FR2833272A1 - Nouvelles phytases et procede de production de ces phytases - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles phytases, en particulier d'origine fongique, ainsi que leurs procédés de production respectifs. La présente invention concerne plus particulièrement de nouvelles phytases issues de champignons du genre Penicillium, en particulier de la souche Penicillium sp. CBS 109899, ainsi que les polynucléotides codant pour ces phytases. L'invention concerne également des vecteurs contenant ces polynucléotides, et des organismes hôtes transformés exprimant lesdites phytases dans leurs tissus.

Description

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Nouvelles phytases et procédé de production de ces phytases
La présente invention concerne de nouvelles phytases, en particulier d'origine fongique, ainsi que leurs procédés de production respectifs. La présente invention concerne plus particulièrement de nouvelles phytases issues de champignons du genre Penicillium, en particulier de la souche Pénicillium CBS 109899, ainsi que les polynucléotides codant pour ces phytases. L'invention concerne également des vecteurs contenant ces polynucléotides, et des organismes hôtes transformés exprimant lesdites phytases dans leurs tissus.

En particulier, les phytases de la présente invention sont particulièrement adaptées à leur utilisation dans des compositions alimentaires destinées à l'alimentation animale. Cette adaptation est liée à leurs propriétés, notamment leur activité dans des conditions de température et de pH correspondant aux conditions de préparation desdites compositions ainsi que celles rencontrées dans le système digestif des animaux.

Le phosphore est un élément essentiel à la vie de tous les organismes. En particulier, il est primordial pour les éleveurs d'animaux de ferme de s'assurer que leurs animaux en ingèrent une quantité suffisante pour optimiser leur croissance et leur développement. La plupart des animaux de ferme sont nourris avec des compositions alimentaires à base de végétaux. Ces végétaux contiennent de grandes quantités de phosphate qu'ils stockent dans leurs tissus sous forme d'un composé de réserve, l'acide phytique. En moyenne, l'acide phytique contient 50 à 70% du phosphore présent dans les plantes. L'acide phytique est naturellement mobilisé et le phosphate qu'il contient est libéré chez la plupart des animaux de ferme, en particulier les ruminants. Toutefois, l'acide phytique n'est pas métabolisé par les animaux monogastriques tels que le Porc et les volailles. Chez ces animaux, l'acide phytique contenu dans leur ration alimentaire est donc rejeté avec les excréments, et l'éleveur doit compléter ladite ration avec du phosphate inorganique afin que ses animaux ingèrent une quantité suffisante de phosphore. Cette stratégie engendre un surcoût pour l'éleveur et génère une pollution issue du rejet dans l'environnement de l'acide phytique non assimilé. Cette pollution est d'autant plus accrue dans les zones d'élevage intensif.

L'acide phytique est également connu pour être un chélateur d'éléments nutritifs importants contenus dans la ration alimentaire, comme par exemple le magnésium, le calcium, le zinc ou le fer. Cette propriété conduit à une diminution de la qualité nutritive de la ration alimentaire donnant à l'acide phytique la propriété d'agent anti-nutritionnel.

Afin de répondre aux différents inconvénients liés à l'absence d'assimilation de l'acide

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phytique par les animaux monogastriques, il a été envisagé d'introduire une enzyme, la phytase, dans la ration alimentaire de ces animaux d'élevage. La phytase hydrolyse l'acide phytique en libérant de l'inositol et du phosphate inorganique. Des phytases et les gènes codant ces phytases ont été isolés à partir de nombreux organismes. Les phytases ont majoritairement été isolées à partir de champignons (Howson and Davis, 1983, Enzyme Microb. Technol. 5,377-382 ; Wyss et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol., 65 (2), 359-366). Parmi les champignons produisant une phytase, on peut citer les champignons du genre Aspergillus, en particulier A. ficuum (Ullah et Gibson, 1987, Preparative Biochemistry 17 (1), 63-91 ; Ullah and Dischinger, 1993, Biochem.

Biophys. Res. Commun., 192 (2), 747-753), A. terreus (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), A. niger (Dvorakova et al., 1997, Folia Microbiol (Praha), 42 (4), 349-352), A. fumigatus (Pasamontes et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol., 63 (5), 1696-1700), du genre Penicillium, en particulier P. caseicolum, du genre Myceliophtora, en particulier M thermophila (Mitchell et al., 1997, Microbiology, 143 (Pt 1), 245-252), du genre

Talaromyces, en particulier T thermophilus, du genre Neurospora, en particulier N crassa et N. sitophila, du genre Thermomyces, en particulier T. lanuginosus (Berka et al., 1998, Appl Environ Microbiol. 64 (11), 4423-4427), ou du genre Monascus, en particulier M anka. Des phytases ont également été trouvées chez des bactéries. A titre d'exemple, on peut citer les bactéries des genres Bacillus, en particulier B. subtilis (Powar et Jagannathan, 1982, J. Bacteriol.

151 (3), 102-1108 ; Shimizu, 1992, Biosci. Biotech. Biocem. 56 (8), 1266-1269 ; Keruvo et al., 1998, Appl. Environ. Microbiol. 64 (6), 2079-2085), Pseudomonas (Cosgrove, 1970, Austral. J.

Biol. Sci. 23,1207-1220), Escherichia, en particulier E. coli (Golovan et al., 2000, Can. J.

Microbiol. 46,59-71), Enterobacter (Yoon et al., 1996, Enzyme and microbiol. Technol ; 18, 449-454), ou Streptomyces. Des phytases de levures ont également été isolées (Dvorakova, 1998, Folia Microbiol. 43 (4), 323-338), comme celles des levures Schwaniiomyces occidentalis et Saccharomyces cerevisiae. Enfin, des phytases ont été trouvées dans les plantes, notamment dans le Soja (Ullah et Gibson, 1988, Arch. Biochem. Biophys., 260 (2), 514-20), dans le Maïs (Maugenest et al., 1997, Biochem J., 322 (Pt 2), 511-7) ; Maugenest et al., 1999, Plant Mol.

Biol., 39 (3), 503-14), ou chez Arabidopsis (Mullaney et Ullah, 1998, Biochem. Biophys. Res.

Commun., 251 (1), 252-5).

Parmi les propriétés permettant de caractériser les phytases, on trouve la constante de Michaelis (Km) vis-à-vis de l'acide phytique, le pH optimum et la température optimale d'activité, ainsi que la stabilité de cette activité à des pH et des températures données. Des données relatives à la structure des phytases peuvent également être utiles, comme le poids moléculaire (PM), le point isoélectrique (pl), ou la séquence peptidique. Pour être utilisables en

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alimentation animale, les phytases doivent posséder des propriétés compatibles avec les traitements que subissent les aliments destinés à cette alimentation. En particulier, l'activité des phytases utilisées doit se maintenir et si possible être optimale aux conditions de température et de pH des procédés de préparation de ces aliments ainsi qu'à celles présentes dans le tractus digestif des animaux ingérant ces aliments. Ces contraintes conduisent principalement à rechercher des phytases dont l'activité résiste à des conditions de température élevées, telles que celles utilisées dans les procédés de préparation des compositions alimentaires, et à des conditions de pH acides, telles que celles présentes dans le tractus digestif des animaux d'élevage.

Afin de répondre à ces critères, des phytases ont été recherchées dans des organismes, en particulier des micro-organismes, se développant dans des milieux dont les conditions de température et de pH correspondent à ces critères. Cette stratégie a permis d'isoler des phytases résistantes à des températures élevées, telles que par exemple celles décrites dans les demandes de brevets WO 97/35016 ou EP 0 684 313, mais aussi des phytases possédant un faible Km, telles que par exemple celles décrites dans la demande de brevet EP 0 960 934. Une autre stratégie a consisté à modifier artificiellement la séquence de phytases connues par mutagenèse dirigée afin de lui conférer des propriétés intéressantes. Cette stratégie à notamment été décrite dans les demandes de brevets WO 99/48380, EP 0 897 985 et EP 0 897 010.

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Description des Figures Figure 1 : Activité de la phytase de Penicillium sp CBS 109899 en fonction du pH. La valeur 100% de l'activité relative correspond à l'activité optimale de la phytase pour un pH donné.

Figure 2 : Activité de la phytase de Penicillium sp CBS 109899 en fonction de la température. La valeur 100% de l'activité relative correspond à l'activité optimale de la phytase pour une température donnée.

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Description
La présente invention concerne des polynucléotides isolés codant pour une phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Cette phytase et les polynucléotides qui la codent sont également caractérisés en ce qu'ils proviennent d'une souche fongique du genre Penicillium, en particulier la souche Penicillium sp CBS 109899.

Selon la présente invention, on entend par"polynucléotide"une molécule d'acide nucléique composée d'une séquence de bases, naturelle ou artificielle, pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin. Lorsque ledit polynucléotide est naturel, il est bien entendu que l'invention ne couvre pas ce polynucléotide dans son environnement naturel, mais le même polynucléotide isolé et purifié du génome de l'organisme vivant dans lequel il se trouve à l'état naturel. Ce polynucléotide peut être obtenu de manière directe, par extraction et purification, ou de manière indirecte par copie. Toutefois, la présente

invention comprend ledit polynucléotide lorsqu'il est intégré de manière artificielle dans le génome d'un organisme vivant autre que celui dans lequel il existe à l'état naturel, ou lorsqu'il est réintroduit artificiellement dans l'organisme vivant duquel il provient, en un ou plusieurs exemplaires dans le génome de cet organisme. Lorsque ce polynucléotide est une sonde, il est généralement simple brin.

L'invention comprend donc les polynucléotides codant pour la séquence peptidique de la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Il est bien connu de l'homme du métier que cette définition inclut tous les polynucléotides qui, bien que comprenant des séquences nucléotidiques différentes comme résultat de la dégénérescence du code génétique, codent pour une même séquence d'acides aminés, donc une même phytase, laquelle est représentée par l'identificateur de séquences SEQ ID NO : 3.

La présente invention comprend également des polynucléotides homologues des polynucléotides précédemment décrits, lesdits polynucléotides homologues codant pour des phytases homologues de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3.

Par"homologue", on entend selon l'invention des polynucléotides codant des phytases et dont les séquences présentent des modifications par rapport aux polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Les polynucléotides homologues sont caractérisés par un degré d'identité avec les polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Le degré d'identité entre deux polynucléotides

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homologues est obtenu par comparaison de leurs séquences et est généralement exprime par un pourcentage de nucléotides identiques entre ces séquences. Ce degré d'identité est mesuré sur une longueur de séquence donnée, la plus courte des séquences comparées déterminant la taille de séquence sur laquelle le degré d'identité des séquences homologues est mesuré. L'invention couvre donc des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport aux polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, et codant pour des phytases dont les propriétés sont équivalentes à celles de la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3.

Par"phytases équivalentes"ou"phytases aux propriétés équivalentes", on entend essentiellement selon l'invention des protéines possédant une activité phytase, indépendamment de leurs propriétés intrinsèques telles que le Km, le pH optimal d'activité ou la température optimale d'activité. Le niveau d'activité phytase peut être mesuré par toute méthode permettant de caractériser une activité phytase. Par phytase, on entend une enzyme dont l'activité catalytique consiste à hydrolyser l'acide phytique pour libérer de l'inositol et du phosphate inorganique. Toutefois, la plupart des phytases ne réalisant pas une hydrolyse complète de l'acide phytique (comportant 6 phosphates), l'activité catalytique d'une phytase selon l'invention peut conduire à la libération de phosphate inorganique et d'esters de phosphate-myoinositol, lesdits esters pouvant être, en fonction de la capacité d'hydrolyse de la phytase, des esters de myoinositol mono-, di-, tri, tétra-ou penta-phosphate. A titre d'exemple, l'activité phytase peut être mesurée selon la méthode de Shimizu (1992, Biosci. Biotech. Biochem. 56 (8), 1266-1269), en particulier telle que décrite dans l'exemple 2. Toutefois, toute méthode permettant de caractériser une activité phytase, soit par la mesure de la diminution de la quantité de substrat, soit par la mesure de l'accumulation des produits issus de la réaction enzymatique, peut être utilisée pour mesurer l'activité phytase. En particulier, des méthodes semblables, utilisant par exemple un autre substrat ou d'autres réactifs, permettent également de mesurer ladite activité phytase.

Les modifications de séquences présentes dans les polynucléotides homologues peuvent être des additions, délétions, ou substitutions de nucléotides qui peuvent être naturelles ou obtenues par les techniques usuelles de mutagenèse. Il est connu que de tels polynucléotides homologues, codant pour des protéines de fonctions équivalentes, existent naturellement dans les génomes d'espèces vivantes différentes, et même dans les génomes de races, variétés ou souches différentes. Par conséquent, il est donc aisé pour un homme du métier, à partir de

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l'enseignement des polynucléotide codant pour la séquence peptidique représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3 selon l'invention, d'isoler de tels polynucléotides homologues en utilisant des techniques bien connues d'hybridation moléculaire (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press).

L'hybridation moléculaire est une réaction d'appariement qui s'effectue entre des brins complémentaires de polynucléotides présentant un certain degré d'identité entre leurs séquences nucléotidiques. L'hybridation permet donc, à partir des polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, d'identifier des polynucléotides homologues de ceux-ci dans le génome d'organismes vivants autres que celui dont ils sont issus, par exemple d'autres champignons, en particulier d'autres souches de Penicillium, par exemple P. funiculosum IMI 134756, et codant pour des phytases aux propriétés équivalentes à la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Plus l'identité de séquence entre des polynucléotides est forte, plus l'hybridation entre lesdits polynucléotides est possible et aisée, et plus la probabilité que ces polynucléotides codent pour des protéines aux propriétés équivalentes est forte. Les méthodes permettant d'hybrider des polynucléotides sont largement décrites dans la littérature (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) et bien connues de l'homme du métier. Elles sont, par exemple, basées sur le criblage d'une banque génomique ou de cDNA créée à partir d'un organisme vivant ou d'un tissu de cet organisme. Le criblage s'effectue à l'aide d'une sonde constituée d'un polynucléotide connu ou un fragment de celui-ci, afin d'identifier dans ces banques les polynucléotides homologues à ladite sonde qui vont s'hybrider à celle-ci.

Selon l'invention, la sonde est constituée d'un polynucléotide codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, ou un fragment de ceux-ci. Afin d'identifier les polynucléotides sur lesquels la sonde s'hybride, celle-ci est marquée, par exemple avec des éléments radioactifs, comme le 32p. Des marqueurs non-radioactifs commercialisés et bien connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés.

La présente invention comprend donc également des polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective à un des polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, ou un fragment de ceux-ci. Il est entendu que ces polynucléotides ne font partie de la présente invention que s'ils codent pour une phytase équivalente à celle représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Par

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"polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective", on entend donc selon l'invention les polynucléotides qui, par une des méthodes usuelles d'hybridation moléculaire (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press), s'hybrident avec une sonde marquée constituée par un des polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, ou un fragment de ceux-ci, à un niveau supérieur à l'hybridation non spécifique de ladite sonde avec d'autres polynucléotides peu homologues, notamment d'autres ADNc si les polynucléotides sondés sont issus d'une banque d'ADNc. Le niveau d'hybridation est mesuré grâce au signal produit par le marqueur de la sonde. Le niveau du signal généré par l'interaction entre les polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective et la sonde est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui généré par l'interaction de la sonde avec les autres polynucléotides générant un"bruit de fond". L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions d'hybridation et de lavage normales, de préférence stringentes ou très stringentes (par exemple hybridation avec un tampon contenant au moins 5 x SSC et 1% SDS à environ 50 C-60 C, et lavages successifs avec 0, 1 % SDS et diminution progressive de la concentration en SSC de 2xSSC à 0,4xSSC ainsi qu'augmentation de la température de 20 C à 50 C). L'homme du métier saura adapter les conditions d'hybridation, c'est-à-dire essentiellement la température et la concentration saline des tampons employés pour l'étape d'hybridation et l'étape de lavage. Ces conditions doivent notamment être adaptées en fonction de la taille de la sonde utilisée et du degré d'identité des polynucléotides présents dans la banque criblée avec cette sonde. L'adaptation des conditions d'hybridation est nécessaire afin d'optimiser le signal généré par les séquences homologues s'hybridant, tout en minimisant le bruit de fond.

Les polynucléotides capables de s'hybrider de manière sélective aux polynucléotides selon l'invention peuvent être isolés à partir de banques génomiques ou de banques d'ADNc produites, par exemple, à partir de souches fongiques, en particulier de souches du genre Penicillium, par exemple la souche P. funiculosum IMI 134756. L'isolement de tels polynucléotides peut se faire par les techniques standards d'hybridation (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd edition, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press), en utilisant comme sonde un polynucléotide codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, un fragment de ces polynucléotides, ou un polynucléotides complémentaire de ceux-ci. Lorsqu'un polynucléotide a été isolé par ces techniques, il est nécessaire d'en déterminer la séquence et d'identifier les propriétés de la

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protéine codée par ce polynucléotide, en particulier de vérifier que cette protéine est une phytase équivalente à la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3.

Les techniques d'hybridation ci-dessus mentionnées permettent donc d'isoler des polynucléotides homologues des polynucléotides codant pour la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. De tels polynucléotides, et les phytases qu'ils codent, sont aisément identifiables par un homme du métier du domaine des biotechnologies maîtrisant les techniques standards de biologie moléculaire. L'invention comprend donc des polynucléotides homologues des polynucléotides codant la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. De manière avantageuse, le degré d'identité des polynucléotides homologues sera d'au moins 45 % par rapport aux polynucléotides codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, de préférence d'au moins 50 %, d'au moins 70 %, d'au moins 80%, plus préférentiellement d'au moins 90 %, et de manière préférée d'au moins 95%. Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité entre des séquences sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP, BLAST (notamment Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36 : 290-300 ; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10), ou BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711, utilisant l'algorithme de Smith et Waterman décrit dans Applied Mathematics, 1981, No. 2,482-489).

De tels polynucléotides homologues peuvent également être obtenus de manière artificielle par les techniques classiques de mutagenèse.

Un polynucléotide préféré codant la phytase représentée par l'identificateur de séquence
SEQ ID NO : 3 est sélectionné parmi les séquences représentées par les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2.

A titre d'exemple de polynucléotide homologue, on peut citer le polynucléotide représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 4.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides codant une phytase décrits ci-dessus proviennent d'un champignon du genre Penicillium. Selon un mode de

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réalisation particulier, ils proviennent de la souche Uenieillium sp ù9e99, ou de la souche Penicilliumfuniculosum IMI 134756.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides selon l'invention codent une phytase possédant les propriétés suivantes : (a) température optimale = 50 C (b) pH optimal = 4-5 (c) Km = 550 tM
La présente invention concerne également des fragments des polynucléotides décrits cidessus. Le terme "fragment" désigne notamment un fragment d'au moins 20 nucléotides, en particulier d'au moins 50 nucléotides, et de préférence d'au moins 100 nucléotides. De tels fragments sont généralement désignés oligonucléotides. Ils peuvent servir de sondes d'hybridation pour identifier des polynucléotides homologues, ou d'amorces pour identifier et amplifier de tels polynucléotides homologues par la technique de PCR ("Polymerase Chain Reaction"telle que décrite dans Ausubel et al., (1987) Current Protocols in Molecular Biology, edit, John Wiley & Sons, Section 6.3-6. 4.

Le terme fragment désigne également des fragments des polynucléotides selon l'invention codant un fragment de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, ou un fragment d'une phytase homologue ou équivalente de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3.

La présente invention concerne également des polynucléotides comprenant au moins un des polynucléotides tels que décrits précédemment.

Tous les polynucléotides décrits ci-dessus codent soit la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, soit une phytase homologue, soit un fragment actif de ces phytases. En conséquence, l'invention s'étend donc à toutes les phytases codées par l'ensemble de ces polynucléotides. Cette définition inclue donc la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, les phytases homologues de cette phytase, et les fragments actifs de ces phytases.

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Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, la phytase est une protéine comprenant au moins la séquence peptidique décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3.

L'invention comprend donc également les phytases homologues de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Par"phytases homologues", on entend selon l'invention les phytases dont les séquences présentent des modifications par rapport à la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. À l'instar des polynucléotides homologues, les phytases homologues sont des phytases dont les séquences peptidiques présentent un certain degré d'identité, lequel degré d'identité est généralement exprimé par un pourcentage d'acides aminés identiques. L'invention couvre donc des phytases présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, et dont les propriétés sont équivalentes à celles de la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3. Ces modifications peuvent être des additions, délétions, ou substitutions d'acides aminés qui peuvent être naturelles ou obtenues par les techniques usuelles de mutagenèse. De manière avantageuse, le degré d'identité des phytases homologues sera d'au moins 35% par rapport à la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, de préférence d'au moins 50%, d'au moins 70 %, d'au moins 80%, plus préférentiellement d'au moins 90 %, et de manière préférée d'au moins 95%.

Les méthodes de mesure et d'identification du degré d'identité entre des séquences sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP, BLAST (notamment Altschul et al., 1993, J. Mol. Evol. 36 : 290-300 ; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10), ou BestFit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711, utilisant l'algorithme de Smith et Waterman décrit dans Applied Mathematics, 1981, No. 2,482-489).

A titre d'exemple de phytase homologue de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, on peut citer la phytase codée par le polynucléotide représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 4.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la phytase selon l'invention provient d'un champignon du genre Penicillium.

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Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la phytase possède les propriétés suivantes : (a) température optimale = 50 C (b) pH optimal = 4-5 (c) Km = 550uM
L'invention s'étend également aux fragments de la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3 et aux fragments des phytases homologues. Par fragment, on entend essentiellement un fragment biologiquement actif, c'est-à-dire un fragment possédant une activité phytase équivalente à celle de la phytase complète telle que mesurée par le test décrit dans l'exemple 2, ou un test semblable.

La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant une phytase selon l'invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression"liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'organisme hôte dans lequel ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par"fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné.

Les promoteurs que peut contenir le gène chimère selon l'invention sont soit constitutifs, soit inductibles. A titre d'exemple, les promoteurs utilisés pour l'expression dans des bactéries

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pourront être choisis parmi les promoteurs cités ci-dessous. Pour l'expression chez Escherichia coli, on peut citer les promoteurs lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, proU, est-l, tetA, cadA, nar, tac, trc, lpp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, APL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gene 32, nprM-lac, VHb, Proteine A (Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60 : 512-538 ; Current Opinions in Biotechnology, 1996,7 ; Weickert et al., 1996, Current Opinions in Biotechnology 7 : 494-499) ou encore le promoteur Ptrp (WO 99/64607). Pour l'expression chez les bactéries Gram positives comme les Corynébactéries ou Streptomyces, on peut citer les promoteurs PtipA (Holmes et al., 1993, EMBO J. 12 : 3183-3191) ou PSI, PS2 (FR91/09870) ou ceux décrit dans la demande EP0629699A2. Pour l'expression chez les levures et champignons, on peut citer les

promoteurs PLAC4 de K lactis (Van den Berg et al., 1990, Bio/Technology 8 : 135-139) ou Ppgk de K lactis (Demande de brevet FR 91/05294), tel ou cbhl de Trichoderma (W094/04673), his, csl, apf de Penicillium (WO 00/68401), gla d'Aspergillus (Gwynne et al., 1987, Bio/Technology 5 : 713-719).

Le gène chimère peut également comprendre une séquence d'adressage subcellulaire, codant un peptide signal ou un peptide de transit. Une telle séquence, située en amont ou en aval du polynucléotide codant pour la phytase, permet de diriger ladite phytase de manière spécifique dans un compartiment cellulaire de l'organisme hôte, ou de diriger sa sécrétion dans l'espace extracellulaire. Par exemple, le gène chimère peut comprendre une séquence codant un peptide signal ou un peptide de transit permettant de diriger la phytase vers un compartiment particulier du cytoplasme comme les mitochondries, les plastes, le réticulum endoplasmique ou les vacuoles. De manière préférée, la séquence d'adressage code pour un peptide signal adressant la phytase dans l'apoplaste ou la matrice extracellulaire.

Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique, vacuolaire ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes, les vacuoles ou les mitochondries. De tels peptides sont largement décrits dans la littérature : Neuhaus and Rodgers, 1998, Plant Molecular Biology 38 : 127-144 ; peptide de transit de l'EPSPS décrit dans le brevet USP 5188642 ; peptide de transit de la petite sous-unité de la ribulose-biscarboxylase/oxygenase (EP 189707).

Selon un autre mode de réalisation, le peptide de transit peut être constitué par un peptide signal d'adressage dans le périplasme bactérien comme ceux des gènes pac (Schumacher et al., 1986, Nucl. Acids. Res. 14 : 5713-5727), ompA (Bowden et Georgiou, 1990, J. Biol. Chem. 265 :

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16761-16766), phoA (Chang et al., 1986, Gene 44 : 121-124), ou par un peptide d'ancrage à la surface de la bactérie comme ceux des gènes PSI et PS2 (FR91/09870).

Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire. A titre d'exemple de peptide de transit chloroplastique, on peut citer un peptide de transit double comprenant, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature Nterminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit chloroplastiques doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909.

Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut se composer de différents éléments permettant d'augmenter le taux de protéine d'intérêt sécrétée dans le milieu. On peut ainsi citer l'association d'une protéine porteuse et d'un site de clivage protéolytique fusionné avec la protéine d'intérêt (USP 6130063).

Selon l'invention, le gène chimère peut également comprendre d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription (enhancer).

La présente invention concerne également un vecteur de clonage, d'expression et/ou de transformation comprenant un gène chimère selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci une phytase. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière préférentielle, le vecteur de transformation selon l'invention est un plasmide. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une phytase. Dans le but d'une transformation stable d'un organisme hôte, le vecteur peut aussi s'intégrer dans le génome. Sa composition peut alors se limiter aux éléments nécessaires à la synthèse de la phytase chez ces hôtes. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New

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York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus du gène chimère selon l'invention, un gène chimère codant un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Parmi les marqueurs de sélection utilisables, on peut citer des marqueurs contenant des gènes de résistance aux antibiotiques ou aux fongicides tels que, par exemple, le gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gene 25 : 179-188 ; Punt et al., 1987 ; Gene, 56 : 117-24), celui de la streptothricine acetyltransferase, celui codant pour un polypeptide conférant une résistance à la phléomycine, celui de la beta-tubuline mutée conférant la résistance au benomyl

(Gold et al., 1994, Gene 142 : 225-30), ou celui de la bialaphos-acetyltransferase (Avalos et al., 1989, Curr Genet, 16 : 369-72). D'autres marqueurs peuvent être des gènes complémentant une auxotrophie comme les gènes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4 (Buxton et Radford, 1983, Mol. Gen.

Genet. 190 : 403-405), arg4, argB (Berse et al., 1983, Gene 25 : 109-117), trpC (Goosen et al., 1989, Mol Gen Genet, 219 : 282-88), le gène de la molybdopterine synthase (Appleyard et al., 1998, J Biol Chem 273 : 14869-76 ; Unkles et al., 1999 ; J Biol Chem, 274 : 19286-93), ou celui de l'acétamidase (Beri and Turner, 1987, Curr Genet, 11 : 639-41). Une autre catégorie de marqueurs de sélection est constituée par des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18 : 1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188, 642) pour la tolérance au glyphosate, le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles, ou encore le gène de la glyphosate oxydoreductase (US5463175). On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, et WO 97/04103.

La présente invention concerne également des organismes hôte transformés, contenant au moins un gène chimère selon l'invention soit intégré dans leur génome, soit porté sur un élément génétique extra-chromosomique, par exemple un plasmide. Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production d'une phytase selon l'invention. De manière préférée, l'organisme hôte est un microorganisme, en particulier un champignon, par exemple des genres Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, ou Trichoderma, une bactérie, par exemple du genre Escherichia, en particulier E. coli, du genre Corynebacterium, du genre Bacillus ou du

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genre Streptomyces, une levure, en particulier des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, ou Pichia, un baculovirus, ou des cellules végétales. L'organisme hôte peut également être une plante, ou une partie de plante.

On entend par"organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome, ou dans un élément génétique extra-chromosomique, par exemple un plasmide, au moins un gène chimère selon l'invention, et produit en conséquence une phytase dans ses tissus, ou dans un milieu de culture. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues.

Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules ou tissus des organismes hôtes à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168 (1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517). L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660 ; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62).

Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de"biolistique"pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696 ; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945, 050).

Plusieurs méthodes de transformation de bactéries sont décrites dans la littérature pour Escherichia coli et d'autres bactéries Gram-négatives (Ausubel et al., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York ; Inoue et al., 1990, Gene 96 : 23-28 ; Chung et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 : 2172-2175). La conjugaison peut également être utilisée (Cameron et al., 1989, J. Bacteriol., 171 : 547-557). Pour les bactéries Grampositives l'électroporation peut être utilisée ainsi que la transformation de protoplastes, en

particulier pour les bactéries du genre Streptomyces (Bonamy et al., 1990, FEMS Microbio. Lett 66 : 263-270 ; Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces : A Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich).

Plusieurs méthodes de transformation de champignons sont également décrites dans la littérature (Talbot, 2001, Molecular and cellular biology offilamentous fungi, Oxford University Press, New York). La transformation de protoplastes avec du PEG est décrite pour Aspergillus

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dans EP 0260762, et une adaptation de cette méthode à l'espèce Penicillium jímiculosum dans WO 00/36120. On connaît également la transformation par intégration assistée d'enzyme de restriction ou REMI (Sanchez et al., 1998, Mol. Gen. Genet. 258 ; 89-94), ainsi que la transformation de protoplastes à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium (de Groot et al., 1998, Nature Biotechnology 16 : 839-842). Des techniques de transformation de levures sont également décrites dans la littérature, notamment dans Ausubel et al. (1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, New York) et Van den Berg et al. (1990, BiolTechnology 8 : 135-139).

Dans le cas particulier où l'organisme hôte à transformer est d'origine végétale, la transformation de cellules ou tissus végétaux peut se faire préférentiellement à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,143-173 ; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3) : 315- 330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16 : 357-384 ; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sei. 4 (1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules ou tissus végétaux par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750). L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature des organismes hôtes à transformer.

La présente invention concerne également un procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase. Selon un mode de réalisation de l'invention, ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant naturellement un polynucléotide selon l'invention dans son génome dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) concentration de l'organisme cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d)
L'étape (c) peut être réalisée par la mise en oeuvre de techniques connues de l'homme de l'art telles que le broyage mécanique (par différence de pression, par action des ultrasons, par trituration), la lyse enzymatique, ou le choc osmotique, lesdites techniques pouvant être employées individuellement ou en combinaison.

Le présent procédé peut également devenir un procédé de production d'une phytase selon l'invention par addition d'une étape supplémentaire (f) de purification. L'étape (f) d'un tel

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procédé de production d'une phytase selon l'invention consiste à purifier la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (e). La purification de la phytase peut se faire par toute technique de concentration ou de séparation des protéines, en particulier les techniques de microfiltration, d'ultrafiltration, d'électrophorèse ou de chromatographie bien connues de l'homme du métier.

Afin de parvenir à une phytase purifiée, l'homme du métier saura employer la méthode de mesure de l'activité phytase ci-dessus mentionnée pour identifier la ou les fractions de purification contenant ladite phytase. Selon ce procédé, la phytase produite peut avoir une pureté de préférence de 50%, de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou avantageusement 100%.

Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, en particulier lorsque la phytase selon l'invention est sécrétée dans le milieu de culture, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'invention dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme
Par"organisme possédant naturellement un polynucléotide selon l'invention dans son génome", on entend tout organisme possédant à l'état naturel un polynucléotide codant pour une phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3 ou un polynucléotide homologue dans son génome.

Selon un mode de réalisation des procédés décrits ci-dessus, ledit organisme est un microorganisme. Selon un mode particulier de réalisation, ledit microorganisme est un champignon, en particulier un champignon du genre Penicillium, en particulier la souche

Penicillium sp CBS 109899.

Selon ces procédés, l'organisme est cultivé dans un milieu adapté pour la production d'une phytase en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art. Ledit organisme, en particulier lorsqu'il s'agit d'un microorganisme, en particulier un champignon, peut être cultivé dans un erlenmeyer agité, un fermenteur à l'échelle du laboratoire ou un fermenteur à l'échelle industrielle (fermentations batch, fed-batch ou sur milieu solide). Le milieu de culture employé doit contenir des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques. Dans le mode de réalisation particulier du procédé utilisant la souche Penicillium sp CBS 109899 comme organisme, l'expression de la phytase est obtenue en présence ou non de sels de phytate (à titre d'exemple, les sels de phytate peuvent être des sels de Na+, des sels Ca++ ou une combinaison de sels de Ca++ et Mg++). Le pH peut être contrôlé (pH 3 ou 4 de préférence) ou libre.

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Selon ce procédé, l'étape de récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme peut se faire par tout moyen de séparation de fractions solides comprises dans une fraction liquide. En particulier, la filtration et la centrifugation sont des moyens adaptés à la mise en oeuvre de cette étape.

Le présent procédé peut également devenir un procédé de production d'une phytase selon l'invention par addition d'une étape supplémentaire (c) de purification. L'étape (c) d'un tel procédé de production d'une phytase selon l'invention consiste à purifier la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (b). La purification de la phytase peut se faire par toute technique de concentration ou de séparation des protéines, en particulier les techniques de microfiltration, d'ultrafiltration, d'électrophorèse ou de chromatographie bien connues de l'homme du métier.

Afin de parvenir à une phytase purifiée, l'homme du métier saura employer la méthode de mesure de l'activité phytase ci-dessus mentionnée pour identifier la ou les fractions de purification contenant ladite phytase. Selon ce procédé, la phytase produite peut avoir une pureté de préférence de 50%, de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou avantageusement 100%.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase met en oeuvre un organisme hôte transformé selon l'invention, et est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'invention (b) concentration de l'organisme hôte transformé cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d)
L'étape (c) peut être réalisée par la mise en oeuvre de techniques connues de l'homme de l'art telles que le broyage mécanique (par différence de pression, par action des ultrasons, par trituration), la lyse enzymatique, ou le choc osmotique, lesdites techniques pouvant être employées individuellement ou en combinaison.

Le présent procédé peut également devenir un procédé de production d'une phytase selon l'invention par addition d'une étape supplémentaire (f) de purification. L'étape (f) d'un tel procédé de production d'une phytase selon l'invention consiste à purifier la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (e). La purification de la phytase peut se faire par toute technique de concentration ou de séparation des protéines, en particulier les techniques de microfiltration, d'ultrafiltration, d'électrophorèse ou de chromatographie bien connues de l'homme du métier.

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Afin de parvenir à une phytase purifiée, l'homme du métier saura employer la méthode de mesure de l'activité phytase ci-dessus mentionnée pour identifier la ou les fractions de purification contenant ladite phytase. Selon ce procédé, la phytase produite peut avoir une pureté de préférence de 50%, de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou avantageusement 100%.

De préférence, l'organisme hôte transformé mis en oeuvre dans ce procédé est un microorganisme. En particulier ledit microorganisme peut être un champignon, par exemple des genres Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, ou Trichoderma, une bactérie, par exemple du genre Escherichia, en particulier E. coli, du genre Corynebacterium, du genre Bacillus ou du genre Streptomyces, une levure, en particulier des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, ou Pichia, un baculovirus, ou des cellules végétales.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, en particulier lorsque la phytase selon l'invention est sécrétée dans un milieu de culture, ce procédé est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'invention (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme hôte transformé
Selon ces procédés, l'organisme est cultivé dans un milieu adapté pour la production d'une phytase en utilisant les techniques connues de l'homme de l'art. Ledit organisme, en particulier lorsqu'il s'agit d'un microorganisme, en particulier un champignon, peut être cultivé dans un erlenmeyer agité, un fermenteur à l'échelle du laboratoire ou un fermenteur à l'échelle industrielle (fermentations batch, fed-batch ou sur milieu solide). Le milieu de culture employé doit contenir des sources de carbone et d'azote et des sels inorganiques.

Selon ce procédé, l'étape de récupération du milieu de culture par élimination de l'organisme hôte transformé peut se faire par tout moyen de séparation de fractions solides comprises dans une fraction liquide. En particulier, la filtration et la centrifugation sont des moyens adaptés à la mise en oeuvre de cette étape.

Le présent procédé peut également devenir un procédé de production d'une phytase selon l'invention par addition d'une étape supplémentaire (c) de purification. L'étape (c) d'un tel procédé de production d'une phytase selon l'invention consiste à purifier la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (b). La purification de la phytase peut se faire par toute technique

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de concentration ou de séparation des protéines, en particulier les techniques de microfiltration,

d'ultrafiltration, d'électrophorèse ou de chromatographie bien connues de l'homme du métier.

Afin de parvenir à une phytase purifiée, l'homme du métier saura employer la méthode de mesure de l'activité phytase ci-dessus mentionnée pour identifier la ou les fractions de purification contenant ladite phytase. Selon ce procédé, la phytase produite peut avoir une pureté de préférence de 50%, de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, ou avantageusement 100%.

La présente invention concerne également des compositions enzymatiques comprenant au moins une phytase selon l'invention.

Par"composition enzymatique", on entend une composition comprenant au moins une phytase selon l'invention, laquelle phytase peut être en proportions variables selon qu'elle est ou non associée à des adjuvants divers favorisant sa stabilité et sa conservation. A titre d'exemples d'adjuvants qui peuvent être utilisés dans une composition enzymatique selon l'invention, on peut citer le sorbitol, le mannitol, le benzoate, des sels minéraux, ou des huiles végétales. La composition enzymatique selon l'invention peut être sous forme liquide, ladite composition et la phytase qu'elle contient se trouvant alors dans une solution aqueuse, ou sous forme solide, ladite composition et la phytase qu'elle contient se trouvant alors lyophilisée sous forme de poudre.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la composition enzymatique comprend, en plus de la phytase selon l'invention, au moins une enzyme additionnelle. Cette enzyme additionnelle peut soit posséder une activité phytase, soit posséder une activité autre que l'activité phytase. Dans le cas où cette enzyme additionnelle possède une activité phytase, ladite activité phytase est de préférence différente et complémentaire de l'activité phytase de la phytase selon l'invention. Dans le cas où cette enzyme additionnelle possède une activité autre que l'activité phytase, elle peut par exemple posséder une activité xylanase, cellulase, p-glucanase, laminarinase, ferulic acide esterase, pullulanase, protéases, amidase, phosphatase, ou mannanase.

De manière préférée, lesdites compositions enzymatiques sont destinées à être incorporées dans des aliments pour animaux d'élevage, en particulier des animaux monogastriques, de préférence des Porcs ou des Volailles.

La présente invention concerne également une composition alimentaire comprenant au moins phytase selon l'invention.

Par"composition alimentaire", on entend essentiellement un aliment destiné aux animaux d'élevage, en particulier aux animaux monogastriques, de préférence les Porcs ou les Volailles.

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Une composition alimentaire selon l'invention est idéalement un aliment destiné aux animaux d'élevage additionné d'une composition enzymatique selon l'invention. La composition alimentaire selon l'invention est donc un aliment pour animaux d'élevage auquel est additionné au moins une composition enzymatique selon l'invention, ledit aliment et ladite composition enzymatique étant mixés de manière à obtenir ladite composition alimentaire.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, lesdites compositions alimentaires comprennent au moins un organisme hôte transformé selon l'invention. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, lesdites compositions alimentaires comprennent au moins un organisme possédant un polynucléotide selon l'invention, en particulier au moins un champignon du genre Penicillium, en particulier un champignon de la souche Penicillium sp CBS 109899.

Avantageusement, les compositions alimentaires selon l'invention sont destinées à être utilisées dans l'alimentation des animaux monogastriques. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, lesdites compositions alimentaires sont destinées à l'alimentation des Porcs. Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, lesdites compositions alimentaires sont destinées à l'alimentation des Volailles.

La présente invention a également pour objet un procédé de production d'une composition alimentaire telle que décrite ci-dessus.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, ledit procédé consiste à mettre en culture un organisme hôte selon l'invention ou un organisme possédant un polynucléotide selon l'invention, en particulier un champignon, plus précisément un champignon du genre Penicillium, en particulier la souche Penicillium sp CBS 109899, à concentrer lesdits organismes par tout procédé de concentration connu de l'homme du métier, en particulier la filtration ou la centrifugation, puis à incorporer lesdits organismes concentrés dans une composition alimentaire.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, ledit procédé consiste à produire un extrait possédant une activité phytase ou une phytase selon l'invention par un des procédés de production dudit extrait ou de ladite phytase tels que décrits ci-dessus, puis à incorporer ledit extrait ou ladite phytase produite dans une composition alimentaire.

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La présente invention concerne également un procédé pour augmenter l'assimilation du phosphate inorganique contenu dans le phytate des aliments à base de végétaux par les animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on incorpore une phytase ou une composition enzymatique selon l'invention dans l'alimentation desdits animaux. De manière préférée, ledit procédé est caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux monogastriques avec une composition alimentaire selon l'invention.

L'invention concerne aussi un procédé pour diminuer l'adjonction de phosphore dans l'alimentation des animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux avec une composition alimentaire selon l'invention.

L'invention concerne également un procédé pour diminuer les rejets de phosphore issus de l'alimentation des animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux avec une composition alimentaire selon l'invention.

La présente invention concerne également un champignon filamenteux du genre Penicillium sp. possédant le numéro de dépôt CBS 109899.

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Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.

Exemple 1 : Caractéristiques et culture de la souche Penicillium sp. CBS 109899
1. 1. Caractéristiques
Sur milieu gélosé PDA (Potato dextrose Broth 24 g/l, Agar-agar 16 g/l) le mycélium de la souche CBS 109899 se développe à 30 C et présente une couleur jaune en vieillissant. Le mycélium aérien s'observe en périphérie de la colonie sans les structures caractéristiques des Penicillium. Après culture du champignon en milieu liquide MN-Uri (Punt, P. J. and van den Hondel, C. A. M. J. J. (1992) Methods in Enzymology 216,447-457) à 28 C, pendant 2 jours sous agitation, le mycélium a été récupéré par filtration et broyé dans l'azote liquide. L'extraction de

l'ADN génomique a été effectuée par la méthode phénol-chloroforme bien connue de l'homme du métier, sur 19 de broyat dans 5ml de tampon de lyse (1% SDS, 2% Triton X-100, 1OOmM NaCl, 1mM EDTA, 10mM Tris pH 8,0). Après purification, l'ADN génomique a été précipité par l'addition de 2 volumes d'éthanol. Une amplification PCR réalisée avec une polymérase à haute fidélité et avec les amorces PN3 (SEQ ID NO : 5) et PN4 (SEQ ID NO : 6) a permis d'obtenir un fragment de 1175 pb qui a été séquencé (SEQ ID No7).

PN 3 : 5'-CCGTTGGTAACCAGCGGAGGGATC-3'
PN 4 : 5'-CCTTGGTCCGTGTTTCAAGACGGG-3'
L'alignement de cette séquence d'espaceur interne transcrit (Internal Transcribed Spacer) avec les séquences ITS disponibles dans les banques de données montre une identité de 96 % avec la séquence ITS identifiée comme celle d'un Penicillium aculeatum et 96 % d'identité avec la séquence ITS de Penicillium funiculosum IMI 134756. La souche CBS 109899 a donc été baptisée Penicillium sp.

1. 2. Conditions de culture

Un milieu synthétique pour la culture de la souche CBS 109899 a été déterminé. Il se compose de glucose 10 g/l, NH4 N03, 0. 1 M KH2P04 1. 5 gll, KCI 0. 5 g/l, MgS04 0. 5 g/l, MnCl2 10 mg/l, ZnS04 10 mg/l, FeS04 10 mg/l dans de l'eau déminéralisée. Pour l'expression de la phytase, un échantillon de mycélium de 1 cm2 prélevé à partir d'une colonie ayant poussé sur

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milieu PDA est incubé dans 30 ml de milieu MSP3 (glucose 10 g/1, Na N03, phytate de Ca 20 g/1, KCl 0. 5 g/l, MUS04 0. 5 g/l, ZnS04 2. 2 mg/l, H3B03 1. 1 mg/l, MnCl2 0. 5 mg/l, FeSO4 0. 5 mg/l, Caca2 0. 17 mg/1, CuSO4 0. 16 mg/1, Na2MoO4 0. 15 mg/l, EDTAN 5 mg/l) pendant 7 jours à 30 C sous agitation. La culture est centrifugée 10 min à 5000 rpm et le surnageant est analysé comme décrit dans l'exemple 2.

Exemple 2 : Mesure de l'activité phytase
La mesure de l'activité phytase est basée sur la méthode de Shimizu (1992, Biosci.

Biotech. Biochem. 56 (8), 1266-1269). Le principe de cette méthode consiste à mesurer la quantité de phosphate inorganique libéré lors de la réaction enzymatique de la phytase avec son substrat (solution de phytate de sodium préparée à 10 g/L dans un tampon acétate 250 mM, CaCl2 1 mM pH 5,5). La quantité de phosphate inorganique libéré est mesurée par réaction de celui-ci avec un réactif chromogène (1 volume de sulfate de fer à 10,8% mélangé extemporanément à 4 volumes d'ammonium molybdate 0, 012M H2S04)'Cette réaction conduit, en milieu fortement acide, à la formation d'un complexe de phosphomolybdate coloré (en présence de Fe2+), et la quantité de complexe formé est quantifiée par la mesure au spectrophotomètre de l'absorbance à 700 nm de la solution colorée générée.

Trois réactions sont menées en parallèle afin de réaliser une cinétique enzymatique à 10, 20 et 30 minutes à 37 C. Les réactions enzymatiques sont arrêtées par l'addition de 2,5 mL d'acide trichloroacétique 20%. L'interférence de l'échantillon est déterminée en ajoutant l'acide trichloroacétique 20% puis l'acide phytique à l'extrait brut, dilué ou non. Le blanc de la réaction enzymatique est réalisé avec du tampon acétate 250 mM, CaCl2 1 mM, pH 5,5. Après l'arrêt des réactions, la quantité de phosphate libérée est révélée par l'ajout d'un même volume de réactif coloré [1 volume de FeSOHO + 4 volumes de solution d'heptamolybdate d'ammonium].

L'intensité de la coloration bleue est mesurée par spectrophotométrie à 700 nm. Elle est rapportée à la concentration en phosphate à l'aide d'une gamme de KHPO comprise entre 0 et 1 mM.

L'activité enzymatique est déterminée à l'aide de la vitesse d'apparition du phosphate au cours de la cinétique enzymatique.

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Exemple 3 : Isolement d'un extrait fongique contenant une activité phytase
La souche CBS 109899 est cultivée à l'échelle de l'erlenmeyer, et dans des fermenteurs de 3 à 200 litres à 30 C pendant 6 à 8 jours. Le milieu de production est composé de glucose à 10 g/L, d'amidon à 40 g/L, de son de riz à 25 g/L, de phytate de Ca++ à 20 g/L, de chlorure d'ammonium à 15 g/L, de sulfate d'ammonium à 0,5 g/L et d'antimousse à 0,9 g/L. Le pH est ajusté à 5,5, mais il n'est pas contrôlé en cours de fermentation. Un inoculum à 4% est utilisé

pour démarrer les fermentations. Cet inoculum correspond à une culture de 3 à 4 jours à 30 C composée de glucose à 10 g/L, de peptone à 10 g/L, de CMC-Na à 5 g/L, de sulfate de magnésium à 0, 5 g/L, de chlorure de calcium à 0, 5 g/L, de Fessu4, 7H2O à 0, 01 g/L, de MnSO, 4H2O à 0,01 g/L. L'inoculum est directement ensemencé par des spores ou un morceau de gélose (milieu PDA, 10 jours à 30 C) sur lequel le champignon est cultivé. Il peut également être luimême ensemencé avec une culture de 3 à 4 jours réalisée dans les mêmes conditions.

En fin de fermentation, la totalité de la culture est filtrée et le filtrat est concentré par ultrafiltration sur membrane organique ou minérale dont le seuil de coupure de 10 Kda. L'activité est déterminée sur un échantillon du retentât d'ultrafiltration et est rapportée au volume initial de fermentation.

Tableau 1 : Activités obtenues en fin de fermentation en fonction du volume de fermentation.

<tb>
<tb> Volume <SEP> des <SEP> Agitation <SEP> Aération <SEP> Activité
<tb> fermenteurs <SEP> rpm <SEP> vvm <SEP> U/mL
<tb> Erlenmeyer <SEP> 220 <SEP> - <SEP> 45-63
<tb> 3L <SEP> 450 <SEP> 1 <SEP> 45
<tb> 30L <SEP> 400 <SEP> 1 <SEP> 55-66
<tb>
Exemple 4 : Caractéristiques des phytases isolées selon l'invention
Les optimum de pH et de température, les stabilités au pH et la température ainsi que les constantes Michaeliennes de l'extrait brut fongique fourni ont été déterminés en utilisant la méthode décrite dans l'exemple 2.

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4. 1. Constantes Michaeliennes La constante de Michaelis-Menten (Kmapp) et la vitesse maximale de la réaction (Vmapp) ont été obtenues en modifiant les concentrations en substrat et les temps d'incubation. La phytase contenue dans l'extrait fongique est caractérisée par un Kmapp de 550 u. M et un Vmapp de 1, 425 umol de phosphate libéré par minute et par mg d'échantillon.

4. 2. Activité phytase en fonction du pH Le pH optimum a été mesuré en modifiant le pH et/ou la nature du tampon de la réaction (à pH 2 : tampon KCI-HCI ; à pH 3 : tampon Glycine-HCl ; à pH 4 ; 5 ; 5,5 et 6 : tampon acétate de sodium ; à pH 7 : tampon Tris-HCl). Les résultats présentés sur la figure 1 montrent l'activité relative calculée par rapport à l'activité enzymatique maximale obtenue. Le pH optimum de la phytase contenue dans l'extrait fongique, mesuré à 37 C, se situe entre pH 4 et pH 5.

4. 3. Activité phytase en fonction de la température
La température optimum a été mesurée en modifiant la température d'incubation des réactions enzymatiques. Les données obtenues présentées dans la figure 2 montrent l'activité relative calculée par rapport à l'activité enzymatique maximum déterminée. La température optimum de la phytase contenue dans l'extrait fongique, à pH 5,5, est voisine de 50 C.

4. 4. Stabilité de la phytase en fonction du pH
La résistance de l'activité phytase aux pH acides a été évaluée. Après exposition de l'extrait à des pH compris entre pH 2 et pH 6,5 à 41OC, durant 0 à 180 minutes, le pH des solutions est stabilisé à pH 5,5 par dilution. L'activité est alors déterminée par la méthode décrite dans l'exemple 2. Les résultats montrent que l'activité phytase de l'extrait est relativement stable jusqu'à un pH de 3,5. Cependant elle est rapidement dénaturée à des pH plus acides, notamment àpH2.

4. 5. Stabilité de la phytase en fonction de la température
La thermostabilité de l'activité phytase a été évaluée pour des températures supérieures ou égales à 60 C. Une solution diluée (concentration finale 1 UI/ml) de l'extrait est portée à la température de test pendant un temps donné (n'excédant pas 30 minutes). Après retour à température ambiante, chaque solution traitée thermiquement est dosée suivant la méthode

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décrite dans l'exemple lA. Dès 5 minutes à 60 C, l'activité phytase est diminuée d'environ 80% jusqu'à être presque nulle après 1 minute à 80 C dans les conditions de réalisation des expériences.

Exemple 5 : Purification d'une phytase selon l'invention
Un extrait enzymatique fongique tel qu'obtenu à l'exemple 3 a été concentré par ultrafiltration en utilisant une membrane dont le seuil de coupure est de 10 kDa. La force ionique et le pH de l'extrait sont ajustés par plusieurs lavages avec un tampon glycine 20 mM pH 3.

Une chromatographie d'échange de cations est réalisée en appliquant le concentrât obtenu sur une colonne SP10, (PerSeptive BiosSytems), à un pH stationnaire de 3. Les protéines fixées sont éluées par un gradient par palier de NaCl 0 à 1 M dans du tampon glycine à un débit de 3 mL/min. Un pic d'activité phytase est obtenu pour environ 30% de NaCl 1M. La phytase est séparée des autres composants du pic d'activité par gel perméation sur colonne HR200 (Pharmacia) en tampon acétate de sodium 50 mM, pH 5,5, à un débit de 0,7 mL/min. La pureté des fractions recueillies est estimée par électrophorèse non dénaturante en gel de poly-acrylamide avec une coloration à l'argent. Une seule bande protéique est présente sur le gel, d'un poids moléculaire estimé à 130 kDa. Toutefois, une électrophorèse SDS-PAGE de la phytase purifiée a conduit à l'observation de 2 bandes polypeptidiques, l'une majoritaire à une distance de migration relative à 70 kDa, l'autre minoritaire à une distance de migration relative à 90 kDa.

Exemple 6 : Microséquençage de la phytase purifiée
6. 1. Détermination de la séquence N-terminale
Les polypeptides correspondant aux bandes polypeptidiques de 70 et 90 kDa obtenues par électrophorèse SDS-PAGE ont été transférés sur membrane PVDF (ProBlott, Applied Biosystems) durant 15 h à 4 C. Les polypeptides ont été détectés par coloration à l'amido black
10B (Sigma) et soumis au séquençage (Institut Pasteur, Laboratoire de Microséquençage des Protéines, Paris). La même séquence N-terminale a été obtenue pour les 2 bandes polypeptidiques (SEQ ID NO : 8).

Ce résultat a conduit à conclure que les 2 bandes polypeptidiques identifiées sur SDS-PAGE correspondaient vraisemblablement au même polypeptide, la différence de vitesse de migration pouvant résulter d'une dégradation partielle d'une fraction du polypeptide au cours des étapes de purification.

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6. 2. Détermination de la séquence aminoacide defragments internes à la phytase
Les 2 polypeptides de 70 et 90 kDa ont été séparés par électrophorèse SDS-PAGE et détectés par coloration à l'amidoblack. La bande polypeptidique à 70 kDa a été excisée du gel et le polypeptide soumis à une digestion in situ par l'Endolysine-C durant 18 h à 37 C. Les fragments peptidiques ont été séparés par HPLC sur une colonne DEAE C18. Les séquences de 4 fragments internes ont été obtenues par microséquençage (SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12).

SEQ ID NO : 8 : IPTDPQVPQ/VYF SEQIDNO : 9 : TSGGDAVNEWTALYLQK SEQ ID NO : 10 : AGGAPFLAQXNPIYXQPXYV SEQIDNO : ! ! : LYDPASK SEQ ID NO : 12 : APGLVR Exemple 7 : Obtention d'une sonde moléculaire relative à la phytase de Penicillium sp. CBS 109899
Après microséquençage, des oligonucléotides ont été déduits des peptides afin d'amplifier par PCR un fragment ADN relatif au gène codant à la phytase de Penicillium sp. CBS 109899.

7. 1. Conception des amorces PCR
Des amorces ont été déduites de la séquence aminoacides N-terminale et de la séquence interne SEQ ID NO : 9. La séquence de l'extrémité N-terminale a conduit à la déduction de 4 pools d'amorces dégénérées sens et la séquence interne SEQ ID NO : 9 à 1 pool d'amorces dégénérées inverses. Chacun des pools d'amorces sens a été employé séparément avec le pool d'amorces inverses.

7.2. Amplification dunfragment ADNgénomique relatif à la phytase
Dans un premier temps, Penicillium sp. CBS 109899 a été cultivé en milieu liquide MNUri (28 C, 180rpm, 2jours). Le mycélium a été récupéré par filtration et broyé dans l'azote liquide. L'extraction de l'ADN génomique a été effectuée dans Sml de tampon de lyse (1% SDS, 2% Triton X-100, lOOmM NaCl, ImM EDTA, 10mM Tris pH 8,0) et 5ml de phénol sur 19 de

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broyat. Après purification de la phase aqueuse par extraction phénol/chloroforme et chloroforme, l'ADN génomique a été précipité par l'addition de 2 volumes d'éthanol.

Les réactions de PCR ont été réalisées sur 100 ng d'ADN génomique avec 1 unité de Taq Polymérase (Q-BIOgene) et à l'aide d'un thermocycleur MJ Research modèle PTC-200. Le produit réactionnel de chaque PCR a été analysé sur gel agarose à 0.8%. Un fragment nucléotidique avoisinant 850 pb et correspondant au couple d'amorces OT ACS 17 P4.4 (SEQ ID NO : 13) et OT ACS 25 P6.1 (SEQ ID NO : 14) a été obtenu, directement sous cloné dans le vecteur pCR4-TOPO (Invitrogen) et séquencé (SEQ ID NO : 15).

L'analyse de la séquence a montré que les deux amorces utilisées pour l'amplification étaient présentes de part et d'autre du fragment amplifié et que les séquences aminoacides déduites leur faisant suite étaient cohérentes avec celles obtenues par microséquençage de la phytase. D'autre part, les séquences aminoacides des fragments peptidiques internes SEQ ID

NO : 10 et SEQ ID NO : 11 figuraient au sein de la séquence aminoacide déduite du fragment d'ADN. Ces observations ont conduit à conclure que le fragment ADN amplifié correspondait à la phytase microséquencée et a été nommé OT ACS 29.1. Ce fragment ADN a ensuite été employé comme sonde moléculaire homologue pour cloner le gène codant la phytase purifiée.

OT ACS 17 P4. 4 (SEQ ID NO : 13) 5'-ACNGAYCCNCARGTCCC OT ACS 25 P6.1 (SEQ ID NO : 14) 5'-GCNGTCCAYTCRTTNAC Exemple 8 : Clonage et caractérisation du gène codant la phytase de Penicillium sp. CBS 109899

8. 1. Détermination de la séquence de l'ADNe relatif à la phytase La séquence complète de l'ADNc a été obtenue par amplification, sous clonage et séquençage de ses extrémités 5'et 3'selon la technique de 5'et 3'RACE-PCR.

Dans un premier temps, Penicillium sp. CBS 109899 a été cultivé en condition d'induction

pour la phytase dans un milieu composé de farine d'amidon à 40 g/l, riz de son 25 g/l, phytate de calcium 20 g/l, glucose lOg/1, NH4Cl 15 g/l MgS04 (H20) 7 0. 5 g/l pH 5. 5 et complémenté en glucoamylase AMG 300 L (Novozymes) à 0. 06 g/l et alpha amylase Termamyl 120 L (Novozymes) à 0.18 g/l. La culture a été menée jusqu'à atteindre une activité phytase de 10 U/ml de milieu de culture. Le mycélium a été recueilli par filtration de la culture sur papier filtre (Wathmann) puis broyé dans l'azote liquide. Les ARN totaux ont été extraits du broyat par

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extraction phénolique dans un tampon acétate de sodium 50 mM pH 5.3, EDTA 10 mM. Les ARNm ont ensuite été rétro-transcrits au moyen du kit GeneRacer (Invitrogen). Les ADNc synthétisés possédaient à leurs extrémités 5'et 3'une séquence nucléotidique déterminée pour l'amplification par PCR ultérieure. Afin d'amplifier spécifiquement les extrémités de l'ADNc d'intérêt 2 amorces, l'une orientée vers l'extrémité 5'nommée OT ACS 37 PI (SEQ ID NO : 20) l'autre vers l'extrémité 3'nommée OT ACS 37 P3 (SEQ ID NO : 21), ont été déduites de la sonde moléculaire dans une région relative à la séquence peptidique SEQ ID NO : 10.

Les réactions de PCR ont été réalisées sur 1 ul de produit de synthèse d'ADNc avec 1 unité de Taq Polymérase (Q-BIOgene) à l'aide d'un thermocycleur MJ research modèle PTC-200 Les produits d'amplification ont été analysés sur gel agarose 0,8 %. Un fragment avoisinant 0,3 kb relatif à l'extrémité 5'et un autre avoisinant 1,7 kb relatif à l'extrémité 3'ont directement été sous clonés dans le vecteur pCR4-TOPO (Invitrogen), puis séquencés. La séquence de l'ADNc complet a ensuite été reconstituée (SEQ ID NO : 2).

OT ACS 37 PI (SEQ ID NO : 20) 5'-GGCGCTCCGTTCCTTGCGCAAAC-3' OT ACS 37 P3 (SEQ ID NO : 21) 5'-GTAGGTCGGCTGGGAATAGATCG-3' 8. 2. Sous clonage d'un fraMt ADN génomique EcoRV contenant le gène
Un fragment d'ADN génomique a été cloné en employant la technique de marche sur le génome. Dans un premier temps, un adaptateur a été ligaturé aux extrémités du fragment de restriction EcoRV. Pour se faire, le produit de digestion de l'ADN génomique de Penicillium sp.

CBS 109899 par EcoR V a été ligaturé à un GenomeWalker Adaptator (CLONTECH Laboratory, Inc) avec l'ADN Ligase T4 dans un tampon 50 mM Tris-HCI pH 7.5, 10 mM MgC12, 10 mM

dithiothréitol, 1 mM ATP et 0. 25 ig/ml de sérum albumine bovine durant 15 h. à 16 C. La réaction a été stoppée par traitement thermique à 70 C et le mélange réactionnel repris dans 200 f. d'eau ultra pure.

Afin d'amplifier par PCR les régions 5'et 3'du fragment de restriction EcoRV, deux amorces sens ont été déduites de la sonde moléculaire, l'une orientée vers l'extrémité 5'nommée OT ACS 32 P5 (SEQ ID NO : 16) l'autre vers l'extrémité 3'nommée OT ACS 32 P3 (SEQ ID NO : 17). L'amorce reverse, nommée Adaptor Primer (CLONTECH Laboratory, Inc), employée pour les réactions de PCR correspondait à la séquence de l'extrémité 5'de l'adaptateur.

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Les réactions de PCR ont été réalisées sur 1 l du produit de ligature avec 1 unitéd'Advantage Genomic Polymerase Mix (CLONTECH Laboratory, Inc) et à l'aide d'un thermocycleur MJ research modèle PTC-200. Le produit réactionnel de chaque PCR a été analysé sur gel agarose à 0.8%.

Deux fragments, l'un avoisinant 1.8 kb relatif à l'extrémité 5'et l'autre avoisinant 1.3 kb relatif à l'extrémité 3', ont été sous clonés et analysés par séquençage. Disposant de la séquence nucléotidique 5'et 3'du fragment EcoRV, des amorces spécifiques aux extrémités ont été dessinées et nommées OT ACS 38 PI (SEQ ID NO : 18) et OT ACS 38 P2 (SEQ ID NO : 19). Le fragment a été amplifié dans sa totalité à l'aide d'une polymérase de haute fidélité. La réaction de

PCR a été réalisée sur 100 ng d'ADN génomique de Penicillium sp. CBS 109899 avec 1 unité de PLATINUM Pfx DNA Polymerase (Life Technologies, Inc. ) et à l'aide d'un thermocycleur MJ research modèle PTC-200. Le produit d'amplification a été analysé sur gel agarose 0,8 %. Un fragment de 3,8 kb a directement été sous cloné dans le vecteur pCR4-TOPO (Invitrogen) séquencé (SEQ ID NO : 1) et nommé OT ACS 38. 1.

8. 3. Analyse de la séquence de I4DNc et du gène
Une séquence aminoacide a été déduite de l'ADNc et analysée (SEQ ID NO : 3). Au sein de cette séquence, toutes les séquences peptidiques internes à la phytase obtenues par microséquençage ont été retrouvées confirmant que l'ADNc séquencé correspond à la phytase d'intérêt. De plus, la séquence aminoacide déduite contient les sites spécifiques de fixation (RHGXRXP) et d'attaque nucléophile (HD) des phosphates caractérisant les phytases appartenant au groupe des acides phosphatases à histidine. L'alignement de la séquence ADNc avec celle du fragment ADN génomique OT ACS 38.1 a permis de déterminer les limites précises du gène d'intérêt et de localiser les introns qu'il contient.

Exemple 9 : Recherche de séquences homologues
9. 1. Construction d'une banque cosmidique de la souche Penieilliumfunieulosum IMI 134756 P. funiculosum IMI 1347S6 a été cultivé en milieu liquide MN-Uri (28 C, 180rpm, 2 jours). Le mycélium a été récupéré par filtration et broyé dans l'azote liquide. L'extraction de

l'ADN génomique a été effectuée dans 5ml de tampon de lyse (1% SDS, 2% Triton X-100, 100mM NaCl, ImM EDTA, 10mM Tris pH 8, 0) et Sml de phénol sur lg de broyat. Après

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purification de la phase aqueuse par phénol/chloroforme et chloroforme, l'ADN génomique a été précipité par l'addition de 2 volumes d'Ethanol.

Le produit de digestion partielle de 20 ug d'ADN génomique par l'enzyme de restriction SalI a été déposé sur un gel d'agarose (low melting point) pour y subir une électrophorèse en champ pulsé (18hrs, 5V/cm) dans un tampon 0,5xTBE. Après coloration au bromure d'éthidium, les fragments d'ADN d'une taille de 30 à 40kb ont été libérés du gel par digestion à la ss-agarase (GIBCO-BRL) et précipités à l'éthanol. Un aliquote de cet ADN génomique a été ligaturé dans le vecteur pMOCosX [Orbach (1994), GENE 150, pp 159-162] préalablement digéré par XhoI et déphosphorylé par la Calf Intestine Phosphatase. Le produit de la ligature mis en présence des éléments du phage zu (Packaging Protocol-STRATAGENE ; Gigapack Gold-11) ont permis la transfection d'une souche d'E. coli Q358 (Maniatis et al., 1982). Après étalement sur milieu gélosé Luria et Bertani (LB) complémenté en ampicilline à 50 g/ml les colonies ont été reprises dans 50 plaques de microtitrations à 96 puits et cultivées une nuit dans 150 u. l de LB complémenté en Ampicilline à 50 u. g/ml. Les cultures ont été répliquées sur membranes Hybond N+ (AMERSHAM) avant d'être complémentées en glycérol à une concentration finale de 50% et stocké à -80oC.

9.2. Criblage de la banque cosmidique avec la sonde OT ACS 29. 1
Une analyse par Southem blot sur l'ADN génomique de la souche P. funiculosum IMI 134756 a été réalisée avec la sonde OT ACS 29.1. La membrane sur laquelle est transféré l'ADN génomique préalablement digéré par plusieurs endonucléases de restrictions et séparé par éléctrophorèse a été pré-hybridée dans le tampon d'hybridation (7% SDS ; 0,5M Sodium phosphate pH 7,0) durant 10 min à 65 C. La sonde a été marquée avec de l'o-P dCTP au moyen du DNA labelling kit (Amersham). La sonde marquée a été ajoutée au tampon d'hybridation et

l'ensemble chauffé durant 5 min à 100 C avant emploi. L'hybridation a été menée durant 6 h à 65 C. Après hybridation, la membrane a été rincée 3 fois durant 15 min à 65 C dans un tampon de rinçage (1% SDS ; O, IM Sodium phosphate pH 7, 0), puis exposée. Cette analyse n'a révélé qu'un seul signal. Le génome de P. funiculosum IMI 134756 ne contient donc qu'une seule copie du gène d'intérêt. La banque cosmidique a alors été criblée sous les mêmes conditions stringentes au moyen de la sonde OT ACS 29.1 et a révélé plusieurs signaux sur les membranes n 15, 19 et 48. Le cosmide 15F10, relatif à la membrane n 15, a ainsi été identifié comme contenant une séquence ADN hybridant avec la sonde OT ACS 29.1. Une analyse de restriction a été effectuée

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sur l'ADN de ce cosmide afin de déterminer la position du gène correspondant. Le gène a été nommé phyF. Le clonage et le séquençage d'un fragment NcoI de 1, 3kb du cosmide 15fla a montré une forte homologie avec la séquence OT ACS 29. 1. Le gène phyF complet se trouve sur un fragment EcoRV-EcoRI de 2, 7kb lequel a été cloné et séquencé (SEQ ID NO : 4).

L'analyse de la séquence montre une région promotrice de 790bp et un début de la séquence codant phyF à l'ATG 791. Le gène phyF à 1536bp (position 791-2527), dont deux introns putatifs d'une taille de 35bp et 61bp.

Exemple 10-Optimisation des conditions de culture de la souche Penicillium sp. CBS 109899

10. 1. Influence de l'agitation sur la production de phytase
Les fermentations ont été réalisées dans les conditions de l'exemple 3, la vitesse d'agitation variant de 400 à 450 rpm (Tableau 2).

Tableau 2 : Activités obtenues en fin de fermentation en fonction de l'agitation.

<tb>
<tb> Volume <SEP> des <SEP> Agitation <SEP> Activité
<tb> fermenteurs <SEP> rpm <SEP> U/mL
<tb> 30L <SEP> 400 <SEP> 66
<tb> 30L <SEP> 425 <SEP> 48
<tb> 30L <SEP> 450 <SEP> 36
<tb>

Ces résultats montrent que l'augmentation de l'agitation a un effet négatif sur la production de phytase par la souche Penicillium sp. CBS 109899 native.

10. 2. Influence de la source d'azote sur la production de phytase
Les fermentations ont été réalisées dans les conditions de l'exemple 3. Le seul paramètre variant étant la source d'azote (son de riz) qui est substituée par une source d'azote différente, le son de soja (Tableau 3).

Tableau 3 : Activités obtenues en fin de fermentation en fonction de la source d'azote.

<tb>
<tb> Source <SEP> d'azote <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Son <SEP> de <SEP> riz <SEP> 100%
<tb> Son <SEP> de <SEP> soja <SEP> 128%
<tb>

<Desc/Clms Page number 35>

Ces résultats montrent que la source d'azote a un effet sur la production de phytase par la souche Penicillium sp. CBS 109899 native, en particulier le son de soja comme source d'azote favorise la production de phytase.

10. 3. Influence de la source de phytate sur la production de phytase
Les fermentations ont été réalisées dans les conditions de l'exemple 3. Le seul paramètre variant étant le phytate de Ca++ qui est substituée par le double sel de Ca++ et Mg++ (Tableau 4).

Tableau 4 : Activités obtenues en fin de fermentation en fonction de la source de phytate.

<tb>
<tb> Sels <SEP> de <SEP> phytate <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Sels <SEP> de <SEP> Ca++ <SEP> 100%
<tb> Sels <SEP> de <SEP> Ca++et <SEP> 120%
<tb> Mg++
<tb>

Ces résultats montrent que la source de phytate a un effet sur la production de phytase par la souche Penicillium sp. CBS 109899 native, en particulier le double sel de calcium et magnésium comme source de phytate permet d'améliorer la production de phytase comparativement au sel de calcium.

10. 4. Influence de la quantité de phytate sur la production de phytase
Les fermentations ont été réalisées dans les conditions de l'exemple 3. Le seul paramètre variant étant la quantité de phytate présente dans le milieu de fermentation (Tableau 5).

Tableau 5 : Activités obtenues en fin de fermentation en fonction de la quantité de phytate.

<tb>
<tb> Phytate <SEP> de <SEP> Activité <SEP> (%)
<tb> Ca++ <SEP> en <SEP> g/L
<tb> 20 <SEP> 100%
<tb> 1 <SEP> 15 <SEP> 70%
<tb> 10 <SEP> 60%
<tb> 0 <SEP> 1%
<tb>

Ces résultats montrent que la production de phytase par la souche Penicillium sp. CBS 109899 native augmente significativement avec la quantité de phytate présente dans le milieu de fermentation.

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Exemple 11. Efficacité zootechnique de la phytase produite par la souche Penicillium sp.

CBS 109899
11. 1. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la digestihilité du phosphore par les coqs
L'expérience a été menée sur 20 coqs. Les animaux ont été divisés en deux groupes de 10, un groupe d'animaux traités et un groupe d'animaux témoins, puis élevés individuellement en cages. Ils on ensuite été nourris avec un aliment à base de maïs et soja déficient en phosphore (P) digestible, supplémenté avec 702 UI (Unité Internationale = quantité de phytase capable de libérer 1 gnole de phosphate par minute à 37 C, pH5. 5, solution de phytate de sodium à 10 g/L) de phytase par kg d'aliment pour le groupe d'animaux traités.

Les faeces des animaux ont été collectés à deux et trois jours après le début de l'expérience afin d'analyser l'excrétion de phosphore. La digestibilité du phosphore correspond au pourcentage de phosphore assimilé par les animaux par rapport à la quantité ingérée. Ce pourcentage est déduit de la quantité excrétée retrouvée dans les faeces (Tableau 6).

Tableau 6 : Ingestion, excrétion et digestibilité du phosphore

<tb>
<tb> Phosphore
<tb> Ingestion <SEP> (g/kg) <SEP> Excrétion <SEP> (g/kg) <SEP> Digestibilité <SEP> (%)
<tb> Aliment <SEP> de
<tb> base <SEP> 0.804 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 003 <SEP> 0.319 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 019 <SEP> 60.3 <SEP> ~ <SEP> 2. <SEP> 5
<tb> Aliment
<tb> complémenté <SEP> 0. <SEP> 801 <SEP> ~ <SEP> 0. <SEP> 011 <SEP> 0.255 <SEP> ~ <SEP> 0. <SEP> 028 <SEP> 68.1 <SEP> ~ <SEP> 4. <SEP> 4
<tb> 702 <SEP> UI/kg
<tb>

Les résultats du tableau 6 montrent clairement que la supplémentation d'un l'aliment de base déficient en phosphore digestible avec la phytase selon l'invention réduit significativement (P < 0. 05) l'excrétion de phosphore. Cet effet est le reflet d'une augmentation de la digestibilité du phosphore chez les animaux nourris avec l'aliment supplémenté. Il montre l'efficacité de la phytase selon l'invention pour libérer le phosphore non-digestible de la ration alimentaire.

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77. 2. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la croissance des poulets
L'expérience a été menée sur 210 poulets de race Ross 308. Les animaux ont été divisés en six groupes de 35, quatre groupes d'animaux traités avec différentes doses de phytase, un groupe d'animaux témoins négatifs non traités, et un groupe d'animaux témoins positifs traités avec du phosphore minéral. Les animaux sont élevés à raison de cinq animaux par cage, et nourris pendant 13 jours (de l'âge 9 jours à l'âge 22 jours). L'aliment de base, constitué de maïs et de soja et déficient en phosphore (P) digestible, est supplémenté avec 4 concentrations différentes de phytase : 243,433, 738, et 1234 UI de phytase par kg d'aliment pour les quatre groupes d'animaux traités, et avec 0,1 % de phosphore minéral sous forme de phosphore mono ou bicalcique pour les témoins positifs.

La croissance a été estimée par mesure des poids corporels des animaux au début et en fin d'expérience. Ces mesures permettent de déterminer le gain de poids corporel et l'indice de consommation (IC). L'indice de consommation correspond à la quantité d'aliment consommé par rapport au gain de poids corporel. Pour une quantité d'aliment donné, une diminution de l'indice signifie une augmentation du gain de poids par l'animal, c'est-à-dire une meilleure assimilation de l'aliment par l'animal. Les résultats sont montrés dans le tableau 7.

Tableau 7 : Effet de la phytase sur la croissance des poulets

<tb>
<tb> Traitement <SEP> Témoins <SEP> 243 <SEP> UI/kg <SEP> 433 <SEP> UI/kg <SEP> 738 <SEP> UI/kg <SEP> 1234 <SEP> UI/kg <SEP> Témoin
<tb> négatifs <SEP> positifs
<tb> Gain <SEP> de <SEP> poids <SEP> (g) <SEP> 216 <SEP> ~ <SEP> 76 <SEP> 369 <SEP> ~ <SEP> 88 <SEP> 435 <SEP> ~ <SEP> 82 <SEP> 452 <SEP> ~ <SEP> 97 <SEP> 497 <SEP> ~ <SEP> 81 <SEP> 461 <SEP> : <SEP> t <SEP> 72
<tb> IC <SEP> 2. <SEP> 28 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0. <SEP> 91 <SEP> 1. <SEP> 74 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0. <SEP> 52 <SEP> 1. <SEP> 57 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0. <SEP> 34 <SEP> 1. <SEP> 61 <SEP> 0. <SEP> 44 <SEP> 1. <SEP> 510. <SEP> 26 <SEP> 1. <SEP> 51 <SEP> : <SEP> t <SEP> 0. <SEP> 23
<tb>

Les résultats montrent que la supplémentation d'un aliment de base déficient en phosphore digestible avec 243,433, 738, et 1234 UI/kg de phytase selon l'invention résulte en un gain de poids augmenté respectivement d'un facteur 1.7, 2.0, 2.1, et 2.3. Les plus fortes doses permettent même d'obtenir des gains de poids supérieurs à la supplémentation de l'aliment en phosphore minéral. Cette supplémentation permet également d'augmenter l'indice de consommation de 33% en moyenne.

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11. 3. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la minéralisation osseuse des poulets
L'expérience a été menée sur 210 poulets de race Ross 308. Les animaux ont été divisés en six groupes de 35, quatre groupes d'animaux traités avec différentes doses de phytase, un groupe d'animaux témoins négatifs non traités, et un groupe d'animaux témoins positifs traités avec du phosphore minéral. Les animaux sont élevés à raison de cinq animaux par cage, et nourris pendant 13 jours (de l'âge 9 jours à l'âge 22 jours). L'aliment de base, constitué de maïs et de soja et déficient en phosphore (P) digestible, est supplémenté avec 4 concentrations différentes de phytase : 243,433, 738, et 1234 UI de phytase par kg d'aliment pour les quatre groupes d'animaux traités, et avec 0,1 % de phosphore minéral sous forme de phosphore mono ou bicalcique pour les témoins positifs.

Au jour 14, un tibia est prélevé sur chaque animal. Chaque tibia est pesé, incinéré, et son contenu en cendres, calcium et phosphore analysé. Les résultats sont montrés dans le tableau 8.

Tableau 8 : Effet de la phytase sur la minéralisation osseuse des poulets

<tb>
<tb> Traitement <SEP> Témoins <SEP> 243UI/kg <SEP> 433UI/kg <SEP> 738UI/kg <SEP> 1234 <SEP> Témoin
<tb> négatifs <SEP> UI/kg <SEP> positifs
<tb> Phosphore <SEP> tibial <SEP> (mg) <SEP> 89. <SEP> 1 <SEP> 138. <SEP> 2 <SEP> 157. <SEP> 8 <SEP> 180. <SEP> 1 <SEP> 215. <SEP> 9 <SEP> 184. <SEP> 1
<tb> SD <SEP> 22. <SEP> 5 <SEP> 21. <SEP> 4 <SEP> 28. <SEP> 1 <SEP> 41. <SEP> 2 <SEP> 37. <SEP> 6 <SEP> 14. <SEP> 8
<tb> Calcium <SEP> tibial <SEP> (mg) <SEP> 43 <SEP> 66.7 <SEP> 76.8 <SEP> 87.8 <SEP> 103.6 <SEP> 89.7
<tb> SD <SEP> 9. <SEP> 6 <SEP> 9. <SEP> 3 <SEP> 13. <SEP> 6 <SEP> 18. <SEP> 6 <SEP> 19. <SEP> 3 <SEP> 8. <SEP> 0
<tb> Cendres <SEP> tibiales <SEP> (mg) <SEP> 309 <SEP> 473 <SEP> 527 <SEP> 594 <SEP> 683 <SEP> 602
<tb> SD71 <SEP> 54 <SEP> 71 <SEP> 102 <SEP> 106 <SEP> 42
<tb>

Ces résultats montrent clairement, pour toutes les concentrations testées, un effet positif de la supplémentation de l'aliment avec une phytase selon l'invention sur la minéralisation osseuse des poulets. En particulier, la phytase selon l'invention favorise la minéralisation calcique et phosphorique des os, ainsi que leur masse de cendres. En outre, pour chacun des paramètres mesurés, un effet-dose est observé.

11. 4. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la digestibilité du phosphore et du calcium des porcs
L'expérience a été menée sur 7 porcs d'un poids moyen approximatif de 70 kg. Une anastomose iléo-rectale a été mise en place par chirurgie sur les animaux afin de pouvoir collecter quantitativement leur contenu iléal. Ils ont été élevés individuellement pour les besoins de

<Desc/Clms Page number 39>

l'expérience.

Les animaux ont été nourris avec trois aliments à base de maïs et soja. Des supplémentations ont été réalisées à 300 et 600 UI par kg d'aliment. Chaque animal a été adapté à un aliment pendant 6 jours consécutifs. Le contenu iléal a été collecté au jour 7, puis l'aliment de l'animal changé. La quantité de calcium et de phosphore du contenu iléal a été analysée, puis la digestibilité de ces deux éléments mesurée. Les résultats sont montrés dans le tableau 9.

Tableau 9 : Effet de la phytase sur la digestibilité du calcium et du phosphore des porcs

<tb>
<tb> Témoin <SEP> 300 <SEP> Ullkg <SEP> 600 <SEP> Ullkg
<tb> Digestibilité <SEP> du <SEP> Ca <SEP> (%) <SEP> 42,73 <SEP> 7, <SEP> 40 <SEP> 45,26 <SEP> 2, <SEP> 49 <SEP> 47,09 <SEP> 8, <SEP> 14
<tb> Digestibilité <SEP> du <SEP> P <SEP> (%) <SEP> 39,46 <SEP> : <SEP> 11, <SEP> 8643, <SEP> 06 <SEP> 9, <SEP> 1147, <SEP> 52 <SEP> 15, <SEP> 23
<tb>

La supplémentation de l'aliment avec une phytase selon l'invention augmente de manière significative la digestibilité du calcium et du phosphore. La digestibilité du calcium est augmentée respectivement de 5.6 et 9.3 % pour les aliments supplémentés avec 300 et 600 UI par kg d'aliment, et la digestibilité du phosphore est augmentée respectivement de 8.4 et 17 % pour les aliments supplémentés avec 300 et 600 UI par kg d'aliment.

11. 5. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la digestibilité du phosphore des porcelets
L'expérience a été menée sur 12 porcelets d'un poids moyen approximatif de 11 kg. Les animaux ont été divisés en deux groupes de 6, un groupe d'animaux traités et un groupe d'animaux témoins, puis élevés individuellement en cage. Ils ont ensuite été nourris pendant 26 jours avec un aliment à base de maïs et soja déficient en phosphore (P) digestible, supplémenté avec 481 UI de phytase par kg d'aliment.

Les faeces des animaux ont été collectés pendant 5 jours à compter du jour 21 de l'expérience afin d'analyser leur contenu en phosphore et en calcium. La digestibilité du phosphore correspond au pourcentage de phosphore et calcium assimilé par les animaux par rapport à la quantité ingérée. Ce pourcentage est déduit de la quantité excrétée retrouvée dans les faeces (Tableau 10).

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Tableau 10 : Effet de la phytase sur la digestibilité du phosphore des porcelets

<tb>
<tb> Ingestion <SEP> (g) <SEP> Excrétion <SEP> (g) <SEP> Digestibilité <SEP> (%)
<tb> Phosphore
<tb> Témoins <SEP> 1. <SEP> 0070. <SEP> 1270. <SEP> 800 <SEP> 0. <SEP> 07820. <SEP> 11i5. <SEP> 79
<tb> 481UI/kg <SEP> 1. <SEP> 145 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 124 <SEP> 0. <SEP> 573 <SEP> : <SEP> ! <SEP> : <SEP> 0. <SEP> 111 <SEP> 50. <SEP> 28 <SEP> ~ <SEP> 6. <SEP> 52
<tb> Calcium
<tb> Témoins <SEP> 1.873 <SEP> ~ <SEP> 0.237 <SEP> 1.228 <SEP> ~ <SEP> 0.180 <SEP> 34. <SEP> 2 <SEP> ~ <SEP> 7. <SEP> 73
<tb> 481 <SEP> UI/kg <SEP> 2.131 <SEP> ~ <SEP> 0. <SEP> 234 <SEP> 1.102 <SEP> ~ <SEP> 0. <SEP> 102 <SEP> 48.62 <SEP> ~ <SEP> 8. <SEP> 44
<tb>

Ces résultats montrent que la supplémentation de l'aliment avec une phytase selon l'invention augmente la digestibilité du phosphore de 250 % et la digestibilité du calcium de 42%.

11. 6. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la croissance des porcelets
L'expérience a été menée sur 12 porcelets d'un poids moyen approximatif de 11 kg. Les animaux ont été divisés en deux groupes de 6, un groupe d'animaux traités et un groupe d'animaux témoins, puis élevés individuellement en cage. Ils ont ensuite été nourris pendant 26 jours avec un aliment à base de maïs et soja déficient en phosphore (P) digestible, supplémenté avec 481 UI de phytase par kg d'aliment.

La croissance a été estimée par mesure des poids corporels des animaux au début et en fin d'expérience. Ces mesures permettent de déterminer le gain de poids corporel et l'indice de consommation (IC). Les résultats sont montrés dans le tableau 11.

Tableau 11 : Effet de la phytase sur la croissance des porcelets

<tb>
<tb> Traitement <SEP> Témoins <SEP> 481 <SEP> UI/kg
<tb> Poids <SEP> corporel <SEP> initial <SEP> (kg) <SEP> 6.81 <SEP> 0. <SEP> 696. <SEP> 75 <SEP> 0. <SEP> 88
<tb> Poids <SEP> corporel <SEP> final <SEP> (kg) <SEP> 13.34 <SEP> 1. <SEP> 58 <SEP> 14.86 <SEP> 1. <SEP> 41
<tb> Gain <SEP> de <SEP> poids <SEP> corporel <SEP> (kg) <SEP> 6.53 <SEP> 1. <SEP> 72 <SEP> 8.11 <SEP> 1. <SEP> 66
<tb> JC <SEP> 2, <SEP> 3111. <SEP> 85 <SEP> 1,63 <SEP> ~ <SEP> 0. <SEP> 88
<tb>

Les résultats montrent que la supplémentation d'un l'aliment de base déficient en phosphore digestible avec 481 UI/kg de phytase selon l'invention résulte en une augmentation de 24 % de gain de poids. Cette supplémentation réduit également significativement l'indice de

<Desc/Clms Page number 41>

consommation.

11. 7. Effet d'un régime alimentaire supplémenté en phytase sur la minéralisation osseuse des porcelets
L'expérience a été menée sur 12 porcelets d'un poids moyen approximatif de 11 kg. Les animaux ont été divisés en deux groupes de 6, un groupe d'animaux traités et un groupe d'animaux témoins, puis élevés individuellement en cage. Ils ont ensuite été nourris pendant 26 jours avec un aliment à base de maïs et soja déficient en phosphore (P) digestible, supplémenté avec 481 UI de phytase par kg d'aliment.

Au jour 27 de l'expérience, un tibia est prélevé sur chaque animal. Chaque tibia est pesé, incinéré, et son contenu en minéraux, calcium et phosphore analysé. Les résultats sont montrés dans le tableau 12.

Tableau 12 : Effet de la phytase sur la minéralisation osseuse des porcelets

<tb>
<tb> Traitement <SEP> Témoins <SEP> 481 <SEP> UI/kg
<tb> Phosphore <SEP> tibial <SEP> (%) <SEP> 1. <SEP> 660. <SEP> 102. <SEP> 18 <SEP> : <SEP> t0. <SEP> 09
<tb> Calcium <SEP> tibial <SEP> (%) <SEP> 3.56 <SEP> 0. <SEP> 30 <SEP> 4.69 <SEP> 0. <SEP> 42
<tb> Minéraux <SEP> (%) <SEP> 10. <SEP> 45i0. <SEP> 6913. <SEP> 12i0. <SEP> 55
<tb>

Les résultats montrent que la supplémentation d'un l'aliment de base déficient en phosphore digestible avec 481 UI/kg de phytase selon l'invention résulte en une augmentation significative de la minéralisation osseuse des porcelets. En particulier, la phytase selon l'invention favorise la minéralisation calcique et phosphorique des os, ainsi que leur masse minérale.

Claims (2)

Revendications 1-Polynucléotide isolé codant pour une phytase, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi le groupe consistant en : (a) un polynucléotide isolé codant pour la phytase décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3 (b) un polynucléotide isolé s'hybridant au polynucléotide selon (a) (c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide selon (a) (d) un fragment d'un polynucléotide selon (a), (b), ou (c) 2-Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est sélectionné parmi les séquences représentées par les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 1 et SEQ ID NO : 2 3-Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO :
1. 4 4-Polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il provient d'un champignon du genre Penicillium

   

   5-Polynucléotide isolé comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4 6-Phytase, caractérisée en ce qu'elle est codée par un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5

   7-Phytase selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle est sélectionnée parmi le groupe consistant en : (a) la phytase représentée par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3 (b) une phytase homologue à la phytase selon (a) (c) un fragment d'une phytase selon (a) ou (b)

   8-Phytase selon l'une des revendications 6 ou 7, caractérisée en ce qu'elle provient d'un champignon du genre Penicillium

   <Desc/Clms Page number 43>

   9-Phytase selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle provient de la souche Penicillium sp CBS 109899

   10-Gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle : (a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte (b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 (c) un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte

   11-Gène chimère selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend, en plus, un peptide signal ou un peptide de transit fonctionnel dans ledit organisme hôte

   12-Vecteur d'expression ou de transformation comprenant un gène chimère selon l'une des revendications 10 ou 11

   13-Vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un phage ou un virus

   14-Organisme hôte transformé comprenant un gène chimère selon l'une des revendications
2. 10 ou 11

   15-Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un microorganisme

   16-Organisme hôte selon la revendication 15, caractérisé en ce que le microorganisme est sélectionné parmi les bactéries, les champignons, les levures, ou les virus

   17-Organisme hôte selon la revendication 16, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie sélectionnée parmi les genres Corynebacterium, Bacillus, Streptomyces, et

   Escherichia, en particulier E. coli

   <Desc/Clms Page number 44>

   18-Organisme hôte selon la revendication 16, caractérisé en ce que le microorganisme est un champignon sélectionné parmi les genres Penicillium, Aspergillus, Chrysosporium, et Trichoderma

   19-Organisme hôte selon la revendication 16, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure sélectionnée parmi les genres Saccharomyces, Kluyveromyces, et Pichia

   20-Organisme hôte selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une cellule végétale, d'une plante, ou une partie de plante

   21-Procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) concentration de l'organisme cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d)

   22-Procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme

   23-Procédé de production d'une phytase selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend toutes les étapes des procédés selon les revendications 21 ou 22, auxquelles est ajoutée une étape supplémentaire : (f) de purification de la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (e) pour le procédé selon la revendication 21 (c) de purification de la phytase à partir du milieu de culture récupéré à l'étape (b) pour le procédé selon la revendication 22

   <Desc/Clms Page number 45>

   24-Procédé de production selon l'une des revendications 21,22 ou 23, caractérisé en ce que l'organisme est un microorganisme.

   25-Procédé de production selon la revendication 24, caractérisé en ce que le microorganisme est un champignon.

   26-Procédé de production selon la revendication 25, caractérisé en ce que le champignon est un champignon du genre Penicillium

   27-Procédé de production selon la revendication 26, caractérisé en ce que le champignon du genre Penicillium est la souche Penicillium sp CBS 109899

   28-Procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 14 à 20 (b) concentration de l'organisme hôte transformé cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d)

   29-Procédé de production d'un extrait possédant une activité phytase, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 14 à 20 (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme hôte transformé

   30-Procédé de production d'une phytase selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend toutes les étapes des procédés selon les revendications 28 ou 29, auxquelles est ajoutée une étape supplémentaire : (f) de purification de la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (e) pour le procédé selon la revendication 28 (c) de purification de la phytase à partir du milieu de culture récupéré à l'étape (b) pour le procédé selon la revendication 29

   <Desc/Clms Page number 46>

   31-Composition enzymatique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une phytase selon l'une des revendications 6 à 9

   32-Composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 14 à 20

   33-Composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5

   34-Composition alimentaire selon la revendication 33, caractérisée en ce que ledit organisme est un champignon

   35-Composition alimentaire selon la revendication 34, caractérisée en ce que ledit champignon est un champignon du genre Penicillium

   36-Composition alimentaire selon la revendication 35, caractérisée en ce que le champignon est la souche Penicillium sp CBS 109899

   37-Composition alimentaire, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une phytase selon l'une des revendications 6 à 9

   38-Utilisation d'une composition alimentaire selon l'une des revendications 32 à 37 pour l'alimentation des animaux monogastriques

   39-Utilisation d'une composition alimentaire selon la revendication 38, caractérisée en ce qu'elle est destinée à l'alimentation des porcs

   40-Utilisation d'une composition alimentaire selon la revendication 38, caractérisée en ce qu'elle est destinée à l'alimentation des volailles

   41-Procédé de production d'une composition alimentaire selon la revendication 32, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :

   <Desc/Clms Page number 47>

   (a) mise en culture d'un organisme hôte selon l'une des revendications 14 à 20 (b) concentration de l'organisme hôte cultivé à l'étape (a) (c) incorporation de l'organisme hôte isolé à l'étape (b) dans ladite composition alimentaire

   42-Procédé de production d'une composition alimentaire selon l'une des revendications 33 à 36, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) concentration de l'organisme cultivé à l'étape (a) (c) incorporation de l'organisme isolé à l'étape (b) dans ladite composition alimentaire

   43-Procédé de production d'une composition alimentaire selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) concentration de l'organisme cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d) (f) incorporation du surnageant récupéré à l'étape (e) dans ladite composition alimentaire

   44-Procédé de production d'une composition alimentaire selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme possédant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 5 dans des conditions lui permettant d'exprimer ladite phytase (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme (c) incorporation du milieu de culture récupéré à l'étape (b) dans ladite composition alimentaire

   45-Procédé de production d'une composition alimentaire selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 14 à 20

   <Desc/Clms Page number 48>

   (b) concentration de l'organisme hôte transformé cultivé à l'étape (a) (c) cassage cellulaire de l'organisme isolé à l'étape (b) (d) centrifugation de l'extrait cellulaire cassé obtenu à l'étape (c) (e) récupération du surnageant possédant l'activité phytase issu de l'étape (d) (f) incorporation du surnageant récupéré à l'étape (e) dans ladite composition alimentaire

   46-Procédé de production d'une composition alimentaire selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de : (a) mise en culture d'un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 14 à 20 (b) récupération du milieu de culture par élimination dudit organisme hôte transformé (c) incorporation du milieu de culture récupéré à l'étape (b) dans ladite composition alimentaire

   47-Procédé selon les revendications 43 ou 45, caractérisé en ce que l'étape (f) est remplacée par les étapes : (f) purification de la phytase à partir du surnageant récupéré à l'étape (e) (g) incorporation de la phytase purifiée à l'étape (f) dans ladite composition alimentaire

   48-Procédé selon les revendications 44 ou 46, caractérisé en ce que l'étape (c) est remplacée par les étapes : (c) purification de la phytase à partir du milieu de culture récupéré à l'étape (b) (d) incorporation de la phytase purifiée à l'étape (c) dans ladite composition alimentaire 49-Procédé pour augmenter l'assimilation du phosphate inorganique contenu dans le phytate des aliments à base de végétaux par les animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on incorpore une phytase selon l'une des revendications 6 à 9 ou une composition enzymatique selon la revendication 31 dans l'alimentation desdits animaux.

   50-Procédé selon la revendication 48, caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux monogastriques avec une composition alimentaire selon l'une des revendications 32 à 37.

   <Desc/Clms Page number 49>

   51-Procédé pour diminuer l'adjonction de phosphore dans l'alimentation des animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux avec une composition alimentaire selon l'une des revendications 32 à 37.

   52-Procédé pour diminuer les rejets de phosphore issus de l'alimentation des animaux monogastriques, caractérisé en ce que l'on alimente lesdits animaux avec une composition alimentaire selon l'une des revendications 32 à 37.

   53-Champignon filamenteux du genre Penicillium sp. possédant le numéro de dépôt CBS 109899