에 포함된 중요 영양소, 예컨대, 마그네슘, 칼슘, 아연 또는 철과 같은 영양소의 킬레이트제로 알려져 있다. 이러한 성질로 인해 음식물의 영양적 가치가 떨어지며 피트산은 항영양제가 된다.

위가 하나인 동물들의 피트산 소화 결핍과 관련된 다양한 단점들에 맞서고자 효소인 피타제를 가축 사료에 첨가하는 방법이 고안되었다. 피타제는 피트산을 가수분해시켜 이노시톨과 무기 인산염으로 분해한다. 많은 유기체로부터, 피타제 및 이를 암호화하는 유전자가 분리되었다. 피타제는 주로 진균으로부터 분리되었다(Howson and Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382; Wyss et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65(2), 359-366). 피타제를 분비하는 진균중에서, 아스퍼길러스 속 진균, 특히, 아스퍼길러스 피쿰(A. ficcum)(Ullahand Gibson, 1987, Preparative Biochemistry 17(1), 63-91; Ullah and Dischinger, 1993, Biochem. Biophys. Res. Comun., 192(2), 747-753), 아스퍼길러스 테레우스(A. terreus)(Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143(Pt1), 245-252), 아스퍼길러스 나이거(A. niger)(Dvorakova et al., 1997, Folia Microbiol (Praha), 42(4), 349-352), 아스퍼길러스 푸미가투스(A. fumigatus)(Pasamontes et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63(5), 1696-1700); 페니실리움 속 진균, 특히, 페니실리움 카세이콜룸(P. caseicolum); 마이셀리오프토라 속 진균, 특히, 마이셀리오프토라 써모필라(M. thermophila)(Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252); 탈라로마이세스 속 진균, 특히, T. 써모필러스(T. thermophilus); 뉴로스포라 속 진균, 특히, N. 크라사(N.crassa) 및 N. 시토필라(N. sitophila); 써모마이세스 속 진균, 특히, T. 라누기노서스(T. lanuginosus)(Berka et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64(11),4423-4427); 또는 모나스커스 속 진균, 특히 M. 안카(M. anka)를 들 수 있다.

피타제는 세균에서도 발견된다. 예를 들어, 바실러스 속, 특히 B. 섭틸리스(B. subtilis)(Powar and Jagannathan, 1982, J. Bacteriol. 151 (3), 102-1108 ; Shimizu, 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56 (8), 1266- 1269 ; Keruvo et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64(6),2079-2085); 슈도모나스 속(Cosgrove,1970, Austral.J.Biol. Sci.23,1207-1220), 에스케리키아 속, 특히 E. 콜라이(Golovan et al.,2000, Can.J. Microbiol.46,59-71); 엔테로박터 속(Yoon et al.,1996, Enzyme andmicrobiol. Technol.;18,449-454); 또는 스트렙토마이세스 속을 들 수 있다. 효모 스크바니이오마이세스 오시덴탈리스(Schwaniiomyce soccidentalis) 및 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모 피타제도 분리되었다(Dvorakova,1998, Folia Microbiol.43(4),323-338). 마지막으로, 피타제는 식물, 특히, 대두(Ullah andGibson,1988, Arch. Biochem. Biophys., 260 (2), 514-20), 옥수수(maize)(Maugenest et al., 1997, Biochem J., 322 (Pt 2), 511-7) ; Maugenest et al., 1999, Plant Mol. Biol., 39 (3), 503-14), 또는 애기장대(Arabidopsis)(Mullaney and Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., 251 (1), 252-5)로부터도 분리되었다.

피타제를 특징지을 수 있는 성질로는 피트산에 대한 마이클 상수(Km), 활성을 위한 최적 pH 및 최적 온도, 그리고 주어진 pH 및 온도에서 그 활성의 안정성이 포함된다. 분자량(MW), 등전점(pI) 또는 펩티드 서열과 같은 피타제 구조에 관한 데이타를 사용할 수도 있다. 피타제가 동물 영양식이에 사용될 수 있기 위해서는, 피타제가 그 영양식이를 목적으로 하는 음식물에 가해지는 가공 처리에 적합한 성질을 가져야만 한다. 특히, 사용된 피타제의 활성이 유지되어야 하고, 가능하다면, 이 음식물들의 제조과정중의 온도와 pH 조건, 그리고, 이 음식물을 섭취하는 동물의 소화관 조건에서 그 활성이 최적이어야 한다. 이러한 제약 때문에 주로 사료 조성물 제조 공정에 사용되는 고온 조건에 견디고 가축들의 소화관에서와 같은 산 pH에 견디는 활성을 갖는 피타제를 연구하게 된다.

이러한 기준들을 만족시키기 위해, 유기체, 특히 이러한 기준들에 상응하는 온도와 pH 조건을 갖는 환경에서 성장하는 미생물에서 피타제를 찾아 왔다. 이러한 전략으로 인해 예컨대 특허 출원 WO 97/35016 또는 EP 0 684 313에 기재된 조건과 같이 고온에서 견디는 피타제를 분리할 수 있었을 뿐 아니라 특허 출원 EP 0 960 934에 기재된 조건과 같이 낮은 Km 값 갖는 피타제를 분리할 수 있었다. 또 다른 전략은 공지 피타제를 부위-지향성 변이발생에 의해 그 서열을 인위적으로 변형시켜 유리한 성질을 부여하는 방법이었다. 이 전략은 특허 출원 WO 99/48380, EP 0 897 985 및 EP 0 897 010에 상세히 기재되어 있다.

본 발명은 신규한 피타제, 특히, 진균 유래의 피타제 및 그 각각의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 진균 페니실리움 속, 특히 페니실리움 sp. CBS 109899 균주로부터 유래한 신규의 피타제 및 이 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터 및 상기 피타제를 조직내에서 발현시키는 형질전환 숙주 유기체에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 피타제는 동물에 영양공급을 목적으로 하는 사료 조성물에 사용하기 특히 적합하다. 이 적합성은, 이 조성물의 제조 조건 및 동물의 소화계에서 일어나는 조건에 상응하는 온도 및 pH에서의 피타제의 성질, 특히 그 활성과 연관되어 있다.

도 1은, 페니실리움 sp. CBS 109899 피타제의 pH 함수로서의 활성을 나타낸다. 상대 활성 100% 값은 주어진 pH에서 상기 피타제의 최대 활성에 해당한다.

도 2는 페니실리움 sp. CBS 109899 피타제의 온도 함수로서의 활성을 나타낸다. 상대 활성 100% 값은 주어진 온도에서 상기 피타제의 최대 활성에 해당한다.

본 발명은 서열 번호 3으로 기재된 피타제를 암호화하는 분리된 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 이 피타제 및 이를 암호화하는 폴리누클레오티드는 페니실리움 속 진균 균주, 특히, 페니실리움 sp. CBS 109899 균주로부터 유래되었다.

본 발명에 따라, 용어 "폴리누클레오티드"는 천연 염기 서열 또는 인위적 염기 서열로 DNA 또는 RNA 형태이고, 바람직하게는 DNA 형태, 특히 이중 가닥을 의미하는 것으로 한다. 상기 폴리누클레오티드가 자연형인 경우, 본 발명은 명백히 자연 환경에 존재하는 폴리쿠늘레오티드는 포함하지 않지만, 자연적으로 이 폴리누클레오티드를 함유하는 생 유기체의 게놈으로부터 분리되고 정제된 폴리누클레오티드는 포함하는 것으로 이해된다. 이 폴리누클레오티드는 추출 및 정제에 의해 직접 얻을 수도 있고 복사에 의해 간접적으로 얻을 수도 있다. 그러나, 본 발명은, 자연적으로 존재하는 것이 아닌 살아 있는 유기체 게놈으로 인위적으로 삽입된 폴리누클레오티드인 경우 또는 이 폴리누클레오티드가 그 유래된 살아있는 유기체내로이 유기체의 하나 이상의 복사체로 재도입된 경우를 포함한다. 이 폴리누클레오티드가 프로브인 경우, 이는 일반적으로 단일-가닥이다.

본 발명은 따라서 서열번호 3으로 기재된 피타제의 펩티드 서열을 암호화하는 폴리누클레오티드를 포함한다. 이 정의에는, 비록 유전코드의 축퇴로 인해 다른 누클레오티드 서열을 포함하더라도, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 폴리누클레오티드가 포함되며 따라서 서열번호 3으로 표현된 동일한 피타제도 포함된다.

본 발명은 전술한 폴리누클레오티드에 상동성인 폴리누클레오티드도 포함하는데, 이 상동성 폴리누클레오티드는 서열번호 3으로 표현된 피타제에 상동성인 피타제를 암호화한다. 본 발명에 따라 용어 "상동성(homologous)"은 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드를 의미하는데, 이 폴리누클레오티드의 서열은 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 대하여 변형되어 있다.

상동성 폴리누클레오티드는 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 대한 동일성 정도에 의해 특징된다. 두 개의 상응하는 폴리누클레오티드간의 동일성 정도는 그 서열 비교에 의해 얻어지고, 일반적으로 서열간의 동일한 누클레오티드 퍼센트에 의해 표현된다. 이 동일성 정도는 주어진 서열길이에 대해 측정되고, 비교되는 서열 중 더 짧은 서열이 상동 서열의 동일성 정도를 결정한다. 따라서 본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 및 서열번호 3으로 표현된 피타제와 성질이 균등한 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 대하여 하나 이상의 서열 변형이 있는 폴리누클레오티드도포함한다.

본 발명에 따라, "균등한 피타제" 또는 "성질이 균등한 피타제"라는 표현은 본질적으로 Km, 활성을 위한 최적 온도 또는 최적 pH와 같이 그 고유 성질과는 독립된, 피타제 성질을 갖는 단백질을 의미하는 것으로 한다. 피타제 활성은, 피타제 활성을 특성화하는 어떤 방법이든 사용하여 측정할 수 있다. 용어 "피타제"는 피트산을 가수분해하여 이노시톨과 무기 인산염을 배출시키는 촉매 활성을 갖는 효소를 의미하는 것으로 한다. 그러나, 대부분의 피타제가 피트산을 완전히 가수분해(6 인산염 포함)하지 못하기 때문에 본 발명에 따른 피타제의 촉매 활성은 무기 인산염의 분비와 이오이노시톨 인산염 에스테르의 분비를 초래할 수 있고, 상기 에스테르는 피타제의 가수분해능에 따라 모노-, 디-, 트리-, 테트라- 또는 펜타인산염 에스테르일 수 있다. 예를 들어, 피타제 활성은 쉬미즈의 논문(Shimizu, 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269), 특히 실시예 2에 기재된 방법에 따라 측정될 수 있다. 그러나, 피타제 활성을 특징 짓는 어떠한 방법도, 기질량의 감소를 측정하든 효소반응으로부터 유래한 생성물의 축적을 측정하든간에, 피타제 활성을 측정하기 위해 사용할 수 있다. 특히, 예컨대 다른 기질 또는 다른 시약을 사용하는 유사한 방법 역시 상기 피타제 활성 측정을 위해 사용할 수 있다.

상동 폴리누클레오티드에 존재하는 서열 변형은 누클레오티드의 부가, 결손 또는 치환일 수 있고 자연적으로 또는 통상의 유전변이 기술을 이용하여 얻을 수 있다. 이러한 상동 폴리누클레오티드, 즉, 균등한 기능으로 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드는 살아 있는 상이한 종 게놈에 자연적으로 존재할 수 있고 심지어는 다른 종족, 변종 또는 균주에도 존재할 수 있다. 그 결과, 당업자가, 본 발명에 따른 서열번호 3으로 표현된 펩티드 서열을 암호화하는 폴리누클레오티드의 개시를 이용하고 잘 알려진 분자 하이브리드화 기술(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Larboratory Press)에 의해 이러한 상동성 폴리누클레오티드를 용이하게 분리할 수 있다.

분자 하이브리드화란, 그 누클레오티드 서열에 있어서 어느 정도 동일성을 갖는 폴리누클레오티드의 상보성 가닥간에 일어나는 짝짓기 반응이다. 따라서, 하이브리드화를 이용하면, 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 및 서열번호 3으로 표현된 피타제와 균등한 성질을 갖는 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드를 이용하여, 그 유래한 유기체가 아닌 다른 살아있는 유기체, 예컨대, 다른 진균, 특히, 다른 페니실리움 균주, 예컨대. P. 푸니콜로섬 IMI 134756 균주의 게놈에서 이 폴리누클레오티드에 상동성인 폴리누클레오티드를 확인할 수 있다. 폴리누클레오티드간에 서열 동일성이 클수록 이 폴리누클레오티드간의 하이브리드 가능성 및 용이성이 크고 이 폴리누클레오티드가 균등한 성질을 갖는 단백질을 암호화할 가능성이 크다. 폴리누클레오티드 하이브리드화 기술은 문헌에 널리 기재되어 있고(Sambrook et al.,1989, MolecularCloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C.eco., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) 당업자에게 잘 알려져 있다. 이 방법들은, 예컨대, 살아있는 유기체 또는 이 유기체의 조직으로부터 생성된 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 기초한다. 이 스크리닝은, 공지의 폴리누클레오티드 또는 그 단편으로 구성된 프로브를 이용하여 상기 라이브러리중에서 이들에 하이브리드될 상기 프로브에 상동성인 폴리누클레오티드를 확인하기 위해 실시된다. 본 발명에 따라, 상기 프로브는 서열번호 3으로 표현되는 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 또는 그 단편으로 구성된다. 프로브가 하이브리드화할 폴리누클레오티드를 확인하기 위해, 예컨대,³²P와 같은 방사성 원소로 표지된다. 당업자에게 잘 알려진 상업적으로 입수가능한 비-방사성 표지를 사용할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 하나의 폴리누클레오티드에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 폴리누클레오티드 또는 그 단편도 포함한다. 이러한 폴리누클레오티드가 서열번호 3으로 표현된 피타제와 균등한 피타제를 암호화하는 경우 이 폴리누클레오티드는 본 발명의 일부인 것으로 이해된다. 본 발명에 따라, "선택적으로 하이브리드화 할 수 있는 폴리누클레오티드"라는 표현은, 통상의 분자 하이브리드화 기술에 의해(Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning : ALaboratory Manual,2nd edition, Nolan C.ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 어느 한 폴리누클레오티드 또는 그 단편으로 구성된 표지된 프로브와, 이 프로브가 다른 비교적 비상동성인 폴리누클레오티드와 비특이적으로 하이브리드화하는 것보다 높은 수준으로 하이브리드화하는 폴리누클레오티드를 의미하는 것으로 한다. 프로브 표지로 생성된 신호에 의해 하이브리드화 정도를 측정된다. 선택적으로 하이브리드화 할 수 있는 폴리누클레오티드와 프로브의 상호작용에 의해 발생된 신호 수준은, "배경잡음(background noise)"을 발생하는 폴리누클레오티드와 프로브간에 발생되는 것보다 일반적으로는 10배, 바람직하기로는 100배 더 강하다. 이러한 선택적 하이브리드화는 일반적으로 정상적인, 바람직하기로는 스트린전트한 또는 매우 스트린전트한 하이브리드화 조건 및 세척 조건(예를 들어 적어도 5 x SSC 및 1% SDS를 포함하는 완충제로 약 50-60℃에서 하이브리드화한 후 계속하여 0.1% SDS로 세척하고 SSC 농도를 2 x SSC에서 0.4 x SSC로 점차 농도를 감소시키면서 그리고 온도를 20℃에서 50℃로 점차 증가시키는 조건)을 사용하여 얻어진다. 당업자는 상기 하이브리드화 조건, 즉, 본질적으로 온도 및 하이브리드화 단계 및 세척 단계에 사용된 완충제의 염 농도를 조정할 수 있을 것이다. 이러한 조건들은, 특히, 사용된 프로브의 길이 및 이 프로브로 스크리닝한 라이브러리에 존재하는 폴리누클레오티드의 동일성 정도의 함수로서 조정되어야 한다. 하이브리드화하는 상동 서열들에 의해 발생된 신호를 최적화함과 동시에 배경잡음을 최소화하도록 하이브리드 조건이 조정할 필요가 있다.

본 발명에 따른 폴리누클레오티드에 선택적으로 하이브리드할 수 있는 폴리누클레오티드는, 예컨대, 진균 균주, 특히, 페니실리움 속 균주, 예를 들어 P. 푸니쿨로섬 IMI 134756 균주로부터 생성된 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 이러한 폴리누클레오티드의 분리는, 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 또는 그 단편을 프로브로 사용하거나 이에 상보적인 폴리누클레오티드를 프로브로 사용하여, 표준 하이브리드화기술(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 따라 수행될 수 있다. 이러한 기술로 폴리누클레오티드가 분리된 경우, 특히, 이 단백질이 서열번호 3으로 표현되는 피타제에 균등한 피타제인지를 확인하기 위하여, 그 서열을 결정하고 이 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 단백질의 성질을 확인하는 것이 필요하다.

따라서, 상기 하이브리드 기술을 사용하면 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 상동성인 폴리누클레오티드를 분리할 수 있다. 이러한 폴리누클레오티드 및 이들이 암호화하는 피타제는 기본 분자 생물학 기술을 마스터한 생명공학 기술 분야의 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 따라서 본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 상동성인 폴리누클레오티드를 포함한다. 유리하기로는, 상기 상동성 폴리누클레오티드의 동일성 정도는 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드에 대하여 적어도 45%, 바람직하게는 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 바람직하게는 적어도 95%일 것이다. 서열간의 동일성 정도를 측정하고 확인하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어 PILEUP, BLAST(특히, Altschul et al.,1993, J. Mol.Evol. 36 :290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10) 또는 BestFit(Applied Mathematics,1981, No.2,482-489에 기재된 스미스와 워터만의 알고리즘을 이용하는, Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 forUnix, Genetics Computer Group,University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711) 프로그램을 사용할 수 있다.

이러한 상동성 폴리누클레오티드는 종래의 변이발생 기술을 이용하여 인위적으로 얻을 수도 있다.

서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 바람직한 폴리누클레오티드는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표현된 서열로부터 선택된다.

상동성 폴리누클레오티드의 예로서, 서열번호 4로 표현된 폴리누클레오티드를 들 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따르면 전술한 피아제를 암호화하는 폴리누클레오티드는 페니실리움 속 진균으로부터 유래한다. 특정 양태에 따르면, 상기 폴리누클레오티드는 페니실리움 sp. CBS 109899 균주 또는 페니실리움 푸니쿨로섬 IMI 134756 균주로부터 유래한다.

본 발명의 특정 양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 하기 성질을 갖는 피타제를 암호화한다:

(a) 최적 온도 = 50℃

(b) 최적 pH = 4-5

(c) Km = 550 ㎛

본 발명은 또한 전술한 폴리누클레오티드의 단편에 관한것이다. "단편"이라는 용어는 특히 적어도 20 누클레오티드, 특히 적어도 50 누클레오티드 및 바람직하게는 적어도 100 누클레오티드의 단편을 나타낸다. 이러한 단편들을 일반적으로 올리고누클레오티드라고 지칭한다. 이들은 상동성 폴리누클레오티드를 확인하기 위한 프로브로 사용될 수도 있고, 문헌(Ausubel et al.,(1987) Current Protocols in Molecular Biology, edit. John Wiley 사료 조성물 Sons, Section 6.3-6.4)에 기재된 PCR(폴리머라제 사슬 반응) 기술을 이용하여 상동성 폴리누클레오티드를 확인하고 증폭시키기 위한 프라이머로 사용될 수도 있다.

"단편"이라는 용어는 또한 서열번호 3으로 표현된 피타제의 단편 또는 서열번호 3으로 표현된 피타제에 상동성이거나 균등한 피타제의 단편을 암호화하는 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 단편을 나타내기도 한다.

본 발명은 또한 적어도 하나의 전술한 폴리누클레오티드를 포함하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다.

전술한 모든 폴리누클레오티드는 서열번호 3으로 표현된 피타제, 상동성 피타제, 또는 이들 피타제의 활성 단편을 암호화한다. 따라서, 본 발명은 이러한 모든 폴리누클레오티드에 의해 암호화되는 모든 피타제에까지도 확장된다. 따라서, 이 정의는 서열번호 3으로 표현된 피타제, 이에 상동성인 피타제 및 이들 피타제의 활성 단편을 포함한다.

본 발명의 바람직한 한 양태에 따르면, 상기 피타제는 적어도 서열번호 3으로 표현된 펩티드 서열을 포함하는 단백질이다.

따라서 본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제에 상동성인 피타제도 포함한다. 본 발명에 따라, "상동성 피타제"라는 용어는 서열번호 3으로 표현된 피타제에 대하여 그 서열이 변형된 피타제를 의미하는 것으로 한다. 상동성 폴리누클레오티드와 같이, 상동성 피타제는 그 펩티드 서열이 어느 정도의 동일성을 보이는 피타제인데, 이 동일성 정도는 이반적으로 동일한 아미노산 퍼센트로 표현된다. 따라서, 본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제에 대하여 하나 이상의 서열 변형을 갖고 그 성질은 서열번호 3으로 표현된 피타제의 성질과 균등한 피타제를 포함한다. 이러한 변형은 아미노산의 부가, 결손 또는 치환일 수 있고, 자연적으로 또는 통상의 변이발생 기술을 사용하여 얻을 수 있다. 유리하기로는, 상동성 피타제의 동일성 정도는 서열번호 3으로 표현된 피타제에 대하여 적어도 35%, 바람직하게는 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 그리고 바람직하게는 적어도 95%일 것이다. 서열간의 동일성 정도를 측정하고 확인하는 방법들은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, PILEUP, BLAST(특히, Altschul et al.,1993, J. Mol. Evol. 36 : 290-300 ; Altschul et al., l990, J. Mol. Biol. 215 :403-10) 또는 BestFit(Applied Mathematics,1981, No.2,482-489에 기재된 스미스와 워터만의 알고리즘을 이용하는, Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 forUnix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI53711) 프로그램을 사용할 수 있다.

서열번호 3으로 표현된 피타제에 상동성인 피타제의 예로 서열번호 4로 표현된 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 피타제를 들 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따르면 전술한 피아제는 페니실리움 속 진균으로부터 유래한다.

본 발명의 특정 양태에 따르면, 상기 피타제는 하기 성질을 갖는다:

(a) 최적 온도 = 50℃

(b) 최적 pH = 4-5

(c) Km = 550 ㎛

본 발명은 서열번호 3으로 표현된 피타제의 단편 및 그 상동성 피타제 단편까지도 확장된다. "단편"이라는 용어는 본질적으로 생화학적으로 활성인 단편, 즉, 실시예 2에 기재된 검정법 또는 유사한 검정법에 의해 측정되었을 때 완전한 피타제와 균등한 피타제 활성을 갖는 단편을 의미하는 것으로 한다.

본 발명은, 서로 기능적으로 연결된, 숙주에서 기능하는 적어도 하나의 프로모터, 본 발명에 따른 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 및 동일한 숙주에서 기능하는 종결인자를 포함하는 키메라 유전자에 관한 것이기도 하다. 일반 유전자가 포함할 수 있는 다양한 인자로는, 첫째, 프로모터, 신호 펩티드 또는 수송 펩티드를 암호화하는 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 구성하는 종결 인자와 같이 단백질 전사, 해독 및 성숙을 조절하는 인자, 둘째, 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드가 있다. "서로 기능적으로 연결된"이라는 표현은, 키메라 유전자의 상기 인자들이 한 인자의 기능이 다른 인자의 기능에 영향받는 방식으로 서로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 이 프로모터는 코딩 서열에 기능적으로 연결되어 있다. 본 발명에 따른 키메라 유전자의 구성 및 그 다양한 인자들의 조립은 당업자에게 공지된 방법, 특히, 삼부룩 등의 문헌(Sambrook et al.,1989, MolecularCloning : A Laboratory Manual, Nolan C.ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된방법을 이용하여 실시할 수 있다. 키메라 유전자를 구성하는 조절 인자의 선택은, 본질적으로 이들이 기능하는 숙주 유기체에 달려있고, 당업자는 주어진 숙주 유기체내에서 기능하는 조절 유전자를 선택할 수 있다. "기능적"이라는 용어는 주어진 숙주 유기체에서 기능할 수 있는 것을 의미하는 것으로 한다.

본 발명에 따른 키메라 유전자가 포함할 수도 있는 프로모터는 구조성이거나 유도성이다. 예를 들어, 세균에서의 발현에 사용된 프로모터는 하기 언급하는 프로모터로부터 선택할 수 있다. 이. 콜라이에서의 발현을 위해서는,lac, trp, lpp,phoA,recA, araBAD, proU, cst-l, tetA, cadA, nar, tac, trc, lpplac,Psyn, cspA,PL,PL-9G-50, PR-PL,T7, λPL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gene 32,nprM-lac, VHb 및 단백질 A 프로모터(Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60 : 512-538; Current Opinions in Biotechnology, 1996, 7; Weickert etal., 1996, Current Opinions in Biotechnology7 :494-499) 또는 다른 P_trp프로모터(WO99/64607)를 언급할 수 있다. 코리네박테리아 또는 스트렙토마이세스와 같은 그람 양성 세균에서의 발현을 위해서는 P_tipA(Holmes et al.,1993, EMBO J. 12:3183-3191) 또는 PS1 및 PS2(FR 91/09870) 프로모터 또는 출원 EP 0 629 699 A2에 기재된 것을 언급할 수 있다. 효모와 진균에서의 발현을 위해서는 K. 락티스 P_LAC4프로모터(Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:135-139) 또는 K. 락티스 P_pgk프로모터(특허 출원 FR 91/05294), 트리코더마tefl또는cbhl프로모터(WO 94/04673), 페니실리움his,cs1또는apf프로모터(WO 00/68401) 및 아스퍼길러스g1a프로모터(Gwynneet al., 1987, Bio/Technology 5:713-719)를 언급할 수 있다.

키메라 유전자는 신호 펩티드 또는 수송 펩티드를 암호화하는 세포하 어드레싱 서열을 포함하기도 한다. 이러한 서열은, 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 윗쪽 또는 아래쪽에 위치하고, 상기 피타제가 숙주 유기체의 세포 구획으로 특이적으로 향하게 하거나 그 세포외 공간으로 배출되도록 한다. 예를 들어, 상기 키메라 유전자는 예컨대 미토콘드리아, 플라스트, 소포체 또는 액포와 같은 세포질내 특정 구획으로 피타제를 이끌기 위한 신호 펩티드 또는 수송 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 어드레싱 서열은 피타제를 아포플라스트 또는 세포외 매트릭스로 어드레스하는 신호 펩티드를 암호화한다.

한 양태에 따르면, 수송 펩티드는 엽록체, 액포 또는 미토콘드리아 어드레싱 신호일 수 있고 이들은 이후 엽록체, 액포 또는 미토콘드리아에서 분리된다. 이러한 펩티드들은 문헌에 널리 기재되어 있다: Neuhaus and Rodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38 :127-144; USP 5,188,642에 기재된 EPSPS 수송 펩티드; 리블로스-비스카복실라아제/옥시게나아제 소단위 수송 펩티드(EP 189707).

다른 양태에 따르면, 상기 수송 펩티드는 세균 주변세포질로 어드레싱하기 위한 신호 펩티드, 예컨대, pac(Schumacher et al., 1986, Nucl. Acids. Res. 14 :5713-5727), ompA(Bowden and Georgiou, 1990, J.Biol. Chem. 265 :16761-16766) 및 phoA(Chang et al., 1986, Gene 44 :121-124.) 유전자의 신호 펩티드 또는 PS1 및 PS2 유전자의 발현 펩티드(FR91/09870)과 같은 세균 표면 발현 펩티드(surface anchoring peptide)로 구성될 수 있다.

수송 펩티드는 단일 또는 이중 펩티드일 수 있다. 이중 수송 펩티드는 경우에 따라 중간 서열로부터 분리된다. 엽록체 수송 펩티드의 예로, 플라스티드에 있는 효소를 암호화하는 식물 유전자의 수송 펩티드를 암호화하는 서열, 플라스티드에 있는 효소를 암호화하는 식물 유전자의 성숙한 N-말단 부분으로부터의 서열 부분, 그리고 플라스티드에 위치한 효소를 암호화하는 식물 유전자의 제2 수송 펩티드를 암호화하는 서열을, 전사 방향으로, 포함하는 이중 수송 펩티드를 언급할 수 있다. 이러한 이중 엽촉체 수송 펩티드들은 예컨대 EP 0 508 909에 기재되어 있다.

한 양태에 따르면, 수송 펩티드는 배지로 분비되는 관심대상 단백질의 양을 증가시키기 위한 다양한 인자로 구성될 수 있다. 운송 단백질과 관심대상 단백질과 융합된 단백분해 절단 위치와의 배합기술을 언급할 수 있다(USP 6,130,063).

본 발명에 따르면, 키메라 유전자는 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재하는 전사 활성자(인핸서)와 같은 다른 조절 서열을 포함할 수도 있다.

본 발명은, 본 발명에 따른 키메라 유전자를 포함하는 클로닝, 발현 및/또는 형질전환 벡터에 관한 것이기도 하다. 본 발명에 따른 벡터는 숙주 유기체를 형질전환시키고 이 유기체내에서 피타제를 발현시키기 위해 사용된다. 이 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 바이러스 일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 형질전환 벡터는 플라스미드이다. 일반적으로, 이 벡터의 주요 특성은 숙주 유기체 세포내에서 그 자신을 유지시키고, 특히, 복제기관이 존재하여 숙주 유기체 세포내에서 자가복제하며 그 안에서 피타제를 발현시키는 능력이어야 한다.숙주 유기체의 안정한 형질전환을 목적으로, 벡터는 게놈내로 삽입되기도 한다. 벡터 조성은 숙주에서 피타제를 합성하는데 필요한 인자로만 제한될 수도 있다. 이러한 벡터의 선택, 그리고 본 발명에 따른 키메라 유전자를 이 벡터내로 삽입하는 기술은 삼부룩 등의 문헌(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Nolan C.ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 상세히 기재되어 있고 당업자의 일반 지식의 일부를 이룬다. 유리하기로는, 본 발명에 사용된 벡터는 본 발명에 따른 키메라 유전자가외에 선택 마커를 암호화하는 키메라 유전자를 포함한다. 이러한 선택 마커는 효과적으로 형질전환되는 숙주, 즉, 벡터로 통합되는 숙주를 선택할 수 있게 한다. 사용가능한 선택 마커중, 예컨대 히그로마이신 포스포트랜스퍼러제 유전자(Gritz etal.,1983, Gene 25 :179-188; Punt etal., 1987 ; Gene 56 :117-24), 스트렙토트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자, 폴리펩티드 부여 플레오마이신 저항을 암호화하는 유전자, 변이된 베타-튜블린 부여 베노밀 저항 유전자(Gold etal., 1994, Gene 142 :225-30) 또는 비알포스 아세틸트랜스퍼라제 유전자(Avalos et al.,1989, Curr Genet, 16 :369-72)와 같이 항생제 또는 진균제에 대한 내성 유전자를 포함하는 마커를 언급할 수 있다. 다른 마커로는 영양요구성(auxotrophy)을 보완하는 유전자, 예컨대, pyrA, pyrB, pyrG, pyr4(Buxton and Radford, 1983, Mol. Gen. Genet. 190 :403-405), arg4, argB(Berse et al., 1983, Gene 25 :109-117) 및 trpC(Goosen et al.,1989, Mol. Gen. Genet., 219 :282-88) 유전자, 써모리브돕테린 신타제 유전자(Appleyard et al., 1998, J. Biol. Chem., 273 :14869-76; Unkles et al., 1999; J. Biol.Chem., 274 :19286-93) 또는 아세트아미다제 유전자(Beri and Turner, 1987, Curr Genet, 11 :639-41)가 될 수 있다. 다른 카테고리의 선택 마커로는, 비알라포스 내성을 위한bar유전자(White et al., NAR 18:1062, 1990), 글리포세이트 내성을 위한 EPSPS 유전자(US 5,188,642), 이속사졸 내성을 위한 HPPD 유전자(WO96/38567) 또는 글리포세이트 옥시도리덕타제 유전자(US5463175)와 같은 제초제 내성 유전자로 구성될 수 있다. 또한, GUS 효소와 같이 용이하게 확인되는 효소를 암호화하는 유전자 또는 형질전환 세포에서 색소 생성을 조절하는 색소 또는 효소를 암호화하는 유전자를 언급할 수 있다. 이러한 선택 마커 유전자는 특히 특허 출원 WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 및 WO 97/04103에 기재되어 있다.

본 발명은, 본 발명에 따른 적어도 하나의 키메라 유전자, 이것이 게놈으로 통합된 것이든 예컨대 플라스미드와 같은 염색체외부 유전인자(extrachromosomal genetic element)에 의해 수송된 것이든 이 키메라 유전자를 포함하는 형질전환된 숙주 유기체에 관한 것이기도 하다. "숙주 유기체"라는 용어는, 본 발명에 따른 피타제를 생산하기 위해 그 내부로 본 발명에 따른 키메라 유전자가 도입될 수 있는 저등 또는 고등 단세포 또는 다세포 유기체를 의미하는 것으로 한다. 바람직하게는, 숙주 유기체는 미생물, 특히 진균으로 예컨대 페니실리움, 아스퍼길러스, 크리소스포리움 또는 트리코더마 속; 세균으로 예컨대 에스케리키아 속, 특히. E. 콜라이, 코리네박테리움 속, 바실러스 속 또는 스트렙토마이세스 속; 효모로, 특히 사카로마이세스, 크루이베로마이세스 또는 피키아 속; 바쿨로바이러스; 또는 식물 세포이다. 숙주 유기체는 식물 또는 식물의 일부일 수도 있다.

"형질전환된 숙주 유기체"라는 표현은, 적어도 하나의 본 발명에 따른 키메라 유전자를 이의 게놈에 통합하고 있거나 플라스미드와 같이 염색체외부 유전인자에 포함되어 있어 그 결과 그 조직내에서 또는 배양배지에서 피타제를 생산하는 숙주 유기체를 의미하는 것으로 한다. 본 발명에 따른 숙주 유기체를 얻기 위하여, 당업자는 많은 공지의 형질전환법을 사용할 수 있을 것이다.

이러한 방법중 하나는, 형질전환될 숙주 유기체의 세포 또는 조직을 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 본 발명에 따른 벡터와 접촉시키는 것으로 구성된다((Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet.168(1),111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). 엘렉트로포레이션도 한 방법으로 여기서는 형질전환될 세포 또는 조직을 발명에 따른 벡터와 함께 전기장에 두는 것으로 구성된다(Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). 다른 방법은 마이크로주사에 의해 벡터를 세포 또는 조직내로 간접적으로 주입하는 기술로 구성된다(Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33(2), 121-136). 유리하기로는, "유전자총(biolistic)" 요법을 사용할 수도 있다. 이 방법은 발명에 따른 벡터를 표면에 흡착시킨 입자를 세포 또는 조직에 포격하는 것으로 구성된다(Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24),9692-9696 ; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3), 286-291; US Patent No.4,945,050).

몇가지 세균 형질전환 방법이 문헌(Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York; Inoue et al.,1990, Gene 96 : 23-28 ; Chung et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2172-2175)에 기재되어 있다. 컨쥬게이션을 사용할 수도 있다(Cameron et al., 1989, J. Bacteriol., 171:547-557). 그람 양성균을 위해서는, 엘렉트로포레이션을 사용할 수도 있고, 특히, 스트렙토마이세스 속 세균을 위해서는 프로토플라스트 형질전환을 사용할 수 있다(Bonamy et al., 1990, FEMS Microbio. Lett 66:263-270; Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulationof Streptomyces: A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich).

진균 형질전환 방법도 몇가지 문헌(Talbot, 2001, Molecular and cellular biology of filamentous fungi, Oxford University Press, NewYork)에 기재되어 있다. 아스퍼길러스에 대한 PEG를 이용한 프로토플라스트 형질전환은 EP 0 260 762에 기재되어 있고, 이 방법을 페니실리움 푸니클로섬 종에 적용시키는 방법은 WO 00/36120에 기재되어 있다. 제한 효소 매개 통합, 즉, REMI(Restriction Enzyme Mediated Integration)도 공지되어 있고(Sanchez et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258;89-94), 아그로박테리움 속 세균을 이용하는 프로토플라스트 형질전환도 공지되어 있다(de Groot et al., 1998, Nature Biotechnology 16:839-842). 효모를 형질전환시키는 기술도 문헌에 기재되어 있는데, 특히 아우수벨 등의 논문(Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York)과 반 덴 베르그 등의 논문(Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8:135-139)에 기재되어 있다.

형질전환될 숙주 유기체가 식물 유래인 특정의 경우, 식물 세포 또는 조직을바람직하게는 아그로박테리움 속 세균을 사용하여, 바람직하게는 상기 식물 세포 또는 조직을 A. 투메파시엔스(Knopf,1979, Subcell. Biochem.6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23-(3):315-330) 또는 A. 리조게네스(Bevan and Chiton,1982, Annu. Rev. Genet.16:357-384 ; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28)로 감염시켜, 형질전환시킬 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움 투메파시엔스를 이용한 식물 세포 또는 조직의 형질전환은 아쉬다 등의 논문(Ishida et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14(6),745-750)에 기재된 프로토콜에 따라 실시할 수 있다. 당업자는 형질전환될 숙주 유기체의 성질에 따라 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명은 피타제 활성을 갖는 추출물을 생산하는 방법에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 게놈내에 본 발명에 따른 폴리누클레오티드를 자연적으로 포함하는 유기체를 상기 피타제를 발현할 수 있는 조건에서 배양하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 배양된 유기체를 농축시키는 단계;

(c) 단계 (b)에서 분리된 유기체 세포를 파열시키는 단계;

(d) 단계 (c)에서 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계;

(e) 단계 (d)에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 수거하는 단계.

단계 (c)는 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 기계분쇄법(압력차, 초음파작용, 연화에 의함), 효소분해법 또는 삼투압 쇼크법에 의해 실시할 수 있고, 이 방법들은 단독으로 또는 병합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 정제 단계인 (f) 단계를 추가함으로써 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 방법이 될 수도 있다. 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 이러한 방법에서의 단계 (f)는 단계(e)로부터 수거된 상청액을 정제하는 것으로 구성된다. 피타제의 정제는, 당업자에게 공지된 단백질을 농축하거나 분리하는 기술, 특히 미세여과, 초여과, 엘렉트로포레시스 또는 크로마토그래피에 의해 실시될 수 있다. 정제된 피타제를 얻기 위하여, 당업자는 상기 피타제를 함유하는 정제 분획을 확인하기 위해 피타제 활성을 측정하는 전술한 방법을 사용할 수도 있다. 이 방법에 따르면, 생산된 피타제는 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 유리하기로는 100%의 순도를 가질 수 있다.

본 발명의 방법따른 다른 양태, 특히, 본 발명에 따른 피타제가 배양 배지로 분비되는 경우에 따르면, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 본 발명에 따른 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 전술한 피타제 발현이 허용되는 조건하에서 배양하는 단계;

(b) 상기 유기체를 제거함으로써 배양배지를 회수하는 단계.

"게놈내에 본 발명에 따른 폴리누클레오티드를 자연적으로 포함하는 유기체"라는 표현은, 그 천연 상태에서, 서열번호 3으로 표현된 피타제를 암호화하는 폴리누클레오티드 또는 이에 상동인 폴리누클레오티드를 그 게놈내에 함유하는 유기체를 의미하는 것으로 한다.

전술한 방법의 한 양태에 따르면, 상기 유기체는 미생물이다. 특정 양태에 따르면, 상기 미생물은 진균, 특히, 페니실리움 속 진균, 특히 페니실리움 sp. CBS109899 균주이다.

이 방법들에 따라, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 피타제를 생산하는데 적합한 배지에서 유기체를 배양한다. 이 유기체는, 특히 미생물, 특히 진균인 경우에는, 흔들 엘렌메이어 플라스크, 실험실-규모의 발효기 또는 산업-규모의 발효기(뱃치 발효, 첨가-뱃치 발효 또는 고형배지하의 발효)에서 배양될 수 있다. 사용된 배양 배지는 탄소, 질소 및 무기염 소스를 함유해야한다. 유기체로서 페니실리움 sp. CBS 109899 균주를 사용하는 방법의 특정 양태에 있어서, 피타제의 발현은 피트산염(예를 들어, 피트산염은 Na+ 염, Ca++ 염 또는 Ca++ 염과 Mg++ 염의 배합일 있다) 존재 또는 부존재하에 얻어진다. pH는 조절될 수도 있고(바람직하기로는 pH 3 또는 4) 자유롭게 놔둘수도 있다.

이 방법에 따르면, 상기 유기체를 제거하여 배양배지를 회수하는 단계는 액체 분획에 포함된 고형 분획을 분리하는 어떠한 수단에 의해서도 실시될 수 있다. 특히, 여과와 원심분리가 이 단계 수행에 적합하다.

본 방법은 정제 단계인 (c) 단계를 추가하여 피타제를 생산하는 방법이 될 수 있다. 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 이러한 방법에서 단계 (c)는 단계 (b)에서 회수한 상청액으로부터 피타제를 정제하는 것으로 구성된다. 피타제는 당업자에게 공지된 단백질을 농축하거나 분리하는 어떠한 기술, 특히, 미세여과, 초여과, 엘렉트로포레시스 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정제된 피타제를 얻기 위해, 당업자는 상기 피타제를 함유하는 정제 분획을 확인하기 위해 피타제 활성을 측정하는 전술한 방법을 사용할 수 있을 것이다. 이 방법에 따르면, 생산된 피타제는 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 유리하기로는 100%의 순도를 가질 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 피타제 활성을 갖는 추출물을 생산하는 방법은 본 발명에 따라 형질전환된 숙주 유기체를 사용하며 하기 단계를 포함한다:

(a) 본 발명에 따라 형질전환된 숙주 유기체를 배양하는 단계;

(b) 단계 (a)에서 배양된 유기체를 농축시키는 단계;

(c) 단계 (b)에서 분리된 유기체 세포를 파열시키는 단계;

(d) 단계 (c)에서 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계;

(e) 단계 (d)에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 수거하는 단계.

단계 (c)는 당업자에게 공지된 방법, 예컨대 기계분쇄법(압력차, 초음파작용, 연화에 의함), 효소분해법 또는 삼투압 쇼크법에 의해 실시할 수 있고, 이 방법들은 단독으로 또는 병합하여 사용될 수 있다.

본 방법은 정제 단계인 (f) 단계를 추가함으로써 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 방법도 될 수 있다. 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 이러한 방법에서단계 (f)는 단계(e)로부터 수거된 상청액을 정제하는 것으로 구성된다. 피타제의 정제는, 당업자에게 공지된 단백질을 농축하거나 분리하는 기술, 특히 미세여과, 초여과, 엘렉트로포레시스 또는 크로마토그래피에 의해 실시될 수 있다. 정제된 피타제를 얻기 위하여, 당업자는 상기 피타제를 함유하는 정제 분획을 확인하기 위해 피타제 활성을 측정하는 전술한 방법을 사용할 수도 있다. 이 방법에 따르면, 생산된 피타제는 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%의 순도를 갖거나 유리하게는 100%의 순도를 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 방법에 사용된 형질전환된 숙주 유기체는 미생물이다. 상세하게, 상기 미생물은 진균, 예컨대 페니실리움, 아스퍼길러스, 크리소스포리움 또는 트리코더마 속 진균; 세균, 예컨대 에스케리키아 속, 특히, E. 콜라이, 코리네박테리움 속, 바실러스 속 또는 스트렙토마이세스 속 세균; 효모, 특히 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 또는 피키아 속 효모; 바쿨로바이러스; 또는 식물 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 특히, 본 발명에 따른 피타제가 배양 배지로 분비되는 경우, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

(a) 본 발명에 따라 형질전환된 숙주 유기체를 배양하는 단계;

(b) 상기 형질전환된 숙주 유기체를 제거하고 배양배지를 회수하는 단계.

이 방법들에 따르면, 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 피타제를 생산하는데 적합한 배지에서 유기체를 배양한다. 이 유기체는, 특히 미생물, 특히 진균인 경우에는, 흔들 엘렌메이어 플라스크, 실험실-규모의 발효기 또는 산업-규모의 발효기(뱃치 발효, 첨가-뱃치 발효 또는 고형배지하의 발효)에서 배양될 수 있다. 사용된 배양 배지는 탄소, 질소 및 무기염 소스를 함유해야한다.

이 방법에 따르면, 상기 유기체를 제거하여 배양배지를 회수하는 단계는 액체 분획에 포함된 고형 분획을 분리하는 어떠한 수단에 의해서도 실시될 수 있다. 특히, 여과와 원심분리가 이 단계 수행에 적합하다.

본 방법은 정제 단계인 (c) 단계를 추가하여 피타제를 생산하는 방법이 될수 있다. 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 이러한 방법에서 단계 (c)는 단계 (b)에서 회수한 상청액으로부터 피타제를 정제하는 것으로 구성된다. 피타제는 당업자에게 공지된 단백질을 농축하거나 분리하는 어떠한 기술, 특히, 미세여과, 초여과, 엘렉트로포레시스 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 정제된 피타제를 얻기 위해, 당업자는 상기 피타제를 함유하는 정제 분획을 확인하기 위해 피타제 활성을 측정하는 전술한 방법을 사용할 수 있을 것이다. 이 방법에 따르면, 생산된 피타제는 바람직하게는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 유리하기로는 100%의 순도를 가질 수 있다.

본 발명은, 본 발명에 따른 적어도 하나의 피타제를 포함하는 효소 조성물에 관한 것이기도 하다.

"효소 조성물"이라는 용어는 본 발명에 따른 적어도 하나의 피타제를 포함하는 조성물을 의미하는 것으로 하고, 상기 피타제는 그 안정성과 보존성을 증진시키는 여러 다양한 보조제와 배합되느냐에 따라 그 분율이 달라질 수 있다. 본 발명에 따른 효소 조성물에 사용될 수 있는 보조제의 예로는 소르비톨, 만니톨, 벤조에이트, 무기염 또는 식물오일을 언급할 수 있다. 본 발명에 따른 효소 조성물은, 상기 조성물과 이 조성물이 포함하는 피타제는 액체용액으로 존재하는 액체 형태이거나, 상기 조성물과 이 조성물이 포함하는 피타제는 분말로 존재하는 고형 형태 일 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따르면, 효소 조성물은 본 발명에 따른 피타제외에도 적어도 하나의 추가의 효소를 포함한다. 이 추가 효소는 피타젤 ㅘㄹ성을 가질 수도 있고 피타제 활성이 아닌 다른 활성을 가질 수도 있다. 이 추가 효소가 피타제 활성을 가질때는 이 활성은 본 발명에 따른 피타제의 활성과는 다른 상보적인 활성이다. 이 추가 효소가 피타제 활성이 아닌 활성을 가질때는 예컨대 자일란아제, 셀룰라아제, 베타-글루카나아제, 라미나리나아제, 페룰산 에스테라아제, 풀루라나아제, 프로테아제, 아미다아제, 포스파타아제 또는 만나나아제 활성을 가질 수 있다.

바람직하게는, 상기 효소 조성물은 사육동물, 특히, 위가 하나인 동물, 바람직하게는 돼지나 가금의 사료에 첨가되는 것으로 한다.

본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 피타제를 포함하는 사료 조성물에 관한 것이기도 하다.

"사료 조성물"이라는 용어는 본질적으로 가축동물, 특히 위가 하나인 동물, 바람직하게는 돼지나 가금을 위한 사료를 의미하는 것으로 한다. 본 발명에 따른 사료 조성물은 이상적으로는 본 발명에 따른 효소 조성물로 보충된 가축동물용 사료이다. 따라서, 본 발명에 따른 사료 조성물은 여기에 적어도 하나의 본 발명에 따른 효소 조성물이 첨가되어 사료와 효소 조성물이 혼합되어 상기 사료 조성물이 얻어지는 가축용 사료이다.

본 발명의 특정 한 양태에 따르면, 상기 사료 조성물은 본 발명에 따라 형질전호나된 적어도 하나의 숙주 유기체를 포함한다. 본 발명의 다른 특정 양태에 따르면, 상기 사료 조성물은 본 발명에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 유기체, 특히, 적어도 하나의 페니실리움 속 진균, 특히 페니실리움 sp. CBS109899 균주를 포함한다.

유리하기로는, 본 발명에 따른 사료 조성물은 위가 하나인 동물 영양공급을 위해 사용되는 것으로 한다. 본 발명의 한 특정 양태에 따르면, 상기 사료 조성물은 돼지 영양공급을 위한 것으로 한다. 본 발명의 다른 특정 양태에 따르면 상기 사료 조성물은 가금 영양공급을 위한 것으로 한다.

본 발명의 주제는 전술한 사료 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이기도 하다.

본 발명의 한 특정 양태에 따르면, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 유기체 또는 본 발명에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 유기체, 특히, 진균, 보다 정확하게는 페니실리움 속 진균, 특히, 페니실리움 sp. CBS 109899 균주를 배양하고, 이 배양된 유기체를 당업자에게 공지된 농축 방법, 특히 여과 또는 원심분리 방법을 사용하여 농축하는 단계 및 상기 농축된 유기체를 사료 조성물로 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 특정 양태에 따르면, 상기 방법은 전술한 바와 같이 피타제 활성을 갖는 추출물 또는 본 발명에 따른 피타제를 생산하는 한 방법에 따라 상기 추출물 또는 피타제를 생산한 다음 생산된 추출물 또는 피타제를 사료 조성물로 첨가하는 단계를 포함한다.

본 발명은, 본 발명에 따른 사료 조성물을 위가 하나인 동물에 공급함으로써 이 동물에 의한 식물-기초 사료의 파트산염에 포함된 무기 인산염의 소화를 증가시키는 방법에 관한 것이기도 하다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 사료 조성물을 위가 하나인 동물에 공급함으로써, 이 동물로부터 인의 배출을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 기탁번호 CBS 109899의 페니실리움 sp. 속의 사상진균에 관한 것이다.

하기 실시예로서 본 발명을 예시하나, 이러한 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 페니실리움 sp. CBS 109899 균주의 배양 및 특성 확인

1.1 특성

PDA 아가 배지( 24 g/ℓ 감자 덱스트로스 브로쓰, 16 g/ℓ 아가-아가)에서, CBS 109899 균주의 균사체가 30℃에서 발육되고, 노화되면, 색깔이 황색으로 된다. 페니실리움의 특징적인 구조없이 공기 균사체가 컬럼주위에서 관찰된다. MN-Uri 액체 배지(P.J. Punt, and C.A.M.J. J. van den Hondel,(1992) Methods inEnzymology 216,447-457)에서 28℃로 교반하면서 이틀동안 진균을 배양한 후, 균사체를 여과 회수하여 액체질소중에 분쇄하였다. 용해 완충액(1% SDS, 2% Triton X-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.0) 5 ㎖ 중에서 분쇄물질 1 g에 대해 당업자에게 잘 알려진 방법인 페놀-클로로포름법을 사용하여 게놈 DNA 추출을 하였다. 정제 후, 에탄올 2 부피를 부가하여 상기 게놈 DNA를 침전시켰다. 고성능 폴리머라아제와 프라이머 PN3(서열번호 5) 및 PN4(서열번호 6)을 이용하여 PCR 증폭시켜 서열화된 1175 bp 단편(서열번호 7)을 수득하였다.

PN3 : 5'-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3'

PN4 : 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'

데이타뱅크에서 이용가능한 ITS 서열을 사용하여 상기 전사된 내부 스페이서 서열을 정렬해보면 페니실리움 아쿨리아툼 서열로 확인되는 ITS 서열과 96%의 동일성 및 페니실리움 푸니쿨로섬 IMI 134756의 ITS 서열과 96%의 동일성을 보인다. 따라서, 상기 CBS 109899 균주를 페니실리움 종으로 명명하였다.

1.2. 배양 조건

상기 CBS 109899 균주를 배양하기 위한 합성배지를 결정하였다. 이 배지는 탈염수 중 글루코스 10 g/ℓ, NH₄N0₃0.1M, KH₂PO₄1.5 g/, KCl 0.5 g/ℓ, MgSO₄0.5 g/ℓ, MnCl₂10 mg/ℓ, ZnSO₄10 mg/ℓ및 FeSO₄10 mg/ℓ로 구성된다. 피타제 발현을 위해, PDA 배지에서 자란 콜로니로부터 취한 1 ㎠ 균사체 샘플을 30 ㎖의 MSP3 배지(글루코스 10 g/ℓ, NaNO₃, 피트산칼슘 20 g/ℓ, KC1 0.5 g/ℓ, MgS0₄0.5 g/ℓ, ZnSO₄2.2 mg/ℓ, H₃BO₃1.1 mg/ℓ, MnCl₂0.5 mg/ℓ, FeS0₄0.5 mg/ℓ, CaCl₂0. 17 mg/ℓ, CuSO₄0.16 mg/ℓ, Na₂MoO₄0.15 mg/ℓ 및 Na₂EDTA 5 mg/ℓ)에서 30℃로 7일간 교반 없이 항온배양하였다. 이 배양액을 5000 rpm으로 10분간 원심분리하고 실시예 2에 기재된 바와 같이 상청액을 분석하였다.

실시예 2: 피타제 활성 측정

쉬미즈 방법(Shimiz, 1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56(8), 1266-1269)에 기초하여 피타제 활성을 측정하였다. 이 방법의 원리는 피타제가 그 기질(1 mM CaCl₂를 함유하는 pH 5.5의 250 mM 아세테이트 완충액중에서 10 g/ℓ로 제조한 피트산나트륨 용액)과 효소반응하는 동안 분비되는 무기 인산염의 양을 측정하는 것으로 구성된다. 분비된 무기 인산염의 양은 이 인산염과 발색제(0.012 M H₂S0₄에서 몰리브산암모늄 4 부피와 즉석 혼합한 10.8%의 항산철 1 부피)와의 반응으로 측정한다. 이 반응은, 매우 산성인 배지에서, 유색의 포스포몰리브데이트 복합체(Fe²⁺존재하에)가 생성되게 하고 이 형성된 복합체의 양은 생성된 유색 용액의 700 nm에서의 흡광도를 분광광도계로 측정하여 정량한다. 세가지 반응을 나란히 실시하여 37℃에서 10분, 20분 및 30분에서의 효소 속도론을 얻었다. 20% 트리클로로아세트산 2.5 ㎖를 첨가하여 이 효소 반응을 중단시킨다. 20% 트리클로로아세트산과 이어서 피트산을 희석된 또는 희석되지 않은 상기 조추출물에 부가하여 샘플 혼란도를 측정한다. 1 mM CaCl₂를 함유하는 pH 5.5의 250 mM 아세테이트 완충액을 써서 효소 반응 블랭크를 제조한다. 반응이 중지된 후, 동일부피의 유색 시약[FeSO₄1 부피 + 헵타몰리브산암모늄 4 부피 용액]을 부가하여 분비된 인산염을 드러나게 하였다. 700 nm 분광광도계로 청색 강도를 측정하였다. 이는 0과 1 mM 범위의 KH₂PO₄를 이용하는 인산염 농도와 관련있다. 효소 속도론에서의 인산염의 출현률을 이용하여 효소 활성을 측정하였다.

실시예 3: 피타제 활성을 함유하는 진균 추출물의 분리

엘렌메이어 플라스크에서, 그리고, 3 내지 200 리터의 발효기에서 30℃로 8 내지 8일 동안 CBS 109899 균주를 배양한다. 생산 배지는 10 g/ℓ글루코스, 40 g/ℓ전분, 25 g/ℓ쌀겨, 20 g/ℓCa²⁺피트산염, 15 g/ℓ염화암모늄, 0.5 g/ℓ황산암모늄 및 0.9 g/ℓ제포제(antiforming agent)로 구성된다. pH는 5.5로 조정하나, 발효중에는 조절되지 않는다. 발효개시를 위해 4% 접종물을 사용한다. 이 접종물은 10 g/ℓ글루코스, 10 g/ℓ펩톤, 5 g/ℓNa-CMC, 0.5 g/ℓ황산마그네슘, 0.5 g/ℓ염화칼슘, 0.01 g/ℓFeS0₄ㆍ7H₂0 및 0.01 g/ℓMnSO₄ㆍ4H₂0로 구성된, 30℃에서의 3-4일 배양물이다. 이 접종물에 직접 포자 또는 아가(PDA 배지, 30℃ 10일)를 파종하고 그 위에서 진균을 배양한다. 또한 그 자체가 동일한 조건에서 제조된 3일 또는 4일 배양액으로 파종된다.

발효 끝무렵에, 전체 배양액을 여과하고 여과물을 10 kDa 파단을 갖는 유기 또는 무기막으로 초여과시켜 농축한다. 초여과 농축수 샘플에 대해 활성을 측정하는데 이는 초기 발효 부피와 관련있다.

발효기 부피	교반(rpm)	통기(aeration)(vvm)	활성(U/mL)
엘렌메이어 플라스크	220	-	45-63
3 L	450	1	45
30 L	400	1	55-66

실시예 4: 본 발명에 따라 분리된 피타제의 특성

실시예 2에 기재된 방법을 이용하여, 제공된 조 진균 추출물의 최적 pH 및 온도, pH 및 온도에 대한 안정성 및 마이클 상수를 결정하였다.

4.1.마이클 상수

기질 농도와 항온배양 시간을 변형시켜 마이클-멘텐 상수(Kmapp)와 최대 반응속도(Vmapp)를 얻었다. 진균 추출물에 함유된 피타제는 1분당 분비된 인산염 및 샘플 1 mg 당 Kmapp 550 μM 및 Vmapp 1.425 μmol으로 특징된다.

4.2. pH 함수로서의 피타제 활성

반응 완충액(pH 2: KCl-HCl 완충액; pH 3: 글리신-HCl 완충액; pH 4,5, 5.5 및 6: 아세트산나트륨 완충액; pH 7:트리스-HCl 완충액)의 성질과 pH를 변형시켜 최적 pH를 측정하였다. 도 1에 제시된 결과는 얻은 최대 효소 활성에 대하여 계산한 상대 활성을 나타낸다. 37℃에서 측정한 진균 추출물에 함유된 피아제의 최적 pH는 pH 4 내지 pH 5이다.

4.3. 온도함수로서의 피타제 활성

효소 반응을 위한 항온배양 온도를 변형시켜 최적 온도를 측정하였다. 도 2에 제시된 데이타는, 결정한 최대 효소 활성에 대하여 계산한 상대 활성을 나타낸다. pH 5.5에서 측정한 진균 추출물에 함유된 피아제의 최적 온도는 50℃ 영역이다.

4.4.pH 함수로서의 피타제 안정성

산 pH에 대한 피타제 활성의 저항성을 측정하였다. 41℃, pH 2 내지 pH 6.6 범위에 0 내지 180 분 동안 추출물을 노출시킨 후, 용액들을 희석하여 pH 5.5로 안정화시킨다. 그 다음, 실시예 2에 기재된 방법으로 활성을 측정한다. 결과는, 추출물의 피타제 활성은 pH 3.5 아래에서 상대적으로 안정하다는 것을 보여준다. 그러나, 그 이상의 pH, 특히 pH 2에서는 신속히 변성된다.

4.5. 온도함수로서의 피타제 안정성

60℃ 이상의 온도에서 피타제 활성의 열안정성을 평가하엿다. 추출물의 희석 용액(최종 농도 1 IU/㎖)을 시험 온도에서 소정의 시간(30분을 초과하지 않음) 동안 두었다. 주위 온도로 회복한 후, 각 열-처리된 용액을 실시예 1A에 기재된 방법에 따라 검정한다. 이 실험 수행 조건에서 60℃ 5분에서부터 피타제 활성이 대략 80% 감소하여 80℃ 1분 후에는 실제적으로 제로가 된다.

실시예 5: 본 발명에 따른 피타제 정제

실시예 3에서 얻은 진균 효소 추출물을 10 kDa 파단 막을 사용하여 초여과시켜 농축하였다. pH 3, 20 mM 글리신 완충액으로 수회 세척하여 상기 추출물의 이온 강도와 pH를 조정한다. 수득한 농축물을 고정 pH 3에서 SP10 컬럼(PerSeptive BiosSystems)에 두어 양이온 교환 크로마토그래피를 실시한다. 부착된 단백질을, 글리신 완충액에서 3 ㎖/min의 유속으로 0 내지 1M NaCl 계단 농도 구배로 전개시킨다. 대략 30% 1M NaCl에서 피타제 활성 피크를 얻는다. HR200 칼럼(Pharmaceia)에서 pH 5.5, 0.7 ㎖/min 유속의 50 mM 아세트산나트륨 완충액으로 겔 투과시켜 피타제와 기타 다른 활성 피크 성분을 분리한다. 수거 분획의 순도는 은 염색과 함께 비변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 측정한다. 측정 분자량 130 kDa의 단일 단백질 밴드가 겔에 존재한다. 그러나, 이 정제된 피타제를 SDS-PAGE 전기영동시킨 후에는 2개의 폴리펩티드 밴드가 관찰되었는데, 하나는 상대 이동거리가 70 kDa인 주 밴드이고 나머지 하나는 상대 이동 거리가 90 kDa인 부 밴드였다.

실시예 6: 정제된 피타제의 마이크로시퀀싱

6.1. N-말단 서열 결정

SDS-PAGE 전기영동으로 얻은 70 kDa 및 90 kDa 폴리펩티드 밴드에 해당하는 폴리펩티드를 4℃에서 15시간 동안 PVDF 막(ProBlott, Applied Biosystems)으로 이동시켰다. 이 폴리펩티드를 아미도 블랙 10B(Sigma)으로 염색하여 검출하고 시퀀싱하였다(Institute Pasteur, Laboratoire de Microsequencage des Proteines [Protein Microsequencing Laboratory], Paris). 상기 두 폴리펩티드 밴드에 대해서 동일한 N-말단 서열을 얻었다(서열번호 8).

6.2. 피타제 중간단편의 아미노산 서열 결정

상기 70 kDa 및 90 kDa 두개의 폴리펩티드를 SDS-PAGE 전기영동으로 분리하고 아미도 블랙으로 염색하여 검출하였다. 70 kDa 폴리펩티드 밴드를 겔에서 잘라내어 엔도리신-C로 37℃에서 18시간 동안 제자리(in situ)분해하였다. C18 DEAE 컬럼상에서 HPLC로 펩티드 단편을 분리하였다. 마이크로시퀀싱으로 4개의 중간단편 서열(서열번호 9, 10, 11 및 12)을 얻었다.

서열번호 8: IPTDPQVPQ/VYF

서열번호 9: TSGGDAVNEWTALYLQK

서열번호 10: AGGAPFLAQXNPIYXQPXYV

서열번호 11: LYDPASK

서열번호 12: APGLVR

실시예 7: 페니실리움 sp. CBS 109899와 관련된 분자 프로브 생산

마이크로시퀀싱 후, 상기 펩티드로부터 올리고누클레오티드를 추론하여, 페니실리움 sp. CBS 109899의 피타제를 암호화하는 유전자와 관련된 DNA 단편을 PCR로 증폭시켰다.

7.1. PCR 프라이머 고안

서열번호 9인 중간서열의 N-말단 아미노산 서열로부터 프라이머를 추론하였다. N-말단 끝 서열로부터 4개의 센스 축퇴 프라이머 풀을 얻었고, 서열번호 9인중간서열 1개의 역 축퇴 프라이머 풀을 얻었다. 각 풀의 센스 프라이머는 역 프라이머 풀과 별개로 사용되었다.

7.2. 피타제 관련 게놈성 DNA 단편의 증폭

먼저, 페니실리움 sp. CBS 109899를 액체 MN-Uri 배지(28℃, 180 rpm, 2일)에서 배양하였다. 여과로 균사체를 수거하고 액체 질소에소 분쇄하였다. 5 ㎖ 용해 완충액(1% SDS, 2% TritonX-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 10 mM Tris pH 8.0) 및 5 ㎖ 페놀에서 분쇄 물질 1g에 대해 게놈 DNA 추출을 하였다. 페놀/클로로포름 추출 및 클로로포름 추출로 수상을 정제한 후, 에탄을 2 부피를 부가하여 게놈 DNA를 침전시켰다.

Taq 폴리머라아제 1 단위(Q-BIOgene)와 MJ 리서치 열 순환 모델 PTC-200을 이용하여 게놈 DNA 100 ng에 대하여 PCR 반응을 실시하였다. 각 PCR로부터의 반응 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 분석하였다. 850 bp 영역에서 프라이머 OT ACS 17 P4.4(서열번호 13) 및 OT ACS 25 P6.1(서열번호 14)에 해당하는 누클레오티드 단편을 얻었고, 바로 pCR4-TOPO 벡터로 서브클로닝하여 시퀀싱하였다(서열번호 15).

서열분석 결과, 증폭에 사용된 두개의 프라이머가 증폭 단편 어느 하나에 존재하였고 이로부터 뒤따라 일어나는 추론된 아미노산 서열은 피타제를 마이크로시컨싱하여 얻은 서열과 긴밀히접촉되어 있다는 것을 알았다. 또한, 중간단편의 아미노산 서열인 서열번호 10과 서열번호 11은 상기 DNA 서열로부터 추론된 아미노산 서열내에 보였다. 이러한 관찰로부터, 증폭된 DNA 단편은 마이크로시퀀스된 피타제에 해당한다는 결론을 얻었고, 이는 OT ACS 29.1로 명명되었다. 이 DNA 단편은상기 정제된 피타제를 암호화하는 유전자를 클로닝하기 위해 상동성 분자 프로브로 사용되었다.

OT ACS 17 P4.4 (서열번호 13) 5'-ACNGAYCCNCARGTCCC

OT ACS 25 P6.1 (서열번호 14) 5'-GCNGTCCAYTCRTTNAC

실시예 8: 피타제와 관련된 cDNA 서열 결정

5' 및 3' RACE-PCR 기술에 따라, 5' 및 3' 말단을 증폭, 서브클로닝 및 시퀀싱하여 cDNA 전서열을 얻었다.

먼저, 전분가루 40 g/ℓ, 쌀겨 25 g/ℓ, 피트산칼슘 20 g/ℓ, 글루코스 10 g/ℓ, NH₄C1 15 g/ℓ 및 MgSO₄.7H₂O 0.5 g/ℓ로 구성된 pH 5.5의 매질에서 피타제 유도 조건 하에 페니실리움 sp. CBS 109899을 배양하고, 글루코아밀라아제 AMG 300 L(Novozymes) 0.06 g/ℓ와 알파 아밀라아제 Termamyl 120 L(Novozymes) 0.18 g/ℓ를 보충하였다. 10 U/㎖ 배양배지의 피타제 활성을 얻을 때까지 배양하였다. 여과지(Whatman)로 배양액을 여과시켜 균사체를 회수하고 액체 질소에서 분쇄하였다. 10 mM EDTA를 함유하는 pH 5.3의 50 mM 아세트산나트륨 완충액에서 페놀 추출에 의해 분쇄물질로부터 전체 RNA를 추출하였다. 그 다음, 진레이서 키트(GeneRacer kit, Invitrogen)를 사용하여 mRNA를 역전사하였다. 합성된 cDNA는, 후속하는 PCR 증폭을 위해 5' 및 3' 말단에 소정의 누크레오티드 서열을 가졌다. 관심대상의 cDNA 말단을 특이적으로 증폭시키기 위해, 2개의 프라이머, 즉, 하나는 5' 말단을향해 배향되고 OT ACS 37 P1(서열번호 20)으로 명명되는 것이고 나머지 하나는 3' 말단을 향해 배향되고 OT AST 37 P1(서열번호 20)으로 명명되는 두 개의 프라이머를, 서열번호 10인 펩티드 서열과 관련된 영역에서 추론하였다.

Tag 폴리머라아제 1 단위(Q-BIOgene)를 가지고 MJ 리서치 열 순환기 모델 PTC-200을 이용하여 cDNA 합성물 1 ㎕에 대해 PCR 반응을 실시하였다. 이 증폭 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 분석하였다. 5' 말단과 관련된 0.3 kb 영역에 있는 단편과 3' 말단과 관련된 1.7 kb 영역에 있는 다른 단편을 바로 벡터 pCR4-TOPO(Invitrogen)로 서브클로닝 한 다음 시퀀싱하였다. 완전한 cDNA 서열을 재구성하였다(서열번호 2).

OT ACS 37 PI (서열번호: 20) 5'-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3'

OT ACS 37 P3 (서열번호: 21) 5'-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3'

8.2. 유전자를 함유하는 EcoRV 게놈 DNA 단편의 서브클로닝

게놈 워킹 기술을 이용하여 게놈 DNA 단편을 클로닝하였다. 먼저, EcoRV 제한 단편에 어댑터를 연결하였다. 이를 위해, MgCl₂10 mM, 디티오트레이톨 10 mM , ATP 1 mM 및 소 혈청 알부민 0.25 ug/㎖을 하유하는 pH 7.5의 트리스-HCl 완충액 50 mM에서 T4 DNA 리가아제를 사용하여 16℃, 15시간 동안, 페니실리움 sp. CBS 109899의 게놈 cDNA의 EcoRV 분해산물을 게놈 워커 어댑터(Genome Walker Adaptor)(CLONTECH Laboratory, Inc)에 연결하였다. 70℃ 열처리로 반응을 중단하고 반응 혼합물을 초순도 물 200 ㎕에 넣었다.

PCR 반응으로 EcoRV 제한 단편의 5' 및 3' 영역을 증폭시키기 위해, 분자 프로브로부터 두개의 센스 프라이머를 추론하였는데, 하나는 5' 말단 배향된 OT ACS32P5(서열번호: 16)로 명명된 것이고 다른 하나는 3' 말단 배향된 OT ACS32P3(서열번호: 17)로 명명된 것이다. PCR 반응에 사용된 어댑터 프라이머(CLONTECH Laboratory, Inc)로 명명된 역프라이머는 어댑터의 5' 말단 서열에 해당하였다.

어드밴티지 게놈믹 폴리머라아제 믹스(Advantage Genomic Polymerase Mix, CLONTECH Laboratory, Inc) 1 단위를 가지고 MJ 리서치 열 순환기 모델 PTC-200을 이용하여 상기 연결 생성물 1 ㎕에 대해 PCR 반응을 실시하였다. 각 PCR 반응 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 분석하였다.

두개의 단편, 즉, 5' 말단과 관련된 1.8 kb 영역에 있는 단편과 3' 말단과 관련된 1.3 kb 영역에 있는 다른 단편을 서브클로닝하여 시퀀싱으로 분석하였다. 일단 EcoRV 단편의 5' 및 3' 누클레오티드 서열이 이용가능하게 되면, 상기 말단들에 특이적인 프라이머를 고안하여 OT ACS38PI (서열번호: 18) 및 OT ACS38P2(서열번호: 19)로 명명하였다. 이 단편은 고성능 폴리머라아제를 사용하여 그 전체를 증폭시켰다. PZATINUM Pfx DNA 폴리머라아제(Life Technologies, Inc.) 1 단위를 가지고 MJ 리서치 열 순환기 모델 PTC-200을 이용하여 페니실리움 sp. CBS 109899의 게놈 DNA 100 ng에 대해 PCR 반응을 실시하였다. 증폭 생성물을 0.8% 아가로스 겔에서 분석하였다. 3.8 kb 단편을 바로 pCR4-TOPO(Invitrogen) 벡터로 서브클로닝하고 시퀀싱한 후(서열번호 1) OT ACS 38.1로 명명하였다.

8.3. cDNA 및 그 유전자 서열의 분석

cDNA로부터 아미노산 서열을 추론하여 분석하였다(서열번호 3). 마이크로시퀀싱으로 얻은 피타제의 중간 펩티드 서열 모두가 이 아미노산 서열에서 발견되었고, 이로 인해 상기 시퀀싱된 cDNA가 관심대상의 피타제에 해당한다는 것이 확인되었다. 또한, 상기 추론된 아미노산 서열은 결합 특이 부위(RHGXRXP)와 인산염의 친핵성 공격 부위(HD)를 포함하는데, 이에 의해 히스티딘 산 포스파타아제 그룹에 속하는 피타제가 특징된다. 상기 cDNA 서열과 게놈 DNA 단편 OT ACS 38.1을 배열시켜 관심대상 유전자의 정확한 한계를 결정할 수 있었고 여기에 포함된 인트론의 위치를 찾을 수 있었다.

실시예 9: 상동성 서열 연구

9.1. 페니실리움 푸니쿨로섬 IMI 134756의 코스미드 라이브러리 구성

P. 푸니쿨로섬 IMI 134756을 MN-Uri 배지(28℃, 180 rpm, 2일)에서 배양하였다. 균사체를 여과 회수하고 액체 질소에서 분쇄하였다. 용해 완충액 5㎖(1% SDS, 2% TritonX-100, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8.0)와 페놀 5 ㎖에서, 분쇄물질 1 g에 대해 게놈 DNA 추출을 실시하였다. 페놀/클로로포름 및 클로로포름으로 상기 수상을 정제한 후 에탄올 2 부피를 가하여 상기 게놈 DNA를 침전시켰다.

SalI 제한 효소를 사용하여 게놈 DNA 20㎍을 부분 분해한 생성물을 아가로스(저 융점) 겔에 로딩시켜 그 안에서 0.5 x TBE 완충액에서 펄스장 전기영동(18시간, 5 V/cm)받도록 하였다. 에티듐 브로마이드로 염색한 후, β-아가라아제(GIBCO-BRL)로 분해하여 겔로부터 30 kb 내지 40 kb 길이 DNA 단편을 분리시킨 후 에탄올로 침전시켰다. 일정분획의 이 게놈 DNA를, XhoI로 분해하고 송아지 장 포스파타아제로 미리 탈인산화시킨 벡터 pMOCosX(Orbach, 1994, GENE 150, pp159-162)에 연결시켰다. 이 연결 생성물은 λ-파아지(Packaging Protocol - STRATAGENE; Gigapack Gold-11) 인자와 접촉시켰는데 이로 인해 E. coli 균주 Q358(Maniatis et al., 1982)를 트랜스펙션시킬 수 있었다. 암피실린 50 ㎍/㎖이 보충된 루리아 및 버타니(LB) 아가 배지에 플레이팅 한 후 콜로니를 50개의 96-웰 미세적정 플레이트에 취하여, 암피실린 50 ㎍/㎖이 보충된 LB 150 ㎕에서 밤새 배양하였다. 이 배양액들은 하이본드(Hybond) N+ 막(AMERSHAM)에서 복제되었고 최종 농도 50%의 글리세롤로 보충된 후 -80℃에 보관되었다.

9.2. 프로브 OT ACS 29.1에 의한 코스미드 라이브러리 스크리닝

프로브 OT ACS 29.1을 사용하여 P. 푸니쿨로섬 IMI 134756 균주의 게놈 DNA를 서던 블롯팅으로 분석하였다. 사전에 몇몇 제한 엔도누클레아제에 의해 분해되고 전기영동으로 분리된 게놈 DNA가 이동한 막을 하이브리드 완충액(7% SDS; 인산나트륨 0.5 M, pH 7.0)에서 65℃로 10분간 전-하이브리드화 하였다. DNA 표지 키트(Amersham)를 사용하여 α-³²P dCTP로 프로브를 표지하였다. 표지된 프로브를 하이브리드화 완충액에 넣고 이 혼합물을 사용전 100℃에서 5분간 가열하였다. 하이브리드화는 65℃에서 6시간 실시하였다. 하이브리드화 후, 막을 65℃에서 세척 완충액(1% SDS; 인산나트륨 0.1 M, pH 7.0)에서 15분간 세차례 세척한 다음 노출시켰다. 이 분석은 하나의 신호만을 보여주었다. 따라서, P. 푸니콜로섬 IMI 134756의 게놈은 오직 하니의 관심 유전자 복사만을 함유한다. 다음, 코스미드 라이브러리를 동일한 스트린전트 조건하에서 OT ACS 29.1을 사용하여 스크리닝하였고, 막 15번, 19번 및 48번에서 수개의 신호이 밝혀졌다. 막 15번에 관련된 코스미드 15F10은 이렇게 프로프 OT ACS 29.1과 하이브리드된 DNA 서열을 함유하는 것으로 확인되었다. 이 코스미드의 DNA에 대하여 제한 분석을 실시하여 그 상응하는 유전자 위치를 결정하였다. 이 유전자는 phyF로 명명되었다. 코스미드 15F10의 1.3 kb NcoI 단편을 클로닝하고 시퀀싱하였더니 OT ACS 29.1 서열과 강한 상동성을 보였다. 전체 phyF 유전자는 2.7 kb EcoRV - EcoRI 단편에 위치하였는데, 이를 클로닝 및 시퀀싱하였다(서열번호 4).

서열분석은 790 bp 프로모터 영역과 ATG 791에서 phyF를 암호화하는 서열의 시작을 보인다. phyF 유전자는 35 bp와 61 bp 길이의 두개의 추정 인트론을 포함하여 1536 bp (위치 791-2527)를 가진다.

실시예 10: OT ACS 38.1(서열번호 1)에 함유된 유전자의 재조합 발현

10.1. P. 푸니쿨로섬 IMI 134756으로의 유전자 다중 복사 도입

클로닝된 유전자(OT ACS 38.1)를 확인하기 위해, 피타제를 거의 생산하지 않는 푸니쿨로섬 IMI 134756으로의 유전자 다중 복사를 도입하고, 형질전환된 클론이 생산성에 있어 증가를 보이는지를 관찰하였다.

이를 위해, P. 푸니쿨로섬 IMI 134756을 WO 00/68410에 기재된 방법에 따라OT ACS 38.1 단편을 포함하는 플라스미드 및 pAN7-1 플라스미드(Punt et al., 1987; Gene, 56:117-24)와 함께 공-형질전환하였고 이는 하이그로마이신으로 선택 가능하다. 형질전환 후, 관심 유전자의 다중복사 통합을 분자 프로브 OT ACS 29.1을 사용하여 서던 분석으로 확인하였다. 서던 블롯팅은 실시예 9에 기재된 조건에 따라 EcoRI 제한 엔도누클레아제로 분해된 후보물질 게놈 DNA에 대해 실시하였다.

피트산칼슘 20 g/ℓ,글루코스 10 g/ℓ, NH₄NO₃8 g/ℓ ,KCl 5 g/ℓ 및 MgSO₄ㆍ7H₂O 5 g/ℓ로 구성된 배지 50 ㎖에서 피타제 유도를 위한 조건하에 양성 후보물질을 배양하고, 흔적원소 1 ㎖/l(2.2% ZnSO₄ㆍ7H₂O, 1.1% H₃BO₃, 0.5% MnCl₂ㆍ4H₂O, 0.5% FeSO₄ㆍ7H₂O, 0.17% CoCl₂ㆍ6H₂O, 0.16% CuSO₄ㆍ5H₂O, 0.15% Na₂MoO₄ㆍ2H₂O 및 5.0% Na₂EDTA, pH 6.5)로 보충하였다. 시간에 따라 배지내 피타제 활성을 측정하였다.

OT ACS 38.1로 형질전환된 P. 푸니쿨로섬 IMI 134756 및 야생형 P. 푸니쿨로섬 IMI 134756으로 구성된 두개의 후보물질 배양액에서의 피타제 활성(U/㎖) 모니터링

일수	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D11	D12	D14
IMI 134756	0	0	0	1.1	0.8	0.9	1.3	1.2	0.9	1.5	1.4
후보 1	0	0	0	2	1.3	1.2	2.2	1.7	2.5	3.6	4.1
후보 2	0	0	0	2.2	1.8	1.4	1.4	1.3	2	2.6	3

배지내 피타제 활성의 모니터링은, OT ACS 38.1의 다중복제가 그 게놈내로 통합된 두 시험 후보물질에 있어서 피타제 생산성은 2배 내지 2.5배 배가되었다.이 결과는 OT ACS 38.1 단편에 함유된 관심 유전자가 피타제를 암호화한다는 것과 페니실리움 균주의 피타제 생산성은 그 게놈 내 유전자의 복제 수를 배가함으로써 증가될 수 있다는 것을 확인해주는 것이다.

10.2.: 이종성 프로모터 조절하에 유전자 발현

WO 00/68410에 기재된 cs131 유전자의 프로모터와 터미네이터를 함유하는 발현 카세트를 사용하여 관심 피타제를 암호화하는 게놈 DNA 단편 OT ACS 38.1 영역을 발현시켰다. 이를 위해, SwaI 부위가 프로모터 말단에 도입된 후, SwaI/SpeI 제한 엔도누클레아제로 발현 카세트를 분해하였다. 게놈 DNA 단편 OT ACS 38.1SO 함유된 피타제를 암호화하는 영역을 하기 프라이머를 이용하여 증폭하였다:

phyGoamp4 5'TAGATATCACGATGCTCAAGCTATATGTAGCTGC 3' (서열번호: 22) 및

phyGoampS 5'ATACTAGTTTAGGACGTAGCATTCTTCGGAATAG 3' (서열번호: 23)

10 pmol의 각 프라이머와 1 단위의 PLATINUM Pfx DNA 폴리머라아제(Life Technologys, Inc.)를 가지고 MJ 리서치 열 순환기 모델 PTC-200D을 이용하여 이 폴리머라아제(Life Technologies, Inc.)와 관련된 완충액 50 ㎕에서 PCR 반응을 실시하였다. PCR 생성물을 EcoRV 및 SpeI 제한 엔도누클레아제로 분해하였고 벡터 pBCMT 내로 연결하였다. 이렇게 얻은 플라스미드를 pCP로 명명하였다.

P. 푸니쿨로섬 IMI 134756을 WO 00/68410에 기재된 방법에 따라 OT ACS 38.1 단편을 포함하는 플라스미드 및 pAN7-1 플라스미드(Punt et al., 1987; Gene, 56:117-24)와 함께 공-형질전환하였고, 이는 하이그로마이신으로 선택이 가능해진다. 후보물질의 게놈으로의 pCP 카세트의 통합은 분자 프로브 OT ACS 28.1을 사용하는 서던 분석을 이용하여, EcoRI 제한 엔도누클레아제로 분해된 8개의 후보물질 게놈 DNA에 대하여 확인하였다. 분석 후, 4개의 공-형질전환체가 선택되어 cs131 프로모터 유도 조건에서 배양되었다. 유전자 발현을 분석하고 피타제 활성을 측정하였다.

선택된 4개의 후보들을 1%의 Corn Steep Liquor가 보충된 50 ㎖의 최소 배지가 있는 125 ㎖ 엘렌메이어 플라스크에서 배양하였다. 28℃, 180 rpm에서 48시간 및 72시간 배양한 후 균사체를 수거하였고, 각 샘플 20 ㎍의 총 RNA에 대해 프로브 OT ACS29.1을 이용하여 노던 분석을 하였다(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). 막을 세척한 후 STORM 인영상제(Molecular Dynamics)를 사용하여 신호을 가시화하였다.

그 결과, pCP로 형질전환된 후보물질에서만 신호가 존재하고 비형질전환된 대조군에서는 신호이 존재하지 않는 것을 알았고, 이는 cs131 프로모터 조절하에서 유전자가 발현되었다는 것을 증명해주는 것이다.

병행하여, 각 배양액의 상청액에서 피타제 활성을 측정하였다. 그 결과가 [표 3]에 기재되어 있다.

pCP로 형질전환되고 cs131 프로모터 유도 조건에서 48시간 및 72시간 배양된 4개의 후보물질의 배양액 상청에서 피타제 활성 측정(U/㎖)

	48시간	72시간
대조군	0	0
후보 1	1	1.2
후보 2	0.8	1.7
후보 3	0.7	1.2
후보 4	1.7	2.9

결과 분석에 의해 pCP로 형질전화된 후보에 해당하는 상청액에서만 피타제 활성이 존재한다는 것을 알았다. 이 결과는 유전자 발현과 일치하는 것이고 게놈 DAN 단편이 피타제를 암호화하는 유전자를 함유한다는 것을 증명해주는 것이다.

실시예 11: 페니실리움 sp. CBS 109899 균주의 배양 조건 최적화

11.1. 피타제 생산에 미치는 교반(진동)의 영향

교반 속도가 400 rpm 내지 450 rpm인 실시예 3의 조건에서 발효를 실시하였다(표4).

발효기 부피	교반(진동)(rpm)	활성(U/mL)
30L	400	66
30L	425	48
30L	450	36

이 결과는 교반을 증가시키면 자연의 페니실리움 sp. CBS 109899 균주의 피타제 생성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여준다.

11.2. 피타제 생산에 미치는 질소원의 영향

실시예 3의 조건에서 발효를 실시하였다. 유일한 변화 파라미터는 질소원(쌀겨)으로 다른 종류의 질소원인 콩겨(soya bran)으로 대체된다(표 5).

질소원	활성(%)
쌀겨	100%
콩겨	128%

이 결과는 자연의 페니실리움 sp. CBS 109899 균주에 의한 피타제 생산에 질소원이 영향을 미친다는 것을 보여준다. 특히, 질소원으로서의 콩겨는 피타제 생산을 촉진한다.

11.3. 피타제 생산에 미치는 피트산염원의 영향

실시예 3의 조건에서 발효를 실시하였다. 변화되는 유일한 파라미터는 Ca++ 피트산염으로 이는 Ca++ 및 Mg++ 이중염을 대체된다(표 6).

피트산염 염	활성(%)
Ca++ 염	100%
Ca++ 및 Mg++ 염	120%

이 결과는 피트산염원이 자연의 페니실리움 sp. CBS 109899 균주에 의한 피타제 생산에 영향을 미친다는 것을 보여준다. 특히, 피트산염원으로서의 칼슘 및 마그네슘 이중염은 칼슘염에 비하여 피타제 생산을 증가시킨다.

11.4. 피타제 생산에 미치는 피트산염량의 영향

실시예 3의 조건에서 발효를 실시하였다. 변화되는 유일한 파라미터는 발효 배지에 존재하는 피트산염의 양이다(표 7).

Ca++ 피트산염(g/L)	활성(%)
20	100%
15	70%
10	60%
0	1%

이 결과는 발효 배지에 존재하는 피트산염량과 함께 자연의 페니실리움 sp.CBS 109899 균주에 의한 피타제 생산이 유의성있게 증가한다는 것을 보여준다.

실시예 12: 페니실리움 sp. CBS 109899 균주에 의한 피타제 생산의 축산학적 효율

12.1. 수탁의 인 소화력에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

수탁 20마리에 대하여 실험하였다. 동물들을 10 마리씩 2 그룹으로 나누어, 한 그룹은 피타제 보충 식이 처리를 하고 한 그룹은 대조군으로 하여 우리에서 독립적으로 사육하였다. 이 동물들에게 소화성 인(P)이 결핍된 옥수수와 대두에 기초한 사료를 공급하였고, 실험군인 처리군 동물에게는 사료 1 kg당 702 IU(International Unit = pH 5.5, 37℃에서 1분당 인산염 1 μmol을 분비할 수 있는 피타제 양, 10 g/l의 피트산나트륨 용액)의 피타제가 보충된 사료를 공급하였다.

인 배설을 분석하기 위해 실험을 시작한지 이틀 및 사흘 후에 동물들의 변을 수거하였다. 인 소화력은 섭취된 양에 대한 동물에 의해 동화된 인 퍼센트에 상응한다. 이 퍼센트는 변에서 발견된 배설량으로부터 산출된다(표 8).

인 섭취, 배설 및 소화력

	섭취(g/kg)	배설(g/kg)	소화력(%)
기본 사료	0.804±0.003	0.319±0.019	60.3±2.5
702 IU/kg으로 보충된 사료	0.801±0.011	0.255±0.028	68.1±4.4

[표 8]의 결과는 소화성 인이 결핍된 기본 사료를 본 발명에 따른 피타제로보충하면 인 배설이 유의성 있게(p<0.05) 감소한다는 것을 명확히 보여준다. 이 효과는 보충 사료를 공급한 동물에서 인 소화력이 증가하는 것을 반영한다. 이는 사료섭취의 비소화성 인 분비에 있어서 본 발명에 따른 피타제의 효율을 보여준다.

12.2. 닭 성장에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

Ross 308 종 닭 210마리에 대해 실험하였다. 이 동물들을 35 마리씩 6 그룹으로 나누어, 4 그룹은 다양한 양의 피타제로 처리하고, 한 그룹은 처리하지 않은 음성 대조군으로 하고, 한 그룹은 무기인으로 처리한 양성 대조군으로 하였다. 이 동물들을 한 우리당 5마리의 비율로 사육하고 13일 동안(9일짜리에서 22일짜리) 사료를 공급하였다. 옥수수와 대두로 구성된 소화성 인(P) 결핍 기본사료를, 4 그룹의 처리군을 위해 서로 다른 4가지 농도의 피타제(사료 1 kg 당 243, 433, 738 및 1234 IU의 피타제)로 보충하고, 양성 대조군을 위해서는 인산일칼슘 또는 인산이칼슘 형태의 0.1%의 무기인으로 보충한다.

실험초기와 끝무렵의 실험동물 체중을 재어 성장을 측정하였다. 이 측정으로 체중 증가와 소비지수(CI)를 결정할 수 있다. 소비지수는 증가된 체중에 대한 소비된 사료의 양에 해당한다. 소정량의 사료에서 소비지수의 감소는 동물의 체중증가의 증가, 즉, 더 나은 동물에 의한 사료 동화를 의미한다. 이 결과를 [표 9]에 기재한다.

닭 성장에 미치는 피타제 영향

처리	음성대조군	243 IU/kg	433 IU/kg	738 IU/kg	1234 IU/kg	양성대조군
체중증가(g)	216±76	369±88	435±82	452±97	497±81	461±72
CI	2.28±0.91	1.74±0.52	1.57±0.34	1.61±0.44	1.51±0.26	1.51±0.23

이 결과는 소화성 인이 결핍된 기본사료를 본 발명에 따른 243, 433, 738 및 1234 IU/kg의 피타제로 보충하면 각각 1.7배, 2.0배, 2.1배 및 2.3배 증가된 체중 증가를 얻을 수 있다는 것을 보여준다. 가장 높은 양 조차도 무기인으로 사료를 보충하는 것보다 더 큰 체중 증가를 얻을 수 있게 한다. 이 보충으로 인해 소비지수가 평균 33% 증가할 수 있다.

12.3. 닭에서 골 무기질화에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

Ross 308 종 닭 210 마리에 대하여 실험을 하였다. 이 동물들을 35 마리씩 6 그룹으로 나누어, 4 그룹은 다양한 양의 피타제로 처리하고, 한 그룹은 처리하지 않은 음성 대조군으로 하며, 한 그룹은 무기인으로 처리한 양성 대조군으로 하였다. 이 동물들을 한 우리당 5마리의 비율로 사육하고 13일 동안(9일짜리에서 22일짜리) 사료를 공급하였다. 옥수수와 대두로 구성된 소화성 인(P) 결핍 기본사료를, 4 그룹의 처리군을 위해 서로 다른 4가지 농도의 피타제(사료 1 kg 당 243, 433, 738 및 1234 IU의 피타제)로 보충하고, 양성 대조군을 위해서는 인산일칼슘 또는 인산이칼슘 형태의 0.1%의 무기인으로 보충한다.

14일째에 각 동물에서 경골을 취한다. 각 경골의 중량을 재고 화장시켜 그 재, 칼슘함량 및 인 함량을 분석한다. 그 결과가 [표 10]에 기재되어 있다.

닭의 골 무기질화에 미치는 피타제 영향

처리	음성대조군	243 IU/kg	433 IU/kg	738 IU/kg	1234 IU/kg	양성대조군
경골 인(mg)	89.1	138.2	157.8	180.1	215.9	184.1
SD	±22.5	±21.4	±28.1	±41.2	±37.6	±14.8
경골칼슘(mg)	43	66.7	76.8	87.8	103.6	89.7
SD	±9.6	±9.3	±13.6	±18.6	±19.3	±8.0
경골 재(mg)	309	473	527	594	683	602
SD	±71	±54	±71	±102	±106	±42

이 결과는 본 발명에 따른 피타제로 사료를 보충하면 시험된 모든 농도에서 닭의 골 무기질화에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 명확히 보여준다. 특히, 본 발명에 따른 피타제는 골의 칼슘 및 인 무기질화, 그리고, 회 질량을 촉진한다. 또한, 각 측정파라미터에서 용량 효과가 관찰된다.

12.4. 돼지에서 인 및 칼슘 소화력에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

평균 근사 체중이 70 kg인 돼지 7마리에 대하여 실험을 하였다. 회장 내용물을 정량적으로 수거할 수 있도록 이 동물들에게 회직장 문합 시술을 하였다. 이 동물들은 실험 목적을 위해 개별적으로 사육되었다.

동물들에게 옥수수 및 대두에 기초환 세가지 사료를 공급하였다. 사료 1 kg 당 300 내지 600 IU 보충하였다. 7일째 회장 내용물을 수거한 후 동물들의 사료를 변경하였다. 회장 내용물내 칼슘 및 인 함량을 분석하고, 이 두 원소의 소화율을 측정하였다. 그 결과가 [표 11]에 있다.

돼지에서 칼슘 및 인 소화율에 미치는 피타제 영향

	대조군	300 IU/kg	600 IU/kg
Ca 소화율(%)	42.73 ±7.40	45.26 ±2.49	47.09 ±8.14
P 소화율(%)	39.46 ±11.86	43.06 ±9.11	47.52 ±15.23

본 발명에 따른 피타제로 사료를 보충하면 칼슘 및 인의 소화율이 유의성있게 증가한다. 사료 1 kg 당 300 및 600 IU/kg 보충한 사료에서, 칼슘 소화율은 각각 5.6% 및 9.3% 증가하였고, 인 소화율은 각각 8.4% 및 17% 증가하였다.

12.5. 새끼돼지에서 인 소화율에 미치는 피타제-보충 식이

평균 근사 체중이 11 kg인 새끼돼지 12마리에 대하여 실험을 하였다. 동물들을 6마리씩 2 그룹으로 나누어 한 그룹은 실험군으로 다른 한 그룹은 대조군으로 하고 우리에서 개별적으로 사육하였다. 26일 동안 소화성 인(P)이 결핍된 옥수수 및 대두에 기초한 사료를 공급하였고, 사료 1 kg 당 481 IU를 보충하였다. 실험 21일째부터 5일 동안 동물들의 변을 수거하여, 그 인 함량 및 칼슘 함량을 분석하였다. 인 소화율은 동물의 섭취량에 대한 동물의 인 및 칼슘 동화량 퍼센트에 해당한다. 이 퍼센트는 변에서 발견되는 배설량으로부터 추산된다(표 12).

새끼 돼지에서 인 소화율에 미치는 피타제 영향

	섭취 (g)	배설 (g)	소화율 (%)
인
대조군	1.007 ±0.127	0.800 ±0.078	20.11 ±5.79
481 IU/kg	1.145 ±0.124	0.573 ±0.111	50.28 ±6.52
칼슘
대조군	1.873 ±0.237	1.228 ±0.180	34.2 ±7.73
481 IU/kg	2.131 ±0.234	1.102 ±0.102	48.62 ±8.44

이 결과는 본 발명에 따른 피타제를 사료에 보충하면 인 소화율이 250% 칼슘 소화율이 42% 증가한다는 것을 보여준다.

12.6. 새끼 돼지 성장에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

평균 근사 체중이 11 kg인 새끼 돼지 12 마리에 대하여 실험을 하였다. 동물들을 6마리씩 2 그룹으로 나누어 한 그룹은 실험군으로 다른 한 그룹은 대조군으로 하고 우리에서 개별적으로 사육하였다. 26일 동안 소화성 인(P)이 결핍된 옥수수 및 대두에 기초한 사료를 공급하였고, 사료 1 kg 당 481 IU를 보충하였다.

실험 초기와 실험 끝에 동물들의 체중을 재어 성장을 측정하였다. 이 측정으로 체중 증가와 소비지수(CI)를 결정할 수 있었다. 그 결과가 [표 13]에 기재되어 있다.

새끼 돼지 성장에 미치는 피타제의 영향

처리	대조군	481 IU/kg
초기 체중(kg)	6.81 ±0.69	6.75 ±0.88
최종 체중(kg)	13.34 ±1.58	14.86 ±1.41
체중 증가(kg)	6.53 ±1.72	8.11 ±1.66
CI	2.31 ±1.85	1.63 ±0.88

이 결과는 소화성 인이 결핍된 기본 사료에 본 발명에 따른 피타제 481 IU/kg을 보충하면 체중이 24% 증가한다는 것을 보여준다. 이 보충은 소비지수도 감소시킨다.

12.7. 새끼돼지의 골 무기질화에 미치는 피타제-보충 식이의 영향

평균 근사 체중이 11 kg인 새끼 돼지 12 마리에 대하여 실험을 하였다. 동물들을 6마리씩 2 그룹으로 나누어 한 그룹은 실험군으로 다른 한 그룹은 대조군으로 하고 우리에서 개별적으로 사육하였다. 26일 동안 소화성 인(P)이 결핍된 옥수수 및 대두에 기초한 사료를 공급하였고, 사료 1 kg 당 481 IU를 보충하였다.

27일째에 각 동물로부터 경골을 채취한다. 각 경골의 무게를 재고 화장시켜 그 무기질, 칼슘과 인 함량을 분석한다. 결과가 [표 14]에 기재되어 있다.

처리	대조군	481 IU/kg
경골 인 (%)	1.66 ±0.10	2.18 ±0.09
경골 칼슘 (%)	3.56 ±0.30	4.69 ±0.42
무기질 (%)	10.45 ±0.69	13.12 ±0.55

이 결과는 소화성 인이 결핍된 기본 사료에 본 발명에 따른 피타제 481 IU/kg을 보충하면 새끼 돼지의 골 무기질화가 유의성있게 증가한다는 것을 보여준다. 특히, 본 발명에 따른 피타제는 골의 칼슘 및 인 무기질화 및 이의 무기질량에 유리하다.

<110> ADISSEO FRANCE S.A.S. <120> Novel phytases and method for producing these phytases <130> IP2004423 <150> FR 01/15954 <151> 2001-12-10 <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3753 <212> DNA <213> Penicillium sp CBS 109899 <220> <221> intron <222> (1491)..(1550) <220> <221> intron <222> (1703)..(1764) <400> 1 ggctttgctg gtgcggggtg agtccgctgg ttggctcgct tctgctgttg cgatttcagc 60 gtcggcttgg gctatgatag ccgccagggt ggctgcgact cggtcatgga gctgtgcgag 120 agtctcacca cgtcgcggtg ggatcacaaa tggtttgtag agactttcag ggttttcggc 180 aaggcaagtt gagaaatgag ggtacagaac atttgccgaa acgggagcgg gaggttcaaa 240 tgtgatgcct ccgaaccatt cgctatgtta aagctgtcaa tcttcttttt cttaatcata 300 ccaatggatg actgccctac cctaatccat tttcgactct gacgttgaga tctgtcccag 360 cgtcaagatt tatctcggct gactgggatt tcttcgctaa ctgctccacg gttggctgga 420 ttgtctgcat gcatcgatag aacggactag aataaatccg aaatggtttt gggatgaagt 480 tagggctact aatatgcgat gcgagctcat gggattgttt gacaccgctt ggattcaagg 540 ttgggtctgc gccattgccg gttggtgtag gaaattctgg 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Ser Leu Ile Gly Ser His Ile Val Pro Phe Ser 420 425 430 Ala Thr Phe Val Phe Glu Ile Ile Lys Ala Pro Gly Leu Val Arg Glu 435 440 445 Asn Arg Ser Lys Tyr Cys Gly Glu Ser Val Tyr Glu Asn Thr Ser Glu 450 455 460 Glu Thr Thr Tyr Ile His Leu Val Ile Asn Gln Arg Thr Val Pro Leu 465 470 475 480 Gly Gln Ser Ile Ser Ala Cys Gly Gln Arg Asp Asp Gly Trp Cys Glu 485 490 495 Ile Ser Ala Phe Ile Gln Ala Gln Lys Glu Asn Ile Val Lys Ala Asn 500 505 510 Tyr Glu Glu Ser Cys Phe Gly Asn Trp Ser Ile Pro Ala Tyr Gly Glu 515 520 525 Ile Arg Asp Gly Ala Ile Pro Lys Asn Ala Thr Ser 530 535 540 <210> 4 <211> 2757 <212> DNA <213> Penicillium funiculosum <400> 4 tgtattgttg tttgtcgaag tcgatttccc agttgttacg attctagcaa gaagattaat 60 acatgcagtt ctcaaacaaa gctcaaggga catgcttact ccatggcgaa caagatagat 120 ggtgtctaga ggcatcgcat cgaaaggccg tcttggctgt attgatagat ttgattgaac 180 agttgtaagt tctcaatttt tctagccttt atacttctaa aggcaaactc tccatcaaaa 240 agtttgcttc gatacctaca cctggaatcc actttccgat agactgcaat gcccactatg 300 accagtgccc acttgcagtc gccaagtttc atttaacttc ctgagacctt ttttggataa 360 acctaaagca aagcgagccg acataattgc ctcatctgat aaagaatgaa atcaagttta 420 gccaacagcg gataaagcaa tatcgcgcct tggttcttaa taggcgttca gtacctgaca 480 atgcagcttc ttggaccagt tattatcggc aaatgtaaat gcttaggata ggcccaacga 540 actcactaat gaggtcccaa atcggaagtc tccagctacc ccagattgtc aaaagccggg 600 gtaggaatat ggcgctcgct atgttgtcta ttcgggcaga aagtcgtgtg acagagagag 660 ttataaataa ccttggaaag cttcgtaatg gacactttgt accggacttc caagattctg 720 ttaacattca ttgttcttct gttcatttga ttttatacaa aagaatcaac agtgtattct 780 cattagcatg atgctcaagc tatgtgtagc tgcctgtttg gtggtggccg gtgtttctat 840 cccgacagac cctacagtaa ctcaagtccc ggattacttc caaacaagct atgggccata 900 tgcaggtatg gtaatacgtg taacttgtca aagagtccca gggctcacag gctataggtg 960 ctactaaagc cggagacgct ccgttccttg cgcaaaccaa cccagtctat tcccagccga 1020 cctatgtcgc aaacacgcca ttggtgacta ctcttcccat atctggtgaa ccccatgacg 1080 ggaacatatt cggctggatg gggactttga ggtatgtatt ctcttgcgct gaagtgccgt 1140 tactacggat ggaactaatt tgatacaaaa cagtccttac cagcccagcc ctgatggatt 1200 tggcgtggat gaatatcctc tccctcccgg tgcaaacatt acgcaaatcc atatggtgca 1260 tcgccatggc tcgcgctatc cgacagcaaa ctccgccatt agcagttggg caaagaagat 1320 aatgcagtat cgatccaacg gcaccgtgtt ctcaggcgaa cttgattttc tgaacacttg 1380 gaactaccag cttggacagg cagagctaac agcacgaggt cggcaagagt tattcgatag 1440 cggtgttctg cattggttca attatggaaa gctctacgat tctgcgtcga aaatcattgc 1500 tcgtacgaca acgatggtgc ggatgttgca atcggctgag aacttcctca acgggttttt 1560 tggtccaaac tggaacaata atgcgacact tgaagttatt attgaaagta ccgggttcaa 1620 caactccctc gcagggaatg atatgtgtcc caatgcaaaa aatacatcag gaggcgatgc 1680 agtagatgaa tggacctcgc tatacttgca gaaagcgaca aatcgcttta gaagtgaaat 1740 atcaggaagc ctgaactgga ctgttgacga cacctacaat gcacaatcta tgtgcccata 1800 tgagacggtt gcccttggtt atagcccgtt ttgcacattg ttttcttggg aggaatggca 1860 agggttccag tatgttaacg atttgaacct ctatgggaat tatggcatgg gatccccagt 1920 aggccgcgcc attgggcttg gattcgtcga agaattaatt gcaaggttgc aaggacaatt 1980 tccaacaccc cctgaagact caattgtttt caatcaatcg ctagatcaga gtgcggcaac 2040 cttccctctc aaccaaacta tctacttcga tttcagccac gacaacgaga tgttctccat 2100 gttaactgcc ctgggcttaa cacaatttgg ggactacctc tctcccacaa agccctctgc 2160 cgatcgttcg ttgattggaa gccatatcgt cccgttctcg gctacctttg tgtttgagat 2220 catcaaagca cctggtcctg tacgagagga tcgatcaaag tattgcggtg aaagtgtgta 2280 tgaaaacact agcgaggaga caacctacat acatctcgtc attaaccaga ggactgttcc 2340 tcttggtcaa agcatttcag catgcggaca acgagatgat ggttggtgtg agatttccgc 2400 cttcattcag gcgcagaaag acaacattga gaaggcaaat tacgagcaaa gctgctttgg 2460 aaattggagt atcccggcgt acggccagat tagagatggc gctattccga agaatgccac 2520 ttcctaactg ctatattaga tgcccccgaa agtttagaca ggagatagta ctcgtcagga 2580 ggcccatatc tcagccagcc acagcactgc ggagcgatga agggttgaat atagcacacc 2640 gcggggtgct tgatcccaag tttgggaagc cggatttaga tattttaatt ctctgttagg 2700 tatatttatg ctacgtagct gatttttgtc caatcgacca atttcatctc cgatatc 2757 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide PN3 <400> 5 ccgttggtaa ccagcggagg gatc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide PN4 <400> 6 ccttggtccg tgtttcaaga cggg 24 <210> 7 <211> 1175 <212> DNA <213> Penicillium sp CBS 109899 <400> 7 ccgttggtaa ccagcggagg gatcattacc gagtgcgggc cctcgcggcc caacctccca 60 cccttgtctc tatacacctg ttgctttggc gggcccaccg gggccacctg gtcgccgggg 120 gacgcacgtc cccgggcccg cgcccgccga agcgcgctgt gaaccctgat gaagatgggc 180 tgtctgagta ctatgaaaat tgtcaaaact ttcaacaatg gatctcttgg ttccggcatc 240 gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattccg tgaatcatcg 300 aatctttgaa cgcacattgc gccccctggc attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca 360 tttctgccct caagcacggc tggtgtgttg ggtgtggtcc ccccggggac ctgcccgaaa 420 ggcagcggcg acgtccgtct ggtcctcgag cgtatggggc tctgtcactc gctcgggaag 480 gacctgcggg ggttggtcac caccacattt taccacggtt gacctcggat caggtaggag 540 ttacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaaaa gaaaccaacc gggattgcct 600 cagtaacggc gagtgaagcg gcaagagctc aaatttgaaa tctggcccct ttggggtccg 660 agttgtaatt tgcagaggat gcttcgggtg cggtccccgt ctaagtgccc tggaacgggc 720 cgtcatagag ggtgagaatc ccgtctggga tgggcggccg cgcccgtgtg aagctccttc 780 gacgagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagcgggtg gtaaatttca tctaaagcta 840 aatactggcc ggagaccgat agcgcacaag tagagtgatc gaaagatgaa aagcactttg 900 aaaagagagt taaacagcac gtgaaattgt tgaaagggaa gcgttgtcca ccagactcgc 960 ccgggggggt tcagccggca cgtgtgccgg tgtactcctc tccgggcggg ccagcatcgg 1020 tttgggcggc tggtgaaagg ccccgggaat gtaacaccct tcggggtgcc ttatagcccg 1080 gggtgccata cagccagcct ggaccgaggc ccgcgcttcg gcgaggatgc tggcgtaatg 1140 gtggtcaacg gcccgtcttg aaacacggac caagg 1175 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Penicillium sp CBS 109899 <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> Xaa = Gln or Val <400> 8 Ile Pro Thr Asp Pro Gln Val Pro Xaa Tyr Phe 1 5 10 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> Penicillium sp CBS 109899 <400> 9 Thr Ser Gly Gly Asp Ala Val Asn Glu Trp Thr Ala Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Lys <210> 10 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ccatgacgga aacatattcg 240 gctggatggg gactttgagg tatgtattat ctttcgctga agtaccgtta gtacggatga 300 aactgatctt agacaaaaca gtccttacca acccagccct gatggatttg gcgtggatga 360 atatcctctc cctcccggtg caaacattac gcaaatccat atggtgcatc gccatggctc 420 gcgctatccg acgtcaaatt ccgcaatcag cgattgggct aagaaaataa tgcagtatcg 480 atccaacggc acagtgttct caggcgaact tgagtttctg aacgcttgga actatcagct 540 cggacaggca gagctaacag cacgaggtcg gcaagagtta ttcgacagcg ggattctaca 600 ttggttcaat tatggaaagc tctacgatcc tgcatcaaaa atcatagctc gcacaacaac 660 gatggtgagg atgttgcaat cagcggagaa cttcctcaat ggattttttg gtccaaactg 720 gactaataat gcgacgcttg aagtcattat tgaaagtacc gggtttaaca actccctcgc 780 agggaatgat aagtgtcgca atgcaaaaaa tacatcgggg ggcgacgcag taaatgaatg 840 gaccgc 846 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 32 P5 <400> 16 ccatcagggc tgggttggta aggactg 27 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 32 P3 <400> 17 ctggactaat aatgcgacgc ttgaagtc 28 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 38 P1 <400> 18 ggctttgctg gtgcggggtg agtc 24 <210> 19 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 38 P2 <400> 19 cctgcgggtt cgtaactttg tttgtaactt gac 33 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 37 P1 <400> 20 ggcgctccgt tccttgcgca aac 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide OT ACS 37 P3 <400> 21 gtaggtcggc tgggaataga tcg 23 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide phyGoamp4 <400> 22 tagatatcac gatgctcaag ctatatgtag ctgc 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence description Oligonucleotide phyGoamp5 <400> 23 atactagttt aggacgtagc attcttcgga atag 34

Claims (53)

1. (a) 서열번호 3으로 기재된 피타제를 암호화하는 분리된 폴리누클레오티드;

   (b) (a)에 따른 폴리누클레오티드와 하이브리드하는 분리된 폴리누클레오티드;

   (c) (a)에 따른 폴리누클레오티드에 상동인 분리된 폴리누클레오티드; 및

   (d) (a), (b) 또는 (c)에 따른 폴리누클레오티드 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 피타제를 암호화하는 분리된 폴리쿠늘레오티드.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 1 및 서열번호 2로 표현된 서열로부터 선택된 폴리누클레오티드.
3. 제1항에 있어서, 서열번호 4로 표현된 폴리누클레오티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 페니실리움 속 진균으로부터 유래하는 폴리누클레오티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 포함하는 분리된 폴리누클레오티드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드에 의해 암호화되는 피타제.
7. 제6항에 있어서,

   (a) 서열번호 3으로 표현된 피타제;

   (b) (a)에 따른 피타제에 상동성인 피타제; 및

   (c) (a) 또는 (b)에 따른 피타제의 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피타제:.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 페니실리움 속 진균으로부터 유래하는 피타제.
9. 제8항에 있어서, 페니실리움 sp. CBS 109899 균주로부터 유래하는 피타제.
10. 기능적으로 서로 연결된 적어도 (a) 내지 (c)를 포함하는 키메라 유전자:

    (a) 숙주 유기체에서 작용하는 하나의 프로모터;

    (b) 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에서 청구한 폴리누클레오티드;

    (c) 숙주 유기체에서 작용하는 종결인자.
11. 제10항에 있어서, 숙주 유기체에서 작용하는 신호 펩티드 또는 수송 펩티드를 더 포함하는 키메라 유전자.
12. 제10항 또는 제11항에서 청구한 키메라 유전자를 포함하는 발현 또는 형질전환 벡터.
13. 제12항에 있어서, 플라스미드, 파지 또는 바이러스인 벡터.
14. 제10항 또는 제11항에서 청구한 키메라 유전자를 포함하는 형질전환된 숙주 유기체.
15. 제14항에 있어서, 미생물인 숙주 유기체.
16. 제15항에 있어서, 미생물이 세균, 진균, 효모 또는 바이러스로부터 선택된 숙주 유기체.
17. 제16항에 있어서, 미생물이 코리네박테리윰, 바실러스, 스트렙토마이세스 및 에스케리키아 속, 특히 이. 콜라이로부터 선택된 세균인 숙주 유기체.
18. 제16항에 있어서, 미생물이 페니실리움, 아스퍼길러스, 크리소스포리움 및 트리코더마 속으로부터 선택된 진균인 숙주 유기체.
19. 제16항에 있어서, 미생물이 사카로마이세스, 클루이베로마이세스 및 피키아 속으로부터 선택된 효모인 숙주 유기체.
20. 제14항에 있어서, 식물 세포, 식물 또는 식물의 일부인 숙주 유기체.
21. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 유기체를 농축시키는 단계;

    (c) (b) 단계에서 분리된 유기체 세포를 파열시키는 단계;

    (d) (c) 단계에서 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계; 및

    (e) (d) 단계에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 수거하는 단계를 포함하는, 피타제 활성을 갖는 추출물을 제조하는 방법.
22. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 피타제가 발현될 수 있는 조건에서 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 유기체를 제거하고 배양 배지를 회수하는 단계를 포함하는, 피타제 활성을 갖는 추출물을 제조하는 방법.
23. 제21항 또는 제22항에서 청구한 제조 단계를 모두 포함하고 하기 (f) 및 (c) 단계를 더 포함하는, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구한 피타제를 제조하는 방법:

    (f) 제21항에서 청구한 방법에서 (e) 단계에서 회수한 상청액으로부터 피타제를 정제하는 단계; 및

    (c) 제22항에서 청구한 방법에서 (c) 단계에서 회수한 배양 배지로부터 피타제를 정제하는 단계.
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 유기체가 미생물인 방법.
25. 제24항에 있어서, 미생물이 진균인 방법.
26. 제25항에 있어서, 진균이 페니실리움 속인 방법.
27. 제26항에 있어서, 페니실리움 속 진균이 페니실리움 sp. CBS 109899 균주인 방법.
28. (a) 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 형질전환 숙주 유기체를 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 형질전환 숙주 유기체를 농축시키는 단계;

    (c) (b) 단계에서 분리된 유기체 세포를 파열시키는 단계;

    (d) (c) 단계에서 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계; 및

    (e) (d) 단계에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 수거하는 단계를 포함하는, 피타제 활성을 갖는 추출물을 제조하는 방법.
29. (a) 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 형질전환 숙주 유기체를 배양하는 단계; 및

    (b) 상기 형질전환 숙주 유기체를 제거하고 배양 배지를 회수하는 단계를 포함하는, 피타제 활성을 갖는 추출물을 제조하는 방법.
30. 제28항 또는 제29항에서 청구한 방법의 모든 단계를 포함하고 하기 (f) 및 (c) 단계를 더 포함하는, 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구한 피타제를 제조하는 방법:

    (f) 제28항에서 청구한 방법에 있어서는 (e) 단계에서 회수한 상청액으로부터 피타제를 정제하는 단계;

    (c) 제29항에서 청구한 방법에 있어서는 (b) 단계에서 회수한 배양 배지로부터 피타제를 정제하는 단계.
31. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구한 적어도 하나의 피타제를 포함하는 효소 조성물.
32. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 적어도 하나의 형질전환 숙주유기체를 포함하는 사료 조성물.
33. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 적어도 하나의 유기체를 포함하는 사료 조성물.
34. 제33항에 있어서, 유기체가 진균인 사료 조성물.
35. 제34항에 있어서, 진균이 페니실리움 속 진균인 사료 조성물.
36. 제35항에 있어서, 진균이 페니실리움 sp. CBS 109899 균주인 사료 조성물.
37. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구한 적어도 하나의 피타제를 포함하는 사료 조성물.
38. 위가 하나인 동물의 영양식이로 사용하기 위한, 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 청구한 사료 조성물의 용도.
39. 제38항에 있어서, 돼지 영양식이로 의도되는 사료 조성물의 용도.
40. 제38항에 있어서, 가금 영양식이로 의도되는 사료 조성물의 용도.
41. (a) 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 숙주 유기체를 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 형질전환 숙주 유기체를 농축시키는 단계; 및

    (c) (b) 단계에서 얻은 분리된 숙주 유기체를 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제32항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
42. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 유기체를 농축시키는 단계; 및

    (c) (b) 단계에서 얻은 분리된 유기체를 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제33항 내지 제36항 중 어느 한 항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
43. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 피타제가 발현될 수 있는 조건에서 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 유기체를 농축시키는 단계;

    (c) (b) 단계에서 얻은 분리된 유기체의 세포를 파열시키는 단계;

    (d) (c) 단계에서 얻은 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계;

    (e) (d) 단계에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 회수하는 단계; 및

    (f) (e) 단계에서 회수한 상청액을 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제37항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
44. (a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에서 청구한 폴리누클레오티드를 함유하는 유기체를 피타제가 발현될 수 있는 조건에서 배양하는 단계;

    (b) 상기 유기체를 제거하고 배양 배지를 회수하는 단계; 및

    (c) (b) 단계에서 회수한 배양 배지를 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제37항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
45. (a) 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 형질전환 숙주 유기체를 배양하는 단계;

    (b) (a) 단계에서 배양된 형질전환 숙주 유기체를 농축시키는 단계;

    (c) (b) 단계에서 얻은 분리된 형질전환 숙주 유기체의 세포를 파열시키는 단계;

    (d) (c) 단계에서 얻은 파열된 세포 추출물을 원심분리하는 단계;

    (e) (d) 단계에서 유래한, 피타제 활성을 갖는 상청액을 회수하는 단계; 및

    (f) (e) 단계에서 회수한 상청액을 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제37항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
46. (a) 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에서 청구한 형질전환 숙주 유기체를 배양하는 단계;

    (b) 상기 형질전환 숙주 유기체를 제거하고 배양 배지를 회수하는 단계; 및

    (c) (b) 단계에서 회수한 배양 배지를 사료 조성물에 첨가하는 단계를 포함하는, 제37항에서 청구한 사료 조성물의 제조 방법.
47. 제43항 또는 제45항에 있어서, (f) 단계가 하기 단계들로 치환되는 제조 방법:

    (f) (e) 단계에서 회수한 상청액으로부터 피타제를 정제하는 단계; 및

    (g) (f) 단계에서 정제된 피타제를 사료 조성물에 첨가하는 단계.
48. 제44항 또는 제46항에 있어서, (c) 단계가 하기 단계들로 치환되는 제조 방법:

    (c) (b) 단계에서 회수한 배양 배지로부터 피타제를 정제하는 단계; 및

    (d) (c) 단계에서 정제된 피타제를 사료 조성물에 첨가하는 단계.
49. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구한 피타제 또는 제31항에서 청구한 효소 조성물을 동물의 영양식이에 첨가함으로써, 위가 하나인 동물에 의한 식물-기초 사료에 함유된 무기 인산염의 동화를 증가시키는 방법.
50. 제48항에 있어서, 위가 하나인 동물이 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 청구한 사료 조성물을 공급받는 방법.
51. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 청구한 사료 조성물을 동물에 공급함으로써, 위가 하나인 동물의 영양식이 인의 첨가를 감소시키는 방법.
52. 제32항 내지 제37항 중 어느 한 항에서 청구한 사료 조성물을 동물에 공급함으로써, 위가 하나인 동물로부터 나오는 인의 배출을 감소시키는 방법.
53. 기탁번호 CBS 109899를 갖는 페니실리움 sp. 속 사상진균.