EA007461B1 - Новые фитазы и способ их получения - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение касается новых фитаз, в частности фитаз, происходящих из грибов, а также соответствующих способов их получения. Настоящее изобретение, в частности, касается новых фитаз, происходящих из грибов рода Penicillium, в особенности штамма CBS 109899 Penicillium sp., а также полинуклеотидов, кодирующих эти фитазы. Изобретение также касается векторов, содержащих эти полинуклеотиды, и трансформированных организмов, экспрессирующих данные фитазы в своих тканях.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается новых фитаз, в частности фитаз, происходящих из грибов, а также соответствующих способов их получения. Настоящее изобретение, в частности, касается новых фитаз, происходящих из грибов рода РешсШшш, в особенности штамма РешсШшш СВ8 109899, а также полинуклеотидов, кодирующих эти фитазы. Изобретение также касается векторов, содержащих эти полинуклеотиды, и трансформированных организмов, экспрессирующих данные фитазы в своих тканях.

В частности, фитазы настоящего изобретения особенно пригодны для применения в кормовых композициях, предназначенных для питания животных. Такая пригодность связана с их свойствами, в частности с активностью в условиях температуры и рН, соответствующих условиям получения данных композиций, а также условиям, встречающимся в пищеварительной системе млекопитающих.

Уровень техники

Фосфор - элемент, необходимый для жизни всех организмов. В частности, он имеет особое значение для тех, кто разводит домашних животных с тем, чтобы животные получали его в достаточном количестве для оптимального роста и развития. Большинство домашних животных получает кормовые композиции на основе растений. Эти растения содержат большое количество фосфата, который они запасают в своих тканях в виде запасного соединения - фитиновой (инозитгексафосфорной) кислоты. В среднем, в фитиновой кислоте содержится от 50 до 70% фосфора, находящегося в растениях. Фитиновая кислота подвергается естественной мобилизации, и содержащийся в ней фосфат высвобождается у большинства домашних животных, в особенности жвачных. Однако фитиновая кислота не метаболизируется у животных с неразделенным желудком, таких как свиньи и птицы. Поэтому у таких животных фитиновая кислота, поступившая с кормом, выделяется с экскрементами, и животноводам приходится добавлять в корма неорганический фосфат для того, чтобы животные получали достаточное количество фосфора. Такой подход влечет дополнительные расходы и вызывает загрязнение от попадания неусвоенной животными фитиновой кислоты в окружающую среду. Такое загрязнение еще больше возрастает в местах интенсивного разведения домашних животных.

К тому же известно, что фитиновая кислота является хелатором таких важных питательных элементов, содержащихся в корме, как магний, кальций, цинк или железо.

Это свойство ведет к уменьшению пищевой ценности корма, что придает фитиновой кислоте свойства противопитательного вещества.

Для того чтобы справиться с различными недостатками, связанными с отсутствием усваивания фитиновой кислоты у животных с неразделенным желудком, было предложено введение фермента фитазы в корма этих домашних животных. Фитаза гидролизирует фитиновую кислоту с освобождением инозита и неорганического фосфата. Фитазы и гены, кодирующие их, были выделены из многих организмов. В основном, фитазы выделяли из грибов (Норкой апб Ωανίκ. 1983, Епхуше МютоЬ. Тесйпо1. 5, 377-382; \Уукк е! а1., 1999, Арр1. Епуйоп. МюгоЬю1. 65(2), 359-366). Из грибов, вырабатывающих фитазу, можно отметить грибы рода АкретдШик, в частности А. йссиш (ШаН апб О1Ькоп, 1987, Ртератабуе Вюс11е1шк1гу 17(1), 63-91; и11аН апб П1ксЫпдет, 1993, Вюсйеш. Вюрйук. Век. Сошшип. 192(2), 747-753), А. 1еттеик (Мйсйе11 е! а1., 1997, МюгоЬю1оду, 143 (Р1 1), 245-252), А. шдет (Иуотакоуа е! а1., 1997, Роба М1сгоЬю1. (Ртайа), 42(4), 349-352), А. £иш1да1ик (Ракашоп!ек е! а1., 1997, Арр1. Епуйоп. МюгоЬю1., 63(5), 1696-1700), рода РешсШшш (^О-а-01/12792), в частности Р. саке1со1иш, рода МусейорйШота, в частности М. Шегшорййа (Мйсйей е! а1., 1997, М1стоЬю1оду, 143 (Р! 1), 245-252), рода Та1агошусек, в частности Т. !йетшорй11ик, рода Иеигокрога, в частности N. сгакка и N. кйорййа, рода Тйегшошусек, в частности Т. 1апидшокик (Ветка е! а1., 1998, Арр1. Епуйоп. М1сгоЬю1. 64(11), 4423-4427), рода Мопаксик, в частности М. апка. Фитазы также обнаружены у бактерий. К примеру, можно отметить бактерии рода ВасШик, в частности В. киЬ1Шк (Ро^ат апб 1адаппа1йап, 1982, 1. Вас!етю1. 151(3), 102-1108; ЗЫшз/и, 1992, ВюксЕ Вю!есй. Вюсйеш. 56(8), 1266-1269; Кетиуо е! а1., 1998, Арр1. Епуйоп. М1стоЬю1. 64(6), 2079-2085), рода Ркеибошопак (Сокдтоуе, 1970, Аик!га1. 1. Вю1. 8сЕ 23, 1207-1220), рода ЕксйепсЫа, в частности Е. сой (Оо1оуап е! а1., 2000, Сап. 1. МютоЬю1. 46, 59-71), рода Еп!егоЬас!ег (Уооп е! а1., 1996, Епхуше апб М1стоЬю1. Тесйпо1. 18, 449-454) или рода 81тер!ошусек. Также выделяли фитазы дрожжей (Эуогакоуа е! а1., 1998, Рока МюгоЬюк 43(4), 323338), например фитазы из дрожжей 8сйтапиошусек осабеШайк и 8ассйатошусек сетеу1к1ае. Наконец, фитазы обнаружены у растений, в частности у сои (И11ай апб О1Ькоп, 1988, АгсН. Вюсйеш. Вюрйук. 260(2), 514-20), кукурузы (Маидепек! е! а1., 1999, Вюсйеш. 1., 322 (Р! 2), 511-7; Маидепек! е! а1., 1999, Р1ап! Мо1. Вю1., 39(3), 503-14) или АгаЫборык (Ми11апеу апб И11ай, 1998, Вюсйеш. Вюрйук. Век. Соттип., 251(1), 252-5).

Свойства, дающие возможность охарактеризовать фитазы, включают константу Михаэлиса (К_ш) в отношении фитиновой кислоты, оптимум рН и температурный оптимум для активности, а также стабильность этой активности при данном рН и температуре. Можно использовать и данные, касающиеся структуры фитаз, такие как молекулярный вес (м.в.), изоэлектрическая точка (р1) и пептидная последовательность. Для того чтобы фитазы можно было использовать для кормления животных, они должны иметь свойства, совместимые с той обработкой, которой подвергаются корма для такого кормления. В частности, должна сохранятся активность фитаз и, по возможности, она должна быть оптимальной в условиях температуры и рН процессов, применяющихся для получения этих кормов, а также в условиях

- 1 007461 пищеварительного тракта животных, потребляющих эти корма. Эти ограничения, в основном, ведут к поиску таких фитаз, активность которых выдерживает условия высокой температуры типа тех, что применяются в процессах получения кормовых композиций, и выдерживает условия кислых значений рН типа тех, что существуют в пищеварительном тракте домашних животных.

Для того чтобы удовлетворить этим критериям, проводился поиск фитаз у организмов, в частности микроорганизмов, развивающихся в таких местах, в которых условия температуры и рН соответствуют этим критериям. Такой подход позволил выделить фитазы, выдерживающие высокие температуры, например фитазы, описанные в патентных заявках \¥0 97/35016 или ЕР 0 684 313, а также фитазы, имеющие низкие значения К_т, например, описанные в патентной заявке ЕР 0 960 934. Другой подход заключался в искусственной модификации последовательности известных фитаз путем направленного мутагенеза с целью придания им полезных свойств. Этот подход, в частности, описан в патентных заявках \¥О 99/48380, ЕР 0 897 985 и ЕР 0 897 010.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Активность фитазы РешсШшт 5р. СВ8 109899 в зависимости от рН. Величина 100% относительной активности соответствует оптимуму активности фитазы при данном значении рН.

Фиг. 2. Активность фитазы РешсШшт 5р. СВ8 109899 в зависимости от температуры. Величина 100% относительной активности соответствует оптимуму активности фитазы при данной температуре.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение касается выделенных полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 3. Эта фитаза и кодирующие ее полинуклеотиды происходят из штамма гриба рода РешсШшт, в частности штамма РешсШшт 5р. СВ8 109899.

В соответствии с настоящим изобретением термин полинуклеотид означает молекулу нуклеиновой кислоты, состоящую из природной или искусственной последовательности оснований, которая может представлять собой ДНК или РНК, предпочтительно ДНК, в особенности двухцепочечную. Если данный полинуклеотид природный, то подразумевается, что изобретение охватывает его не в природном окружении, но только выделенный и очищенный полинуклеотид из генома живого организма, в котором он находится в природе. Такой полинуклеотид может быть получен непосредственно, путем экстрагирования и очистки, или косвенно, путем копирования. Однако настоящее изобретение охватывает данный полинуклеотид и в том случае, когда он встроен искусственно в геном другого живого организма, а не того, в котором он находится в природе, или когда он искусственно введен обратно в тот живой организм, из которого он происходит, в виде одной или нескольких копий в геноме этого организма. В том случае, когда этот полинуклеотид является зондом, то он обычно одноцепочечный.

Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, кодирующие пептидную последовательность фитазы, представленной последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 3. Специалистам в данной области хорошо известно, что такое определение охватывает все полинуклеотиды, в том числе и нуклеотидные последовательности, отличающиеся вследствие вырожденности генетического кода, которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность, то есть одну и ту же фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3.

Настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, гомологичные вышеописанным полинуклеотидам, причем данные гомологичные полинуклеотиды кодируют фитазы, гомологичные фитазе, представленной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3. В соответствии с изобретением термин гомологичный означает, что последовательности полинуклеотидов, кодирующих фитазы, содержат модификации по сравнению с полинуклеотидами, кодирующими фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3. Гомологичные полинуклеотиды отличаются по степени их тождественности полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3. Степень тождественности между двумя соответствующими полинуклеотидами определяется путем сравнения их последовательностей и обычно выражается в виде процентного содержания идентичных нуклеотидов между этими последовательностями. Степень тождественности измеряется по определенному отрезку последовательности, причем более короткая из сравниваемых последовательностей определяет тот отрезок последовательности, по которому измеряется степень тождественности гомологичных последовательностей. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, содержащие одну или несколько модификаций последовательности по сравнению с полинуклеотидами, кодирующими фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, и кодирующие фитазы, свойства которых эквивалентны свойствам фитазы, представленной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3.

В соответствии с изобретением выражение эквивалентные фитазы или фитазы с эквивалентными свойствами, в сущности, означает белки, обладающие фитазной активностью, независимо от присущих им свойств, таких как К_т, оптимум рН или температурный оптимум для активности. Уровень фитазной активности может быть измерен любым методом определения фитазной активности. Термин фитаза служит для обозначения фермента, каталитическая активность которого заключается в гидролизе фитиновой кислоты с освобождением инозита и неорганического фосфата. Однако, поскольку большинство фитаз не осуществляют полный гидролиз фитиновой кислоты (содержащей 6 фосфатов), то каталитическая активность фитазы по настоящему изобретению может приводить к освобождению неорганического

- 2 007461 фосфата и фосфатных эфиров миоинозита, причем данные эфиры, в зависимости от гидролитической способности фитазы, могут представлять собой моно-, ди-, три-, тетра- или пентафосфатные эфиры миоинозита. К примеру, фитазную активность можно измерять по методу 81ιίιηίζι.ι (1992, Вюзск Вю1есй. Βίοсйет. 56(8), 1266-1269), в частности, как описано в примере 2. Однако для измерения фитазной активности можно использовать любой метод определения фитазной активности, измеряя либо уменьшение количества субстрата, либо накопление продуктов ферментативной реакции. В частности, аналогичные методы с применением, к примеру, другого субстрата или других реагентов также позволяют измерять фитазную активность.

Модификации последовательности в гомологичных полинуклеотидах могут представлять собой вставки, делеции или замены нуклеотидов, которые могут быть природными или могут осуществляться обычными методами мутагенеза. Известно, что такие гомологичные полинуклеотиды, кодирующие белки с эквивалентными функциями, в природе существуют в геномах различных видов организмов и даже в геномах различных рас, разновидностей или штаммов. Следовательно, специалисты в этой области, руководствуясь сведениями данного изобретения о полинуклеотидах, кодирующих пептидную последовательность, представленную последовательностью 8ЕО ΙΌ N0: 3, смогут легко выделить такие гомологичные полинуклеотиды при помощи хорошо известных методов молекулярной гибридизации (8ашЬгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб ебйюп, Νοίαη С. еб., №\ν Уогк: Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз).

Молекулярная гибридизация - это реакция спаривания, которая имеет место между комплементарными нитями полинуклеотидов, имеющих определенную степень тождественности нуклеотидных последовательностей. Таким образом, гибридизация дает возможность, используя полинуклеотиды, кодирующие фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, идентифицировать полинуклеотиды, гомологичные этим полинуклеотидам, в геноме других живых организмов, чем те организмы, из которых они происходят, например других грибов, в частности других штаммов Решсййит, к примеру Р. £ишси1о8ит ΙΜΙ 134756, и кодирующие фитазы, обладающие свойствами, эквивалентными свойствам фитазы, представленной последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3. Чем более тождественны последовательности полинуклеотидов, тем больше вероятность и легкость гибридизации между данными полинуклеотидами и тем больше вероятность того, что эти полинуклеотиды кодируют белки с эквивалентными свойствами. Методы гибридизации полинуклеотидов широко представлены в литературе (ЗатЬгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1оп1пд: А ЬаЬога1огу Маииа1, 2иб ебйюп, №1ап С. еб., №\ν Уогк: Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз) и хорошо известны специалистам в данной области. Так, они могут основываться на скринировании геномной библиотеки или библиотеки кДНК, полученной из живого организма или из ткани этого организма. Скринирование проводится с помощью зонда, состоящего из известного полинуклеотида или его фрагмента, с целью идентификации в этих библиотеках полинуклеотидов, гомологичных данному зонду, которые будут с ним гибридизироваться. В соответствии с изобретением зонд состоит из полинуклеотида, кодирующего фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, или его фрагмента. Для идентификации тех полинуклеотидов, с которыми гибридизируется зонд, на него сажают метку, к примеру, с помощью радиоактивных элементов типа ³²Р. Также можно использовать коммерчески доступные нерадиоактивные метки, хорошо известные специалистам в данной области.

Таким образом, настоящее изобретение также включает полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации с одним из полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, или его фрагментом. Предусматривается, что эти полинуклеотиды являются частью настоящего изобретения только в том случае, если они кодируют фитазу, эквивалентную той, что представлена последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3. Таким образом, в соответствии с изобретением выражение полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации означает полинуклеотиды, которые, одним из обычных методов молекулярной гибридизации (8ашЬгоок е1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1, 2пб ебйюп, №1ап С. еб., №\ν Уогк: Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргезз), гибридизируются с меченым зондом, состоящим из одного из полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью 8Е0 ΙΌ N0: 3, или его фрагмента, на уровне, превышающем неспецифическую гибридизацию данного зонда с другими, сравнительно негомологичными полинуклеотидами, в частности с другими кДНК, если такие полинуклеотиды происходят из библиотеки кДНК. Уровень гибридизации измеряют по сигналу, исходящему от метки зонда. Уровень сигнала, возникающего при взаимодействии между полинуклеотидами, способными к избирательной гибридизации, и зондом, обычно в 10 раз, предпочтительно в 100 раз превышает интенсивность сигнала, возникающего при взаимодействии зонда с другими полинуклеотидами, создающими уровень шума. Избирательную гибридизацию обычно проводят при нормальных, предпочтительно строгих или очень строгих условиях гибридизации и отмывки (например, гибридизация в буфере, содержащем как минимум 5х88С и 1% 8Ό8 примерно при 50-60°С, и ряд промывок в 0,1% 8Ό8 с постепенным снижением концентрации 88С от 2х88С до 0,4х88С и повышением температуры от 20 до 50°С). Специалисты в данной области могут модифицировать условия гибридизации, в основном, температуру и концентрацию солей в буферах, используемых на стадии гибридизации и на стадии отмывки. В частности, эти условия следует модифицировать в зависимости от длины зонда и от степени тождественности полинуклеотидов в библиотеке, скринируемой этим зондом.

- 3 007461

Условия гибридизации необходимо модифицировать таким образом, чтобы оптимизировать сигнал, возникающий при гибридизации гомологичных последовательностей, и в то же время свести к минимуму уровень шума.

Полинуклеотиды, способные к избирательной гибридизации с полинуклеотидами по изобретению, могут быть выделены из геномных библиотек или библиотек кДНК, полученных, к примеру, из штаммов грибов, в частности штаммов рода РешсШшт, например штамма Р. ГишсШозит ΙΜΙ 134756. Выделение таких полинуклеотидов может осуществляться стандартными методами гибридизации (8ашЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, 2пй ейШоп, Νοίαη С. ей., №\ν Уогк: Со1й 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу Ргезз), с использованием в качестве зонда полинуклеотида, кодирующего фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, или фрагмента такого полинуклеотида, либо комплементарного к нему полинуклеотида. После выделения полинуклеотида этими методами необходимо определить его последовательность и установить свойства белка, кодируемого этим полинуклеотидом, в частности проверить, что этот белок представляет собой фитазу, эквивалентную фитазе, представленной последовательностью 8ЕЦ ΙΌ N0: 3.

Вышеуказанные методы гибридизации, таким образом, дают возможность выделить полинуклеотиды, гомологичные полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3. Такие полинуклеотиды и кодируемые ими фитазы могут быть легко идентифицированы специалистами в области биотехнологии, владеющими стандартными методами молекулярной биологии. Таким образом, изобретение охватывает полинуклеотиды, гомологичные полинуклеотидам, кодирующим фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3. Предпочтительно степень тождественности гомологичных полинуклеотидов должна составлять не менее 45% относительно полинуклеотидов, кодирующих фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, предпочтительно не менее 50%, не менее 70%, не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и предпочтительно не менее 95%. Методы измерения и установления степени тождественности последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. К примеру, можно воспользоваться программами РГОЕиР, ВЬА8Т (в частности, А1!зсйи1 е! а1., 1993, 1. Мо1. Еуо1. 36: 290-300; А1!зсйи1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Вю1. 215: 403-10) или Вез1Рй (\У15соп5ш 8ес.|иепсе Апа1уз1з Раскаде, Уегзюп 8 Гог υηίχ, Сепейсз Сотри!ег Сгоир. итуегзйу Кезеагсй Рагк, 575 8с1епсе Опте, Майкоп, νΙ 53711, используя алгоритм, описанный 8тйй апй ^а!егтап, Аррйей МаШетайсз, 1981, №. 2, 482-489).

Такие гомологичные полинуклеотиды можно также получить искусственно при помощи стандартных методов мутагенеза.

Предпочтительно полинуклеотид, кодирующий фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, выбирают из последовательностей, представленных 8ЕЦ ГО N0: 1 и 8ЕЦ ГО N0: 2.

В качестве примера гомологичного полинуклеотида можно отметить полинуклеотид, представленный последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 4.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения полинуклеотиды, кодирующие вышеописанную фитазу, происходят из гриба рода РешсШшт. В предпочтительном воплощении они происходят из штамма РешсШшт зр. СВ8 109899 или из штамма РешсШшт ЕишсШозит ГМ! 134756.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения полинуклеотиды по изобретению кодируют фитазу, обладающую следующими свойствами:

(a) оптимальная температура = 50°С (b) оптимум рН = 4-5 (c) К_т = 550 мкМ

Настоящее изобретение также касается фрагментов вышеописанных полинуклеотидов. Термин фрагмент, в частности, означает фрагмент, состоящий, по меньшей мере, из 20 нуклеотидов, в особенности, по меньшей мере, из 50 нуклеотидов и предпочтительно, по меньшей мере, из 100 нуклеотидов. Такие фрагменты обычно называют олигонуклеотидами. Они могут использоваться как гибридизационные зонды для идентификации гомологичных полинуклеотидов или как праймеры для идентификации и амплификации таких гомологичных полинуклеотидов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), как описано в АизиЬе1 е! а1. (1987) Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, ей!. 1о11п νίΚ}' & 8опз, 8ес1юп 6.3-6.4.

Термин фрагмент также означает фрагменты полинуклеотидов по изобретению, кодирующих фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, или фрагмент фитазы, гомологичный или эквивалентный фитазе, представленной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3.

Настоящее изобретение также касается полинуклеотидов, включающих, по меньшей мере, один из вышеописанных полинуклеотидов.

Все полинуклеотиды, описанные выше, кодируют либо фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, либо гомологичную фитазу, либо активный фрагмент этих фитаз. Следовательно, изобретение распространяется на все фитазы, кодируемые всеми этими полинуклеотидами. Данное определение, таким образом, включает фитазу, представленную последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 3, фитазы, гомологичные этой фитазе, и активные фрагменты этих фитаз.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза представляет собой белок, включающий, по меньшей мере, пептидную последовательность, представленную 8ЕЦ ГО N0: 3.

- 4 007461

Таким образом, изобретение также охватывает фитазы, гомологичные фитазе, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3. В соответствии с изобретением термин гомологичные фитазы означает фитазы, последовательности которых содержат модификации по сравнению с фитазой, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3. Подобно гомологичным полинуклеотидам, гомологичные фитазы - это фитазы, пептидные последовательности которых проявляют определенную степень тождественности, при этом степень тождественности обычно выражается процентным содержанием идентичных аминокислот. Таким образом, изобретение охватывает фитазы, содержащие одну или несколько модификаций последовательности по сравнению с фитазой, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3, и свойства которых эквивалентны свойствам фитазы, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3. Эти модификации могут представлять собой вставки, делеции или замены аминокислот, как природные, так и полученные обычными методами мутагенеза. Предпочтительно степень тождественности гомологичных фитаз должна составлять не менее 35% относительно фитазы, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3, предпочтительно не менее 50%, не менее 70%, не менее 80%, более предпочтительно не менее 90% и предпочтительно не менее 95%. Методы измерения и установления степени тождественности последовательностей хорошо известны специалистам в данной области. К примеру, можно воспользоваться программами РШЕИР, ВБА8Т (в частности, А1!ксйи1 е! а1., 1993, 1. Мо1. Еуо1. 36: 290-300; А1!ксйи1 е! а1., 1990, 1. Мо1. Вю1. 215: 403-10) или Век!Е1! (ЭДщсоикш 8едиеисе Аиа1ук1к Раскаде, Уегкюи 8 £ог Ишх, Сеиейск Сошри1ег Сгоир. Ишуегайу Векеагсй Рагк, 575 8с1еисе Опте. МаФкои, νΙ 53711, используя алгоритм, описанный 8тйй аий ЭДа!егтаи, Аррйей Ма!йетайск, 1981, №. 2, 482-489).

В качестве примера фитазы, гомологичной фитазе, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3, можно привести фитазу, кодируемую полинуклеотидом, представленным последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 4.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза по изобретению происходит из гриба рода РешсШшт.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения фитаза обладает следующими свойствами:

(a) оптимальная температура = 50°С (b) оптимум рН = 4-5 (c) К_т = 550 мкМ

Изобретение также распространяется на фрагменты фитазы, представленной последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3, и на фрагменты гомологичных фитаз. Термин фрагмент, в основном, означает биологически активный фрагмент, то есть фрагмент, обладающий фитазной активностью, эквивалентной активности целой фитазы, при измерении методом, описанным в примере 2, или сходным методом.

Настоящее изобретение также касается химерного гена, включающего функционально связанные друг с другом, по меньшей мере, один промотор, функционирующий в организме хозяина, полинуклеотид, кодирующий фитазу по изобретению, и элемент-терминатор, функционирующий в том же организме хозяина. Разнообразные элементы, которые могут содержаться в обычном гене, - это, во-первых, элементы, регулирующие транскрипцию, трансляцию и созревание белков, такие как промоторы, последовательности, кодирующие сигнальный пептид или транзитный пептид, или элементы-терминаторы, составляющие сигнал полиаденилирования, а, во-вторых, - полинуклеотид, кодирующий пептид. Выражение функционально связанные друг с другом означает, что данные элементы химерного гена связаны друг с другом таким образом, что на функционирование одного из этих элементов влияет функционирование другого. К примеру, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если он способен оказывать влияние на экспрессию данной кодирующей последовательности. Конструирование химерного гена по изобретению и сборка его различных элементов могут осуществляться методами, хорошо известными в данной области, в частности методами, описанными в 8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога!огу Маииа1, 2ий еййюи, №1аи С. ей., №\ν Уогк: Со1й 8рпид НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк. Выбор регуляторных элементов, входящих в состав химерного гена, в основном, зависит от организма хозяина, в котором они должны функционировать, и специалисты в этой области способны выбрать регуляторные элементы, функционирующие в данном организме хозяина. Термин функционирующий означает способный к функционированию в данном организме хозяина.

Промоторы, содержащиеся в химерном гене по изобретению, могут быть конститутивными либо индуцибельными. Например, промоторы для экспрессии в бактериях могут быть выбраны из промоторов, указанных ниже. Для экспрессии в ЕксйейсЫа сой можно указать промоторы 1ас, 1гр, 1рр, рйоА, гесА, агаВАЭ, ргоИ, ск!-1, !е!А, сайА, иаг, !ас, 1гс, 1рр-1ас, Ркуи, скрА, РЬ, РБ-9С-50, РВ-РЬ, Т7, ХРЬ-РТ7, Т3-1ас, Т5-1ас, Т4 гена 32, иргМ-1ас, УНЬ и промотор белка А (Макпйек, 1996, МюгоЬю1. Реу. 60: 512-538; Сштеи! 0ршюик ш ВюйсйиоЦду, 1996, 7; ЭДеюкег! е! а1., 1996, Сиггеи! 0ршюг1к шВюйскиоЦду, 7: 494-499) либо же промотор Р_!гр (ЭД0 99/64607). Для экспрессии в таких грам-положительных бактериях, как СогуиеЬас!ег1а или 81гер!отусек, можно указать промоторы Р_!1рА (Но1тек е! а1., 1993, ЕМВ0 1. 12: 3183-3191), или Р81 и Р82 (ЕВ 91/09870), либо промоторы, описанные в заявке ЕР 0629699А2. Для экспрессии в дрожжах и грибах можно указать промотор Р_ьас4 К. 1асйк (Уаи йеи Вегд е! а1., 1990, Вю/Тес1то1оду 8: 135-139), или промотор Р_рдк К. 1ас!1к (патентная заявка ЕВ 91/05294), либо промотор !е£1 или сЬ11 у Тйсйойегта (ЭД0

- 5 007461

94/04673), промотор Ык, ск1 или арГ у РешсШшт (\УО 00/68401) и промотор д1а у АкрегдШик (С\\уппе е! а1., 1987, Вю/Тесйпо1оду 5: 713-719).

Химерный ген также может содержать последовательность субклеточной адресации, кодирующую сигнальный пептид или транзитный пептид. Такая последовательность, находящаяся впереди или позади от полинуклеотида, кодирующего фитазу, позволяет направить данную фитазу в клеточный компартмент организма хозяина или направить ее на секрецию во внеклеточное пространство. Например, химерный ген может содержать последовательность, кодирующую сигнальный пептид или транзитный пептид, для направления фитазы в определенный компартмент цитоплазмы, такой как митохондрии, пластиды, эндоплазматический ретикулум или вакуоли. Предпочтительно последовательность адресации кодирует сигнальный пептид, направляющий фитазу в апопласт или внеклеточный матрикс.

В соответствии с одним из воплощений транзитный пептид может представлять собой сигнал хлоропластной, вакуольной или митохондриальной адресации, который впоследствии отщепляется в хлоропластах, вакуолях или митохондриях. Такие пептиды широко представлены в литературе: №ийаик апй Войдег^ 1998, Р1ап1 Мо1еси1аг Вю1оду 38: 127-144; транзитный пептид ЕРЗРЗ, описанный в патенте ИЗР 5188642; транзитный пептид малой субъединицы рибулозобискарбоксилазы/оксигеназы (ЕР 189707).

В соответствии с другим воплощением транзитный пептид может состоять из сигнального пептида для адресации в периплазму бактерий типа пептидов генов рас (Зсйцтасйег е! а1., 1986, Ыис1. АсИк Рек. 14: 5713-5727), отрА (Во\\'йеп апй Сеогдюи, 1990, 1. Вю1. Сйет. 265: 16761-16766) и рйоЛ (Сйапд е! а1., 1986, Сепе 44: 121-124) или из якорного пептида для поверхности бактерий типа пептидов генов РЗ1 и РЗ2 (ЕК91/09870).

Транзитные пептиды могут быть одинарными или сдвоенными. Сдвоенные транзитные пептиды необязательно разделены промежуточной последовательностью. В качестве примера хлоропластного транзитного пептида можно отметить сдвоенный транзитный пептид, включающий, в направлении транскрипции, последовательность, кодирующую транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах, часть последовательности зрелого Ν-концевого участка растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах, а затем последовательность, кодирующую второй транзитный пептид растительного гена, кодирующего фермент, находящийся в пластидах. Такие двойные хлоропластные транзитные пептиды описаны, к примеру, в патентной заявке ЕР 0508909.

В соответствии с одним из воплощений транзитный пептид может состоять из разных элементов для увеличения количества определенного белка, секретируемого в среду. При этом можно отметить комбинацию из белка-переносчика и сайта протеолитического расщепления, слитую с данным белком (иЗР 6130063).

Согласно изобретению химерный ген также может включать другие регуляторные последовательности, расположенные между промотором и кодирующей последовательностью, такие как активаторы транскрипции (энхансеры).

Настоящее изобретение также касается векторов для клонирования, экспрессии и/или трансформации, включающих химерный ген по изобретению. Вектор по изобретению пригоден для трансформации организма хозяина и экспрессии фитазы в этом организме. Вектор может представлять собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус. Предпочтительно вектор для трансформации по изобретению представляет собой плазмиду. В общем, главным качеством такого вектора должна быть способность к сохранению и саморепликации в клетках организма хозяина, в частности, благодаря наличию начала репликации и к экспрессии в них фитазы. В целях стабильной трансформации организма хозяина вектор также может встраиваться в геном. При этом состав вектора может ограничиваться элементами, необходимыми для синтеза фитазы в организме хозяина. Выбор такого вектора, а также методы включения в него химерного гена по изобретению подробно описаны в ЗатЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 2пй еййюп, №1ап С. ей., №\ν Уогк: Со1й Зрппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргекк, и входят в общие познания специалистов в данной области. Предпочтительно вектор, используемый в настоящем изобретении, наряду с химерным геном по изобретению, также содержит химерный ген, кодирующий селекционный маркер. Такой селекционный маркер дает возможность проводить отбор эффективно трансформированных организмов хозяина, то есть тех, что содержат вектор. Из числа селекционных маркеров, которые могут быть использованы, можно отметить маркеры, содержащие гены устойчивости к антибиотикам, например такие, как ген гигромицинфосфотрансферазы (Сгйх е! а1., 1983, Сепе 25: 179188; Рип! е! а1., 1987, Сепе 56: 117-24), ген стрептотрицинацетилтрансферазы, ген, кодирующий полипептид, придающий устойчивость к флеомицину, ген мутированного β-тубулина, придающего устойчивость к беномилу (Со1й е! а1., 1994, Сепе 142: 225-30), или ген биалафосацетилтрансферазы (Ауа1ок е! а1., 1989, Сигг. Сепе!. 16: 369-72). Другие маркеры могут быть генами, восполняющими ауксотрофию, такие как гены ругА, ругВ, ругС, руг4 (Вих!оп апй КайГогй, 1983, Мо1. Сеп. Сепе!. 190: 403-405), агд4, агдВ (Вегке е! а1., 1983, Сепе 25: 109-117) и 1грС (Соокеп е! а1., 1989, Мо1. Сеп. Сепе!. 219: 282-88), ген молибдоптеринсинтазы (Арр1еуагй е! а1., 1998, 1. Вю1. Сйет. 273: 14869-76; ипк1ек е! а1., 1999, 1. Вю1. Сйет. 274: 1928693) или ген ацетамидазы (Веп апй Тигпег, 1987, Сигг. Сепе!. 11: 639-41). Другая категория селекционных маркеров состоит из генов устойчивости к гербицидам, таких как ген Ьаг устойчивости к биалафосу (\У1Ше е! а1., NЛΚ 18: 1062, 1990), ген ЕРЗРЗ устойчивости к глифозату (ИЗ 5 188 642), ген НРРО устой

- 6 007461 чивости к изоксазолу (АО 96/38567) или ген глифозатоксидоредуктазы (И8 5463175). Также можно отметить гены, кодирующие легко определяемые ферменты типа фермента ОИ8, или гены, кодирующие пигменты или ферменты, регулирующие выработку пигментов в трансформированных клетках. Такие гены селекционных маркеров, в частности, описаны в патентных заявках АО 91/02071, АО 95/06128, АО 96/38567 и АО 97/04103.

Настоящее изобретение также касается трансформированных организмов хозяина, содержащих, по меньшей мере, один химерный ген по изобретению, встроенный в геном либо находящийся на внехромосомном генетическом элементе, к примеру плазмиде. Термин организм хозяина служит для обозначения любых низших или высших, одноклеточных или многоклеточных организмов, в которые может быть введен химерный ген по изобретению для продукции фитазы по изобретению. Предпочтительно организм хозяина представлен микроорганизмом, в частности грибом, например, из рода РешеШшш, АзрегдШиз, СЫузозрогшт или Тйсйобегта, либо бактерией, например, из рода ЕзсйейсЫа, в частности Е. сой, или из рода СогупеЬас!егшт, ВасШиз или 8!гер!отусез, либо дрожжевым организмом, в частности из рода 8ассйаготусез, КЫууеготусез или РюЫа, либо бакуловирусом или растительными клетками. Организм хозяина также может быть представлен растением или частью растения.

Выражение трансформированный организм хозяина служит для обозначения организма хозяина, в который был введен, в геном или во внехромосомный генетический элемент, например плазмиду, по меньшей мере, один химерный ген по изобретению, вследствие чего он продуцирует фитазу в тканях или в культуральной жидкости. Для получения организмов хозяина по изобретению специалисты в данной области могут воспользоваться одним из многих известных методов трансформации.

Один из этих методов заключается в обработке подлежащих трансформации клеток или тканей организма хозяина полиэтиленгликолем (ПЭГ) вместе с вектором по изобретению (Сйапд апб Сойеп, 1979, Мо1. Оеп. Оепе!. 168(1), 111-115; Мегсешег апб Сйаззу, 1988, ВюсЫш1е 70(4), 503-517). Другой метод это электропорация, которая заключается в воздействии на подлежащие трансформации клетки или ткани вместе с вектором по изобретению электрического поля (Апбгеазоп апб Еуапз, 1988, Вю1ес1шк|иез 6(7), 650-660; 81идекаиа апб Эоиег, 1989, Айз!. 1. Вю1ес1шо1. 3(1), 56-62). Следующий метод заключается в непосредственном введении векторов в клетки или ткани при помощи микроинъекции (Оогбоп апб Кибб1е, 1985, Оепе 33(2), 121-136). Можно с выгодой использовать биолистический метод. Он заключается в бомбардировке клеток или тканей частицами, на которых адсорбированы векторы изобретения (Вгисе е! а1., 1989, Ргос. Ыа!1. Асаб. 8ск И8А 86(24), 9692-9696; К1еш е! а1., 1992, Вю1ес1шо1оду 10(3), 286291; И8 Ра!еп! Ыо. 4 945 050).

В литературе описано несколько методов трансформации бактерий - ЕзсйепсЫа сой и других грамотрицательных бактерий (АизиЬе1 е! а1., 1995, Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг Вю1оду, 1о1ш АПеу апб 8опз, Хеи Уогк; 1поие е! а1., 1990, Оепе 96: 23-28; Сйипд е! а1., 1989, Ргос. Ыа11. Асаб. 8οΐ. И8А 86: 2172-2175). Также можно воспользоваться конъюгацией (Сатегоп е! а1., 1989, 1. Вас!епо1. 171: 547-557). Для грамположительных бактерий можно использовать электропорацию, а также трансформацию протопластов, в особенности для бактерий рода 81гер!отусез (Вопату е! а1., 1990, ЕЕМ8 М1сгоЬю1. Ье!!. 66: 263-270; Нориооб е! а1., 1985, Оепейс Машрц1а!юп ок 8!гер!отусез: А ЬаЬога!огу Мапиа1. 1о1ш 1ппез Еоипбайоп, Хогизск).

В литературе также описано несколько методов трансформации грибов (Та1Ьо!, 2001, Мо1еси1аг апб се11и1аг Ыо1оду ок Й1ашеп!оиз йтдг Охкогб Ишуегзйу Ргезз, Хеи Уогк). Трансформация протопластов с помощью ПЭГ описана для АзрегдШиз в ЕР 0260762, и адаптация этого метода для вида РешсШшт кишси1озит описана в АО 00/36120. Также известна трансформация методом встраивания с помощью рестрикционных ферментов (ВЕМ1) (8апс11ех е! а1., 1998, Мо1. Оеп. Оепе!. 258, 89-94), а также трансформация протопластов с помощью бактерий рода АдгоЬас!епит (бе Огоо! е! а1., 1998, ХаШге Вю1ес1шо1оду 16: 839-842). Методы трансформации дрожжей также описаны в литературе, в частности АизиЬе1 е! а1., 1995, Сиггеп! Рго!осо1з ш Мо1еси1аг В1о1оцу, 1о1ш Айеу апб 8опз, Хеи Уогк; и Уап беп Вегд е! а1., 1990, Вю/Тес1шо1оду 8: 135-139.

В особом случае, когда подлежащий трансформации организм хозяина имеет растительное происхождение, клетки или ткани растения лучше всего трансформировать с помощью бактерий рода АдгоЬас!епит, предпочтительно путем инфицирования клеток или тканей данных растений А. !итекас1епз (Кпорк, 1979, 8иЬсе11. Вюсйет. 6, 143-173; 8йаи е! а1., 1983, Оепе 23(3): 315-330) или А. гЫходепез (Веуап апб СЫ1!оп, 1982, Аппи. Веу. Оепе!. 16: 357-384; Теркег апб Саззе-Ое1Ьай, 1987, М1сгоЬю1. 8ск 4(1), 24-28). Предпочтительно трансформация растительных клеток или тканей с помощью АдгоЬас!егшт !итекас1епз проводится по методике, описанной 1зЫба е! а1. (1996, Ха!. Вю1ес11по1. 14(6), 745-750). Специалисты в данной области могут выбрать соответствующий метод в зависимости от природы подлежащего трансформации организма хозяина.

Настоящее изобретение также касается способа получения экстракта, обладающего фитазной активностью. В соответствии с одним из воплощений изобретения этот способ включает стадии:

(a) культивирования организма, обладающего от природы полинуклеотидом по изобретению в своем геноме, в условиях, позволяющих экспрессию данной фитазы, (b) концентрирования организма, выращенного на стадии (а),

- 7 007461 (с) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (к) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (к).

Стадия (с) может осуществляться методами, известными специалистам в данной области, такими как механическое измельчение (посредством давления, воздействия ультразвука, растирания), энзиматический лизис или осмотический шок, причем эти методы могут применяться поодиночке или в сочетании.

Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (ί). Стадия (ί) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е). Очистка фитазы может проводиться любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации, ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%.

В соответствии со следующим воплощением способа по изобретению, в частности, когда фитаза по изобретению секретируется в культуральную среду, данный способ включает стадии:

(a) культивирования организма, обладающего от природы полинуклеотидом по изобретению, в условиях, позволяющих экспрессию данной фитазы, (b) получения культуральной жидкости путем удаления данного организма.

Выражение организм, обладающий от природы полинуклеотидом по изобретению в своем геноме служит для обозначения любого организма, в природном состоянии обладающего полинуклеотидом, кодирующим фитазу, представленную последовательностью 8Еф ΙΌ N0: 3, или гомологичный полинуклеотид в своем геноме.

В соответствии с одним из воплощений способов, описанных выше, данный организм представлен микроорганизмом. В предпочтительном воплощении данный микроорганизм представляет собой гриб, в частности гриб из рода РешсШшш, в особенности штамм РешсШшш 5р. СВ8 109899.

В соответствии с этими способами организм культивируют в среде, пригодной для получения фитазы методами, известными в этой области. Данный организм, особенно когда он представлен микроорганизмом, в частности грибом, можно культивировать в конической колбе со встряхиванием, в лабораторном ферментере или промышленном ферментере (периодическое культивирование, подпитываемое культивирование или культивирование в твердой среде). Культуральная среда должна содержать источники углерода и азота и неорганические соли. В предпочтительном воплощении способа с использованием штамма РешсШшш 5р. СВ8 109899 в качестве организма экспрессия фитазы осуществляется в присутствии или в отсутствие солей фитиновой кислоты (например, эти соли могут представлять собой соли №Г. соли Са⁴⁴ или сочетание солей Са⁺ и Мд⁴⁴). Величину рН можно контролировать (рН 3 или 4 предпочтительно) либо оставить как есть.

В соответствии с этим способом стадия получения культуральной жидкости путем удаления организма может осуществляться любым способом разделения твердых фракций, заключенных в жидкой фракции. В частности, фильтрация и центрифугирование являются подходящими способами выполнения этой стадии.

Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (с). Стадия (с) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (Ь). Фитаза может быть очищена любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации, ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%.

В соответствии со следующим воплощением изобретения в способе получения экстракта, обладающего фитазной активностью, применяется трансформированный организм хозяина по изобретению, и он включает стадии:

(a) культивирования трансформированного организма хозяина по изобретению, (b) концентрирования трансформированного организма хозяина, выращенного на стадии (а), (c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (к) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (к).

Стадия (с) может осуществляться методами, известными специалистам в данной области, такими как механическое измельчение (посредством давления, воздействия ультразвука, растирания), энзиматический лизис или осмотический шок, причем эти методы могут применяться поодиночке или в сочетании.

Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении

- 8 007461 дополнительной стадии очистки (ί). Стадия (ί) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е). Очистка фитазы может проводиться любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации, ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%.

Предпочтительно трансформированный организм хозяина в этом способе представлен микроорганизмом. В частности, данный микроорганизм может быть представлен грибом, например, из рода РепюШшш, АкретдШик, Сйтукокрогшт или Тпсйобегта. либо бактериями, например, из рода ЕксйепсЫа, в частности Е. сой, или из рода СотупеЬас!егшт, ВасШик или 8!гер!отусек, либо дрожжевым организмом, в частности, из рода 8ассйатотусек, К1цууетотусек или РюЫа, либо бакуловирусом или растительными клетками.

В соответствии со следующим воплощением изобретения, в частности, когда фитаза по изобретению секретируется в культуральную среду, данный способ включает стадии:

(a) культивирования трансформированного организма хозяина по изобретению, (b) получения культуральной жидкости путем удаления трансформированного организма хозяина.

В соответствии с этими способами организм культивируют в среде, пригодной для получения фитазы методами, известными в этой области. Данный организм, особенно когда он представлен микроорганизмом, в частности грибом, можно культивировать в конической колбе со встряхиванием, в лабораторном ферментере или промышленном ферментере (периодическое культивирование, подпитываемое культивирование или культивирование в твердой среде). Культуральная среда должна содержать источники углерода и азота и неорганические соли.

В соответствии с этим способом стадия получения культуральной жидкости путем удаления трансформированного организма хозяина может осуществляться любым способом разделения твердых фракций, заключенных в жидкой фракции. В частности, фильтрация и центрифугирование являются подходящими способами выполнения этой стадии.

Данный способ также может стать способом получения фитазы по изобретению при добавлении дополнительной стадии очистки (с). Стадия (с) такого способа получения фитазы по изобретению заключается в очистке фитазы из супернатанта, полученного на стадии (Ь). Фитаза может быть очищена любым методом концентрирования или разделения белков, в частности методами микрофильтрации, ультрафильтрации, электрофореза или хроматографии, хорошо известными в этой области. Для получения очищенной фитазы специалисты в данной области могут воспользоваться вышеуказанным методом измерения фитазной активности для того, чтобы идентифицировать фракции, содержащие данную фитазу. В соответствии с этим способом полученная фитаза может иметь чистоту предпочтительно в 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или предпочтительно 100%.

Настоящее изобретение также касается энзиматических композиций, содержащих, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению.

Термин энзиматическая композиция служит для обозначения композиции, включающей, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению, причем фитаза может находиться в различных пропорциях, в зависимости от того, содержится она вместе с различными адъювантами, усиливающими ее стабильность и сохранность, или нет. В качестве примера адъювантов, которые могут применяться в энзиматической композиции по изобретению, можно отметить сорбит, маннит, бензоат, неорганические соли или растительные масла. Энзиматическая композиция может находиться в жидком виде, при этом композиция и содержащаяся в ней фитаза находится в водном растворе либо в твердом виде, при этом композиция и содержащаяся в ней фитаза лиофилизована в виде порошка.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения энзиматическая композиция включает, наряду с фитазой по изобретению, еще, по меньшей мере, один дополнительный фермент. Этот дополнительный фермент может обладать фитазной активностью либо обладать не фитазной, а другой активностью. Если такой дополнительный фермент обладает фитазной активностью, то эта фитазная активность предпочтительно отличается от фитазной активности фитазы по изобретению и дополняет ее. Если такой дополнительный фермент обладает не фитазной, а другой активностью, то это может быть, к примеру, ксиланазная, целлюлазная, β-глюканазная, ламинариназная, ферулатэстеразная, пуллуланазная, протеазная, амидазная, фосфатазная или манназная активность.

Предпочтительно данные энзиматические композиции предназначаются для введения в корма для домашних животных, в особенности животных с неразделенным желудком, предпочтительно свиней или птиц.

Настоящее изобретение также касается кормовой композиции, включающей, по меньшей мере, одну фитазу по изобретению.

Термин кормовая композиция, в основном, служит для обозначения корма, предназначенного для домашних животных, в особенности животных с неразделенным желудком, предпочтительно свиней или птиц. Кормовая композиция по изобретению теоретически представляет собой корм, предназначенный для домашних животных, с добавлением энзиматической композиции по изобретению. Следовательно,

- 9 007461 кормовая композиция по изобретению представляет собой корм для домашних животных, в который добавлена, по меньшей мере, одна энзиматическая композиция по изобретению, при этом данный корм и данную энзиматическую композицию смешивают таким образом, чтобы получить кормовую композицию.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения данные кормовые композиции включают, по меньшей мере, один трансформированный организм хозяина по изобретению. В следующем предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции включают, по меньшей мере, один организм, содержащий полинуклеотид по изобретению, в частности, по меньшей мере, один гриб из рода РешсШшт, в особенности гриб штамма РешсШшт кр. СВ8 109899.

Предпочтительно кормовые композиции по изобретению предназначаются для кормления животных с неразделенным желудком. В предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции предназначаются для кормления свиней. В другом предпочтительном воплощении изобретения данные кормовые композиции предназначаются для кормления домашних птиц.

Предметом настоящего изобретения также является способ получения кормовой композиции, описанной выше.

В соответствии с предпочтительным воплощением изобретения данный способ заключается в культивировании организма хозяина по изобретению или организма, содержащего полинуклеотид по изобретению, в частности гриб, точнее гриб из рода РешеШшш, в особенности гриб штамма РешеШшш кр. СВ8 109899, в концентрировании данного организма любым методом, известным в этой области, в частности фильтрации или центрифугирования, а затем во включении данных концентрированных организмов в кормовую композицию.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением изобретения данный способ заключается в получении экстракта, обладающего фитазной активностью, или фитазы по изобретению одним из способов получения экстракта или фитазы, описанных выше, а затем во включении данного экстракта или данной фитазы в кормовую композицию.

Настоящее изобретение также касается способа повышения усваивания неорганического фосфата, содержащегося в фитиновой кислоте растительных кормов, у животных с неразделенным желудком, в котором в рацион данных животных включается фитаза или энзиматическая композиция по изобретению. Предпочтительно в данном способе животным с неразделенным желудком скармливают кормовую композицию по изобретению.

Изобретение также касается способа уменьшения введения фосфора животным с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по изобретению.

Изобретение также касается способа уменьшения выброса фосфора, происходящего из рациона животных с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по изобретению.

Настоящее изобретение также касается нитчатого гриба из рода РешеШшш, имеющего депозитный номер СВ8 109899.

Нижеследующие примеры служат для иллюстрации осуществляемости настоящего изобретения, не ограничивая, однако, его сферу действия.

Пример 1. Характеристики и культивирование штамма РешеШшш кр. СВ8 109899.

1.1. Характеристики.

На агаризованной среде РИЛ (24 г/л картофельного бульона, 16 г/л агар-агара) мицелий штамма СВ8 109899 развивается при 30°С и после созревания имеет желтый цвет. Воздушный мицелий наблюдается по периферии колонки и не имеет характерных для РешеШшш структур. После культивирования гриба в жидкой среде ΜΝ-ϋτί (Р.1. Рип! апб С.А.М.И. уап беп Нопбе1 (1992) МеШобк ίη Епхушо1оду 216, 447-457) при 28°С в течение 2 дней со встряхиванием мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Экстракцию геномной ДНК проводили фенол-хлороформным методом, хорошо известным в этой области, используя 1 г измельченного материала в 5 мл буфера для лизиса (1% 8Ό8, 2% тритон Х-100, 100 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ трис, рН 8,0). После выделения геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола. Проводили ПЦР-амплификацию, используя высокоточную полимеразу и праймеры РШ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 5) и РШ (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 6) для получения фрагмента в 1175 п.о., который подвергали секвенированию (8Е0 ΙΌ ΝΟ: 7).

РШ3: 5'-СС6ТТ66ТААССА6С66А660АТС-3'

РШ4: 5'-ССТТО6ТСС6Т6ТТТСАА6АС66О-3'

Совмещение последовательности этого транскрибируемого изнутри спейсера с имеющимися в банках данных последовательностями 1Т8 показало тождественность на 96% с последовательностью ГГ8, идентифицированной как принадлежащей РешеШшш аси1еа!ит, и тождественность на 96% с последовательностью 1Т8 штамма ΙΜΙ 134756 Решс111шт ГишсШокит. Поэтому штамм СВ8 109899 поименован РешаШит кр.

1.2. Условия культивирования.

Была установлена синтетическая среда для культивирования штамма СВ8 109899. Она состоит из 10 г/л глюкозы, 0,1 М ΝΗ₄ΝΟ₃, 1,5 г/л КН₂РО₄, 0,5 г/л КС1, 0,5 г/л Мд8О₄, 10 мг/л МпС1₂, 10 мг/л 2п8О₄ и 10 мг/л Εе8Ο₄ в деминерализованной воде. Для экспрессии фитазы отбирали образец мицелия в 1 см² из колонии, выросшей на среде РИА, и инкубировали в 30 мл среды М8Р3 (10 г/л глюкозы, 20 г/л фитата кальция,

- 10 007461

0,5 г/л КС1, 0,5 г/л Мд8О₄, 2,2 мг/л Ζπ§0₄, 1,1 мг/л Н₃ВО₃, 0,5 мг/л МпС1₂, 0,5 мг/л Ре8О₄, 0,17 мг/л СаС1₂, 0,16 мг/л Си8О₄, 0,15 мг/л №₂МоО₄ и 5 мг/л №₂ЕОТЛ) в течение 7 дней при 30°С со встряхиванием. Культуру центрифугировали 10 мин при 5000 об./мин и супернатант анализировали, как описано в примере 2.

Пример 2. Измерение фитазной активности.

Измерение фитазной активности основывается на методе 8Ηίηιίζυ (1992, Βίοδοί. Вюкеей. Вюсйет. 56(8), 1266-1269). Принцип этого метода состоит в измерении количества неорганического фосфата, высвобожденного во время ферментативной реакции фитазы с ее субстратом (раствор фитата натрия в концентрации 10 г/л в 250 мМ ацетатном буфере, содержащем 1 мМ СаС1₂, рН 5,5). Количество неорганического фосфата измеряют по реакции этого фосфата с хромогенным реагентом (свежеприготовленная смесь из 1 объема 10,8% сульфата железа и 4 объемов молибдата аммония в 0,012 М Н₂8О₄). Эта реакция в сильнокислой среде ведет к образованию окрашенного фосфомолибдатного комплекса (в присутствии Ре²⁺), количество которого определяется по измерению поглощения окрашенного раствора при 700 нм на спектрофотометре.

Для получения энзиматической кинетики выполняются три параллельные реакции продолжительностью в 10, 20 и 30 мин при 37°С. Ферментативные реакции останавливают добавлением 2,5 мл 20% трихлоруксусной кислоты. Помехи от образца определяются добавлением сначала 20%-ной трихлоруксусной кислоты, а затем фитиновой кислоты в необработанный экстракт, который может быть разбавлен или нет. Холостую пробу для ферментативной реакции готовят на 250 мМ ацетатном буфере, содержащем 1 мМ СаС1₂, рН 5,5. После остановки реакций количество высвободившегося фосфата определяют добавлением такого же объема цветного реагента (1 объем Ре8О₄-7Н₂О + 4 объема раствора гептамолибдата аммония). Интенсивность синей окраски измеряют на спектрофотометре при 700 нм. Ее зависимость от концентрации фосфата устанавливают с помощью КН₂РО₄ в интервале от 0 до 1 мМ. Ферментативную активность определяют по скорости появления фосфата в ходе энзиматической кинетики.

Пример 3. Получение клеточного экстракта, содержащего фитазную активность.

Штамм СВ8 109899 культивировали в масштабе лабораторной конической колбы и в ферментерах объемом от 3 до 200 л при 30°С в течение 6-8 дней. Продукционная среда состояла из 10 г/л глюкозы, 40 г/л крахмала, 25 г/л рисовых отрубей, 20 г/л Са²⁺-фитата, 15 г/л хлорида аммония, 0,5 г/л сульфата аммония и 0,9 г/л пеногасителя. Значение рН доводили до 5,5, однако, его не контролировали во время культивирования. Для запуска ферментации использовали 4%-ный инокулят. Такой инокулят соответствует культуре, выращенной за 3-4 дня при 30°С в среде, состоящей из 10 г/л глюкозы, 10 г/л пептона, 5 г/л ΝαСМС, 0,5 г/л сульфата магния, 0,5 г/л хлорида кальция, 0,01 г/л Ре8О₄-7Н₂О и 0,01 г/л Мп8О₄-4Н₂О. Инокулят получают при непосредственном посеве спор или кусочка агара (среда РИЛ, 10 дней при 30°С), на котором культивировали гриб. Для посева также можно использовать и 3-4-дневную культуру, полученную в тех же условиях.

По окончании ферментации всю культуру фильтровали и фильтрат концентрировали путем ультрафильтрации через органическую или неорганическую мембрану с пределом исключения в 10 кД. Активность определяли в образце концентрированного ультрафильтрата и пересчитывали на исходный объем ферментации.

Таблица 1

Активности, полученные по окончании ферментации, и их зависимость от объема ферментации

Объем ферментера	Перемешивание, об/мин	Продувка воздухом, отн. объем	Активность, Ед/мл
Коническая колба	220	-	45-63
3 л	450	1	45
30 л	400	1	55-66

Пример 4. Характеристики выделенной фитазы по изобретению.

В полученном неочищенном клеточном экстракте определяли оптимум рН, температурный оптимум, стабильность в отношении рН и температуры, а также константы Михаэлиса, используя метод, описанный в примере 4.

4.1. Константы Михаэлиса.

Константу Михаэлиса-Ментен (Кт_каж) и максимальную скорость реакции (Ут_каж) определяли при варьировании концентрации субстрата и времени инкубации. Содержащаяся в клеточном экстракте фитаза характеризуется значением Кт_каж=550 мкМ и Ут_каж=1,425 мкмоль фосфата за 1 мин в 1 мг образца.

4.2. Фитазная активность в зависимости от рН.

Оптимум рН измеряли при варьировании значения рН и/или природы буфера для реакции (при рН 2: буфер КС1-НС1; при рН 3: буфер глицин-НС1; при рН 4, 5, 5,5 и 6: натрий-ацетатный буфер; при рН 7: буфер трис-НС1). Приведенные на фиг. 1 результаты представляют относительную активность в пересче

- 11 007461 те на максимальную ферментативную активность. Оптимум рН содержащейся в клеточном экстракте фитазы, измеренный при 37°С, находится между рН 4 и рН 5.

4.3. Фитазная активность в зависимости от температуры.

Температурный оптимум измеряли при варьировании температуры инкубации для ферментативных реакций. Полученные данные, приведенные на фиг. 1, представляют относительную активность в пересчете на максимальную ферментативную активность. Температурный оптимум содержащейся в клеточном экстракте фитазы, измеренный при рН 5,5, находится в районе 50°С.

4.4. Стабильность фитазы в зависимости от рН.

Определяли устойчивость фитазной активности к кислым значениям рН. После обработки экстракта при значениях рН от рН 2 до рН 6,5 при 41°С в течение от 0 до 180 мин значения рН растворов стабилизировали на уровне рН 5,5 путем разбавления. Затем определяли активность методом, описанным в примере 2. Результаты показывают, что фитазная активность экстракта относительно стабильна вплоть до рН 3,5. Однако она быстро денатурирует при более кислых значениях рН, в особенности при рН 2.

4.5. Стабильность фитазы в зависимости от температуры.

Определяли термостабильность фитазной активности при температурах, больших или равных 60°С. Разбавленный раствор экстракта (конечная концентрация 1 Ед/мл) выдерживали при требуемой температуре в течение определенного времени (не превышающего 30 мин). После возвращения к комнатной температуре в каждом из подвергнутых тепловой обработке растворов определяли активность в соответствии с методом, описанным в примере 2. Начиная с 5 мин при 60°С, когда фитазная активность снижалась примерно на 80%, она уменьшалась практически до нуля после 1 мин при 80°С, в условиях проведения экспериментов.

Пример 5. Очистка фитазы по изобретению.

Клеточный ферментный экстракт, полученный в примере 3, концентрировали при помощи ультрафильтрации, используя мембрану с пределом исключения в 10 кД. Ионную силу и рН экстракта доводили посредством нескольких промывок в 20 мМ глициновом буфере, рН 3.

Проводили катионообменную хроматографию, нанося полученный концентрат на колонку ЗР10 (Рег8ерЕуе Вю8у51ет5) при постоянном значении рН 3. Удерживаемые на колонке белки элюировали при помощи ступенчатого градиента №С1 от 0 до 1 М в глициновом буфере при скорости потока 3 мл/мин. Получали пик фитазной активности примерно при 30% 1 М №С1. Фитазу отделяли от других компонентов пика активности путем гель-фильтрации на колонке НВ2000 (Рйагташа) в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, при скорости потока 0,7 мл/мин. Чистоту собранных фракций оценивали методом электрофореза в неденатурирующем полиакриламидном геле с окрашиванием серебром. На геле была только одна полоса белка с расчетным молекулярным весом в 130 кД. Однако после электрофореза в 8Э8-РЛСЕ наблюдались 2 полипептидные полосы: одна основная полоса при относительном расстоянии миграции в 70 кД и другая второстепенная полоса при относительном расстоянии миграции в 90 кД.

Пример 6. Микросеквенирование очищенной фитазы.

6.1. Определение ^концевой последовательности.

Полипептиды, соответствующие полипептидным полосам в 70 и 90 кД, полученным при электрофорезе в 808-РЛСЕ, переносили на мембрану из РУИЕ (РгоВ1о11. Аррйей Вю5У51ет5) в течение 15 ч при 4°С. Полипептиды выявляли по окрашиванию амидочерным 10В (81§та) и подвергали секвенированию (Ιη5ΐί1υΐ Ра51еиг, Лаборатория микросеквенирования белков, Париж). ^концевые последовательности были одинаковы у двух полипептидных полос (8ЕЦ ΙΌ N0: 8).

Этот результат привел к заключению, что две полипептидные полосы, обнаруженные при 8Ό8РАСЕ, вероятно, соответствуют одному и тому же полипептиду, а различия в скорости миграции, возможно, происходят от частичной деградации части полипептида на стадии очистки.

6.2. Определение аминокислотной последовательности внутренних фрагментов фитазы.

Два полипептида в 70 и 90 кД разделяли методом электрофореза в 8Э8-РЛСЕ и выявляли по окрашиванию амидочерным. Полосу полипептида в 70 кД вырезали из геля и полипептид подвергали расщеплению ίη 511и с помощью фермента Епйо1у5ше-С в течение 18 ч при 37°С. Пептидные фрагменты разделяли методом НРЬС на колонке С18 ИЕЛЕ. При микросеквенировании были получены последовательности 4 внутренних фрагментов (8ЕЦ ΙΌ N0: 9, 8ЕЦ ΙΌ N0: 10, 8ЕЦ ΙΌ N0: 11 и 8ЕЦ ΙΌ N0: 12).

8ЕС) ΙΌ N0: 8: ШТОРЦУРЦ/УУР

8ЕС) ΙΌ N0: 9: Т8С1С11)Л\\Е\\'ТЛЕ¥Е('Ж

8ЕС) ΙΌ N0: 10: ЛббЛРЕЬАЦХдаГСХЦРХУУ

8ЕС) ΙΌ N0: 11: ЕУ1ЖЛ8К

8ЕО ΙΌ N0: 12: АРбЬУВ

Пример 7. Получение молекулярного зонда, относящегося к фитазе РешсШшт 5р. СВЗ 109899.

После микросеквенирования из пептидов были рассчитаны олигонуклеотиды для амплификации методом ПЦР фрагмента ДНК, относящегося к гену, кодирующему фитазу РешсШшт 5р. СВЗ 109899.

7.1. Разработка праймеров для ПЦР.

Праймеры были рассчитаны из ^концевой аминокислотной последовательности и внутренней последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 9. Из ^концевой последовательности были рассчитаны 4 набора смысловых вырожденных праймеров, а из внутренней последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 9 был расчитан 1 набор

- 12 007461 обратных вырожденных праймеров. Каждый из наборов смысловых праймеров использовали по отдельности с набором обратных праймеров.

7.2. Амплификация фрагмента геномной ДНК, относящегося к фитазе.

Сначала РешсШшш 5р. СВ8 109899 культивировали в жидкой среде МЫ-Ий (28°С, 180 об./мин, 2 дня). Мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Проводили экстракцию геномной ДНК в 5 мл буфера для лизиса (1% 8Ό8, 2% тритон Х-100, 100 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ трис, рН 8,0) и 5 мл фенола на 1 г измельченного материала. После очистки водной фазы путем экстракции фенол/хлороформом и хлороформом геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола.

Реакции ПЦР проводили с использованием 100 нг геномной ДНК на 1 единицу полимеразы Тад (фВЮдеие) на термоциклизаторе М1 Ве5еагс11 модель РТС-200. Продукты каждой реакции ПЦР анализировали на 0,8% агарозном геле. Получили нуклеотидный фрагмент в районе 850 п.о., соответствующий паре праймеров ОТ АС8 17 Р4.4 (8Еф ΙΌ N0: 13) и ОТ АС8 25 Р6.1 (8Еф ΙΌ N0: 14), который субклонировали прямо в вектор рСВ4-Т0Р0 (Шуйгодеи) и просеквенировали (8Еф ΙΌ N0: 15).

Анализ последовательности показал, что два праймера, использовавшиеся для амплификации, находятся по обе стороны от амплифицированного фрагмента и что выведенные аминокислотные последовательности, следующие за ними, соответствуют тем, что получены при микросеквенировании фитазы. Кроме того, аминокислотные последовательности внутренних пептидных фрагментов 8Еф ΙΌ N0: 10 и 8Е0 ΙΌ N0: 11 входят в аминокислотную последовательность, выведенную из фрагмента ДНК. Эти наблюдения привели к заключению, что амплифицированный фрагмент ДНК соответствует микросеквенированной фитазе, и его назвали ОТ АС8 29.1. Затем этот фрагмент ДНК использовали в качестве гомологичного молекулярного зонда для клонирования гена, кодирующего очищенную фитазу.

ОТ АС8 17 Р4.4 (8ЕО ΙΌ N0: 13): 5'-АС\6А¥СС\САВСТССС

ОТ АС8 25 Р6.1 (8ЕО ΙΌ N0: 14): 5'-С,С\С1ТССА¥ТСВТТ\АС

Пример 8. Клонирование и характеристика гена, кодирующего фитазу РешсШшш 5р. СВ8 109899.

8.1. Определение последовательности кДНК, относящейся к фитазе.

Полную последовательность кДНК получали путем амплификации, субклонирования и секвенирования ее 5'- и 3'-концов в соответствии с методом 5'- и 3'-ВАСЕ-РСВ.

Сначала РешсШшш 5р. СВ8 109899 культивировали в условиях индукции фитазы в среде, состоящей из 40 г/л крахмальной муки, 25 г/л рисовых отрубей, 20 г/л фитата кальция, 10 г/л глюкозы, 15 г/л N4^1 и 0,5 г/л Мд80₄-7Н₂0, рН 5,5, с добавлением 0,06 г/л глюкоамилазы АМС 300 Ь (№уохуте5) и 0,18 г/л α-амилазы Тегтату1 120 Ь (Хоуохуте5). Культивирование продолжали до достижения фитазной активности в 10 единиц на 1 мл культуральной среды. Мицелий собирали фильтрованием культуры через фильтровальную бумагу (^йа1таи), а затем измельчали в жидком азоте. Экстрагировали тотальную РНК из измельченного материала путем экстракции фенолом в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,3, содержащем 10 мМ ЭДТА. Затем мРНК подвергали обратной транскрипции с помощью набора СепеВасег (Шуйгодеи). Синтезированная кДНК имела заданную последовательность на 5'- и 3'-концах для последующей ПЦР-амплификации. Чтобы специфически амплифицировать концы требуемой кДНК, были составлены 2 праймера: один, направленный на 5'-конец и названный ОТ АС8 37 Р1 (8Еф ΙΌ N0: 20), а другой на 3'-конец и названный ОТ АС8 37 Р3 (8Еф ΙΌ N0: 21), исходя из молекулярного зонда в участке, относящемся к пептидной последовательности 8Еф ΙΌ N0: 10.

Реакции ПЦР проводили с использованием 1 мкл продукта синтеза кДНК на 1 единицу полимеразы Тад (ф-ВЮдепе) на термоциклизаторе М1 Ве5еагс11 модель РТС-200. Продукты амплификации анализировали на 0,8% агарозном геле. Фрагмент в районе 0,3 т.п.о., относящийся к 5'-концу, и другой в районе 1,7 т.п.о., относящийся к 3'-концу, клонировали непосредственно в вектор рСВ4-Т0Р0 (Шуйгодеи), а затем секвенировали. Затем была воспроизведена последовательность всей кДНК (8Еф ΙΌ N0: 2).

ОТ АС8 37 Р1 (8ЕО ΙΌ N0: 20): 5'-СССССТСССТТССТТССССАААС-3'

ОТ АС8 37 Р3 (8ЕО ΙΌ N0: 21): 5'-СТАССТССССТСССААТАСАТСС-3'

8.2. Сублонирование содержащего ген ЕсоВУ-фрагмента геномной ДНК.

Фрагмент геномной ДНК клонировали методом продвижения по геному. Сначала лигировали адаптер по концам рестрикционного фрагмента от ЕсоКУ. Для этого продукт расщепления геномной ДНК РешсШшт 5р. СВ8 109899 ферментом ЕсоВУ лигировали с адаптером Сепоте \¥а1кег АкарЮг (С1оп1ес11 ЬаЬогаШгу, Шс.) с помощью ДНК-лигазы Т4 в 50 мМ трис-НС1 буфере, рН 7,5, содержащем 10 мМ МдС1₂, 10 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 0,25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, в течение 15 ч при 16°С. Реакцию останавливали тепловой обработкой при 70°С и реакционную смесь разбавляли в 200 мкл ультрачистой воды.

Для амплификации методом ПЦР 5'- и 3'-участков рестрикционного фрагмента от ЕсоВУ были составлены 2 смысловых праймера, исходя из молекулярного зонда: один, направленный на 5'-конец и названный ОТ АС8 32 Р5 (8Еф ΙΌ N0: 16), а другой на 3'-конец и названный ОТ АС8 32 Р3 (8Еф ΙΌ N0: 17). Обратный праймер под названием Акар1ог Рйтег (СЧоп1ес11 ЬаЬога1огу, Шс.), использовавшийся для реакций ПЦР, соответствовал последовательности 5'-конца адаптера.

Реакции ПЦР проводили с использованием 1 мкл продукта лигирования на 1 единицу смеси поли

- 13 007461 мераз АбуаШаде Оепотк Ро1утега5е Μίχ (С1оп1есй ЬаЬогаФгу, 1пс.), на термоциклизаторе М1 Кекеагсй модель РТС-200. Продукты каждой реакции ПЦР анализировали на 0,8% агарозном геле.

Два фрагмента, один в районе 1,8 т.п.о., относящийся к 5'-концу, и другой в районе 1,3 т.п.о., относящийся к 3'-концу, субклонировали и анализировали путем секвенирования. После получения 5'- и 3'нуклеотидных последовательностей ЕсоКУ-фрагмента были составлены праймеры, специфичные к концам, названные ОТ АС8 38 Р1 (8Еф ГО N0: 18) и ОТ АС8 38 Р2 (8Еф ГО N0: 19). Фрагмент амплифицировали во всей полноте с помощью высокоточной полимеразы. Реакцию ПЦР проводили с использованием 100 нг геномной ДНК РешсШшт 5р. СВ8 109899 на 1 единицу ДНК-полимеразы Р1айпцт Ρίχ (ЫГе Тес11по1од1е5. 1пс.) на термоциклизаторе М1 Кекеагсй модель РТС-200. Продукт амплификации анализировали на 0,8% агарозном геле. Фрагмент в 3,8 т.п.о. субклонировали непосредственно в вектор рСК4Т0Р0 Цпуйгодеп), секвенировали (8Еф ГО N0: 1) и назвали ОТ АС8 38.1.

8.3. Анализ последовательности кДНК и гена.

Исходя из кДНК, выводили аминокислотную последовательность и анализировали (8Еф ГО N0: 3). Все последовательности внутренних пептидов фитазы, полученные при микросеквенировании, обнаруживались в этой аминокислотной последовательности, подтверждая, что просеквенированная кДНК соответствует требуемой фитазе. Кроме того, выведенная аминокислотная последовательность содержит специфические сайты для связывания (КНСХКХР, где X - любая аминокислота; 8Еф ГО N0: 24) и нуклеофильной атаки (НО) фосфатов, которые характеризуют фитазу как принадлежащую к группе гистидиновых кислых фосфатаз. Совмещение последовательности кДНК с последовательностью фрагмента геномной ДНК ОТ АС8 38.1 дает возможность определить точные границы данного гена и локализовать содержащиеся в нем интроны.

Пример 9. Поиск гомологичных последовательностей.

9.1. Получение космидной библиотеки из штамма ΙΜΙ 134756 РешсШшт ГишсШокит.

Р. ГишсШокит ΙΜΙ 134756 культивировали в жидкой среде МН-ип (28°С, 180 об./мин, 2 дня). Мицелий собирали фильтрованием и измельчали в жидком азоте. Проводили экстракцию геномной ДНК в 5 мл буфера для лизиса (1% 808, 2% тритон Х-100, 100 мМ №С1, 1 мМ ЭДТА и 10 мМ трис, рН 8,0) и 5 мл фенола на 1 г измельченного материала. После очистки водной фазы фенол/хлороформом и хлороформом геномную ДНК осаждали добавлением 2 объемов этанола.

Продукт частичного расщепления 20 мкг геномной ДНК рестрикционным ферментом 8а11 наносили на агарозный (с низкой температурой плавления) гель, чтобы подвергнуть его импульсному электрофорезу (18 ч, 5 В/см) в буфере 0,5хТВЕ. После окрашивания бромистым этидием фрагменты ДНК длиной от 30 до 40 т.п.о. извлекали из геля путем расщепления β-агаразой (01Ьсо-ВКЕ) и осаждали этанолом. Порцию этой геномной ДНК лигировали в вектор рМ0Со5Х [0гЬасй (1994), Оепе 150, рр. 159-162], предварительно обработанный ХМ и дефосфорилированный фосфатазой из кишечника теленка. Продукт лигирования, после реакции с элементами фага λ (Раскадтд Рго1осо1 - 81га1адепе; Офараск Со1б-11), можно трансфецировать в штамм 0358 Е. сой (МашаШ е1 а1., 1982). После посева на агаризованную среду Луриа и Бертани (ЬВ) с добавлением 50 мкг/мл ампициллина выросшие колонии пересевали в 50 микропланшетов на 96 лунок и культивировали в течение ночи в 150 мкл ЬВ с добавлением 50 мкг/мл ампициллина. Культуры реплицировали на мембраны N+ (Атегайат), а затем добавляли глицерин до конечной концентрации 50% и хранили при -80°С.

9.2. Скринирование космидной библиотеки зондом ОТ АС8 29.1.

Анализ геномной ДНК штамма 1М1 134756 Р. ГишсШокит методом Саузерн-гибридизации проводили с помощью зонда ОТ АС8 29.1. Мембрану, на которую переносили геномную ДНК, предварительно расщепленную несколькими рестрикционными эндонуклеазами и разделенную методом электрофореза, преинкубировали в буфере для гибридизации (7% 808, 0,5 М фосфат натрия, рН 7,0) в течение 10 мин при 65°С. Зонд метили [а-³²Р]-бСТР с помощью набора для мечения ДНК (Атег5йат). Меченый зонд вносили в буфер для гибридизации и эту смесь нагревали 5 мин при 100°С перед употреблением. Гибридизацию проводили в течение 6 ч при 65°С. После гибридизации мембрану промывали 3 раза по 15 мин при 65°С в промывочном буфере (1% 808, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,0), а затем подвергали экспозиции. Этот анализ выявил только один сигнал. Следовательно, в геноме Р. ГишсШокит 1М1 134756 содержится только одна копия данного гена. После этого космидную библиотеку скринировали в таких же строгих условиях с помощью зонда ОТ АС8 29.1, который выявил несколько сигналов на мембранах № 15, 19 и 48. При этом космида 15Б10, относящаяся к мембране № 15, была идентифицирована как содержащая последовательность ДНК, гибридизирующейся с зондом ОТ АС8 29.1. Проводили рестрикционный анализ ДНК из этой космиды для того, чтобы определить положение соответствующего гена. Этот ген назвали рйуБ. Клонирование и секвенирование NсоI-фрагмента в 1,3 т.п.о. из космиды 15Б10 показало сильную гомологию с последовательностью ОТ АС8 29.1. Полный ген рйуБ был локализован на фрагменте ЕсоКУ-ЕсоК! в 2,7 т.п.о., который клонировали и секвенировали (8Еф ГО N0: 4).

При анализе последовательности выявлен промоторный участок в 790 п.о. и начало кодирующей рйуБ последовательности на АТС 791. Ген рйуБ имеет размер 1737 п.о. (положения 791-2527).

- 14 007461

Пример 10.

Рекомбинантная экспрессия гена, содержащегося в ОТ АС8 38.1 (8ЕЦ ΙΩ N0: 1).

10.1. Введение множественных копий гена в Р. Гишси1озит IΜI 134756.

Для проверки клонированного гена (ОТ АС8 38.1) было решено ввести множественные копии в геном штамма ^Ι 134756 Р. Гишси1озит, вырабатывающего мало фитазы, и посмотреть, будут ли трансформированные клоны проявлять увеличение продуктивности.

Для этого Р. Гишси1озит ^Ι 134756 котрансформировали в соответствии с методом, описанным в патенте \0 00/68401, плазмидой, содержащей фрагмент ОТ АС8 38.1, и плазмидой рА\7-1 (Рип! е! а1., 1987, Оепе, 56: 117-24), позволяющей селекцию на гигромицине. После трансформации проверяли встраивание множественных копий данного гена методом 8ои1Ьет-гибридизации с помощью молекулярного зонда ОТ АС8 29.1. 8оиГЬегп-гибридизацию проводили в соответствии с условиями, описанными в примере 9, используя геномную ДНК кандидатов, расщепленную рестрикционной эндонуклеазой ЕсоКР

Положительных кандидатов культивировали в условиях индукции фитазы в 50 мл среды, состоящей из 20 г/л фитата кальция, 10 г/л глюкозы, 8 г/л ЫН^0₃, 5 г/л КС1 и 5 г/л Мд80₄-7Н₂0, с добавлением 1 мл/л раствора микроэлементов (2,2% 7п80₄-7Н₂0, 1,1% Н₃ВО₃, 0,5% МпС1₂-4Н₂0, 0,5% Ре80₄-7Н₂0, 0,17% СоС12-6Н20, 0,16% Си804-5Н20, 0,15% \аЛ-1о0₁-21Ы) и 5,0% АГЕНТА, рН 6,5). Фитазную активность в среде измеряли по времени.

Результаты, полученные при анализе 2 кандидатов с использованием ^трансформированного Р. Гишси1озит ^Ι 134756 в качестве контроля, представлены в табл. 2.

Измерения фитазной активности в среде показывают, что у двух исследованных кандидатов, у которых в геном встроились множественные копии ОТ АС8 38.1, продукция фитазы возросла в 2-2,5 раза. Этот результат как будто подтвержает, что данный ген, содержащийся во фрагменте ОТ АС8 38.1, кодирует фитазу и что продукция фитазы штаммом РешсШшт может быть повышена при увеличении числа копий гена в геноме.

10.2. Экспрессия гена под контролем гетерологичного промотора.

Использовали экспрессионную кассету, содержащую промотор и терминатор гена сз131, описанного в патенте \0 00/68401, для экспрессии участка фрагмента геномной ДНК ОТ АС8 38.1, кодирующего данную фитазу. Для этого после введения сайта 8\\ηΙ в конец промотора экспрессионную кассету расщепляли рестрикционными эндонуклеазами 8νаI/8реI. Кодирующий фитазу участок, содержащийся во фрагменте геномной ДНК ОТ АС8 38.1, амплифицировали с помощью следующих праймеров:

рЬуОоатр4: 5'-ТАОАТАТСАСОАТОСТСААОСТАТАТОТАОСТОС-3' (8ЕО ГО N0: 22) рЬуОоатр5: 5'-АТАСТАОТТТАООАСОТАОСАТТСТТСООААТАО-3' (8ЕО ГО N0: 23)

Реакцию ПЦР проводили на термоциклизаторе М1 КезеагсЬ модель РТС-200 с использованием 10 пмоль каждого из праймеров на 1 единицу ДНК-полимеразы Р1а1тыт РГх (ЫГе ТесЬпо1още5, Ыс.) в 50 мкл буфера для этой полимеразы (ЫГе ТесЬпо1още5, Ыс.). Продукт ПЦР расщепляли рестрикционными эндонуклеазами ЕсоКУ и 8реI и лигировали с вектором рВСМТ. Полученную при этом плазмиду назвали рСР.

Р. Гишси1озит ^Ι 134756 котрансформировали в соответствии с методом, описанным в патенте \\Ό 00/68401, плазмидой, содержащей фрагмент ОТ АС8 38.1, и плазмидой рА\7-1 (Рип! е! а1., 1987, Оепе, 56: 117-24), позволяющей селекцию на гигромицине. Встраивание кассеты рСР проверяли методом 8оы1Ьегп-гибридизации с помощью молекулярного зонда ОТ АС8 29.1, используя геномную ДНК 8 кандидатов, расщепленную рестрикционной эндонуклеазой ЕсоКГ После анализа были отобраны 4 котрансформанта и культивированы в условиях индукции промотора сз131. Проводили анализ на экспрессию гена и измеряли фитазную активность.

Отобранные 4 кандидата культивировали в конических колбах на 125 мл в 50 мл минимальной среды с добавлением 1% кукурузного экстракта. Собирали мицелий после культивирования в течение 48 ч и 72 ч при 28°С, 180 об./мин, и проводили анализ каждого образца методом ХоПЬет-гибридизации с помощью зонда ОТ АС8 29.1, используя 20 мкг тотальной РНК (8атЬгоок е! а1., 1989, Мо1еси1аг СЧоптд: А ЬаЬога!огу Мапиа1). После отмывки мембраны сигналы проявляли на фосфорадиографе (Мо1еси1аг ЭупатГсз).

Результаты показывают наличие сигнала исключительно у кандидатов, трансформированных рСР, и отсутствие сигнала у нетрансформированного контроля, свидетельствуя, что ген экспрессируется под

- 15 007461 контролем промотора сз131.

Параллельно этому измеряли фитазную активность в супернатантах каждой из культур. Результаты представлены в табл. 3.

Таблица 3 Измерения фитазной активности (ед./мл) в супернатантах культур 4 кандидатов, трансформированных рСР и культивированных в условиях индукции промотора сз131 в течение 48 ч и 72 ч

	48 ч	72 ч
Контроль	0	0
Кандидат 1	1	1,2
Кандидат 2	0,8	1,7
Кандидат 3	0,7	1,2
Кандидат 4	1,7	2,9

В качестве контроля использовали Р. ГитсШозит ^Ι 134756.

Анализ результатов показывает, что фитазная активность имеется только в супернатантах, соответствующих кандидатам, трансформированным рСР. Такой результат согласуется с экспрессией гена и свидетельствует, что этот фрагмент геномной ДНК содержит ген, кодирующий фитазу.

Пример 11. Оптимизация условий культивирования штамма СВ8 109899 РешсШшт зр.

11.1. Влияние перемешивания на продукцию фитазы.

Ферментацию проводили в условиях из примера 3, при этом скорость перемешивания варьировали от 400 до 450 об./мин (табл. 4).

Таблица 4

Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от перемешивания

Объем	Перемешивание,	Активность,
ферментера	об/мин	ед./мл
30 л	400	66
30 л	425	48
30 л	450	36

Эти результаты показывают, что усиление перемешивания оказывает отрицательное влияние на продукцию фитазы исходным штаммом СВ8 109899 РешсШшт зр.

11.2. Влияние источника азота на продукцию фитазы.

Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром был источник азота (рисовые отруби), который заменяли другим источником азота - соевыми отрубями (табл. 5).

Таблица 5 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от источника азота

Источник азота	Активность (%)
Рисовые отруби	100%
Соевые отруби	128%

Эти результаты показывают, что источник азота оказывает влияние на продукцию фитазы исходным штаммом СВ8 109899 РешсШшт зр.; в частности, соевые отруби как источник азота усиливают продукцию фитазы.

11.3. Влияние источника фитата на продукцию фитазы.

Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром был Са⁺⁺-фитат, который заменяли двойной солью Са⁺⁺ и Мд (табл. 6).

Таблица 6 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от источника фитата

Соли фитата	Активность (%)
Соли Са++	100%
Соли Са++ и Мд++	120%

Эти результаты показывают, что источник фитата оказывает влияние на продукцию фитазы исходным штаммом СВ8 109899 РешсШшт зр.; в частности, двойная соль кальция и магния как источник фи

- 16 007461 тата дает возможность усилить продукцию фитазы по сравнению с солью кальция.

11.4. Влияние содержания фитата на продукцию фитазы.

Ферментацию проводили в условиях из примера 3. Единственным варьируемым параметром было содержание фитата в среде ферментации (табл. 7).

Таблица 7 Активности, полученные по окончании ферментации, в зависимости от содержания фитата

Эти результаты показывают, что продукция фитазы исходным штаммом СВ8 109899 РешсШшш зр. значительно повышается с увеличением содержания фитата в среде ферментации.

Пример 12. Зоотехническая эффективность фитазы, вырабатываемой штаммом СВ8 109899 РешсШшш зр.

12.1. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора у петухов.

Эксперимент проводился на 20 петухах. Животных разделили на 2 группы по 10 петухов: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), с добавлением 702 Ед (международная единица = количество фитазы, способное к образованию 1 мкмоль фосфата за 1 мин при 37°С, рН 5,5, раствор фитата натрия 10 г/л) фитазы на 1 кг корма в группе подопытных животных.

Собирали экскременты животных через 2 и 3 дня после начала эксперимента для анализа выделения фосфата. Усваиваемость фосфора соответствует проценту фосфора, усвоенного животными, по сравнению с потребленным количеством. Этот процент вычисляли, исходя из количества, выделенного с экскрементами (табл. 8).

Таблица 8

Потребление, выделение и усваиваемость фосфора

	Фосфор
	Потребление (г/кг)	Выделение (г/кг)	Усваиваемость (%)
Основной корм	0,804 ± 0,003	0,319 ±0,019	60,3 ± 2,5
Корм с добавлением 702 Ед/кг фитазы	0,801 ±0,011	0,255 ± 0,028	68,1 ±4,4

Результаты в табл. 8 четко показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора фитазы по изобретению значительно уменьшает (р<0,05) выделение фосфора. Этот эффект отражает повышение усваиваемости фосфора у животных, получавших корм с добавкой. Он свидетельствует об эффективности фитазы по изобретению в высвобождении неусваиваемого фосфора из потребляемого корма.

12.2. Влияние дополненного фитазой рациона на рост цыплят.

Эксперимент проводился на 210 цыплятах породы Козз 308. Животных разделили на 6 групп по 35 цыплят: 4 группы животных, получавших различные дозы фитазы, 1 группа не получавших фитазу животных - отрицательный контроль, и 1 группа животных, получавших неорганический фосфат - положительный контроль. Животных содержали в клетках по 5 цыплят и давали корм в течение 13 дней (с 9дневного возраста до 22 дней). В основной корм, состоящий из кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), добавляли фитазу в 4 различных концентрациях: 243, 433, 738 и 1234 Ед/кг корма для 4 групп подопытных животных, а также 0,1% неорганического фосфата в виде однозамещенного или двузамещенного фосфата кальция для положительного контроля.

Рост оценивали по измерению веса тела животных в начале и в конце эксперимента. Эти измерения дают возможность определить прирост веса и показатель расхода корма (ПРК). Показатель расхода корма соответствует количеству потребленного корма относительно прироста веса. При заданном количестве корма снижение показателя означает увеличение прироста веса животного, то есть лучшее усваивание корма животным. Результаты представлены в табл. 9.

- 17 007461

Таблица 9

Влияние фитазы на рост цыплят

Параметр	Отрицат. контроль	243 Ед/кг	433 Ед/кг	738 Ед/кг	1234 Ед/кг	Положит, контроль
Прирост веса (г)	216 ±76	369 ± 88	435 ± 82	452 ± 97	497 ±81	461 ± 72
ПРК	2,28 ± 0,91	1,74 ±0,52	1,57 ±0,34	1,61 ±0,44	1,51 ±0,26	1,51 ±0,23

Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 243, 433, 738 и 1234 Ед/кг корма фитазы по изобретению ведет к приросту веса, который повышается в 1,7, 2,0, 2,1 и 2,3 раза, соответственно. Самые высокие дозы даже позволяют получить больший прирост веса, чем при добавлении в корм неорганического фосфата. Добавление фитазы в корм также позволяет улучшить показатель расхода корма, в среднем, на 33%.

12.3. Влияние дополненного фитазой рациона на минерализацию костной ткани у цыплят.

Эксперимент проводился на 210 цыплятах породы Рокк 308. Животных разделили на 6 групп по 35 цыплят: 4 группы животных, получавших различные дозы фитазы, 1 группа не получавших фитазу животных - отрицательный контроль, и 1 группа животных, получавших неорганический фосфат - положительный контроль. Животных содержали в клетках по 5 цыплят и давали корм в течение 13 дней (с 9дневного возраста до 22 дней). В основной корм, состоящий из кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), добавляли фитазу в 4 различных концентрациях: 243, 433, 738 и 1234 Ед/кг корма для 4 групп подопытных животных, а также 0,1% неорганического фосфата в виде однозамещенного или двузамещенного фосфата кальция для положительного контроля.

На 14-ый день у каждого животного извлекали большую берцовую кость. Каждую кость взвешивали, прокаливали и определяли зольность и содержание кальция и фосфора. Результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10

Влияние фитазы на минерализацию костной ткани у цыплят

Параметр	Отрицат. контроль	243 Ед/кг	433 Ед/кг	738 Ед/кг	1234 Ед/кг	Положит, контроль
Фосфат в кости (мг)	89,1	138,2	157,8	180,1	215,9	184,1
	±22,5	±21,4	±28,1	±41,2	±37,6	±14,8
Кальций в кости (мг)	43	66,7	76,8	87,8	103,6	89,7
	±9,6	±9,3	±13,6	±18,6	±19,3	±8,0
Зольность кости (мг)	309	473	527	594	683	602
8Э	±71	±54	±71	±102	±106	±42

Эти результаты четко показывают, при всех исследованных концентрациях, положительный эффект добавления в корм фитазы по изобретению на минерализацию костной ткани у цыплят. В частности, фитаза по изобретению усиливает минерализацию кальция и фосфора в костной ткани, а также зольность. Кроме того, наблюдается дозовая зависимость по каждому из исследованных параметров.

12.4. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора и кальция у свиней.

Эксперимент проводился на 7 свиньях средним весом примерно 70 кг. У животных хирургическим путем осуществляли илеоректальный анастомоз для того, чтобы можно было количественно собирать содержимое подвздошной кишки. Их содержали по одному в целях эксперимента.

Животным давали 3 вида корма на основе кукурузы и сои. Добавление фитазы осуществляли по 300 и 600 Ед/кг корма. Каждое животное адаптировали к корму на протяжении 6 дней. Содержимое подвздошной кишки собирали на 7-ой день, после чего животному меняли корм. Определяли содержание кальция и фосфора в содержимом подвздошной кишки, а затем измеряли усваиваемость этих двух элементов. Результаты представлены в табл. 11.

Таблица 11

Влияние фитазы на усваиваемость кальция и фосфора у свиней

	Контроль	300 Ед/кг	600 Ед/кг
Усваиваемость Са (%)	42,73 ± 7,40	45,26 ± 2,49	47,09 ±8,14
Усваиваемость Р (%)	39,46 ± 11,86	43,06 ±9,11	47,82 ± 15,23

- 18 007461

Добавление в корм фитазы по изобретению значительно повышает усваиваемость кальция и фосфора. Усваиваемость кальция возрастала на 5,6 и 9,3%, соответственно, при добавлении 300 и 600 Ед/кг корма, а усваиваемость фосфора возрастала на 8,4 и 17%, соответственно, при добавлении 300 и 600 Ед/кг корма.

12.5. Влияние дополненного фитазой рациона на усваиваемость фосфора у поросят.

Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма.

Собирали экскременты животных на протяжении 5 дней, начиная с 21-го дня эксперимента, для анализа на содержание фосфора и кальция. Усваиваемость фосфора соответствует проценту фосфора и кальция, усвоенного животными, по сравнению с потребленным количеством. Этот процент вычисляли, исходя из количества, выделенного с экскрементами (табл. 12).

Таблица 12

Влияние фитазы на усваиваемость фосфора у поросят

	Потребление (г)	Выделение (г)	Усваиваемость (%)
	Фосфор
Контроль	1,007 ±0,127	0,800 ± 0,078	20,11 ±5,79
481 Ед/кг	1,145 ±0,124	0,573 ±0,1 И	50,28 ± 6,52
	Кальций
Контроль	1,873 ±0,237	1,228 ±0,180	34,20 ± 7,73
481 Ед/кг	2,131 ±0,234	1,102 ±0,102	48,62 ± 8,44

Эти результаты показывают, что добавление в корм фитазы по изобретению повышает усваиваемость фосфора на 250% и усваиваемость кальция на 42%.

12.6. Влияние дополненного фитазой рациона на рост поросят.

Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма.

Рост оценивали по измерению веса тела животных в начале и в конце эксперимента. Эти измерения дают возможность определить прирост веса и показатель расхода корма (ПРК). Результаты представлены в табл. 13.

Таблица 13

Влияние фитазы на рост поросят

Параметр	Контроль	481 Ед/кг
Исходный вес тела (кг)	6,82 ± 0,69	6,75 ± 0,88
Конечный вес тела (кг)	13,34 ± 1,58	14,86 ± 1,41
Прирост веса (кг)	6,53 ± 1,72	8,11 ± 1,66
ПРК	2,31 ± 1,85	1,63 ±0,88

Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 481 Ед/кг фитазы по изобретению ведет к увеличению прироста веса на 24%. Добавление фитазы также значительно уменьшает показатель расхода корма.

12.7. Влияние дополненного фитазой рациона на минерализацию костной ткани у поросят.

Эксперимент проводился на 12 поросятах средним весом примерно 11 кг. Животных разделили на 2 группы по 6 поросят: 1 группа подопытных животных и 1 группа контрольных животных, а затем содержали в клетках по одному. Затем на протяжении 26 дней им давали корм на основе кукурузы и сои с дефицитом усваиваемого фосфора (Р), в который добавляли фитазу по 481 Ед/кг корма.

На 27-ый день эксперимента у каждого животного извлекали большую берцовую кость. Каждую кость взвешивали, прокаливали и определяли зольность и содержание кальция и фосфора. Результаты представлены в табл. 14.

- 19 007461

Таблица 14

Влияние фитазы на минерализацию костной ткани у поросят

Параметр	Контроль	481 Ед/кг
Фосфор в кости (%)	1,66 ±0,10	2,18 ±0,09
Кальций в кости (%)	3,56 ± 0,30	4,69 ± 0,42
Минералы (%)	10,45 ±0,69	13,12 ±0,55

Результаты показывают, что добавление в основной корм с дефицитом усваиваемого фосфора 481 Ед/кг фитазы по изобретению ведет к значительному увеличению минерализации костной ткани у поросят. В частности, фитаза по изобретению усиливает минерализацию кальция и фосфора в костной ткани, а также содержание минералов.

Перечень последовательностей <110> АсНззео <120> Новые фитазы и способ получения <130 РМ01046 <140 <141>

<160 23 <170 РаРелЫп Чег. 2.1 <210 1 <211> 3753 <212> ДНК <213> РепхсИИого зр СВ5 109999 <220 <221> интрон <222> (1491)..(1550) <220>

<221> интрон <222> (1703)..(1764) <400 1 ддссЕгдсЕд дРдсддддЕд адЕссдоСдд ЕЕддсЕсдсЕ ЕсЕдсСдЕЕд сдаСЕЕсадс 60 дЕсддсЕЕдд дссасдасад ссдссадддЕ ддсЕдсдасЕ сддЪсаъдда дсгдЕдсдад 120 адссесасса сдссдсддСд ддаСсасааа ЕддЕЕЕдсад адасЕСЕсад ддссЕгсддс 180 уоуЭЗйСу уяууьиСоаа 24 0

ЕдЕдаЕдссЕ ссдааесаЕЕ сдсьасдееа аадссдссаа есессеееее сссаассаса 300 ссааЕддаЕд асЕдсссЕас ссЕааЕссаЕ ЕЕЕсдасЕсЕ дасдЕЕдада ЕсгдЕсссад 360 сдЕсаадаЕЕ ЕагсЕсддсЕ дасСдддаЕЕ ЕСЕЕсдсЕаа ссдссесасд дЕсддседда 420 ЕЕдЕсЕдсаЕ дсаЕсдаЕад аасддасЕад ааЕаааЕссд аааЕддЕЕЕЕ дддаСдаадр 400 садддсеасЕ аасасдсдас дсдадсссас дддассдссс дасассдссЕ ддагссаадд 540 ЕЕдддСсЕдс дссаЕЕдссд дЕЕддЕдЕад даааРЕсрдд аардеасЕсЕ ЕдрЕЕдьсда 600 ааЕсдарсЕс· ссадСЕдЕЕа сдаЕЕсЕадс саадаадаЕЕ ааЕасаЕсса дЕгсЕсааар 660 ааадсЕсаад ддасаЕдсЕЕ асгссарддс даасдадаЕа даррдЕдрсЕ ададдсаЕсд 720 сдссдааадд ссдЕсЕрддд асссЕсддср дЕаЕсдаЕад аЕсЕдаЕЕда асэдРЕдсаа 700 дРЕсЕсааРЕ ЕсЕсЕадссЕ ЕРаЕасрЕср ададдсааас ЕсЕссаЕсаа ададРЕЕдсР 840 ссаасассЕа сассЕддаэЕ ссасггрссд асадзсрдса аЕдсссасЕа ЕаасРадЕдс 900 ссаасЕдЕдд ЕсссСаадЕЕ ссаЕссаасЕ ЕсррдадаЕс ЕссссЕддас ааасЕЕааас 960 сааэдсдадс сдаеаЕзаРЕ дссЕсарсЕд дсЕдаЕсада ЕааадааЕаа аарсаасада 1020 ддасаасдаа сЕааадсдсс ЕЕдгЕСсаар сааЕЕЕСсад Еасссдэсса ЕдсэссьЕсЕ 1080 ЕддассадЕЕ аРЕдЕсддса аасдЕаааЕд сЕЕдддаРад дсссаагдаа сЕсасЕаРда 1140 ддсессаааЕ саРЕЕсЕадс ЕассссадаЕ ЕЕЕсаааадс сддддЕадаа аЕаРддЕдср 1200 гдсгасдрЕд ссГаСЕсддд саддаддЕсд ЕдЕдасадад ададЕЕаЕаа аЕаассЕРдд 1260 аассЕЕддаа аРсЕЕсдРаа рдсасасЕЕЕ дЕассддаср ЕЕсааддЕРЕ сасссаасаЕ 1320 ЕсаЕгдсссЕ СЕддгЕсаЕа ЕЕсЕаРасад аадааЕсада асЕдЕаРЕЕс даЕЕассасд 1380 асдсЕсаадс Еасасдрадс сдсссдЕСРд дсддсддссд дрдЕЕгсЕар сссдасадас 1440 ссгассдЕаа сссаадЕссс ддаЕЕасЕЕс сааасдадсЕ аЕдддссаЕа ЕдсаддраЕд 1500 дааасасдсд рассЕСдрса ааддсЕаЕЕа дддсссааса ддсЕасаддЕ дсЕассааад 1560 ссддаддсдс сссдЕЕссЕЕ дсдсааасса аЕссдарсса ьссссадссд ассЕэсдрсд 3 620 сааасасдсс аСЕддЕдаса асгЕсЕЕссса ЕаЕсЕддЕда ассссасдас ддааасасаЕ 1690 рсддсрддар ддддасЕЕЕд аддЕагдЕаЕ ЕаЕсЕЕЕсдс Едаадрассд ЕЕадЕасдда 1740 ЕдааасЕдаЕ ссьадасааа асадЕссЕСа ссаасссадс ссЕдаСддас ссддсдсдда 1800 ЕдааЕаЕссЕ сЕсссЕсссд дЕдсааасаЕ ЕасдсаааЕс саЕаЕддЕдс аЕсдссаЕдд 1860 сссдсдссар ссдасдссаэ агсссдсааг садсдагедд дссаадаааа гааедсадба 1920 ЕсдаЕссаас ддсасадЕдЕ ЕсЕсаддсда аСЕЕдадЕЕЕ СЕдаасдсгЕ ддааеЕаЕса 1990 дсЕсддасад дсададсЕаа садсасдадд Есддсаадад ЕЕаЕЕсдаса дсдддаЕЕсЕ 2040 асаРЕддрЕс аасЕаСддаа адсьсЕасда ЕссЕдсасса аазарсаЕад сЕсдсасаас 2100

- 20 007461 аасдаЕддСд аодаЕдСЕдс ааЕсадсдда даасЕгссЕс ааСддаЕЕЕЕ ЕЕддЕссааа 2160 сЕддасгааЕ ааЕдсдасдс сЕдаадЕсас ЕаЕСдааадС ассдддЕСса асаасгсссС 2220 сдсадддааЕ дасасдЕдЕс дсаасдсааа аааЕасассд дддддсдасд садЕаааСда 2280 асддассдсд сЕаЕасЕЕдс адааадсдас ааагсдсСЕс адаадЕдааа ЕаЕсЕддаад 2340 сесдаассдд асЕдСЕдасд асасдЕасаа СдсасадЕсд аЕдЕдсссаЕ асдадасЕдс 2400 гдсасЕЕддЕ СаЪадЕссдк ЕЕЕдЕасаСЕ дСЕСЕСЕЕдд даддааЕддс аадддЕЕсса 2460 дсаЕдссаас дасЕсдаасс ЕсЕаСдддаа сЕаСддсаЕд ддЕЕсЕссад ЕЕддссдсдс 2520 саЕЕддасЕЕ ддаЕЕЕдЕсд аадааЕЕдаС ЕдсасддсЬд саддддсааа Есссааассс 2580 сссЕдаадас ссаасЕдддЕ ЕсааЕсааЕС дсЕадаЕдаЕ адЕдссдсда сесЕсссЕсЕ 2640 саассаааса аЕсЕасЕЕсд асЕЕЕадсса сдасаасдад аЕдЕЕсссда ЕдсгдасЕдс 2700 ссЕдддсЕЕд асасадССсд дддасЕассЕ СЕсЕсссасд аадсссссЕд сддаЕсдЕсс 2760 дсЕдассдда адссаЕассд ЕсссдЕЕсЕс ддсЕассСЕЕ дЕаСЕСдада Есассааадс 2820 ассЕддссЕЕ дЕасдадада аЕсдаЕсааа дЕаЕЕдсддЬ дааадЕдсдЕ аСдааааЕас 2880 дадсдаадаа асаассЕаса ЕасаЕСЕсдЕ сассаассад аддасЕдЕЕс сЕсЕЕддЕса 2940 аадсассЕса дсагдсдддс аасдадаЕда ЕддСЕддЕдг даааЕЕЕссд ссЕЕсаЕХса 3000 ддсдсадааа даааасаЕсд Едааддсааа ЕЕасдаддаа адсгдЕЕЕсд даааЕСддад 3060 саЕсссддсд Еасддсдада Есадддасдд сдсЕаЕЕссд аадааЕдсЕа сдЕссЕаасЕ 3120 дсЕаЕаЕЕад асдсссЕсда аад-ЕЕЕадаЕ ЕддадаЕасЕ сддасааасЕ сдсгссаЕЕС 3190 ааЕадсЕада адддсаасЕа ЕдСссдсссс асЕсасЕсед аЕассадаЕа сасдЕадЕаЕ 3240 даЕдсаадЕа Есссдадссс ЕсасаЕдааЕ аЕЕсдддсЕа адЕсЕдсЕда аадасаЕссЕ 3300 даЕЕаааСсЕ адЕЕдЕсадЕ ЕдссддЕдсс аеедасаасЕ дасадсЕаса дсдадЕаЕаЕ 3360 ЕддсдЕЕасд ЕаЕаЕаасса асЕаассасЕ дСЕааддсдЕ дЕдадсааЕс даЕасаЕааа 3420 ЕсЕсссаЕад дссаассдЕд дсаададЕЕа ЕсаасЕассЕ адаЕсЕаЕса сЕЕсЕдЕсЕс 3480 асдаададда ддаддаддад ассаСдсЕСС Ессдсадсас ЕаЕааааЕас аЕЕСЕсддЕЕ 3540 агасасаадс сдсСдассда сдЕсддЕдЕс дЕЕЕсссЕсд аааЕсЕдсаЕ ЕЕЕсЕаааЕЕ 3600 ЕЕссаЕддсс аасЕаддадд сЕдддаЕЕЕс аЕсааадсас дддаааддЕЕ ЕЕЕдЕсаасЕ 3660 аЕаЕссГдСЕ аЕсадЕаЕас ссдЕаададЕ ЕадддЕЕадЕ даддссасда ЕдЕЕЕсЕддд 3720 дЕсаадЕЕас ааасааадсс асдаасссдс адд > - . 3753 <210> 2 <211> 1761 <212> ДНК <213> РепхаШиш зр СВ5 109899 <220> <221> кодирующая последовательность <222> (89)..(1711) <400> 2 ассддасЕЕЕ сааддгЕЕса ЕЕЕаасасЕс ассдЕссЕЕЕ ддЕЕсаСаЕС сЕаЕасадаа 60 даассадаас ЕдЕаЕЕЕсда ЕЕассасд асд ссс аад сса СаС дЕа дсс дсс 112

МеЕ 1>еи Ьуз Ьей Тух Уа1 А1а А1а

ЕаС сЕд дЕд дЕд

дсс А1а

ддС <51у

1 дсс СсЕ аСс ссд аса

5 дас ссе

асе ТЫ

дЕа Уа1

асе ТЫ

160

Суз

Ьей Уа1 Уа1 10

Уа1 Зег 15

11е

Рго ТЬг

Азр 20

Рго

саа

дес

ссд

даЕ

Еас

ЕЕС

саа

асд

аде

Еас

ддд

сса

ЕаЕ

дса

ддс

дсЕ

208

С1п

Уа1

Рго

Азр

Туг

РЬе

С1Л

ТЫ

Зег

Туг

01у

Рго Туг

А1а

С1у

А1а

25

30

35

40

асе

ааа

дсс

дда

ддс

дсС

ссд

ССС

ССЕ

дед

саа

асе

аас

ссд

асе

ЕаЕ

256

ТЬг

Ьуз

А1а

61у

С1у

А1а

Рго

РЬе

Ьей

А1а

Е1п

ТЬг

Азп

Рго

Не

Туг

45

50

55

ССС

сад

ссд

асе

сас

дСс

дса

аас

асд

сса

ЕЕд

дЕд

аса

асС

СЕЕ

ссс

304

Зег

Е1п

Рго

ТЬг

Туг

Уа1

А1а

А5П

ТЫ

Рго

Ьей

Уа1

ТЬг

ТЬг

Ьей

Рго

60

65

70

аса

ЕсС

ддс

даа

ссс

саЕ

дас

дда

аас

аЕа

ЕСс

ддс

Едд

асд

ддд

асЕ

352

Не

Зег

С1у

εϊυ

Рго

ΗΪ5

Азр

С1у

Азп

Не

РЬе

С1у

Тгр

Мес

С1у

ТЬг

75

90

05

- 21 007461

ссд аде Ьеи Зег 90

ссС Рго

Сас саа Туг 61 п

ссс Рго

аде Зег 95

ССЕ Рго

даС дда ССС Азр С1у РЬе

ддс дед дас 61у Уа1 Азр 100

даа С1и

СаС Туг

4 00

ссС

сЕс

ссЕ

ссс

ддс

дса

аас

аЕС

асд

саа

аСс

сас

асд

дед

сас

сдс

448

Рго

Ьеи

Рго

Рго

С1у

А1а

Азп

Не

ТЫ

С1п

Не

Нхз

МеЕ

Уа1

Н1з

Агд

105

110

115

120

саС

дас

Ссд

сдс

ЕаЕ

ссд

асд

Сса

ааС

Ссс

дса

асе

аде

даС

Сдд

дес

496

Н1з

61у

Зег

Агд

Туг

Рго

ТЬг

Зег

Азп

Зег

А1а

Не

Зег

Азр

Тгр

А1а

125

130

135

аад

ааа

аЕа

аСд

сад

Сас

еда

ССС

аас

ддс

аса

дСд

ССс

Сса

ддс

даа

544

Ьуз

Ьуз

Не

Мес

61п

Туг

Агд

Зег

Азп

С1у

ТЬг

Уа1

РЬе

Зег

61у

61и

140

145

150

СЕС

дад

ССС

сед

аас

дсЕ

Сдд

аас

СаС

сад

сСс

дда

сад

дса

дад

сСа

592

Ьеи

61и

РЬе

Ьеи

Азп

А1а

Тгр

Азп

Туг

С1п

Ьеи

С1у

С1п

А1а

61 и

Ьеи

155

160

165

аса

дса

еда

ддС

едд

саа

дад

ССа

ссс

дас

аде

999

аСС

сса

саС

Сдд

640

ТЫ

А1а

Агд

С1у

Агд

61п

61и

Ьеи

РЬе

Азр

Зег

С1у

Не

Ьеи

Нхз

Тгр

170

175

180

ССС

аас

СаС

дда

а'ад

сЕс

Сас

даС

ссС

дса

сса

ааа

аСс

аСа

дсс

сдс

688

РЬе

Азп

Туг

61у

Ьуз

Ьеи

Туг

Азр

Рго

А1а

Зег

Ьуз

11е

Г1е

А1а

Агд

1Θ5

190

195

200

аса

аса

асд

аСд

дед

адд

асд

ссд

саа

Сса

дед

дад

аас

есс

ссс

аас

736

ТЬг

ТЬг

ТЬг

Мее

Уа1

Агд

Мес

Ьеи

61п

Зег

А1а

С1и

Азп

РЬе

Ьеи

Азп

205

210

215

дда

ССС

ССС

ддС

сса

аас

Сдд

асС

аас

аас

дед

асд

есс

даа

дСс

аСС

784

61у РЬе РЬе 61у Рго Азп Тгр ТЬг Азп Азп А1а ТЬг Ьеи С1и Уа1 Не

220 225 230 аН даа адЕ асе ддд Икс аас. аас ссс сЕс дса ддд ааЕ даЕ асд где Θ32

Г1е С1и 5ег ТЬг С1у РЬе Азп Азп Зег Ьеи А1а С1у Азп Азр Мее Суз

235 240 245

сдс Агд

аас Азп 250

дса ааа ааС

аса ТЫ

Сед 5ег 255

ддд ддс дас

дса А1а

дса Уа1 260

аас даа

Едд Тгр

асе ТЬг

880

А1а

Ьуз

Азп

61у

С1у Азр

Азп

61и

дед

сСа

Сас

сед

сад

ааа

дед

аса

аас

сдс

СЕс

ада

адЕ

даа

аСа

СсЕ

928

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

61 п

Ьуз

А1а

ТЬг

Азп

Агд

РЬе

Агд

5ег

61 и

Ь1е

Зег

265

270

275

280

дда

аде

сед

аас

сдд

асе

дсс

дас

дас

асд

Сас

аас

дса

сад

ссд

асд

976

С1у

Зег

Ьеи

Азп

Тгр

ТЬг

Уа1

Азр Азр

ТЫ

Туг

Азп

А1а

61п

Зег

МеЕ

285

290

295

сдс

сса

гас

дад

асе

дсс

дса

сСс

ддс

Сас

аде

ссд

ССС

СдС

аса

ЕСд

1024

Суз

Рго

Туг

С1и

ТЬг

ν»ι

А1а

Ьеи

61у

Туг

5ег

Рго

РЬе

Суз

ТЬг

Ьеи

300

305

310

ССС

ссс

сдд

дад

даа

Сдд

саа

ддд

ССс

сад

сас

дсс

вас

дас

ЕЕд

аас

1072

РЬе

Зег

Тгр

61 и

С1и

Тгр

61п

61у

РЬе

61п

Туг

Уа1

Азп

Азр

Ьеи

Азп

315

320

325

сСс

са£

ддд

аас

СаС

ддс

асд

ддС

СсЕ

сса

дЕС

ддс

сдс

дсс

асе

дда

1120

Ьеи

Туг

61 у

АЗП

Туг

61 у

Мес

61у

Зег

Рго

Уа1

61 у

Агд

А1а

11е

61 у

330

335

340

сЕС

дда

ссс

дсс

даа

даа

ССд

аСС

аса

сдд

•сид

сад

ддд

саа

аСс

сса

1168

Ьеи

С1у

РЬе

Уа1

С1и

51и

Ьеи

Пе

А1а

Агд

Ьеи

61п

61 у

б1п

11е

Рго

- 22 007461

345

350

355

360

аас

ссс

ссС

даа

дас

Сса

ддд

ССС

аас

саа

ссд

с£а

да С

да С

адС

1216

Азп

Рго

Рго

61 и

Азр

Зег

11е

С1у

₽пе

Азп

61п

Зег

Ьей

Азр

Азр

Зег

365

370

375

дсс

дед

ас±

М:с

ссС

ССС

аас

саа

аса

аСс

Сас

М:с

дас

ССС

аде

сас

1264

А1а

А1а

ТЫ

РЬе

Рго

Ьей

Азп

61п

ТЬг

Не

Туг

РЬе

Азр

РЬе

5ег

Н15

380

385

390

дас

аас

дад

асд

£Сс

Сед

аСд

ССд

асС

дсс

сед

ддс

ССд

аса

сад

ССС

1312

Аар

Азп

С1и

МеС

РЬе

Зег

мес

Ьей

ТЬг

А1а

Ьей

61у

Ьей

ТЫ

ст

РЬе

395

4 00

405

ддд

дас

Бас

сСс

ССС

ссс

асд

аад

ссс

СсС

дед

дас

еде

Ссд

ссд

аСС

1360

С1у

Азр

Туг

Ьей

Зег

Рго

ТЬг

Ьуз

Рго

Зег

А1а

Азр

Агд

Зег

Ьей

Не

410

415

420

дда

аде

сас

асе

дСо

ссд

Мхе

Сед

де С

асе

ссс

дСа

ССС

дад

аСс

аСс

1408

61У

Зег

Нхз

Не

Уа1

Рго

РЬе

Зег

Д1а

ТЬх

РЬе

Уа1

РЬе

С1и

Не

Не

425

430

435

440

ааа

дса

ссь

ддс

СЬХ

дса

еда

дад

ааС

еда

Сса

аад

сас

сдс

ддс.

даа

1456

Буз

А1а

Рго

С1у

Ьей

Уа!

Агд

61и

Азп

Агд

Зег

Ьуз

Туг

Суз

61 у

61и

445

450

455

аде

дед

гак

даа

аас

асд

с* у С

уае

уоа

αυα

аии

ι,άύ

α йй

иаь

иьи

1504

Зег

Уа1

Туг

С1и

А5П

ТЬг

Зег

С1и

С1и

ТЬг

ТЬг

Туг

Не

НХЗ

Ьей

Уа1

4 60

4 65

470

аСС

аас

сад

адд

асе

дсс

с се

СГ.С

ддс

саа

аде

аСС

сса

дса

Сдс

ддд

1552

Не

Азп

С1п

Агд

ТЬг

Уа1

Рго

Ьей

С1у

С1п

Зег

Не

Зег

А1а

Суз

61 у

475

480

485

саз

еда

дас

даС

ддС

Сдд

едС

даа

аМ:

Ссс

дсс

,сСс

асе

сад

дед

сад

1600

С1л

Агд

Азр

Азр

01у

Тгр

Суз

61и

11е

Зег

А1а

РЬе

Не

61П

А1а

С1п

490

4 95

500

ааа

даа

аас

а Се

дед

аад

дса

ааС

Ьас

дад

даа

аде

сдс

ссс

дда

ааС

1648

Буз

С1и

Аэп

11е

Уа1

Ьуз

А1а

Азп

Туг

С1и

С1и

5ег

Суз

РЬе

61у

Азп

505

510

515

520

сдд

аде

аге

ссд

дед

Сае

ддс

дад

аСс

адд

даС

ддс

дсС

аМ:

ссд

аад

1696

Тгр

Зег

11е

Рго

А1а

Туг

61у

61 и

11е

Агд

Азр

С1у

А1э

Не

Рго

Ь/5

525

530

535

ааС

дсС

асд

ссс

саа

сСдсСаСаСС адасдссссс дааадсссад

аССддадага

1751

Азп

А1а

ТЬг

5ег

540 сСсддасааа 1761 <210> 3 <211> 540 <212> Белок <213> РетсПИит ар СВЗ 109899 <400> 3

Мес

Ьео

Ьу5

Ьей

Туг

Уа1

А1а

А1а

Суз

Ьей

Уа1

Уа1

А1а

61у

Уа1

Зег

1

5

10

15

11е

Рго

ТЬг

Азр

Рго

ТЬг

Уа1

ТЬг

ст

Уа1

Рго

Азр

Туг

РЬе

61п

ТЬг

20

25

30

Зег

Туг

С1у

Рго

Туг

А1а

С1У

А1а

ТЬг

Ьуз

А1а

61 у

С1у

А1а

Рго

РЬе

35

40

45

Ьей

А1а

ст

ТЬг

Азп

Рго

11 е

Туг

Зег

61П

РГО

ТЬг

Туг

Уа1

А1а

Азп

- 23 007461

55 60

ТЫ Рго Ьеи Уа1 65

ТЬг ТЬг Ьеи 70

ι Рго 11е 5ег 61у 61и Рго Нхз 75

Азр О1у 80

Ав η

! Не

; РЬе

ι С1у

Тгр

ι МеС

01 у

• ТЫ

Ьеи

5ег

Рго

' Туг

61п

Рго

Зег

Рго

85

90

95

Азр

1 С1у

1 РЬе

О1у

Уа1

Азр

01 и

Туг

Рго

> Ьеи

Рго

Рго

01 у

А1а

Азп

Пе

100

105

110

ТЬг

О1п

11е

НхЗ

Мер

Уа1

Нхз

Агд

Нхз

61 у

Зег

Агд

Туг

Рго

ТЬг

Зег

115

120

125

Азп

Зег

А1а

11е

Вех

Азр

Тгр

А1а

Ьуз

Ьуз

11е

Мег

01 п

Туг

Агд

Зег

130

135

140

Азл

С1у

ТЬг

Уа1

РЬе

Зег

С1у

61 и

Ьеи

С1и

РЬе

Ьеи

Азп

А1а

Тгр

Азп

145

150

155

160

Туг

01п

Ьеи

01 у

С1П

А1а

01 и

Ьеи

ТЬг

А1а

Агд

С1у

Агд

С1Л

61 и

Ьеи

165

170

175

РЬе

Азр

Зег

С1у

11е

Ьеи

Н15

Тгр

РЬе

Азп

Туг

61у

Ьуз

Ьеи

Туг

Αδρ

180

185

190

Рго

А1а

Зег

Ьуз

Не

Пе

А 1а

Агд

ТЬг

ТЬг

ТЬг

МеС

Уа1

Агд

МеС

Ьеи

195

200

205

01 п

5ег

А1а

61 и

Азп

РЬе

Ьеи

Азп

01у

РЬе

РЬе

61у

Рго

Азп

Тгр

ТЬг

210

215

220

Азп

Азп

А1а

ТЬг

Ьеи

61 и

Уа1

Пе

Пе

61и

Зег

ТЬг

61 у

РЬе

Азп

Азп

225

230

235

240

Зег

Ьеи

А1а

01 у

Азп

Азр

МеС

Суз

Агд

Азп

А1а

Ьуз

Азп

ТЬг

Зег

01у

245

250

255

σι у

Аэр

А1а

Уа1

Азп

61 и

Тгр

ТЬг

А1а

Ьеи

Туг

Ьеи

С1П

Ьуз

А1а

ТЫ

260

265

270

Азп

Агд

РЬе

Агд

5ег

61и

Пе

Зег

61у

Зег

Ьеи

Азп

Тгр

ТЫ

Уа1

Азр

275

280

285

Азр

ТЬг

Туг

Азп

А1а

61п

Зег

МеС

Суз

Рго

Туг

С1и

ТЬг

Уа1

А1а

Ьеи

290

295

300

С1у

Туг

Зег

Рго

РЬе

Суз

ТЬг

Ьеи

РЬе

Зег

Тгр

01и

61и

Тгр

61п

01у

305

310

315

320

РЬе

01п

Туг

Уа1

Азп

Азр

Ьеи

Азп

Ьеи

Туг

61у

АЗП

Туг

С1у

Мес

01 у

325

330

335

Зег

Рго

Уа1

01 у

Агд

А1а

11е

<51 у

Ьеи

61 у

РЬе

Уа1

01 и

61и

Ьеи

11е

340

345

350

Д1а

Агд

Ьеи

61п

С1у

61п

Пе

Рго

Азп

Рго

Рго

С1и

Азр

5ег

Не

01у

355

360

365

РЬе

Азп

С1П

Зег

Ьеи

Азр

Αδρ

Зег

А1а

А1а

ТЬг

РЬе

Рго

Ьеи

Азп

С1п

370

375

380

ТЫ

11е

Туг

РЬе

Азр

РЬе

Зег

Нхз

Азр

Азп

61 и

МеС

РЬе

Зег

МеС

Ьеи

385

390

395

400

ТЬг

А1а

Ьеи

01 у

Ьеи

ТЬг

61п

РЬе

С1у

Азр

Туг

Ьеи

Зег

Рго

ТЬг

Ьу5

405

410

415

Рго

5ег

А1а

Азр

Агд

Зег

Ьеи

Пе

С1у

Зег

Нхз

Пе

Уа1

Рго

РЬе

Зег

420

425

430

А1а

ТЬг

РЬе

Уа1

РЬе

61и

Пе

Пе

Ьуз

А1а

Рго

С1у

Ьеи

Уа1

Агд

С1и

435

440

445

Азп

Агд

Зег

Ьуз

Гут

Суз

61у

61и

Зег

Уа1

Туг

61 и

Азп

ТЬг

Зег

С1и

450

455

460

01 и

ТЬг

ТЬг

Туг

Не

Ηχδ

Ьеи

Уа1

Не

Азп

61п

Агд

ТЬг

Уа1

Рго

Ьеи

465

470

475

480

С1у

С1п

Зег

Пе

Зег

А1а

Суз

С1у

01п

Агд

Азр

Азр

С1у

Тгр

Суз

61и

485

490

495

Пе

Зег

А1а

РЬе

Пе

61п

А1а

С1п

Ьуз

61«

Азп

Пе

Уа1

Ьуз

А1а

Азп

500

505

510

Туг

61и

01и

Зег

Суз

РЬе

61у

Азп

Тгр

Зег

11е

Рго

А1а

Туг 01у

61и

515

520

525

11е .

Агд

А$р

01у

А1а

Пе

Рго

Ьуз

Азп

А1а

ТЫ

Зег

530 535 540 <210> 4 <211> 2757

- 24 007461 <212> ДНК <213> Реп1С1111ит £ип!си1о5ит <400> 4 £дса£сдсСд СССдссдаад ссдаССЬссс адГЬдссасд аЬссЬадсаа даадаСЪаа! 60 асакдсадСС сГСааасааа дсссааддда саСдсе^асс ссаСддсдаа саада^адас 120 ддСдСсСада ддсаГсдсаГ сдаааддссд Сс1Лддс£д£ аЕСдагадаС. (ЬдаС+даас 180 адЬЬдъаадг Сс^ааакЫзС сс1адссс.££ аеасгсссаа аддсааассс гссаьсаааа 240 адБЕЬдсесс дасассЬаса сс£ддааесс асЫГссдаь адассдсаас дсссасСаСд 300 ассадсдссс асЬЬдсадсс дссаадеъьс аЫЛааесхе сТдадассЫ: ссссддаЪаа 360 ассеааадса аадсдадссд асасаассдс сЬсаЬсЬдас ааадааЬдаа аЬсаадьгса 420 дссаасадсд даСааадсаа саТсдсдссЬ сддьесссаа Саддсдсьса дсасс£даса 480 аедсадсгеес СсддассадЪ еаесаЬсддс ааасдьааас дсСЕадда^а ддсссаасда 540 ас£сас£ааЪ даддг.сссаа а£сддаадес СссадсСасс ссадаседсс аааадссддд 600 дсаддаасаЬ ддсдсссдсС агдггдгсса сссдддсада аадесдедьд асадададад 660 ксасаааьаа ссеьддааад сгссдсааЬд дасассьсдг ассддас£Ьс саадаегсгд 720 ЪСаасаЪгса ЬьдЬЪссЬсЪ д-ЫсаЬПсда (Ъ^Ьа-Сасаа аадааЪсаас адЬдеаеесЬ: 780 сассадсаЬд аьдсгсаадс Ьаъдсдгадс едсссдссед д£дд<:ддссд дсдсссесае 840 сссдасадас ссСасэдсаа сесаадсссс ддаЬСасссс сааасаадсС аЪдддссаЬа 900 гдсаддСа£д дЬааеасдсд ЕаасТЪдЪса аададЬссса дддсЬсасад дсЬаеаддсд 960 сГасЬааадс сддадасдс! ссдсгссгЪд сдсааассаа сссадссса£ Ссссадссда 1020 ссЕаЪдссдс ааасасдсса сСддСдасеа сСсссссса^ аЪсЬддбдаа ссссасдасд 1080 ддаасаЬасе сддссддасд дддасгееда ддсасд£ас£ сСс£хдсдс£ даадЪдссдЬ 1140 £ассасддаЬ ддаас1:аа£С сдаг.асаааа садсссЬЬас садсссадсс сЪда£ддаеЬ 1200 £ддсдСдда£ дааЬаСссЬс СсссСсссдд сдсааасасЬ асдсаааССС асасддЪдса 1260 ЬсдссаЪддс ссдсдсьаьс сдасадсааа спссдссасс адсадСЕддд сааадаадас 1320 ааЪдсадсаС сдаЬссаасд дсассдсдег сЪсаддсдаа с1:сдаССГЕс СдаасасГЕд 1380 дэасСассад сссддасадд сададс^аас адсасдадд£ сддсаададе сасссдасад 1440 сддьдсссгд саЪеддЪкса ассасддааа дсксЪасдаС есгдсдЪсда ааа^саЪсдс 1500 Ссдсасдаса асдаЬддЬдс ддаедеедса ассддскдад аасеессеса асдддЬЪССС 1560 ъддсссааас ьддаасааса аьдсдасась ьдаадгласс аСХдааадСа ссдддсссаа 1620 саасЬсссхс дсадддааед аЬапдЬдесс сааедсаааа ааЬасаесад даддсда£дс 1680 адЬадасдаа еддассссдс ЬаЬасЬЬдса дааадсдаса аа£сдскс£.а даадсдааас 1740 ассаддаадс сьдаассдда с+дсгдасда сассеасаас дсасааеска Ьдкдсссаеа 1800 СдадасддСЬ. дсссеъдд^с. асадсссдСЬ ИдсасаЬЬд схскеГЪддд аддаа&ддса 1860. адддЬЬссад сасдсЬаасд аеь-едаассс ссаСдддаа!: гаЬддсаедд да(гссссад£ 1920 аддссдсдсс аЬЛдддсгьд дасссдЪсда адааЬЪааеЬ дсаадд££дс ааддасааье 1980 Ьссаасассс сссдаадасС сааесдсссс сааесааЬсд скадассада дСдсддсаас 2040 с£1:ссс-Ьсес аассааасХа Ьс1;асЪссда гсЕсадссас дасааедада ьдсссСссаП 2100 > дсгаасъдсс сЬдддсссаа сасааЬСсдд ддассасссс Ьсгсссасаа адссссссдс 2160 сдассдгссд гСдаЬСддаа дссасассдС сссдеСсСсд дссасссссд сдСсСдадае 2220 сахсааадса ссгддсссСд Сасдададда ^сдассааад ЬаЪЬдсдоед ааадсдСдСа 2280 гдаааасасг адсдаддада саасссасаС асаСсЬсдСс а£Лаассада ддасЬдЬЪсс 2340 Ссгьдд^саа адсаССЬсад сагдсддаса асдадагдае ддгеддед^д адасссссдс 2400 5 сххсаьесад дсдсадааад асаасаЬЬда дааддсаааС сасдадсааа дсьдсеьедд 2460 ааассддадь аГсссддсдЬ асддссадаь еададасддс дсгасхссда адааСдссас 2520 ££сс(:аассд сСаСаЪСада едсссссдаа адЬССадаса ддадасадеа сЬсдСсадда 2580 ддссса£аЬс есадссадсс асадсасСдс ддадсдасда адддЬСдаае аьадсасасс 2640 дсддддгдсЪ ьдаЬсссаад ССХдддаадс сддаЬЬЛада саг£СЪааЪ£ сСсЬдЪЬадд 2700 О Сасае£саСд ссасдЬадсс даЫ:ЕГСдГ.с саассдасса аегхсасссс сдаЪаЪс 2757 <210> 5 <211> 24 ^{5 <212>} ДНК <213> Искусственная последовательность ^<220> η <223> Описание искусственной последовательности <0 Олигонуклеотид ΡΝ3 <400> 5 ссдссддсаа ссадсддадд даъс 24 >5 <210;» 6

- 25 007461 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная- последовательность <220>

<223> Описание искусственной поеледовательнсти Олигонуклеотид ; ₽Ν4 <400> 6 ссГЬддСссд сдСЬЬсаада сддд 24 <210> 7 <211> 1175 <212> ДНК <213> Ρβηΐοϊΐΐίυιη зр СВ8 109899 <400> 7 ссдЫддсаа ссадсддадд дэгсассасс дадедсдддс ссссдсддсс саасстссса 60 сссьедЕсес еаЬасассСд НдсЬЕЬддс дддсссассд дддссасссд дСсдссдддд 120 дасдсасдес сссдддсссд сдсссдссда адсдсдсЕдЬ даасссЬдаС даадасдддс 180 ЪдСссдадса сСагдааааЬ £д(:сааааск ЬСсаасааЬд даЪсЪсСЪдд ССссддсаЬс 24 0 дакдаадаас дсадсдааа£ дсдаеаадСа аЬдидааЬЕд садааспссд ^дааНсаЬсд 300 аа(:сг1:сдаа сдеасаНдс дссссскддс а«ссддддд дса^дсссдТ ссдадсдЬса 360 е1Ьс1дссс± саадсасддс ГддсдСдЬгд ддед^ддксс ссссддддас сгдсссдааа 420 ддсадсддсд асдсссдСсЬ ддСссСсдад сдСаеддддс сскдесасес дсЪсдддаад480 дасссдсддд дд(:£дд£сас сассасаеее еассасддес дассСсддае саддеаддад540

СгасссдсСд аасСЬаадса ЬаЕсаа^аад сддаддаааа дааэссаасс дддае^дссЬ600 садеаасддс дадсдаадсд дсаададссс аааЬСЬдааа ЪсЬддссссЬ ГЛддддсссд660 адГ.Ьдсаасе ЬдсададдаГ дссесдддед сддЪссссдЬ сЬаадкдссс сддаасдддс720 сд^саИадад ддИдадааес ссдЬсЬддда едддсддссд сдсссдедЬд аадсЬссСгс780 дасдадЬсда дссдее+ддд аасдсадссс еаадсдддгд дсаааЬекса есСааадсСа840 аагасгддсс ддадассдаГ адсдсасаад Ьададгдасс дааадаСдаа аадсасеъъд900 аааадададЪ сааасадсас дЪдаааСсд! сдааадддаа дсдсСдСсса ссадасСсдс960 ссддддддд^ Ьсадссддса сдсд^дссдд гдСассссЪс Ьссдддсддд ссадса+сдд1020 ьесдддсддс Гддсдааадд ссссдддааС дсаасассст Ъсддддъдсс ееаЪадсссд1080 дддёдссэгэ садссадссс ддассдаддс ссдсдсеесд дсдаддаСдс Сддсдсаагд1140 дЬддссаасд дсссдЪсЕтд эаасасддас саадд1175 <210> 8 <211> 11 <212> Белок <213> РегйсШпи ар СВЗ 109899 <220>

<221> неизвестно <222> (9) <223> Хаа » С1п ог УаЬ <40О> 8

Не Рго ТЬг Азр Рго Е1п Уа1 Рго Хаа Туг РЬе

5 10 <210> 9 <211> 17 <212> Белок <213> РепхсННит Зр СВ5 109899 <400> 9

ТЬг бег Е1у Е1у Аар А1а Уа1 Азп 61и Тгр ТЬг А1а Беи Туг Ьеи Е1п 1 5 10 15

Ьуз

- 26 007461 <210> 10 <211> 20 <212> Белок <213> Реп1Сл111ип» зр СВ5 109899 <400> 10

А1а С1у С1у А1а Рго РЬе Ьеи А1а С1п Хаа Азп Рго Не Туг Хаа <31п

10 15

Рго Хаа Туг Уа!

<210> 11 <211> Ί <212> Белок <213> РегпсШшп зр СВ2 1098 99 <400> 11

Ьеи Туг Азр Рго А1а 5ег Ьуз

5 <210> 12 <211> б <212> Белок <213> РегНсШЬит зр СВ5 109899 <400> 12

А1а Рго <51 у Ьеи Уа! Агд

5 <210> 13 <211> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> Описание искусственной последовательности <223>

Олигонуклеотид ОТ АС5 17 Р4.4 <400> 13 аспдаусспс агдйссс 17 <210> 14 <2Ц> 17 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности Олигонуклеотид ^{АС5 25} Р6.1 <400> 14 дслаЬссауг сгккпас 17 <210> 15 <211> 846 <212> ДНК <213> РепхсИИит эр СВ5 109899

- 27 007461 <400> 15 асадагассс аддгсссдда ССасгГссаа асдадссагд ддссатасдс аддсасддаа 60 аСасдсдЬас сс^дасааад дссассаддд сссаасаддс сасаддсдсс. ассааадссд 120 даддсдсссс дссссеьдсд сааассаа^с сдаЪссаЬГс ссадссдасс Сасдесдсаа 100 асасдсса^Г ддЕдасаасТ сСЕсссаГаЬ сГддгдаасс ссасдасдда аасасасссд 240 дсСддаГддд дасЕЬСдадд Ьасдсассас сссссдссда адЬассдкЬа дСаеддасда300 аасгдасссг адасааааса д^есеЬасса асесадсссЬ. дакддаЕЕЪд дсд^ддаСда360 аьагссссгс сс±сссдд1д саааса^йас дсааагссаЪ агддсдсасс дссасддссс420 дсдсЬаСссд асдГсаааЫ: ссдсааЪсад сдаС±дддс± аадааааГаа СдсадЪаСсд480 а1:ссаасддс асадид±пс1 саддсдаасг сдадссссгд аасдсгсдда асСаСсадсС540 сддасаддса дадссаасад сасдаддьсд дсаададЪЬа еесдасадсд ддаССсЕаса600 ееддеесааЬ ЬаЬддааадс Гсеасдаксс едса-Ьсаааа апсаеадсЬс дсасаасаас660 даЬддЬдадд аедгСдсаа-е садсддадаа сСкссСсааЕ ддаССкЬГЕд дсссааассд720 дасъааеааС дсдасдсс^д аадссаГгаЬ Едааадсасс дддсссааса асксссЪсдс780 адддааедас. аадедесдса аЕдсаааааа Еасагсдддд ддсдасдсад Сааа±даа±д840 дассдс846 <210> 16 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности Олигонуклеотид·., ОТ дез 32 Р5 <400> 16 ссаСсадддс ЬдддЫддЬа аддасЬд 27 <210> 17 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности Олигонуклеотид ОТ _Дс5 32 рз <400> 17 ссддасеааС ааНдсдасдс ЬСдаадСс 28 <210> 18 <211> 24 <212> ДНК ^<213^> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности Олигонуклеотид. ОТ АС5 38 ?1 <400> 18 ддс£ЕСдс£д дгдсддддСд адГс 24 <210> 19 <211> 33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности

Олигонуклеотид ОТ АС 5 38 Р2

- 28 007461 <400 19 сйдсдддй сд1аас(йд Шд1аасй дас <210> 20 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> Описание искусственной последовательности <223> Олигонуклеотид ОТ АС8 37 Р1 <400> 20 ддсдс1ссд1 (ссйдсдса аас <210> 21 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> Описание искусственной последовательности <223> Олигонуклеотид ОТ АС8 37 РЗ <400> 21 д!адд(сддс 1дддаа1ада 1сд <210> 22 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> Описание искусственной последовательности <223> Олигонуклеотид рЬуСоатр4 <400> 22

1ада1а1сас да1дс1саад с1а1а(д1ад с1дс <210> 23 <211> 34 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220> Описание искусственной последовательности <223> Олигонуклеотид рНуСоатрб

- 29 007461 <400> 23 а(ас(адШ аддасд!адс айсйсдда а!ад <210> 24 <211> 7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Специфический сайт для связывания в 8ЕО Ю N0:3 <220>

<221 > неизвестно <222> (4)..(4) <223> Хаа = любая аминокислота <220>

<221 > неизвестно <222> (6)..(6) <223> Хаа = любая аминокислота <400> 24

Агд ΗΪ5 61у Хаа Агд Хаа Рго

Claims (53)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный полинуклеотид, кодирующий фитазу, выбранный из группы, состоящей из:

   (a) выделенного полинуклеотида, кодирующего фитазу, представленную последовательностью 8 ЕС) ΙϋΝΟ: 3;

   (b) гомологичного выделенного полинуклеотида, тождественного по меньшей мере на 50% полинуклеотиду по п.(а);

   (c) выделенного полинуклеотида, комплементарного полинуклеотиду по п.(а) или (Ь);

   (ά) фрагмента, состоящего по меньшей мере из 100 нуклеотидов полинуклеотида по пп.(а), (Ь) или (с), кодирующего активный фрагмент фитазы.
2. 2. Полинуклеотид по π. 1, представленный последовательностью 8ЕС) ГО N0: 1 или 8ЕС) ГО N0: 2.
3. 3. Полинуклеотид по π. 1, представленный последовательностью 8 ЕС) ГО N0: 4.
4. 4. Полинуклеотид по одному из пп.1-3, происходящий из гриба рода РешсйНиш, например Решсй1шт зр. с депозитным номером СВ8 109899.
5. 5. Выделенный полинуклеотид, включающий полинуклеотид по одному из пп.1-4.
6. 6. Фитаза, кодируемая полинуклеотидом по одному из пп.1-5.
7. 7. Фитаза, выбранная из группы, состоящей из:

   (a) фитазы, представленной последовательностью 8Е() ГО N0: 3;

   (b) гомологичной фитазы, тождественной по меньшей мере на 35% фитазе по п.(а);

   (c) активного фрагмента фитазы по и.(а) или (Ь), обладающего фитазной активностью, эквивалентной активности указанной фитазы.
8. 8. Фитаза по любому из пп.6 или 7, происходящая из гриба рода РешсйНиш.
9. 9. Фитаза по и. 8, происходящая из штамма СВ8 109899 РешсйНиш зр.
10. 10. Химерный ген, включающий функционально связанные друг с другом, по меньшей мере:

    (a) один промотор, функционирующий в организме хозяина;

    (b) полинуклеотид по одному из пп.1-5;

    (c) элемент-терминатор, функционирующий в организме хозяина.

    - 30 007461
11. 11. Химерный ген по п.10, также включающий последовательность, кодирующую сигнальный пептид или транзитный пептид, функционирующий в организме хозяина.
12. 12. Экспрессионный или трансформационный вектор, включающий химерный ген по любому из пп.10 и 11.
13. 13. Вектор по п.12, представляющий собой плазмиду, фаг или вирус.
14. 14. Трансформированный организм хозяина, включающий химерный ген по любому из пп.10 и 11.
15. 15. Организм хозяина по п.14, представляющий собой микроорганизм.
16. 16. Организм хозяина по п.15, в котором микроорганизм выбран из бактерий, грибов, дрожжей или вирусов.
17. 17. Организм хозяина по п.16, в котором микроорганизм представлен бактерией, выбранной из родов СогупеЬас!егшт, ВасШиз, 8!гер!отусез и ЕзсйейсЫа, в частности Е. сой.
18. 18. Организм хозяина по п.16, в котором микроорганизм представлен грибом, выбранным из родов РешсШшт, АзрегдШиз, СЫузозрогшт и Тйсйобегта.
19. 19. Организм хозяина по п.16, в котором микроорганизм представлен дрожжевым организмом, выбранным из родов 8ассйаготусез, К1иууеготусез и РюЫа.
20. 20. Организм хозяина по п.14, представляющий собой растительную клетку, растение или часть растения.
21. 21. Способ получения экстракта, обладающего фитазной активностью, включающий стадии:

    (a) культивирования организма, обладающего полинуклеотидом по одному из пп.1-5, в условиях, позволяющих ему экспрессировать данную фитазу, (b) концентрирования организма, выращенного на стадии (а), (c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (б) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (б).
22. 22. Способ получения экстракта, обладающего фитазной активностью, включающий стадии:

    (a) культивирования организма, обладающего полинуклеотидом по одному из пп.1-5, в условиях, позволяющих ему экспрессировать данную фитазу, (b) выделения культуральной среды путем удаления данного организма.
23. 23. Способ получения фитазы по одному из пп.6-9, включающий все стадии способов по п.21 или 22, к которым добавлена дополнительная стадия:

    (к) для способа по п.21 - очистка фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е), (c) для способа по п.22 - очистка фитазы из культуральной среды, полученной на стадии (Ь).
24. 24. Способ получения по одному из пп.21-23, в котором организм представляет собой микроорганизм.
25. 25. Способ получения по п.24, в котором микроорганизм представлен грибом.
26. 26. Способ получения по п.25, в котором гриб представлен грибом из рода РеЫсШшт.
27. 27. Способ получения по п.26, в котором гриб из рода РеЫсШшт представлен штаммом СВ8 109899 РеЫсШшт зр.
28. 28. Способ получения экстракта, обладающего фитазной активностью, включающий стадии:

    (a) культивирования трансформированного организма хозяина по одному из пп.14-20, (b) концентрирования трансформированного организма хозяина, выращенного на стадии (а), (c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (б) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (б).
29. 29. Способ получения экстракта, обладающего фитазной активностью, включающий стадии:

    (a) культивирования трансформированного организма хозяина по одному из пп.14-20, (b) получения культуральной жидкости путем удаления трансформированного организма хозяина.
30. 30. Способ получения фитазы по одному из пп.6-9, включающий все стадии способов по пп.28 и 29, к которым добавлена дополнительная стадия:

    (к) для способа по п.28 - очистка фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е), (c) для способа по п.29 - очистка фитазы из культуральной среды, полученной на стадии (Ь).
31. 31. Энзиматическая композиция, включающая по меньшей мере одну фитазу по одному из пп.6-9.
32. 32. Кормовая композиция, включающая по меньшей мере один трансформированный организм хозяина по одному из пп.14-20.
33. 33. Кормовая композиция, включающая по меньшей мере один организм, содержащий полинуклеотид по одному из пп.1-5.
34. 34. Кормовая композиция по п.33, в которой организм представлен грибом.
35. 35. Кормовая композиция по п.34, в которой гриб представлен грибом из рода РеЫсШшт.
36. 36. Кормовая композиция по п.35, в которой гриб представлен штаммом СВ8 109899 РешсШшт зр.
37. 37. Кормовая композиция, включающая по меньшей мере одну фитазу по одному из пп.6-9.
38. 38. Применение кормовой композиции по одному из пп.32-37 для кормления животных с неразделенным желудком.

    - 31 007461
39. 39. Применение кормовой композиции по п.38, предназначенной для кормления свиней.
40. 40. Применение кормовой композиции по п.38, предназначенной для кормления домашних птиц.
41. 41. Способ получения кормовой композиции по п.32, включающий стадии:

    (a) культивирования организма хозяина по одному из пп.14-20, (b) концентрирования организма хозяина, выращенного на стадии (а), (c) включения организма хозяина, выделенного на стадии (Ь), в кормовую композицию.
42. 42. Способ получения кормовой композиции по одному из пп.33-36, включающий стадии:

    (a) культивирования организма, обладающего полинуклеотидом по одному из пп.1-5, в условиях, позволяющих ему экспрессировать фитазу, (b) концентрирования организма, выращенного на стадии (а), (c) включения организма, выделенного на стадии (Ь), в кормовую композицию.
43. 43. Способ получения кормовой композиции по п.37, включающий стадии:

    (a) культивирования организма, обладающего полинуклеотидом по одному из пп.1-5, в условиях, позволяющих ему экспрессировать фитазу, (b) концентрирования организма, выращенного на стадии (а), (c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (й) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (й), (Г) включения супернатанта, выделенного на стадии (е), в кормовую композицию.
44. 44. Способ получения кормовой композиции по п.37, включающий стадии:

    (a) культивирования организма, обладающего полинуклеотидом по одному из пп.1-5, в условиях, позволяющих ему экспрессировать фитазу, (b) выделения культуральной среды путем удаления данного организма, (c) включения культуральной среды, выделенной на стадии (Ь), в кормовую композицию.
45. 45. Способ получения кормовой композиции по п.37, включающий стадии:

    (a) культивирования трансформированного организма хозяина по одному из пп.14-20, (b) концентрирования трансформированного организма хозяина, выращенного на стадии (а), (c) разрушения клеток организма, выделенного на стадии (Ь), (й) центрифугирования экстракта из разрушенных клеток, полученного на стадии (с), (е) выделения супернатанта, обладающего фитазной активностью, полученного на стадии (й), (Г) включения супернатанта, выделенного на стадии (е), в кормовую композицию.
46. 46. Способ получения кормовой композиции по п.37, включающий стадии:

    (a) культивирования трансформированного организма хозяина по одному из пп.14-20, (b) выделения культуральной среды путем удаления данного трансформированного организма хозяина, (c) включения культуральной среды, выделенной на стадии (Ь), в кормовую композицию.
47. 47. Способ по п.43 или 45, в котором стадия (Г) заменена стадиями:

    (Г) очистка фитазы из супернатанта, полученного на стадии (е), (д) включения фитазы, очищенной на стадии (Г), в кормовую композицию.
48. 48. Способ по п.44 или 46, в котором стадия (с) заменена стадиями:

    (с) очистки фитазы из культуральной среды, полученной на стадии (Ь), (й) включения фитазы, очищенной на стадии (с), в кормовую композицию.
49. 49. Способ повышения усваивания неорганического фосфата, содержащегося в фитиновой кислоте растительных кормов, у животных с неразделенным желудком, в котором фитаза по одному из пп.6-9 или энзиматическая композиция по п.31 включается в рацион данных животных.
50. 50. Способ по п.49, в котором животным с неразделенным желудком скармливают кормовую композицию по одному из пп.32-37.
51. 51. Способ уменьшения введения фосфора в рацион животных с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по одному из пп.32-37.
52. 52. Способ уменьшения выброса фосфора, происходящего из рациона животных с неразделенным желудком, в котором данным животным скармливают кормовую композицию по одному из пп.32-37.
53. 53. Нитчатый гриб из рода РешсШшт, имеющий депозитный номер СВЗ 109899.